阅读说明：本技术 一种海参皂甙的提取方法 (Method for extracting sea cucumber saponin ) 是由 梁志勇 王群 马迪 宋仁芳 于 2020-05-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种海参皂甙的提取方法,属于海洋生物技术领域。本发明以海参深加工废弃物海参内脏为原料,集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术、乙醇沉淀和树脂吸附技术,研制开发出高体外抗氧化能力和抗癌功效的海参皂甙生物制品,其中混菌好氧发酵菌种主要包括酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和冷解糖芽孢杆菌。所得海参皂甙具有较强的抗氧化能力和抗癌功能,光谱性强,可在保健、食品、医药等领域高效利用。该提取方法海参皂甙提取率高,能够实现海参加工废弃物的资源化再利用,便于工业化生产,市场前景广阔。(The invention discloses a method for extracting holothurian saponins, belonging to the technical field of marine organisms. The invention takes sea cucumber viscera which are wastes of deep processing of sea cucumber as raw materials, integrates the modern bioseparation technology, the biological enzymolysis technology, the mixed bacteria microbial fermentation technology, the ethanol precipitation and the resin adsorption technology, and develops a sea cucumber saponin biological product with high in-vitro oxidation resistance and anticancer efficacy, wherein the mixed bacteria aerobic fermentation strain mainly comprises saccharomyces cerevisiae, bacillus subtilis and bacillus saccharolyticus. The obtained sea cucumber saponin has strong oxidation resistance and anticancer function, strong spectrum, and can be used in fields of health promotion, food, medicine, etc. The extraction method has high extraction rate of holothurian saponin, can realize resource recycling of holothurian processing waste, is convenient for industrial production, and has wide market prospect.)

一种海参皂甙的提取方法

技术领域

本发明涉及一种海参皂甙的提取方法，尤其是一种利用海参内脏为原料通过微生物协同发酵制备高抗氧化能力和营养保健功效的海参皂甙生物制品，属于海洋生物技术领域。

背景技术

海参是一种重要的海洋无脊椎动物，肉质细嫩、营养丰富，是典型的高蛋白、低脂肪的食物，具有极高的营养价值和药用价值， 对于高血压、冠心病、肝炎等患者以及老年人而言是食疗佳品，它既可以增强机体的免疫力和造血功能，又可抑制多种霉菌及人类癌细胞的生长和转移等。早在一千多年前，我国就有食用海参的习惯，并将海参视为一种珍贵的滋补品，列为“海八珍”之首。《本草从新》中记载海参具有“甘、咸、温、补肾益精、壮阳疗痿”的功效，清朝《本草纲目拾遗》中记载“海参性温补，足敌人参故名海参； 味甘咸、补肾经、益精髓、消痰延、摄小便、壮阳疗痿、杀疮虫”。

近年来研究发现海参中的主要活性成分为其次生代谢产物一一海参皂甙，海参皂甙在海参体壁真皮结缔组织、体腔、内腺管及内脏中均有分布，具有多种药理活性活性，如抗肿瘤作用、提高免疫力、抗新血管形成、抗凝血、促进纤维蛋白溶解、抑制栓塞形成、抗炎作用（如关节炎）和抗放射活性，以及抑制艾滋病病毒、乙肝病毒、单纯坝疹病毒等:另外，研究还发现海参皂甙具有广谱的抗真菌功效。目前，己有很多国家的科研机构致力于以海参皂甙为主的产品的研发。由于加工成果中皂甙多残留于加工废液中，对加工废弃物的资源化再利用提取海参皂甙研究较少，已造成资源严重浪费和流失。

现有技术中，海参皂甙的制备工艺主要集中于有机溶剂萃取法，如专利CN2005100441221公开了一种利用海参加工废液制备海参皂甙的工艺方法，首先将海参废液进行过滤，然后滤液用乙醇沉淀、静置、离心，再将离心上清液减压浓缩，最后通过大孔吸附树脂柱制备海参皂甙。比较现有技术发现海参皂甙提取率低、生产成本高，难以实现产业化生产，尤其是对于提高海参皂甙的抗氧化性及营养功效及定向制备技术的研究相对较少，成为制约海参皂甙规模化利用的最大技术瓶颈。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，满足海参加工废弃物高效提取及高值化利用，本申请提供一种海参皂甙的提取方法，集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术，研制开发出高体外抗氧化能力的海参皂甙生物制品，满足保健、医疗、食品等领域对海参皂甙的应用需求，该工艺技术发酵工艺简单高效、所得产品抗氧化能力和自由基清除能力强，生产成本低，易于工业化规模生产。

本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：

一种海参皂甙的提取方法，其特征在于制备方法包括如下步骤：

（1）清洗：将加工的新鲜海参内脏用自来水清洗干净，再用天然矿泉水或纯化水洗净沥干待用；

（2）匀浆：将步骤(1)所得海参内脏加入高速匀浆机，加入天然矿泉水或纯化水，进行高速匀浆，直至全部能够通过2mm孔径圆筛；

（3）灭菌：将匀浆后的海参内脏通过高压蒸锅灭菌，冷却后待用；

（4）复合酶解：向灭菌后的浆液中加入质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃条件下搅拌酶解30min；

（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵8h；

（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；

（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（8）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（9）离心：以10000r/min速率离心分离，去除不溶性成分；

（10）乙醇沉淀：向离心液中加入乙醇，静置60min以上；

（11）离心浓缩：离心除去沉淀物，减压浓缩得到海参皂甙提取液。

优选的，上述步骤（4）中复合酶制剂为蛋白酶、非淀粉多糖酶和柚苷酶的中的一种或几种的混合物。

优选的，上述蛋白酶、非淀粉多糖酶和柚苷酶的质量比为2:1：1。

优选的，上述步骤（5）中所述复合微生物菌剂为酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和冷解糖芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:1：2。

优选的，上述步骤（10）乙醇沉淀时应使其中的乙醇浓度为30～40%。

优选的，上述述步骤（5）中好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.2～0.3m³/m³.min。

上述酿酒酵母种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10⁹cfu/mL。

上述枯草芽孢杆菌和冷解糖芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体枯草芽孢杆菌和冷解糖芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10⁹cfu/mL。

优选的，海参皂甙提取液可以通过树脂吸附提取制备海参皂甙干制品，具体工艺步骤为：将海参皂甙提取液以2～3倍柱体积/h的流速通过大孔吸附树脂柱，而后用水以同样的流速洗脱，接着用乙醇洗脱被吸附在大孔吸附树脂上的海参皂甙成分并收集洗脱液减压浓缩至浸膏状，最后冷冻干燥为海参皂甙干品。

优选的，上述洗脱用的乙醇浓度为60～70%，减压浓缩中的温度控制在40～50℃。

本发明提供一种海参皂甙的提取方法，所得海参皂甙具有较强的抗氧化能力，提取液可根据应用途径做浓缩、吸附干燥、醇析或树脂纯化等处理，满足在保健、食品、医药等领域的高效利用。

本发明提供一种海参皂甙的提取方法，与现有技术相比，具有以下显著优势：

（1）本申请以海参深加工废弃物海参内脏为原料，集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术，显著提升了海参皂甙的提取率和抗氧化能力；尤其是尽管柚苷酶对提升海参皂甙提取液抗氧化能力的影响不显著，但对复合酶制剂提高海参皂甙提取液的抗氧化能力具有显著的影响；

（2）本申请利用好氧菌（酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌）共同发酵海参内脏蛋白提取海参皂甙，充分利用微生物间的协同作用，提升海参皂甙的提取率和体外抗氧化能力，其中：酿酒酵母在发酵过程中会产生各种降解细胞壁的酶类，使得更多的海参皂甙从细胞壁中释放出来，且酵母是产生能够释放结合态酚酸的酶类，有利于提升海参皂甙的体外抗氧化能力；枯草芽孢杆菌在高温发酵过程中能够杀灭发酵液中的致病菌，并具有较强的产蛋白酶、蛋白酶等能力，可以将大分子淀粉、蛋白物质降解为微生物所利用，从而提高海参皂甙的提取率，但对海参皂甙的抗氧化能力影响不显著；冷解糖芽孢杆菌的加入则可以显著提升海参皂甙·OH自由基清除能力；

（3）本发明采用乳酸杆菌进行厌氧发酵，提升了海参皂甙的稳定性，试验结果表明，在20～80℃范围内，温度和时间对海参皂甙抗氧化性影响不大，当温度超过100℃时抗氧化性随着温度和时间的增加开始降低，稳定性高于目前报道的技术水平；

（4）采用液体发酵，提高了菌体的生长速率，缩短了发酵时间，提升了生产效率发酵工艺条件温和，生产成本低，且易于规模化生产，对提升行业经济效益及规模化推广应用具有重要作用。

具体实施方式

在本申请中，酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和冷解糖芽孢杆菌的活化方法如下：

（1）酿酒酵母种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10⁹cfu/mL；

（2）上述枯草芽孢杆菌和冷解糖芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体枯草芽孢杆菌和冷解糖芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10⁹cfu/mL。

实施例1

一种海参皂甙的提取方法，具体工艺步骤包括：

（1）清洗：将加工的新鲜海参内脏用自来水清洗干净，再用天然矿泉水或纯化水洗净沥干待用；

（2）匀浆：将步骤(1)所得海参内脏加入高速匀浆机，加入天然矿泉水或纯化水，进行高速匀浆，直至全部能够通过2mm孔径圆筛；

（3）灭菌：将匀浆后的海参内脏通过高压蒸锅灭菌，冷却后待用；

（4）复合酶解：向灭菌后的浆液中加入质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃条件下搅拌酶解30min；所述复合酶制剂为蛋白酶、非淀粉多糖酶和柚苷酶混合物，其中蛋白酶、非淀粉多糖酶和柚苷酶的质量比为2:1：1；

（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵8h；所述复合微生物菌剂为酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和冷解糖芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:1：2；好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.2～0.3m³/m³.min；

（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；

（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（8）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（9）离心：以10000r/min速率离心分离，去除不溶性成分；

（10）乙醇沉淀：向离心液中加入乙醇，静置60min以上；乙醇沉淀时应使其中的乙醇浓度为30～40%；

（11）离心浓缩：离心除去沉淀物，减压浓缩得到海参皂甙提取液。

实施例2

一种海参皂甙的提取方法，具体工艺步骤包括：

（1）清洗：将加工的新鲜海参内脏用自来水清洗干净，再用天然矿泉水或纯化水洗净沥干待用；

（2）匀浆：将步骤(1)所得海参内脏加入高速匀浆机，加入天然矿泉水或纯化水，进行高速匀浆，直至全部能够通过2mm孔径圆筛；

（3）灭菌：将匀浆后的海参内脏通过高压蒸锅灭菌，冷却后待用；

（4）复合酶解：向灭菌后的浆液中加入质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃条件下搅拌酶解30min；所述复合酶制剂为蛋白酶、非淀粉多糖酶和柚苷酶的混合物，其中蛋白酶、非淀粉多糖酶和柚苷酶的质量比为1:1：1；

（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵8h；所述复合微生物菌剂为酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和冷解糖芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:1：2；好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.2～0.3m³/m³.min；

（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；

（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（8）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（9）离心：以10000r/min速率离心分离，去除不溶性成分；

（10）乙醇沉淀：向离心液中加入乙醇，静置60min以上；乙醇沉淀时应使其中的乙醇浓度为30～40%；

（11）离心浓缩：离心除去沉淀物，减压浓缩得到海参皂甙提取液。

实施例3

一种海参皂甙的提取方法，具体工艺步骤包括：

（1）清洗：将加工的新鲜海参内脏用自来水清洗干净，再用天然矿泉水或纯化水洗净沥干待用；

（2）匀浆：将步骤(1)所得海参内脏加入高速匀浆机，加入天然矿泉水或纯化水，进行高速匀浆，直至全部能够通过2mm孔径圆筛；

（3）灭菌：将匀浆后的海参内脏通过高压蒸锅灭菌，冷却后待用；

（4）复合酶解：向灭菌后的浆液中加入质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃条件下搅拌酶解30min；所述复合酶制剂为蛋白酶、非淀粉多糖酶的混合物，其中蛋白酶、非淀粉多糖酶的质量比为2:1；

（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵8h；所述复合微生物菌剂为酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和冷解糖芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:1：2；好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.2～0.3m³/m³.min；

（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；

（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（8）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（9）离心：以10000r/min速率离心分离，去除不溶性成分；

（10）乙醇沉淀：向离心液中加入乙醇，静置60min以上；乙醇沉淀时应使其中的乙醇浓度为30～40%；

（11）离心浓缩：离心除去沉淀物，减压浓缩得到海参皂甙提取液。

实施例4

一种海参皂甙的提取方法，具体工艺步骤包括：

（1）清洗：将加工的新鲜海参内脏用自来水清洗干净，再用天然矿泉水或纯化水洗净沥干待用；

（2）匀浆：将步骤(1)所得海参内脏加入高速匀浆机，加入天然矿泉水或纯化水，进行高速匀浆，直至全部能够通过2mm孔径圆筛；

（3）灭菌：将匀浆后的海参内脏通过高压蒸锅灭菌，冷却后待用；

（4）复合酶解：向灭菌后的浆液中加入质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃条件下搅拌酶解30min；所述复合酶制剂为蛋白酶、非淀粉多糖酶的混合物，其中蛋白酶、非淀粉多糖酶的质量比为1:1；

（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵8h；所述复合微生物菌剂为酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和冷解糖芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:1：2；好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.2～0.3m³/m³.min；

（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；

（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（8）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（9）离心：以10000r/min速率离心分离，去除不溶性成分；

（10）乙醇沉淀：向离心液中加入乙醇，静置60min以上；乙醇沉淀时应使其中的乙醇浓度为30～40%；

（11）离心浓缩：离心除去沉淀物，减压浓缩得到海参皂甙提取液。

实施例5

一种海参皂甙的提取方法，具体工艺步骤包括：

（1）清洗：将加工的新鲜海参内脏用自来水清洗干净，再用天然矿泉水或纯化水洗净沥干待用；

（2）匀浆：将步骤(1)所得海参内脏加入高速匀浆机，加入天然矿泉水或纯化水，进行高速匀浆，直至全部能够通过2mm孔径圆筛；

（3）灭菌：将匀浆后的海参内脏通过高压蒸锅灭菌，冷却后待用；

（4）复合酶解：向灭菌后的浆液中加入质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃条件下搅拌酶解30min；所述复合酶制剂为柚苷酶；

（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵8h；所述复合微生物菌剂为酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和冷解糖芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:1：2；好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.2～0.3m³/m³.min；

（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；

（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（8）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（9）离心：以10000r/min速率离心分离，去除不溶性成分；

（10）乙醇沉淀：向离心液中加入乙醇，静置60min以上；乙醇沉淀时应使其中的乙醇浓度为30～40%；

（11）离心浓缩：离心除去沉淀物，减压浓缩得到海参皂甙提取液。

实施例6

一种海参皂甙的提取方法，具体工艺步骤包括：

（1）清洗：将加工的新鲜海参内脏用自来水清洗干净，再用天然矿泉水或纯化水洗净沥干待用；

（2）匀浆：将步骤(1)所得海参内脏加入高速匀浆机，加入天然矿泉水或纯化水，进行高速匀浆，直至全部能够通过2mm孔径圆筛；

（3）灭菌：将匀浆后的海参内脏通过高压蒸锅灭菌，冷却后待用；

（4）复合酶解：向灭菌后的浆液中加入质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃条件下搅拌酶解30min；所述复合酶制剂为蛋白酶、非淀粉多糖酶和柚苷酶混合物，其中蛋白酶、非淀粉多糖酶和柚苷酶的质量比为2:1：1；

（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵8h；所述复合微生物菌剂为酿酒酵母和冷解糖芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为1:1；好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.2～0.3m³/m³.min；

（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；

（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（8）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（9）离心：以10000r/min速率离心分离，去除不溶性成分；

（10）乙醇沉淀：向离心液中加入乙醇，静置60min以上；乙醇沉淀时应使其中的乙醇浓度为30～40%；

（11）离心浓缩：离心除去沉淀物，减压浓缩得到海参皂甙提取液。

实施例7

一种海参皂甙的提取方法，具体工艺步骤包括：

（1）清洗：将加工的新鲜海参内脏用自来水清洗干净，再用天然矿泉水或纯化水洗净沥干待用；

（2）匀浆：将步骤(1)所得海参内脏加入高速匀浆机，加入天然矿泉水或纯化水，进行高速匀浆，直至全部能够通过2mm孔径圆筛；

（3）灭菌：将匀浆后的海参内脏通过高压蒸锅灭菌，冷却后待用；

（4）复合酶解：向灭菌后的浆液中加入质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃条件下搅拌酶解30min；所述复合酶制剂为蛋白酶、非淀粉多糖酶和柚苷酶混合物，其中蛋白酶、非淀粉多糖酶和柚苷酶的质量比为2:1：1；

（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵8h；所述复合微生物菌剂为枯草芽孢杆菌；好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.2～0.3m³/m³.min；

（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；

（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（8）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（9）离心：以10000r/min速率离心分离，去除不溶性成分；

（10）乙醇沉淀：向离心液中加入乙醇，静置60min以上；乙醇沉淀时应使其中的乙醇浓度为30～40%；

（11）离心浓缩：离心除去沉淀物，减压浓缩得到海参皂甙提取液。

对比实施例1

一种海参皂甙的提取方法，具体工艺步骤包括：

（1）清洗：将加工的新鲜海参内脏用自来水清洗干净，再用天然矿泉水或纯化水洗净沥干待用；

（2）匀浆：将步骤(1)所得海参内脏加入高速匀浆机，加入天然矿泉水或纯化水，进行高速匀浆，直至全部能够通过2mm孔径圆筛；

（3）灭菌：将匀浆后的海参内脏通过高压蒸锅灭菌，冷却后待用；

（4）复合酶解：将灭菌后的浆液在40～60℃条件下搅拌酶解30min；

（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵8h；所述复合微生物菌剂为酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和冷解糖芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:1：2；好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.2～0.3m³/m³.min；

（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；

（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（8）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（9）离心：以10000r/min速率离心分离，去除不溶性成分；

（10）乙醇沉淀：向离心液中加入乙醇，静置60min以上；乙醇沉淀时应使其中的乙醇浓度为30～40%；

（11）离心浓缩：离心除去沉淀物，减压浓缩得到海参皂甙提取液。

对比实施例2

一种海参皂甙的提取方法，具体工艺步骤包括：

（1）清洗：将加工的新鲜海参内脏用自来水清洗干净，再用天然矿泉水或纯化水洗净沥干待用；

（2）匀浆：将步骤(1)所得海参内脏加入高速匀浆机，加入天然矿泉水或纯化水，进行高速匀浆，直至全部能够通过2mm孔径圆筛；

（3）灭菌：将匀浆后的海参内脏通过高压蒸锅灭菌，冷却后待用；

（4）复合酶解：向灭菌后的浆液中加入质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃条件下搅拌酶解30min；所述复合酶制剂为蛋白酶、非淀粉多糖酶和柚苷酶混合物，其中蛋白酶、非淀粉多糖酶和柚苷酶的质量比为2:1：1；

（5）好氧发酵：将酶解后的酶解液在28～35℃条件下好氧发酵8h；好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.2～0.3m³/m³.min；

（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；

（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（8）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（9）离心：以10000r/min速率离心分离，去除不溶性成分；

（10）乙醇沉淀：向离心液中加入乙醇，静置60min以上；乙醇沉淀时应使其中的乙醇浓度为30～40%；

（11）离心浓缩：离心除去沉淀物，减压浓缩得到海参皂甙提取液。

实施例8 测定不同工艺下海参皂甙提取液的抗氧化能力

测定实施例1-7及对比实施例中海参皂甙提取液的抗氧化能力，其中·OH自由基清除率的测定参照邵秀芝等《食品化学试验》中所述方法；DPPH自由基清除率的测定参照林恋竹等《反应时间对DPPH法、ABTS法评价抗氧化性结果的影响》中所述方法；测定结果如下：

试验组别	·OH清除率（%）	DPPH自由基清除率（%）
			实施例1试验组	3.58	84.69
实施例2试验组	3.44	82.03
			实施例3试验组	3.18	79.63
实施例4试验组	3.31	80.48
			实施例5试验组	2.55	71.07
实施例6试验组	3.11	78.27
			实施例7试验组	2.63	72.92
对比实施例1	2.49	68.83
			对比实施例2	2.71	70.34

上述实验结果表明实施例1-6所得的海参皂甙提取液具有较高的抗氧化能力。同时，实验结果表明改变复合酶制和复合微生物的组成会显著降低海参皂甙提取液的抗氧化能力。实施例1为本发明最佳实施例。

以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。