阅读说明：本技术 一种大分子量角蛋白的制备方法及其应用 (Preparation method and application of high molecular weight keratin ) 是由 史劲松 龚劲松 叶金鹏 许正宏 蒋敏 钱建瑛 于 2020-06-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种大分子量角蛋白的制备方法及其应用,本发明通过角蛋白酶与谷氨酰胺转氨酶联合使用,通过角蛋白酶来水解羊毛得到可溶性角蛋白水解液,通过离心,在上清液中加入Tgase来交联角蛋白,经过透析和冷冻干燥即可得到大分子角蛋白粉末。本发明的方法可以从废弃羊毛提取羊毛角蛋白并将其交联,羊角蛋白的分子量可以达到120kDa。该大分子量角蛋白的制备方法工艺简单,条件易控,原料为废弃的羊毛,废物再利用,不引入化学试剂,绿色环保,节约能源；本发明还提供所述大分子量角蛋白在生物材料上的应用,该纳米材料垫具有生物相容性以及促进伤口愈合的作用。(The invention discloses a preparation method and application of high molecular weight keratin. The method can extract and crosslink the wool keratin from the waste wool, and the molecular weight of the wool keratin can reach 120 kDa. The preparation method of the high molecular weight keratin has the advantages of simple process and easily controlled conditions, the raw material is waste wool, the waste is recycled, no chemical reagent is introduced, the method is green and environment-friendly, and the energy is saved; the invention also provides application of the high molecular weight keratin to a biological material, and the nano material pad has the effects of biocompatibility and wound healing promotion.)

一种大分子量角蛋白的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种大分子量角蛋白的制备方法及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

我国是产毛和用毛大国，每年都有大量不可纺的短纤维、粗纤维，以及前处理工艺中损坏的羊毛被废弃，既浪费资源又增加环境压力。如何将这些废弃的羊毛再利用，一直是研究的热点。

羊毛角蛋白的加工水解工艺包括化学处理法、物理加工法和生物酶水解法。化学处理法是采用强酸和强碱进行配合处理，水解产品营养价值破坏较多，而且环境污染严重而应用最少。物理加工法即高温高压水解法，对设备及耗能的要求很高，所以生产成本很高。化学处理法和物理加工法只能得到分子量很低的多肽；生物酶水解法是采用高活性的蛋白水解酶或者微生物在温和适宜的条件下将羊毛降解为可溶性，此法不仅污染少、耗能低、反应条件温和，但是角蛋白水解酶使用过程中存在反应难控制，酶作用专一性较差等问题，制备的角蛋白具有较低的分子量(<60kDa)和较差的机械性能。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明通过角蛋白酶与谷氨酰胺转氨酶联合使用，通过角蛋白酶来水解羊毛得到可溶性角蛋白水解液，通过离心，在上清液中加入Tgase来交联角蛋白，经过透析和冷冻干燥即可得到大分子角蛋白粉末。本发明提供的方法操作简单，获得的羊毛角蛋白分子量为120kDa。

本发明的第一个目的是提供一种大分子量角蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)将羊毛纤维洗净，用脱脂溶剂脱脂12～24h，清洗去除表面残留的脱脂溶剂，烘干剪碎，得到脱脂羊毛纤维；

(2)将步骤(1)中的脱脂羊毛纤维加入水中，调节pH至9～10，加入角蛋白酶，在45～55℃，水解12～24h，离心获得角蛋白水解液；

(3)将步骤(2)的角蛋白水解液pH调节至6～8，加入谷氨酰胺转氨酶，在45～55℃，反应24～48h，灭酶得到角蛋白溶液；

(4)将步骤(3)的角蛋白溶液经过透析、冷冻、干燥得到所述的大分子量角蛋白。

进一步地，所述的角蛋白酶的加入量为15,000～20,000U/g羊毛。

进一步地，所述的谷氨酰胺转氨酶的加入量为15-20U/g角蛋白。

进一步地，在步骤(2)中，脱脂羊毛纤维与水的浴比为4～6:100。

进一步地，在步骤(1)中，所述的脱脂溶剂为醚、苯、二硫化碳、丙酮、氯仿中的一种或多种混合。

进一步地，在步骤(1)中，所述的脱脂是在65～75℃处理12～24h。

进一步地，在步骤(4)中，所述的透析是采用分子截留量为8,000～14,000的透析袋透析2～4天，透析过程中4～6h换一次水。

进一步地，在步骤(2)中，所述的离心是在6000～10000rpm，离心5-10min。

本发明的第二个目的是提供所述的方法制备得到的角蛋白。

本发明的第三个目的是提供所述的角蛋白在生物纳米材料垫的应用。

进一步地，所述的应用具体包括：室温条件下，称取羊毛角蛋白粉末溶于六氟异丙醇中，在密封的条件下搅拌至溶解均匀，然后称取聚(β-羟基丁酸戊酸酯)加至上述溶液中，制成大分子量角蛋白/聚(β-羟基丁酸戊酸酯)纺丝液，密封3h后搅拌备用，其中，大分子角蛋白/聚(β-羟基丁酸戊酸酯)纺丝液的质量分数为4-6wt％，大分子量角蛋白与聚(β-羟基丁酸戊酸酯)的质量比为3:7-5:5；用注射器抽取溶解好的大分子角蛋白/聚(β-羟基丁酸戊酸酯)纺丝液，固定在恒流泵上，恒流泵的流速为0.5-1.0mL/h；然后将高压静电发生器的正极接到针头上，负极连接到接收板上，接收板上铺有一层铝箔纸，用于接收静电纺纤维，开始静电纺丝，在室温条件下进行，湿度低于75％，距离控制在15-25cm，电压控制在10-20kV；每次纺丝4h，纺丝完成后，将铝箔纸取下，干燥条件下保存。

本发明的有益效果：

(1)本法制备的角蛋白分子量大，可达120kDa，属于可溶性蛋白，并且热稳定性提高。

(2)本发明在制备大分子量角蛋白时利用角蛋白酶和TGase，反应条件温和，对环境的污染小。

(3)本发明制备出的大分子量角蛋白提高细胞的存活率，促进细胞迁移。

(4)本发明制备出的大分子量角蛋白可以提高角蛋白纳米纤维的机械性能，其中，杨氏模量提高了41％。

附图说明

图1为交联前后羊毛角蛋白的SDS-PAGE图

图2为羊毛及交联前后羊毛角蛋白的XRD衍射图

图3为羊毛及交联前后的羊毛角蛋白的红外光谱图

图4为交联前后的羊毛角蛋白的圆二色谱图

图5为交联前后的羊毛角蛋白的结构含量分布

图6为羊毛和交联前后的羊毛角蛋白的热力学分析结果

图7为交联角蛋白对细胞活力的影响结果

图8为交联角蛋白对细胞迁移的影响

图9为交联前后角蛋白与聚(β-羟基丁酸戊酸酯)(PHBV)通过复合静电纺丝制备而成的纳米纤维的SEM图及直径分布，AB、CD和EF分别为PHBV、PHBV/30％水解角蛋白、PHBV/30％交联角蛋白

图10为静电纺丝所得纳米纤维的红外光谱图

图11为静电纺丝所得纳米纤维的XRD衍射图

图12为交联前后角蛋白与聚(β-羟基丁酸戊酸酯)通过复合静电纺丝制备而成的纳米纤维的应力-应变曲线

图13为静电纺丝制备而成的纳米纤维对小鼠伤口愈合的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：

本实施例所述的一种大分子量羊毛角蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)、采用丙酮对废弃的羊毛进行脱脂处理，温度为72℃，处理时间为15h，脱脂之后用去离子束洗涤3次，然后在60℃的烘箱中烘干；

(2)、取5g剪碎的羊毛加入至水中，调节溶液pH值至9，然后加入20,000U/g羊毛的角蛋白酶，水解温度为50℃，水解时间12h；

(3)、经(2)处理的溶液进行离心分离获得羊毛角蛋白水解液。离心的速率的8,000rpm，离心的时间为10min。

(4)、在经(3)所得的水解角蛋白溶液上清中加入TGase对角蛋白进行交联，调整pH为8.0，TGase的添加量为15U/g角蛋白，反应温度为45℃，反应时间为24h；

(5)、将步骤(4)中的上清液装入分子截留量为8,000-14,000的透析袋，透析过程中每4h换一次水，透析2天。

(6)、将步骤(5)中所得的大分子角蛋白溶液放入-80℃冰箱冷冻12h，然后在冷冻干燥机上干燥48h，得到角蛋白固体；对干燥后的样品进行研磨，得到羊毛角蛋白粉末。

采用上述方案羊毛的水解率为63.1％，双酶法制备出的角蛋白分子量分布为120.1kDa。红外光谱显示交联前后角蛋白内部没有新的化学键生成。XRD、圆二色谱结果说明交联过后角蛋白的的α-螺旋占比下降，而β-折叠、转角和无规则卷曲占比上升。热力学实验表明交联之后的角蛋白的最大热分解温度略大于水解角蛋白，说明交联提高了角蛋白的热稳定性。此外，交联角蛋白可以提高细胞的存活率，促进细胞的迁移。

实施例2：

本实施例所述的一种大分子量羊毛角蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)、采用丙酮对废弃的羊毛进行脱脂处理，温度为72℃，处理时间为15h，脱脂之后用去离子束洗涤3次，然后在60℃的烘箱中烘干；

(2)、取5.5g剪碎的羊毛加入至水中，调节溶液pH值至9.3，然后加入18,000U/羊毛的角蛋白酶，水解温度为50℃，水解时间15h；

(3)、经(2)处理的溶液进行离心分离获得羊毛角蛋白水解液。离心的速率的8,000rpm，离心的时间为10min。

(4)、在经(3)所得的水解角蛋白溶液上清中加入TGase对角蛋白进行交联，调整水解液的pH为7.0，TGase的添加量为20U/g角蛋白，反应温度为49℃，反应时间为32h；

(5)、将步骤(4)中的上清液装入分子截留量为8,000-14,000的透析袋，透析过程中每5h换一次水，透析3天。

(6)、将步骤(5)中所得的大分子量角蛋白溶液放入-80℃冰箱冷冻24h，然后在冷冻干燥机上干燥60h，得到角蛋白固体；对干燥后的样品进行研磨，得到羊毛角蛋白粉末。

采用上述方案羊毛的水解率为69.2％，双酶法制备出的角蛋白分子量分布为121.5kDa。红外光谱显示交联前后角蛋白内部没有新的化学键生成。XRD、圆二色谱结果说明交联过后角蛋白的的α-螺旋占比下降，而β-折叠、转角和无规则卷曲占比上升。热力学实验表明交联之后的角蛋白的最大热分解温度略大于水解角蛋白，说明交联提高了角蛋白的热稳定性。此外，交联角蛋白可以提高细胞的存活率，促进细胞的迁移。

实施例3：

本实施例所述的一种大分子量羊毛角蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)、采用丙酮对废弃的羊毛进行脱脂处理，温度为72℃，处理时间为24h，脱脂之后用去离子束洗涤3次，然后在60℃的烘箱中烘干；

(2)、取5.8g剪碎的羊毛加入至水中，调节溶液pH值至10，然后加入25,000U/羊毛的角蛋白酶，水解温度为50℃，水解时间24h；

(3)、经(2)处理的溶液进行离心分离获得羊毛角蛋白水解液。离心的速率的8,000rpm，离心的时间为10min。

(4)、在经(3)所得的水解角蛋白溶液上清中加入TGase对角蛋白进行交联，调整水解液的pH为6.0。TGase的添加量为25U/g角蛋白，反应温度为52℃，水解时间为48h；

(5)、将步骤(4)中的上清液装入分子截留量为8,000-14,000的透析袋，透析过程中每6h换一次水，透析4天。

(6)、将步骤(5)中所得的大分子量角蛋白溶液放入-80℃冰箱冷冻24h，然后在冷冻干燥机上干燥72h，得到角蛋白固体；对干燥后的样品进行研磨，得到羊毛角蛋白粉末。

采用上述方案羊毛的水解率为72.6％，双酶法制备出的角蛋白分子量分布为107.5kDa。红外光谱显示交联前后角蛋白内部没有新的化学键生成。XRD、圆二色谱结果说明交联过后角蛋白的的α-螺旋占比下降，而β-折叠、转角和无规则卷曲占比上升。热力学实验表明交联之后的角蛋白的最大热分解温度略大于水解角蛋白，说明交联提高了角蛋白的热稳定性。此外，交联角蛋白可以提高细胞的存活率，促进细胞的迁移。

实施例4：

本实施例所述的一种大分子量角蛋白的应用方法，包括以下步骤：

(1)、室温条件下，称取实施例1中制备好的大分子量角蛋白粉末溶于六氟异丙醇中，在密封的条件下搅拌至溶解均匀，然后称取聚(β-羟基丁酸戊酸酯)加至上述溶液中，制成大分子角蛋白/聚(β-羟基丁酸戊酸酯)纺丝液，密封3h后搅拌备用；其中，大分子量角蛋白/聚(β-羟基丁酸戊酸酯)纺丝液的质量分数为4-6wt％，大分子角蛋白与聚(β-羟基丁酸戊酸酯)的质量比为3:7。

(2)、用注射器抽取溶解好的大分子量角蛋白/聚(β-羟基丁酸戊酸酯)纺丝液，固定在恒流泵上，恒流泵的流速为1.0mL/h；

(3)、将高压静电发生器的正极接到针头上，负极连接到接收板上，接收板上铺有一层铝箔纸，用于接收静电纺纤维，开始静电纺丝，在室温条件下进行，湿度低于75％，距离控制在15cm，电压控制在20kV。

(4)、每次纺丝4h，纺丝完成后，将铝箔纸取下，干燥条件下保存。

SEM结果显示所有结构的纤维膜都呈现了三维结构，纳米纤维表面光滑无串珠形成。PHBV纳米纤维模板的平均纤维直径约为512±210nm。加入角蛋白后，纤维直径略有减小，平均直径分别为355±118nm(PHBV/30％水解角蛋白)、353±111nm(PHBV/30％交联角蛋白)。红外光谱和X射线衍射结果显示PHBV/30％交联角蛋白纳米纤维膜的特征峰的峰形和位置没有发生明显的改变，说明两者以物理形式混合，没有发生化学变化。性能测试结果：水解角蛋白/聚(β-羟基丁酸戊酸酯)纳米纤维垫的杨氏模量为30.78MPa；大分子量角蛋白/聚(β-羟基丁酸戊酸酯)纳米纤维垫的杨氏模量43.98MPa。小鼠伤口愈合实验证明PHBV/交联角蛋白纳米纤维膜对小鼠伤口愈合具有促进作用。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。