阅读说明：本技术 一种南非2型***病毒vp1基因的可溶性表达方法 (Soluble expression method of south Africa type 2 foot-and-mouth disease virus VP1 gene ) 是由 丁耀忠 汪洋 李国秀 马维民 何继军 李茜 爱斯纳非.科友斯.伍赛特 代军飞 张�杰 于 2019-11-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法,以南非2型口蹄疫病毒基因组(JX014256)为参考序列,在FMDV SAT2的VP1蛋白编码基因上游直接偶联SUMO促溶表达标签编码基因,然后在SUMO的上游引入6个His标签编码基因,再根据大肠杆菌密码子嗜性,优化HisSUMO-SAT2-VP1基因,重组至PUC57质粒,以HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57质粒为模板,设计特异性引物；PCR扩增后利用相同的限制性内切酶酶切目的片段与表达载体,将目的基因克隆入pET32a(+)原核表达载体,构建重组质粒pET32a-HisSUMO-VP1,转入大肠杆菌诱导表达,利用镍柱进行纯化。结果表明HisSUMO-VP1蛋白在大肠杆菌中能可溶性表达,纯化后的目的蛋白具有较好的免疫原性。本发明充分利用His与SUMO标签的优点,不仅提高Ni与组氨酸结合的特异性和稳定性,而且提高重组蛋白纯化效率。(The invention discloses a soluble expression method of a south African type 2 foot-and-mouth disease virus VP1 gene, which takes a south African type 2 foot-and-mouth disease virus genome (JX014256) as a reference sequence, directly couples SUMO solubilizing expression label encoding genes on the upper stream of a VP1 protein encoding gene of FMDV SAT2, introduces 6 His label encoding genes on the upper stream of SUMO, optimizes HisSUMO-SAT2-VP1 gene according to escherichia coli codon tropism, recombines to a PUC57 plasmid, takes HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57 plasmid as a template, and designs a specific primer; after PCR amplification, the target fragment and the expression vector are cut by the same restriction enzyme, the target gene is cloned into a pET32a (+) prokaryotic expression vector, a recombinant plasmid pET32a-HisSUMO-VP1 is constructed, and the recombinant plasmid is transferred into escherichia coli for induced expression and is purified by a nickel column. The result shows that the HisSUMO-VP1 protein can be expressed in Escherichia coli in a soluble way, and the purified target protein has better immunogenicity. The invention fully utilizes the advantages of His and SUMO labels, not only improves the specificity and stability of the combination of Ni and histidine, but also improves the purification efficiency of recombinant protein.)

一种南非2型***病毒VP1基因的可溶性表达方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种南非2型***病毒VP1基因的可溶性表达方法。

背景技术

***(foot-an-mouth disease，FMD)是由***病毒(Foot-an-mouthdisease，FMDV)引起的多种偶蹄动物易感的一种急性、热性、接触性传染病，对世界各地造成毁灭性的危害。FMDV属于小RNA病毒科，FMDV有4种结构蛋白(VP4、VP2、VP3和VP1)和9种非结构蛋白(Lab、Lb、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)。FMDV共有7个血清型，即A型、O型、C型、Asia1型和南非1～3(Southern African Territories，SAT1-3)，各血清型之间无交叉保护力。研究表明，***的VP1是诱导动物机体产生中和抗体的主要结构蛋白，其流行具有一定的地域性，其中，A型、O型和C型在欧洲、美洲、亚洲、非洲地区流行，南非型***流行于撒哈拉沙漠以南的非洲地区。南非型***在中国从未爆发，但由于近两年在中国爆发非洲猪瘟，给中国的养猪业带来巨大的危害，不排除以后南非型***会传播到中国的情况。目前国内主要的研究局限在O型和A型***，缺乏对南非2型***的检测技术及疫苗的研究，为了更好的做好防控工作，本发明开展了对南非2型***的研究。

酵母小泛素相关修饰蛋白(small ubiquitin-related modifier,SUMO)作为融合标签广泛用于提高异源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达，SUMO不仅具有保护重组蛋白不被宿主蛋白酶降解、提高蛋白稳定性、促进蛋白折叠等优点，而且还可通过SUMO蛋白酶将SUMO从作用的靶蛋白切割下来，从而得到天然的目的蛋白。除此之外，我们常用的蛋白标签还有多聚组氨酸标签(His-tag)，该标签可以被Ni-NTA亲和层析树脂吸附，通过不同浓度含咪唑的缓冲液将目的蛋白洗脱实现蛋白纯化。鉴于SUMO作为融合标签的突出优势，可将其加以利用，解决目前VPI蛋白可溶性表达效果差，Ni与组氨酸的结合特异性和稳定性低，以及重组蛋白纯化效率低的缺陷。

发明内容

针对上述背景技术中指出的不足，本发明提供了一种南非2型***病毒VP1基因的可溶性表达方法，旨在解决上述背景技术中现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种南非2型***病毒VP1基因的可溶性表达方法，该方法包括以下步骤：

(1)合成VP1基因

根据GenBank公布的FMDV-SAT2-VII-VP1(JX014256)基因优化序列为参考序列，在FMDV SAT2的VP1蛋白编码基因上游直接偶联SUMO促溶表达标签编码基因，并进而在SUMO的上游引入6个His(组氨酸)标签编码基因，便于纯化目的蛋白，在此基础上，又根据大肠杆菌密码子嗜性，优化HisSUMO-SAT2-VP1基因，重组至PUC57质粒，以HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57质粒为模板，设计特异性引物；

(2)PCR扩增

以HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57重组质粒为模板，进行PCR扩增，PCR扩增体系为50μL：Ex-Taq Mix 25μL，上下游引物各1μL，模板2μL，ddH₂O 21μL；反应程序为：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，进行35个循环，72℃延伸10min；将扩增产物进行凝胶电泳，观察并胶回收目的片段，于-20℃保存；

(3)pET32a-HisSUMO-VP1重组质粒的构建与鉴定

利用EcoR I和Xho I分别对pET32a(+)载体和VP1胶回收目的片段进行酶切，酶切产物进行凝胶电泳，然后胶回收目的片段与载体，并且进行连接，取连接产物转化于E.coliDH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃培养8h，挑取单菌落培养8h，12000r/min离心收菌体，提取质粒，对质粒进行PCR与酶切鉴定并测序；

(4)HisSUMO-VP1重组蛋白的小剂量诱导表达

将鉴定后的阳性质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂板培养后挑取单个菌落接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，200r/min，37℃培养2h，至OD₆₀₀为0.6-1.0时，加入IPTG进行诱导表达，然后取1ml诱导后的菌液于6000r/min离心5min，沉淀用PBS溶液重悬，取样品，100℃煮沸10min；

(5)重组蛋白Ni-NTA树脂纯化

首先将Ni-NTA树脂用10倍含有10mM咪唑的磷酸盐缓冲液平衡树脂数次，对以可溶性形式表达的重组蛋白的上清液与Ni-NTA树脂4℃结合12h，然后用Wash Buffer洗涤杂蛋白，控制流速，最后用Elution Buffer洗涤目的蛋白，分别收集样品。

优选地，步骤(1)中，所述引物的基因序列如下：

上游引物：5‘-CGGAATTCCACCACCATCATCACCAC-3’，划下横线处为EcoR I限制性酶切位点；

下游引物5‘-CCGCTCGAGTTACAGGGTCTGACGCTCAACG-3’，划下横线处为Xho I限制性酶切位点。

优选地，步骤(1)中，所述目的片段的大小为993bp。

优选地，步骤(3)中，所述酶切中所用的酶切体系为：VP1基因PCR胶回收产物或pET32a(+)载体各30μL，10×K Buffer 4μL，EcoR I 3μL，Xho I 3μL，总体体积为40μL，37℃水浴12h。

优选地，步骤(3)中，进行连接时所用的连接体系为：pET32a(+)载体酶切后回收产物6μL，VP1基因酶切后回收产物分别为2μL，T4连接酶1μL，T4 Buffer 1μL，总体体积为10μL。

优选地，进行连接的条件为：16℃过夜连接。

优选地，步骤(4)中，所述IPTG的终浓度为1mmol/L，所述诱导表达的条件为16℃诱导表达12h。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明充分利用His与SUMO标签的优点，设计并优化序列，在其N端依次添加His、SUMO标签，Ni与组氨酸的结合，不仅提高结合特异性和稳定性，而且提高重组蛋白纯化效率。同时SUMO标签实现了重组蛋白的可溶性表达。此外，本实验还摸索纯化条件，且对表达产物进行鉴定，探讨该重组蛋白的反应原性，为后继的VLP的体外组装和建立ELISA等检测方法奠定基础。

附图说明

图1是本发明实施例提供的PCR扩增结果图，图中，M：DNA标准DL2000；1-3：HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57基因PCR扩增产物；4：阴性对照。

图2是本发明实施例提供的重组质粒pET32a-HisSUMO-VP1的鉴定结果图，图中，M：DNA标准DL10000；1：pET32a-HisSUMO-VP1重组质粒PCR扩增产物；2：阴性对照；3：pET32a-HisSUMO-VP1重组质粒；4：pET32a-HisSUMO-VP1酶切产物。

图3是本发明实施例提供的重组质粒pET32a-HisSUMO-VP1在大肠杆菌中诱导表达结果图，图中，M：蛋白分子质量标准；1：pET32a空载体；2：IPTG诱导前；3：IPTG诱导后。

图4是本发明实施例提供的HisSUMO-VP1蛋白不同诱导温度的可溶性表达结果图，图中，M：蛋白分子质量标准；1：pET32a空载体；2：诱导前菌体；3-4：16℃诱导超声破碎后上清与沉淀；5-6：28℃诱导超声破碎后上清与沉淀；7-8：37℃诱导超声破碎后上清与沉淀。

图5是本发明实施例提供的HisSUMO-VP1蛋白不同诱导时间的可溶性表达结果图，图中，M：蛋白分子质量标准；1：pET32a空载体；2：诱导前菌体；3-8：诱导表达时间分别为3h、6h、9h、12h、16h、24h。

图6A是本发明实施例提供的SAT2-VP1重组蛋白纯化SDS-PAGE分析的结果图，图中，M：蛋白分子质量标准；1：上清；2：流穿液；3：E1液；4：E2液；5：E3液；6：E4液；7：E5液；8：：E6液；9：E7液；图6B是本发明实施例提供的重组蛋白Western blot分析的结果图，图中，1：pET32a空载体；2：VP1重组蛋白。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一、材料与方法

1、材料

pET32a(+)载体由中国农业科学院兰州兽医研究所保存，DNA Marker、蛋白Marker、EcoR I、Xho I限制性酶、Ex-Taq DNA聚合酶购于TaKaRa公司，质粒小量提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒都购于AxyPrep公司，异丙基-β-D-硫代半乳糖甘(IPTG)、氨苄西林抗生素购于索莱宝生物公司，抗组氨酸标签(His-Tag)的兔源单克隆抗体购于Abcam公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG购于SIGMA公司，蛋白胨、酵母提取物购自OXOID(英国)公司，Ni-NTA树脂购于QIAGEN公司，感受态细胞BL21(DE3)和DH5α均为本实验室保存，HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57重组质粒由南京金斯瑞生物公司优化合成。

2、VP1基因的合成

根据GenBank公布的FMDV-SAT2-VII-VP1(JX014256)基因优化序列为参考序列，在FMDV SAT2的VP1蛋白编码基因上游直接偶联SUMO促溶表达标签编码基因，然后在SUMO的上游引入6个His标签编码基因，再根据大肠杆菌密码子嗜性，优化HisSUMO-SAT2-VP1基因，重组至PUC57质粒，以HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57重组质粒为模板，设计引物；引物的基因序列如下：

上游引物：5‘-CGGAATTCCACCACCATCATCACCAC-3’，划下横线处为EcoR I限制性酶切位点；

下游引物5‘-CCGCTCGAGTTACAGGGTCTGACGCTCAACG-3’，划下横线处为Xho I限制性酶切位点。引物由西安擎科生物科技有限公司合成。

3、PCR扩增

以HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57重组质粒为模板，进行PCR扩增，PCR扩增体系为50μL：Ex-Taq Mix 25μL，上下游引物各1μL，模板2μL，ddH₂O 21μL；反应程序为：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，进行35个循环，72℃延伸10min；将扩增产物进行凝胶电泳，观察并胶回收目的片段，于-20℃保存。

4、pET32a-HisSUMO-VP1重组质粒的构建与鉴定

利用EcoR I和Xho I分别对pET32a(+)载体和VP1胶回收目的片段进行酶切，所述酶切中所用的酶切体系为：VP1基因PCR胶回收产物或pET32a(+)载体各30μL，10×K Buffer4μL，EcoR I 3μL，Xho I 3μL，总体体积为40μL，37℃水浴12h；酶切产物进行凝胶电泳，胶回收目的片段与载体，并且进行连接，连接体系为：pET32a(+)载体酶切后回收产物6μL，VP1基因酶切后回收产物分别为2μL，T4连接酶1μL，T4 Buffer 1μL，总体体积为10μL，16℃过夜连接。取连接产物转化于E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃培养8h，挑取单菌落培养8h，12000r/min离心收菌体，提取质粒，对质粒进行PCR与酶切鉴定并测序。

5、HisSUMO-VP1重组蛋白的小剂量诱导表达

将鉴定后的阳性质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂板培养后挑取单个菌落接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，200r/min，37℃培养2h，至OD₆₀₀为0.6-1.0时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达，16℃诱导表达12h。然后取1ml诱导后的菌液于6000r/min离心5min，沉淀用PBS溶液重悬，取样品，100℃煮沸10min，将未诱导的菌液做阴性对照进行SDS-PAGE电泳。

6、蛋白质可溶性表达预测

根据公式：

CV＝λ1(N+G+P+S)/n+λ2[(R+K)+(D+E)]/n-0.03|

其中n为蛋白中氨基酸数

N、G、P、S分别为Asn、Gly、Pro、Ser残基的数量

R、K、D、E分别为Arg、Lys、Asp、Glu残基的数量

λ1＝0.202，λ2＝-0.23

CV’＝1.71

可溶性概率＝CV-CV’

判定标准：如果CV-CV’>0不可溶；CV-CV’<0有可能可溶。

将SAT2-HisSUMO-VP1-PUC57测序结果的核酸序列翻译为蛋白质序列代入公式，预测各结构基因在大肠杆菌中可溶性表达的概率。

7、蛋白表达条件的优化

(1)蛋白表达温度的优化

将复苏的菌液扩大培养至50ml LB培养基中，200r/min，37℃培养2h，至OD₆₀₀为0.8时，加入终浓度为1mmol/L IPTG，分别在16℃、28℃、37℃下诱导16h，未诱导菌液与空载体作阴性对照，各取1ml菌液6000rpm/min离心5min收菌，1×PBS悬浮洗涤3遍，对菌体进行SDS-PAGE电泳分析，观察蛋白的表达情况，再对菌体进行超声破碎后，10000rpm/min离心10min收集上清裂解液和沉淀，分别进行SDS-PAGE电泳分析，分析重组蛋白的存在方式。

(2)IPTG诱导时间的优化

在16℃、终浓度为1mmol/L IPTG条件下诱导表达，表达时间分别为3、6、9、12、16、24h，各取1ml菌液离心收集菌体进行SDS-PAGE，分析VP1蛋白的表达量，确定诱导表达的最佳时间。

8、重组蛋白Ni-NTA树脂纯化与Western blot分析

首先将Ni-NTA树脂用10倍含有10mM咪唑的磷酸盐缓冲液平衡树脂数次，对以可溶性形式表达的重组蛋白的上清液与Ni-NTA树脂4℃结合12h，然后用Wash Buffer洗涤杂蛋白，控制流速，最后用Elution Buffer洗涤目的蛋白，分别收集样品。测定含有目的蛋白条带积份的OD₂₈₀值，确定目的蛋白存在于何种积份，最后进行SDS-PAGE分析。

纯化后的VP1重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜，用5％脱脂奶粉室温封闭1h，加抗His-Tag的单克隆抗体(1：2000稀释)于4℃摇床孵育过夜，PBST缓冲液洗涤PVDF膜5遍，每遍10min，再加HRP标记的山羊抗兔(1：5000稀释)于室温摇床孵育1h，PBST缓冲液洗PVDF膜5遍，ECL底物显色试剂避光显色1min，暗室中曝光，同时设pET32a空载体诱导表达菌作为阴性对照。

二、结果分析

1、PCR扩增结果

以HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57基因为模板，用上下游物扩增获得1条约993bp的目的片段，如图1所示，由图可知其与预期结果相符合。

2、重组质粒pET32a-HisSUMO-VP1的鉴定结果

构建的重组质粒pET32a-HisSUMO-VP1经PCR扩增鉴定和酶切鉴定，产物经琼脂糖凝胶电泳，如图2所示，结果显示扩增条带及酶切片段长约获得993bp，与预期片段的大小一致，而阴性对照无目的条带。

3、重组质粒pET32a-HisSUMO-VP1在大肠杆菌中诱导表达结果

将阳性重组质粒pET32a-HisSUMO-VP1转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，16℃诱导表达培养后，经SDS-PAGE结果显示，如图3所示，诱导后的重组菌的分子量约为63kd，与预期表达蛋白的大小一致。

4、蛋白质可溶性表达预测

将测序的核酸序列翻译为蛋白质序列，代入公式中，求得CV-CV’值，预测VP1结构基因在大肠杆菌中可溶性表达的概率，结果如表1所示：

表1 SAT2型FMDV VP1结构基因可溶性表达预测结果

5、HisSUMO-VP1融合蛋白表达条件的优化

为了提高HisSUMO-VP1融合蛋白的表达量，对诱导条件进行优化，主要包括诱导温度与可溶性表达和诱导表达时间等方面。实验结果表明，HisSUMO-VP1重组蛋白均在16℃与28℃主要以可溶性形式存在上清中，且可溶性表达量较大，而在37℃主要以包涵体形式存在沉淀中(如图4)，由此确定表达温度为16℃。优化IPTG的诱导表达时间结果显示，HisSUMO-VP1蛋白第12h的表达量与第16h的表达量接近，因而选定最佳的诱导时间为16h(如图5)。

6、HisSUMO-VP1重组蛋白Ni-NTA树脂纯化与Western blot鉴定结果

Ni-NTA树脂纯化HisSUMO-VP1目的蛋白主要集中于E3积份，其中在E2-E4阶段出现较集中的洗脱峰(如图6A)。表达蛋白经SDS-PAGE电泳分离后转印至PVDF膜，用抗His-Tag单克隆抗体检测反应原性。结果表明，HisSUMO-VP1重组蛋白在63kD处出现特异性的显色条带，而pET32a空载体处无特异性条带。因此，HisSUMO-VP1重组蛋白与抗His-Tag单克隆抗体发生特异性反应，表明具有良好的反应原性(如图6B)。

三、结论

Western blot结果表明HisSUMO-VP1融合蛋白能与抗His单克隆抗体发生特异性反应，因而SUMO融合系统是大规模生产功能性VP1融合蛋白的理想选择。SUMO融合技术已经广泛用于原核表达系统中，而在真核生物中，SUMO标签会被SUMO蛋白酶裂解。研究人员升级了SUMO标签，称为SUMOstar标签，它不仅在真核生物系统中可以抵抗相扑蛋白酶的裂解。而且还可以在酵母、昆虫和哺乳动物细胞中维持增强蛋白表达和溶解性。

本发明通过对SAT2型FMDV的结构基因VP1所翻译的蛋白质进行预测可以发现VP1具有一定可溶性表达，试验结果和预测结果较为一致。成功构建了pET32a-HisSUMO-VP1重组表达载体，在大肠杆菌表达系统中诱导表达出大小约为63kd的HisSUMO-VP1蛋白，而且目的蛋白均以可溶性形式存在，并且重组蛋白与抗His-Tag的单克隆抗体进行Western blot反应呈阳性，表明该重组蛋白具有很好的反应原性。因此，该重组蛋白可被用于SAT2型FMDVLP疫苗的研制，为SAT2型FMDV的防控和诊断奠定了基础。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。