具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；实施例及试验例中所用的各类培养基、试剂、大肠杆菌(E.coli JM109)pIRES-Neo质粒、细胞系试剂、工具酶等均为市售商品。pIRES-neo、pIRES-neo2、pIRES-neo3、pRC/CMV、pEE6.4、pEE12.4、pEGFP-C1、pcDNA3.1、pCHO1.0质粒等均为市售商品。未特别指明的，实施例及试验例中相关操作均为领域内常规技术手段，比如参照Sambrook等编著的分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW.Molecular cloning:a laboratory manual.2001)，或者产品制造厂商提供的说明书等。

实施例1 2A肽基因的合成

该实施例提供了2A肽的基因序列。

根据SEQ ID NO.1所示的口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F2A)氨基酸序列，以及如SEQ ID NO.3所示的马鼻炎A病毒(equine rhinitis A virus,E2A)、如SEQID NO.5所示的点褐翅蛾病毒(Thosea asigna virus,T2A)和如SEQ ID NO.7所示的猪特斯琴病毒(porcine teschovirus,P2A)氨基酸序列；根据CHO细胞密码子偏爱性，设计2A肽基因序列，如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8所示。

实施例2含2A肽基因重组表达载体的构建

该实施例提供包含2A肽编码基因的重组表达载体的构建方法，包括如下步骤：

人工合成SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8，为实现定向克隆，在合成序列的5′端、3′端分别引入StuI(AGGCCT)、AgeI(ACCGGT)酶切位点。

用AgeI/StuI分别双酶切合成的2A序列，同时用AgeI/StuI双酶切pIRES-Neo质粒DNA载体。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的2A序列片段和pIRES-Neo线形质粒DNA。

2A序列的双酶切体系为：2A序列10μL(1μg/μL)，10×CutSmart Buffer 3.0μL，AgeI/StuI(10U/μL)各1.0μL，补足水至30μL；酶切条件为：37℃，酶切3h。

pIRES-Neo质粒的双酶切体系为：pIRES-Neo质粒5μL(1μg/μL)，10×CutSmartBuffer2.0μL，AgeI/StuI(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL；酶切条件为：37℃，酶切3h。

取酶切后的2A序列片段和pIRES-Neo线形质粒DNA(摩尔比5:1)，使用NEB公司^TM的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到大肠杆菌(E.coli)JM109菌株感受态细胞悬液中转化，取150μL转化菌液接种到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养。提取重组质粒并进行双酶切(AgeI/StuI)验证，取酶切验证正确的质粒进行测序验证，构建正确的质粒分别命名为pIRES-F2A、pIRES-E2A、pIRES-T2A、pIRES-P2A。

实施例3 EGFP重组表达载体的构建

本实施例提供含有重组表达载体的工程菌的构建方法，包括如下步骤：

1)PCR扩增EGFP基因

参照pEGFP-C1载体的Enhanced green fluorescent protein(EGFP)基因序列(GenBank：U55763.1，第613～1332位碱基)设计引物P1和P2(用于扩增720bp的EGFP基因DNA)，引物的5′端分别引入EcoRV、NheI酶切位点，引物序列如下所示(下划线处为酶切位点)：

P1：5′-CCGGATATCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′；

P2：5′-CTAACCGGTGGACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′。

以pEGFP-C1质粒(购自美国Clontech公司)为模板，使用引物P1、P2扩增EGFP基因，反应体系见下表1。

表1 PCR扩增体系

反应程序：95℃3min，94℃40s，56～60℃30s，72℃40s，每个退火温度4个循环，最后55℃1min，30个循环，72℃3min。

琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，纯化后送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank公开的EGFP序列完全一致。

2)构建含EGFP序列的表达载体

用EcoRV、NheI双酶切EGFP的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用EcoRV、NheI双酶切pIRES-F2A、pIRES-E2A、pIRES-T2A、pIRES-P2A。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的EGFP序列片段和pIRES-F2A、pIRES-E2A、pIRES-T2A、pIRES-P2A线性质粒DNA。

EGFP序列的酶切体系为：1μL 10×NEB Buffer 2.1，10U/μL EcoRV、NheI酶各0.5μL，1.3μg/μL EGFP扩增产物0.78μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。

质粒的酶切体系为：1μL 10×NEB Buffer 2.1，10U/μL EcoRV、NheI酶各0.5μL，1.0μL质粒pIRES-F2A、pIRES-E2A、pIRES-T2A、pIRES-P2A(1.0μg/μL)，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。

取酶切后的EGFP序列片段和pIRES-F2A、pIRES-E2A、pIRES-T2A、pIRES-P2A线性质粒DNA，用T4连接酶进行连接(连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-F2A、pIRES-E2A、pIRES-T2A、pIRES-P2A线性质粒DNA 200ng，酶切后的EGFP序列片段87.2ng，350U/μL T4连接酶1μL，补足水至20μL)，16℃连接过夜。将连接产物加入E.coli JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pIRES-EGFP-F2A、pIRES-EGFP-E2A、pIRES-EGFP-T2A、pIRES-EGFP-P2A。

实施例4含EGFP及RLuc双顺反子表达载体构建

根据海肾荧光素酶基因(RLuc)序列、如SEQ ID NO.9所示，人工合成RLuc基因，为实现定向克隆，在合成序列的5′端、3′端分别引入EcoRI(GAATTC)、BamHI(GGATCC)酶切位点。克隆到pIRES-EGFP-F2A、pIRES-EGFP-E2A、pIRES-EGFP-T2A、pIRES-EGFP-P2A载体上。

用EcoRI/BamHI分别双酶切合成的RLuc基因序列，同时用EcoRI/BamHI双酶切pIRES-EGFP-F2A、pIRES-EGFP-E2A、pIRES-EGFP-T2A、pIRES-EGFP-P2A质粒DNA载体。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的RLuc基因序列片段和线形质粒DNA。

RLuc基因序列的双酶切体系为：RLuc基因序列10μL(1μg/μL)，10×NEBuffer 2.12.0μL，EcoRI/BamHI(10U/μL)各1.0μL，补足水至20μL；酶切条件为：37℃，酶切3h。

质粒双酶切体系为：质粒5μL(1μg/μL)，10×NEBuffer 2.1 2.0μL，EcoRI/BamHI(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL；酶切条件为：37℃，酶切3h。

取酶切后的RLuc基因序列片段和线形质粒DNA(摩尔比5:1)，使用NEB公司^TM的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到大肠杆菌(E.coli)JM109菌株感受态细胞悬液中转化，取150μL转化菌液接种到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养。提取重组质粒并进行双酶切(EcoRI/BamHI)验证，取酶切验证正确的质粒进行测序验证，构建正确的质粒分别命名为pIRES-EGFP-F2A-RLuc、pIRES-EGFP-E2A-RLuc、pIRES-EGFP-T2A-RLuc、pIRES-EGFP-P2A-RLuc。

实施例5重组抗体表达载体的构建

根据阿达木抗体序列，如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示，人工合成阿达木抗体重链和轻链，采用无缝克隆技术分别替换pIRES-EGFP-F2A-RLuc、pIRES-EGFP-E2A-RLuc、pIRES-EGFP-T2A-RLuc、pIRES-EGFP-P2A-RLuc的RLuc和EGFP序列，构建的载体分别命名为pIRES-LC-F2A-HC、pIRES-LC-E2A-HC、pIRES-LC-T2A-HC、pIRES-LC-P2A-HC。具体由通用生物基因(安徽)有限公司完成。

本发明实施例1提供的2A肽能够应用于哺乳动物重组蛋白的表达，提高重组蛋白的表达量水平，具体的应用方式包括将含有2A肽序列的表达载体，转染至哺乳动物宿主细胞，例如CHO细胞、HEK293细胞等，获得外源目的基因重组蛋白表达系统，培养细胞，即可得到外源目的基因蛋白。下面分别以试验例1～4验证本发明2A肽对哺乳动物重组蛋白表达系统的目的基因表达量水平的影响。

试验例1 eGFP、RLuc瞬时表达结果

为了观察报告基因eGFP和RLuc的瞬时表达效率，对瞬时转染的细胞进行了分析。用含10％胎牛血清的完全培养基培养CHO细胞，待细胞处于对数生长期时，收集细胞以15万/ml接种到24孔板。次日细胞快长满时用1μl脂质体转染试剂转染含有P2A、T2A、E2A、F2A的载体1μg。每种载体转染3个复孔，设置空白对照。将上述细胞放置于培养箱培养48h后置于倒置荧光显微镜下观察eGFP的瞬时转染情况(图1A和B)，用海肾荧光素酶检测试剂盒根据说明书进行裂解细胞后用化学发光仪检测RLuc的瞬时表达(图1C)。实验结果显示，eGFP转染效率E2A(87％)、F2A(91％)高于P2A(83％)、T2A(75％)并且E2A、F2A的RLuc的瞬时表达均高于P2A、T2A。

试验例2 eGFP、RLuc细胞稳定表达水平分析

转染过载体的CHO细胞用含有杀稻瘟菌素(15μg/ml)的DMEM/F12培养基进行加压筛选。待未转染的对照细胞用杀稻瘟菌素完全杀死后，实验组存活的细胞为稳定转染的细胞株，降低培养基杀稻瘟菌素浓度为10μg/ml进行传代扩大培养，培养到20代。用流式细胞仪和化学发光仪分别检测eGFP平均荧光强度(MFI)和RLuc的稳定表达量。

结果如图2所示。转染含有E2A载体的细胞eGFP和RLuc表达量最高，其次是含有F2A、P2A、T2A的载体。E2A和F2A的eGFP、RLuc稳定表达水平高于P2A和T2A。

试验例3阿达木抗体瞬时表达结果

1. 2A肽介导的载体在CHO细胞阿达木抗体瞬时表达水平

按照上述试验例1进行pIRES-LC-F2A-HC、pIRES-LC-E2A-HC、pIRES-LC-T2A-HC、pIRES-LC-P2A-HC转染进入CHO细胞，进行瞬时表达实验，每天细胞计数，培养至第七天收集细胞上清，ELISA检测各组阿达木抗体的表达量，试验结果见图3。

由图3可知，转染pIRES-LC-F2A-HC、pIRES-LC-E2A-HC、pIRES-LC-T2A-HC、pIRES-LC-P2A-HC的CHO细胞阿达木抗体产量分别为66.23mg/L、89.88mg/L、31.88mg/L、46.06mg/L，和试验例1一致，E2A表达量最高，其次是F2A。

2. 2A肽介导的载体在HEK293细胞阿达木抗体瞬时表达水平

按照上述试验例1进行pIRES-LC-F2A-HC、pIRES-LC-E2A-HC、pIRES-LC-T2A-HC、pIRES-LC-P2A-HC转染进入HEK293细胞，进行瞬时表达实验，每天细胞计数，培养至第七天收集细胞上清，ELISA检测各组阿达木抗体的表达量，试验结果见图4。

由图4可知，转染pIRES-LC-F2A-HC、pIRES-LC-E2A-HC、pIRES-LC-T2A-HC、pIRES-LC-P2A-HC的HEK293细胞阿达木抗体产量分别为64.15mg/L、109.56mg/L、41.09mg/L、36.78mg/L，和试验例1一致，E2A表达量最高，其次是F2A。

试验例4阿达木抗体稳定表达结果

1. 2A肽介导的载体在CHO细胞阿达木抗体稳定表达水平

用含浓度为800μg/mL G418的培养基培养细胞，正常CHO细胞(未转染细胞)全部死亡时，换用含500μg/mL G418培养基维持多克隆细胞生长，两周后得到稳定转染的多克隆CHO细胞株。将稳定转染阿达木的多克隆细胞株转入125mL悬浮培养瓶中，初始细胞量为5～6×10⁶个/mL，加入30ml无血清培养基，120rpm悬浮培养。每天细胞计数，并收集细胞上清，用ELISA检测试剂盒测定各组阿达木抗体的表达量，试验结果见图5。

由图5可知，转染pIRES-LC-F2A-HC、pIRES-LC-E2A-HC、pIRES-LC-T2A-HC、pIRES-LC-P2A-HC的CHO细胞阿达木抗体产量分别为177.60mg/L，259.35mg/L、89.52mg/L、105.82mg/L，和试验例2一致，E2A表达量最高，其次是F2A。

2. 2A肽介导的载体在HEK293细胞阿达木抗体稳定表达水平

用含浓度为600μg/mL G418的培养基培养细胞，正常HEK293细胞(未转染细胞)全部死亡时，换用含400μg/mL G418培养基维持多克隆细胞生长，两周后得到稳定转染的多克隆HEK293细胞株。将稳定转染阿达木的多克隆细胞株转入125mL悬浮培养瓶中，加入30ml无血清培养基，120rpm悬浮培养。每天细胞计数，并收集细胞上清，用ELISA检测试剂盒测定各组阿达木抗体的表达量，试验结果见图6。

由图6可知，转染pIRES-LC-F2A-HC、pIRES-LC-E2A-HC、pIRES-LC-T2A-HC、pIRES-LC-P2A-HC的HEK293细胞阿达木抗体产量分别为164.15mg/L，209.56mg/L、76.61mg/L、105.36mg/L，和试验例2一致，E2A表达量最高，其次是F2A。综上所述，实施例1提供了四种2A肽(F2A、E2A、T2A、P2A)，实施例2提供了含有2A肽基因的重组表达载体的构建方法，实施例3-4分别构建了基于F2A、E2A、T2A、P2A的EGFP及Rluc双顺反子表达载体；并通过试验例1-2证明，E2A和F2A能够促进EGFP、Rluc在哺乳动物细胞中稳定的高水平表达，显著提高其表达水平；实施例5分别构建了基于F2A、E2A、T2A、P2A的阿达木抗体重组蛋白表达系统，并通过试验例3-4证明，E2A和F2A能够促进阿达木抗体在哺乳动物细胞中稳定高水平表达，显著提高抗体表达量。由此可知，在哺乳动物细胞中，并非任意2A肽均可提高重组蛋白表达水平，本发明通过试验验证了E2A和F2A的功能，为改善哺乳动物细胞表达系统，进一步提高重组蛋白的表达量、增强细胞株的稳定性、降低生产成本奠定了基础。

<110> 新乡医学院

<120> 一种2A肽、双顺反子表达载体、重组蛋白表达系统及应用

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus）

<221> F2A

<400> 1

Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala

1 5 10 15

Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 2

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> F2A

<400> 2

ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60

tccaaccctg gacct 75

<210> 3

<211> 22

<212> PRT

<213> 马鼻炎A病毒（Equine rhinitis A virus）

<221> E2A

<400> 3

Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp

1 5 10 15

Val Glu Ala Thr Leu Asp

20

<210> 4

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> E2A

<400> 4

ggaagcggac agtgtactaa ttatgctctc ttgaaattgg ctggagatgt tgaagcaacc 60

ctggacct 68

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> 点褐翅蛾病毒（Thosea asigna virus）

<221> T2A

<400> 3

Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

1 5 10 15

Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 6

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> T2A

<400> 6

ggaagcggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctgga 60

cct 63

<210> 7

<211> 22

<212> PRT

<213> 猪特斯琴病毒（Porcine teschovirus）

<221> P2A

<400> 7

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 8

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> P2A

<400> 8

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacct 66

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物P1

<400> 9

ccggatatca tggtgagcaa gggcgaggag 30

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物P2

<400> 10

ctaaccggtg gacttgtaca gctcgtccat gc 32

<210> 11

<211> 936

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Rluc基因

<400> 11

atgacttcga aagtttatga tccagaacaa aggaaacgga tgataactgg tccgcagtgg 60

tgggccagat gtaaacaaat gaatgttctt gattcattta ttaattatta tgattcagaa 120

aaacatgcag aaaatgctgt tattttttta catggtaacg cggcctcttc ttatttatgg 180

cgacatgttg tgccacatat tgagccagta gcgcggtgta ttataccaga ccttattggt 240

atgggcaaat caggcaaatc tggtaatggt tcttataggt tacttgatca ttacaaatat 300

cttactgcat ggtttgaact tcttaattta ccaaagaaga tcatttttgt cggccatgat 360

tggggtgctg tttggcattt cattatagct atgagcatca agataagatc aaagcaatag 420

ttcacgctga aagtgtagta gatgtgattg aattcatggg atgaatggcc tgatattgaa 480

gaagatattg cgttgatcaa atctgaagaa ggagaaaaaa tggttttgga gaataacttc 540

ttcgtggaaa ccatgttgcc atcaaaaatc atgagaaagt tagaaccaga agaatttgca 600

gcatatcttg aaccattcaa agagaaaggt gaagttcgtc gtccaacatt atcatggcct 660

cgtgaaatcc cgttagtaaa aggtggtaaa cctgacgttg tacaaattgt taggaattat 720

aatgcttatc tacgtgcaag tgatgattta ccaaaaatgt ttattgaatc ggacccagga 780

ttcttttcca atgctattgt tgaaggtgcc aagaagtttc ctaatactga atttgtcaaa 840

gtaaaaggtc ttcatttttc gcaagaagat gcacctgatg aaatgggaaa atatatcaaa 900

tcgttcgttg agcgagttct caaaaatgaa caataa 936