阅读说明：本技术 一种从角豆水提取物中提纯d-松醇的方法 (Method for purifying D-pinitol from carob water extract ) 是由 李文德 杨浩 蒲首丞 赵虎军 楼永增 于 2019-12-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种从角豆水提取物中提纯D-松醇的方法,属于D-松醇提纯技术领域,所述提纯D-松醇的方法包括以下步骤：原料预处理：调节原料液的pH呈酸性；蔗糖水解转化：原料液中加入蔗糖酶,将蔗糖水解转化为果糖和葡萄糖；果糖沉淀：将果糖采用沉淀法去除；葡萄糖氧化：将葡萄糖氧化为葡萄糖酸；提纯D-松醇：将葡萄糖酸采用层析法分离后,减压浓缩水洗脱液得到高纯度D-松醇。本发明目的在于在使用温和的提纯方法减少杂质的同时,再分步骤尽可能多的去除升血糖因子。(The invention discloses a method for purifying D-pinitol from a water extract of carob, belonging to the technical field of purification of D-pinitol, and the method for purifying D-pinitol comprises the following steps: pretreatment of raw materials: adjusting the pH of the raw material liquid to be acidic; hydrolysis and transformation of sucrose: adding sucrase into the raw material solution to hydrolyze and convert sucrose into fructose and glucose; and (3) fructose precipitation: removing fructose by precipitation; oxidation of glucose: oxidizing glucose to gluconic acid; purifying D-pinitol: separating gluconic acid by chromatography, and concentrating water eluent under reduced pressure to obtain high-purity D-pinitol. The present invention aims to remove as much as possible of the hyperglycemic factor by a subdivided step while reducing impurities using a mild purification method.)

一种从角豆水提取物中提纯D-松醇的方法

技术领域

本发明涉及D-松醇提纯技术领域，尤其涉及一种从角豆水提取物中提纯D- 松醇的方法。

背景技术

D-松醇(D-pinitol)，IUPC为(1S，2S，4S，5R)-6-methoxycyclo hexane.1，2， 3，4，5.pentol，CAS登记号为10284-63-6，中文别名有右旋肌醇甲醚、3-甲基肌醇(mateze)、咳宁醇、甲基肌醇、蒎立醇、山扁豆醇、英文别名有Sennite、L-chiro-Inositol、pinite、pinecamphor，分子式为C₇H₁₄₀O₆，分子量为194.18， D-松醇在甲醇中为白色颗粒状的结晶，无臭，昧甜，易溶于水，难溶于甲醇、乙醇，不溶于氯仿、丙酮、***等有机溶剂。D-松醇的熔点为186-188℃；比旋光度为65.5。其结构如下所示：

D-松醇是一种具有多种重要生理活性的物质，有报道治疗高血糖、代谢紊乱、咳嗽、加强肌氨酸的保持力，对肝脏的保护作用以及抗肿瘤的作用。

D-松醇可以通过化学合成制得，但是化学合成存在各种化工反应原料的残留问题，存在安全风险，而食用级目前主要通过从植物中分离纯化天然制备而来。 D-松醇天然存在于松科植物糖松、葛根、中东长角豆、银杏的花粉、豆科植物夜关门中，同时在番泻叶，瞿麦、白皮松松塔、Pindrow叶及马达加斯加胶乳等植物中也发现了D-松醇的存在。而且经研究发现，中东长角豆水提取物中，D-松醇含量5-6％左右，但是水含量39％左右，果糖含量13％左右，葡萄糖含量13％左右，蔗糖含量22.3％左右，杂质较多，并且对于糖尿病患者等不宜摄取糖分的人群来说，糖分占比过高，升血糖因子果糖、蔗糖、葡萄糖含量较大，极易导致血糖升高，所以在减少提取物中的杂质含量，提纯D-松醇的同时，减少升血糖因子的量，是急需解决的问题。

目前，提取D-松醇的方法常用有的溶剂法、超声法，提取后用离子交换树脂、沉淀剂等进行提纯，但是这些手段提纯效果不佳，杂质含量较多，升血糖因子也几乎没有被去除。所以，现在急需一种安全温和的D-松醇提纯方法，将升血糖因子转化为对人体血糖没有影响和对健康有益的因子。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种从角豆水提取物中提纯D-松醇的方法，在使用温和的酶解提纯方法减少杂质的同时，再先后进行蔗糖水解转化、果糖沉淀、葡萄糖氧化，尽可能可能多的去除升血糖因子。

一种从角豆水提取物中提纯D-松醇的方法，所述方法包括以下步骤：

原料预处理：调节原料液角豆水提取物的pH呈酸性；

蔗糖水解转化：原料液中加入蔗糖酶，将蔗糖水解转化为果糖和葡萄糖；

果糖沉淀：将果糖采用沉淀法去除；

葡萄糖氧化：将葡萄糖氧化为葡萄糖酸；

提纯D-松醇：将葡萄糖酸采用层析法分离后，减压浓缩水洗脱液，烘干得到高纯度D-松醇。

进一步，所述提纯D-松醇的方法包括以下步骤：

原料预处理：将原料液稀释后加入醋酸调节pH＝4-5；调节pH达到蔗糖酶催化反应的最佳pH，保证后续蔗糖能尽可能多的水解转化为果糖和葡萄糖；

蔗糖水解转化：将经过预处理的原料液水浴加热至50-60℃后添加蔗糖酶，于150-200rpm的搅拌速率下保温水解，搅拌反应2-4h后，得到水解液；经检测，蔗糖水解率为95-97.6％。

经过蔗糖水解转化后，蔗糖转化为果糖和葡萄糖，升血糖因子含量降低；

果糖沉淀：将水解液加入2-10℃的去离子冷水中，水解液与去离子冷水的体积比为1:(5-7)，搅拌均匀后，再加入过饱和氢氧化钙溶液，于0-10℃的冷库中静置10h，离心，得到的上清液一减压浓缩。

本步骤用氢氧化钙沉淀果糖，此时溶液中剩余大量葡萄糖，升血糖因子含量进一步降低；

葡萄糖氧化：取减压浓缩后的上清液一，稀释后调节pH＝5-6，水浴加热，保温，使上清液一达到酶催化的最佳反应温度后，根据检测的葡萄糖浓度添加葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，搅拌均匀，并同时通入流量为1L/min的氧气或压缩空气，反应时间为12-24h，得到反应液；

提纯D-松醇：反应液经过离子交换树脂进行层析，水洗脱得到含有D-松醇的洗脱液，对洗脱液进行减压浓缩后，烘干得到提纯后的D-松醇；离子交换树脂选用D293阴离子交换树脂；

二次提纯：将得到的D-松醇用去离子水溶解后重复蔗糖水解转化、果糖沉淀、葡萄糖氧化、提纯D-松醇步骤，得到纯度为90％以上的D-松醇。

进一步，所述蔗糖水解转化步骤中，蔗糖酶的添加量为15-25mg/100g原料液。

进一步，所述果糖沉淀步骤中，水解液与过饱和氢氧化钙溶液的体积比为 1:(0.5-1.5)，所述过饱和氢氧化钙溶液的浓度为10-20％。

进一步，所述葡萄糖氧化步骤中，取减压浓缩后的上清液一，稀释至葡萄糖的浓度为10％。

进一步，所述葡萄糖氧化，葡萄糖氧化酶的用量为3.5-4kg/吨葡萄糖，过氧化氢酶的用量为2.5-3kg/吨葡萄糖。

进一步，所述果糖沉淀步骤中，上清液一进行减压浓缩后，向上清液一中加入果糖吸附剂，于200rpm的速率搅拌8-10h，随后将果糖吸附剂过滤，所述果糖吸附剂是火山石活化预处理后进行除杂，再负载钙离子得到的。

进一步，所述果糖沉淀步骤还包括将上清液一减压浓缩至2倍原料液体积，再加入1.5倍原料液体积且浓度为20％的饱和氢氧化钙溶液，搅拌均匀，置于4℃的冷库中静置10h后进行离心，离心后得到的上清液二减压浓缩，葡萄糖氧化步骤中对减压浓缩后的上清液二进行处理。当检测溶液中的果糖沉淀率≤90％时，需要进行再次沉淀，去除溶液中多余的果糖，进一步减少溶液中得果糖含量。

进一步，所述葡萄糖氧化步骤中，水浴加热至温度为34-35℃，保温，进行萄葡糖氧化。

进一步，所述果糖沉淀、葡萄糖氧化、提纯D-松醇步骤中减压浓缩的具体操作为，将上清液抽真空，减压至(-0.06)-(-0.1)Mpa，在低于60℃的环境中使上清液浓缩。优选的温度为55℃。

有益效果:

1、将蔗糖转化为果糖和葡萄糖，将果糖沉淀去除、葡萄糖转化为葡萄糖酸去除，简化步骤，减少杂质，降低升血糖因子的含量，提纯D-松醇。

2、采用安全温和的酶法分步将升血糖因子中的蔗糖和葡萄糖去除，并且转化程度高，还同时避免引入其他杂质和溶剂，提高食用安全性。

3、将升血糖因子安全的转化成葡萄糖酸，与果糖一起作为副产物，提高提纯D-松醇方法的实用程度和开发价值，便于推广。

附图说明

图1是实施例1原料液的谱图；

图2是实施例1去除蔗糖(步骤(2)结束)后的谱图；

图3是实施例1提纯D-松醇后的谱图；

图4是实施例1的对照谱图。

具体实施方式

以下将结合具体实施例本发明进行详细说明：

实施例1：D-松醇提纯一

(1)原料预处理：称取1kg(约1000ml)原料液角豆水提取物，然后取0.5L 蒸馏水进行稀释，将稀释完成的原料液置于反应器中，搅拌均匀，随后用醋酸调节pH＝4-5，搅拌均匀；本实施例采用的角豆水提取物原料液中，含D-松醇约6％，果糖约13％，葡萄糖含量约13％，蔗糖含量约22.3％，经计算原料液中含D-松醇约60g，果糖约130g，葡萄糖含量约130g，蔗糖含量约223g，余量为杂质和水；

(2)蔗糖水解转化：将经过预处理的原料液水进行水浴加热，加热至原料液温度为55℃左右，添加150mg蔗糖酶，保温水解搅拌反应3h后得到水解液，搅拌速率为150rpm；反应完成后测定蔗糖水解率，经检测，蔗糖水解率为96％；

(3)果糖沉淀：将水解液中加入4℃的去离子冷水，水解液与去离子冷水的体积比为1:5，搅拌均匀后，再加入1.5L浓度为20％的冷氢氧化钙溶液，搅拌均匀，于4℃的冷库中静置10h，离心，得到上清液一，经检测，果糖沉淀率为 80％；取上清液一，抽真空，减压至-0.1Mpa，在55℃的环境中使上清液一浓缩至2000ml，再加入1500ml浓度为20％的冷饱和氢氧化钙溶液，搅拌均匀，置于 4℃的冷库中静置10h，离心，离心后得到上清液二，将上清液二抽真空，减压至-0.1Mpa，在55℃的环境中使上清液二减压浓缩，经检测，果糖累积沉淀率为 96％；

(4)葡萄糖氧化：取减压浓缩后的上清液二，将上清液二稀释至2370ml，调节pH＝5-6，搅拌均匀，水浴加热至上清液二温度为34-35℃，保温，检测葡萄糖浓度为10％，添加葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，葡萄糖氧化酶的用量约0.83g，过氧化氢酶的用量为0.59g，搅拌均匀，并同时通入流量为1L/min的氧气，反应时间为12h，得到反应液；经测量，葡萄糖氧化率为96％；

(5)提纯D-松醇：葡萄糖氧化步骤得到的反应液经过D293阴离子交换树脂进行层析，水洗脱得到含有D-松醇的洗脱液，将洗脱液抽真空，减压至-0.1Mpa，在55℃的环境中减压浓缩，随后烘干得到87.9g纯度为68.3％的D-松醇；用浓度为20mol/L的氢氧化钠溶液洗脱葡萄糖酸洗脱液，将葡萄糖酸洗脱液抽真空，减压至-0.1Mpa，在55℃的环境中减压浓缩得到高纯度的葡萄糖酸钠；

(6)二次提纯D-松醇：步骤提纯D-松醇得到的纯度68.3％的D-松醇产品 87.5克用去离子水溶解成200ml溶液，按相应参数重复步骤(2)蔗糖水解转化-(5)提纯D-松醇纯化过程，得到61.1克98％纯度的D-松醇。

实施例2：D-松醇提纯二

D-松醇提纯之前需要先进行果糖吸附剂制备，制备步骤如下：

火山石活化预处理：将200g火山石清洗干净，放入烘箱中于70℃干燥12h，再于480±5℃中煅烧2h，冷却后研磨，过100目筛，得到活化后的火山石；

火山石除杂：将活化后的火山石加入15wt％的柠檬酸溶液中搅拌浸泡10h后用蒸馏水清洗干净，随后再浸入2wt％的氢氧化钠溶液中搅拌浸泡8h，再用蒸馏水清洗干净，自然风干；柠檬酸溶液和氢氧化钠溶液的用量为没过火山石即可；

火山石负载钙离子：将10g乙二胺四乙酸加入去离子水中，搅拌溶解后将除杂后的火山石加入，搅拌30min再加入15g氯化钙，超声搅拌直至氯化钙完全溶解，调剂溶液pH为中性，加入800ml 3wt％的海藻酸钠溶液、300ml 5wt％葡萄糖酸内酯溶液，搅拌均匀，常温下以600rpm的速率搅拌反应10h，随后将火山石取出，于5-6℃的环境下静置2h，静置完成后将火山石于250℃烘烤40min，得到负载有钙离子的火山石。

D-松醇提纯：

(1)原料预处理：称取1kg(约1000ml)原料液角豆水提取物，然后取0.5L 蒸馏水进行稀释，将稀释完成的原料液置于反应器中，搅拌均匀，随后用醋酸调节pH＝4-5，搅拌均匀；本实施例采用的角豆水提取物原料液中，含D-松醇约6％，果糖约13％，葡萄糖含量约13％，蔗糖含量约22.3％，经计算原料液中含D-松醇约60g，果糖约130g，葡萄糖含量约130g，蔗糖含量约223g，余量为杂质和水；

(2)蔗糖水解转化：将经过预处理的原料液水进行水浴加热，加热至原料液温度为55℃左右，添加150mg蔗糖酶，保温水解搅拌反应3h后得到水解液，搅拌速率为150rpm；反应完成后测定蔗糖水解率，经检测，蔗糖水解率为96％；

(3)果糖沉淀：将水解液中加入4℃的去离子冷水，水解液与去离子冷水的体积比为1:5，搅拌均匀后，再加入1.5L浓度为20％的冷氢氧化钙溶液，搅拌均匀，于4℃的冷库中静置10h，离心，得到上清液一，经检测，果糖沉淀率为 80％；取上清液一，抽真空，减压至-0.1Mpa，在55℃的环境中使上清液一浓缩至2000ml，再加入制备的果糖吸附剂，于200rpm的速率搅拌10h，随后量果糖吸附剂过滤干净，经检测，果糖沉淀率为98％；

(4)葡萄糖氧化：取减压浓缩后的上清液一，将上清液一稀释至2370ml，调节pH＝5-6，搅拌均匀，水浴加热至上清液一温度为34-35℃，保温，检测葡萄糖浓度为10％，添加葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，葡萄糖氧化酶的用量约0.83g，过氧化氢酶的用量为0.59g，搅拌均匀，并同时通入流量为1L/min的氧气，反应时间为12h；得到反应液，经测量，葡萄糖氧化率为96％；

(5)提纯D-松醇：葡萄糖氧化步骤得到的反应液经过D293阴离子交换树脂进行层析，水洗脱得到含有D-松醇的洗脱液，将洗脱液抽真空，减压至-0.1Mpa，在55℃的环境中减压浓缩，随后烘干得到86.8g纯度为68.9％的D-松醇；用浓度为20mol/L的氢氧化钠溶液洗脱葡萄糖酸洗脱液，将葡萄糖酸洗脱液抽真空，减压至-0.1Mpa，在55℃的环境中减压浓缩得到高纯度的葡萄糖酸钠；

(6)二次提纯D-松醇：步骤提纯D-松醇得到的纯度69％的D-松醇产品86.5 克用去离子水溶解成200ml溶液，按相应参数重复步骤(2)蔗糖水解转化-(5) 提纯D-松醇纯化过程，得到60.9克98％纯度的D-松醇。

由于氢氧化钙溶液溶解度较小，所以果糖沉淀率大约在80％左右，对于剩下的果糖可以采用吸附的方式进行去除。火山岩具有天然蜂窝多孔结构，且具有惰性，表面带有正电荷，是作为吸附果糖的良好材料，在本发明中选用红色的火山石作为吸附材料。将火山石研磨成颗粒状，过100目筛，既可以提高火山石与果糖的接触面积，又方便过滤。火山石中含有少量的三氧化二铁、三氧化二铝等金属氧化物杂质，为了避免在提纯D-松醇时引入新的杂质，需要对火山石进行除杂，选用比较温和的柠檬酸和浓度比较低的氢氧化钠溶液去除火山石中的金属氧化物，达到除杂的目的。果糖与钙能形成沉淀，所以需要在多孔的火山石内负载钙离子。火山石内部孔隙中充满了乙二胺四乙酸，随后加入过量的氯化钙，乙二胺四乙酸与氯化钙形成络合物作为钙源，随后在中性条件下，葡萄糖酸内酯水解络合物，钙源释放，与海藻酸钠溶液形成凝胶，此时火山石孔隙内充满了含有过量氯化钙的凝胶，在250℃的温度下烘烤后，凝胶脱水约75％，此时火山石的孔隙内形成负载有钙离子的网状空间结构，当果糖通过火山石孔隙时，和钙离子形成沉淀，果糖被进一步去除。

对实施例1进行检测：色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：安捷伦糖分析柱ZORBAX Carbohydrate4.6×250，5um，流速： 1.0ml/min，柱温：35℃，以水A:乙腈B按梯度列表为流动相，具体参数见表1；用蒸发光散射检测器检测，漂移管温度：41℃，气压350-355KPa。理论板数按白果内酯峰计算应不低于2500。

表1

时间，min	A，％	B，％
			0	8	92
20	8	92
			25	20	80
40	20	80
			42	8	92
45	8	92

对照图谱制备：分别称取D-松醇、果糖、葡萄糖、蔗糖四种对照品，加水制成2.0mg/1ml浓度的溶液。

样品溶液的制备：于原料液、步骤(2)结束后、步骤(5)结束后四个操作段分别量取对应的溶液2.0g，精密称定，加水溶解，稀释至50ml，0.45um过滤，即得。

测定法方法：分别精密吸取对照品溶液5ul、10ul、20ul，供试品溶液5-20ul，注入液相色谱仪，测定，用外标三点法对数方程计算D-松醇的含量，即得，按干燥品计算，得到的结果如图1-图4，结果分析如下：

1、对照图谱制备后的结果如图4所示，目的在于确定D-松醇、果糖、葡萄糖、蔗糖各个成分的出图时间，得到的结果为：峰1(约18.574min出峰)D-松醇、峰2(约19.545min出峰)果糖、峰3(约23.796min出峰)葡萄糖、峰4 (约27.531min出峰)蔗糖；

2、根据图1原料液谱图可知，原料液中峰1D-松醇含量最少，峰4蔗糖含量最多，也含有部分峰2果糖、峰3葡萄糖。

3、根据图2去除蔗糖(步骤(2)结束)后的谱图可知，步骤(2)蔗糖水解转化结束后，峰4蔗糖含量明显下降，峰1D-松醇、峰2果糖、峰3葡萄糖含量上升，其中葡萄糖和果糖含量显上升，说明蔗糖经水解后转化为果糖和葡萄糖，基本被去除。

4、根据图3提纯D-松醇后的谱图可知，步骤(5)提纯D-松醇步骤结束后，图中峰1D-松醇最明显，峰2果糖、峰3葡萄糖含量明显下降，说明果糖、葡萄糖基本被去除，实现角豆水提物中D-松醇的提纯。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。