一种***病毒抗原、表达***病毒抗原的基因及其重组载体和重组乳酸乳球菌

一种病毒抗原、表达病毒抗原的基因及其重组载体和重组乳酸乳球菌

文档序号：1766433 发布日期：2019-12-03 浏览：22次 >En<

阅读说明：本技术 一种***病毒抗原、表达***病毒抗原的基因及其重组载体和重组乳酸乳球菌 (A kind of foot-and-mouth disease virus antigen, the gene for expressing foot-and-mouth disease virus antigen and its recombinant vector and Recombinant Lactococcus lactis ) 是由潘丽张中旺吕建亮张富东马中元刘新生周鹏王永录张永光于 2019-08-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种口蹄疫病毒抗原、表达口蹄疫病毒抗原的基因TB1-Co1及其重组载体和重组乳酸乳球菌,属于基因工程疫苗技术领域,所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。经动物免疫试验证实,本发明的口蹄疫病毒抗原具有较好的免疫原性。本发明还提供了一种表达上述方案所述口蹄疫病毒抗原的基因TB1-Co1,通过在多表位蛋白的C末端融合M细胞的靶向配体Co1,靶向配体Co1与C5a受体相互作用不仅能够递送连接配体的模型抗原到M细胞,而且也能激发抗原特异性免疫应答包括全身性免疫应答和局部黏膜免疫应答。(The present invention provides a kind of foot-and-mouth disease virus antigen, the gene TB1-Co1 of expression foot-and-mouth disease virus antigen and its recombinant vector and Recombinant Lactococcus lactis, belong to recombinant vaccine technical field, the amino acid sequence of the antigen is as shown in SEQ ID NO:1.It is confirmed through animal immune experiment, foot-and-mouth disease virus antigen of the invention has preferable immunogenicity.The present invention also provides a kind of gene TB1-Co1 of foot-and-mouth disease virus antigen described in expression above scheme, the targeting ligand Co1 of M cell is merged by the C-terminal in multi-epitope albumen, targeting ligand Co1 and C5a receptor interaction can not only deliver the model antigen of linking ligand to M cell, and energy challenging antigen specific immune response includes systemic immune response and local mucosal immune response.)

技术领域

本发明涉及基因工程疫苗技术领域，尤其涉及一种***病毒抗原、表达***病毒抗原的基因TB1-Co1及其重组载体和重组乳酸乳球菌。

背景技术

***(Foot-and-mouth disease，FMD)是由***病毒(Foot-and-mouthdisease virus，FMDV)引起的急性、热性、高度接触性传染病，主要侵害猪、牛、羊等家畜和其它野生偶蹄动物。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和***皮肤发生水疱性疹。***病毒属于小RNA病毒科***病毒属，病毒基因组为单股正链RNA，约8.5kb，有7个血清型，型间无交叉保护。其开放阅读框由L基因、P1结构蛋白基因(包括VP4、VP2、VP3、VP1基因)、P2非结构蛋白基因(包括2A、2B、2C基因)和P3非结构蛋白基因(3A、3B、3C、3D基因)组成。VP1蛋白含有诱导FMD免疫反应的关键表位，包括VP1(21～60aa)、VP1(140～160aa)、VP1(200～212aa)，这些短肽是决定各种亚型FMDV免疫原性的主要抗原决定簇片段。其中，FMDV表面VP1上的140～160位氨基酸多肽链中包含三肽RGD环，它是FMDV吸附感染宿主细胞所必须的氨基酸序列，次位点诱导产生的抗体可封闭FMDV表面的相应位点，阻断FMDV和宿主细胞的结合，对于预防FMDV入侵宿主细胞具有重要意义。

目前研究较热的FMD新型疫苗包括亚单位疫苗、多表位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗和核酸疫苗等。目前大部分发达国家通过灭活苗和扑杀相结合的政策，已经成功消灭了***，但很多发展中国家以及第三世界国家的防制主要采取免疫接种。由于传统***疫苗存在着散毒以及灭活不彻底的风险，许多国家已经禁止使用***灭活苗或弱毒苗，因此，世界各国的相关研究室都在致力于研制安全、有效的新型***疫苗。

黏膜表面积(包括消化道、生殖道和呼吸道黏膜)在体内占有的面积很大，比身体的皮肤表面积大400多倍。黏膜免疫系统是防御外界病原微生物的入侵动物机体的第一道屏障。该系统的淋巴组织不仅在体内分布很广，而且数量也最多。已知黏膜免疫部位的免疫细胞(如T细胞、B细胞)和免疫分子(如SIgA、SIgM)的数量超过全身免疫系统，黏膜免疫系统在防御传染病的发生中发挥的作用将越来越重要。黏膜疫苗经口服、点眼或滴鼻等途径作用于黏膜表面，以此诱导黏膜免疫应答。黏膜免疫的最大优点是可以模拟自然感染途径，直接刺激呼吸道和消化道黏膜下丰富的淋巴组织产生大量的免疫活性细胞和抗体，直接切断病原微生物入侵机体的途径，因此黏膜免疫对阻止由黏膜入侵机体内的病原微生物效果最好。黏膜作为机体与外界连通的门户，对于FMDV的侵入有很大的助力作用。M细胞(microfold cell)或膜细胞(membranous cell)，因细胞游离面有许多微皱褶而得名。M细胞广泛存在于呼吸道和消化道的黏膜中。M细胞的特点是有利于摄取腔中的抗原并及时将抗原呈递给淋巴细胞，诱导局部免疫应答。因此，M细胞是黏膜免疫反应中摄取抗原的第一个细胞，是黏膜相关淋巴组织的初始效应位点。摄取抗原是诱导免疫反应最关键的一步。所以M细胞在病原微生物从呼吸道入侵和黏膜免疫呈递抗原中均发挥重要的作用。最近研究表明，M细胞摄取腔内抗原有3种途径：①非特异性细胞吞噬；②特异性受体介导的吞噬；③树突状细胞通过M细胞向腔内伸出突起，DC有很强的吞噬能力和提呈抗原能力。由于M细胞中没有能降解蛋白质的溶酶体，M细胞对抗原不进行加工处理，M细胞的功能只是将抗原或病原微生物摄取后进行传递。M细胞利用特殊的细胞结构，在十几min以内就可以将抗原传送给附近抗原呈递细胞，经过加工和处理后的蛋白质抗原降解成10到14个氨基酸长度的多肽，再和MHCⅡ类分子结合后呈递给辅助性T淋巴细胞，产生对抗原的局部黏膜免疫反应。

近年来，随着分子生物学的发展和对乳酸乳球菌认识的加深，乳酸乳球菌已用多种蛋白的表达。但是相对于大肠杆菌原核表达系统，乳酸乳球菌表达系统(NICE)有一定的缺陷，主要表现在外源蛋白的表达量较低、某些遗传背景不够清楚、操作比较繁琐、很难实现规模化生产这一技术瓶颈。

发明内容

本发明的目的在于提供一种***病毒抗原、表达***病毒抗原的基因TB1-Co1及其重组载体和重组乳酸乳球菌，本发明旨在克服黏膜疫苗效率低下这一难题，提供一种更加高效的黏膜疫苗。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种***病毒抗原，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了一种表达上述方案所述***病毒抗原的基因TB1-Co1，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选的，所述***病毒为***A型病毒。

本发明还提供了一种包含上述方案所述基因TB1-Co1的重组载体。

优选的，所述重组载体以质粒pNZ8148作为原始载体。

优选的，所述基因TB1-Co1***在质粒pNZ8148上的NcoI和HindⅢ之间。

本发明还提供了一种包含上述方案所述重组载体的重组乳酸乳球菌。

本发明还提供了上述方案所述的重组乳酸乳球菌在制备A型***口服疫苗中的应用。

本发明还提供了上述方案所述的重组乳酸乳球菌在A型***黏膜免疫活载体中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了一种***病毒抗原，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述***病毒抗原的分子量为40kD。经动物免疫试验证实，本发明的***病毒抗原具有较好的免疫原性。本发明还提供了一种表达上述方案所述***病毒抗原的基因TB1-Co1，通过在多表位蛋白的C末端融合M细胞的靶向配体Co1，靶向配体Co1与C5a受体相互作用不仅能够递送连接配体的模型抗原到M细胞，而且也能激发抗原特异性免疫应答包括全身性免疫应答和局部黏膜免疫应答。本发明还提供了一种包含所述基因TB1-Co1的重组载体以及包含该重组载体的重组乳酸乳球菌，虽然黏膜疫苗具有很多其他疫苗所不具备的优势，但是它也存在着许多需要解决的问题：a、饮水或饲喂的免疫过程中，抗原经消化道受到胃酸以及胃蛋白酶的降解，所需的疫苗量大，需二次免疫才能达到预期的效果；b、适合于免疫原性较强的病毒；c、在肠黏膜免疫的过程中目的蛋白需要克服肠上皮屏障；d、黏膜免疫耐受。口服黏膜免疫中，由于抗原会在胃液中降解，所以可以用胶囊或保护性载体来递呈抗原，本发明采用乳酸乳球菌作为活载体递呈目的抗原，最大程度的保护了目的抗原，使得在作用部位(小鼠PP结)时能刺激机体产生有效的免疫应答。对于克服肠上皮的屏障作用，可以通过黏膜免疫增强剂、植物口服载体、靶向M细胞和DC来解决递呈效率的低下的问题。

附图说明

图1是实施例2中重组质粒pNZ8148-TB1和pNZ8148-TB1-Co1的构建路线图；

图2是实施例2中重组质粒pNZ8148-TB1和pNZ8148-TB1-Co1的酶切鉴定图；其中，M：DNA分子质量标准；1～2为重组质粒pNZ8148-TB1经Nco I/HindⅢ双酶切后的产物；3～5为重组质粒pNZ8148-TB1-Co1经Nco I/HindⅢ双酶切后的产物；

图3是实施例3中重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1和NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1表达蛋白的SDS-PAGE图；其中，M为蛋白质分子质量标准；1：诱导的空载体对照；2:未诱导的NZ9000/pNZ8148-TB1；3:未诱导的NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1；4～5:诱导的NZ9000/pNZ8148-TB1；6～7:诱导的NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1)；

图4是实施例3中重组乳酸乳球菌表达蛋白的Western blot检测图；其中，A为经Nisin诱导的重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1表达的目的蛋白；B为经Nisin诱导的重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1表达的目的蛋白；C为经Nisin诱导的乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148表达的蛋白；

图5是实施例4中小鼠肠液中sIgA抗体水平的动态变化图；

图6是实施例4中小鼠肺脏中sIgA抗体水平的动态变化图；

图7是实施例4中小鼠血清中IgG抗体水平的动态变化图；

图8是实施例4中小鼠血清中IgA抗体水平的动态变化图；

图9实施例4中是小鼠外周血中CD4+、CD8+T淋巴细胞的流式细胞术检测图；

图10是实施例4中是小鼠外周血中CD4+、CD8+T淋巴细胞的占比图；

图11是实施例4中小鼠脾脏T淋巴细胞增殖反应图；

图12是实施例4中小鼠血清中IL-5水平的动态变化图；

图13是实施例4中小鼠血清中IFN-水平的动态变化图；

图14是实施例4中目的蛋白TB1和TB1-Co1进入小鼠PP结的电镜图；其中a.TB1经接种小鼠后20min时的PPs电镜图；b.TB1-Co1接种小鼠后20min时的PPs电镜图；c.TB1经接种小鼠后40min时的PPs电镜图；d.TB1-Co1接种小鼠后40min时的PPs电镜图；e.TB1-Co1接种小鼠后60min时的PPs电镜图，每个比例尺代表50μm。

具体实施方式

本发明提供了一种***病毒抗原(重组蛋白)，所述抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示，具体为：MGMKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYAISISEIGKVIVKHIEGIFLLGGGGSGGGGSETQVQRRYHTDVGFLMDRFVQIKPVGPTHVIDLMQTHQHGGGGGSGGGGSQNRRGDLGPLAARLAAQLPASGGGGSGGGGSHKQKIIAPAKQLLGGGGSGGGGSETQVQRRHHTDVSFIMDRFVQIKPVSPTHVIDLMQTHQHGGGGGSGGGGSATRRGDLGSLAARLAAQLPASGGGGSGGGGSATRRGDLGSLAARLAAQLPASGGGGSGGGGSETQVQRRQHTNVGFIMDRFVKIPSQSPTHVIDLMQTHQHGGGGGSGGGGSNAGRRGDLGSLAARVAAQLPAGGGGSGGGGSRHKQRIIAPAKQLGGGGSGGGGSAAIEFFEGMVHDSIKGGGGSGGGGSSFHQLPARSPLP；所述***病毒抗原的分子量约为40kD；所述***病毒抗原具有较好的免疫原性。

本发明还提供了一种表达上述方案所述***病毒抗原的基因TB1-Co1，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，全长为1256bp，具体为(5’-3’)：CCATGGGTATGAAAAAGAAAATTATTTCAGCAATTCTTATGTCTACAGTTATTTTAAGTGCTGCAGCTCCACTTTCAGGTGTTTATGCTATTAGTATTTCAGAAATTAAAGGTGTTATTGTTCATAAAATTGAAACAATTCTTTTTGGAGGAGGTGGATCAGGTGGAGGTGGATCTGAAACACAAGTTCAACGTAGATATCATACTGATGTTGGATTTTTAATGGATCGTTTTGTTCAAATTAAACCAGTTGGACCTACACATGTTATTGATCTTATGCAAACTCATCAACATGGTGGAGGTGGAGGTAGTGGAGGTGGAGGTTCACAAAATCGTAGAGGAGATTTAGGTCCATTAGCAGCTAGATTAGCAGCTCAATTACCTGCATCAGGTGGAGGTGGAAGTGGTGGTGGAGGTTCACATAAACAAAAAATTATTGCACCTGCTAAACAACTTTTGGGTGGTGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTAGTGAAACTCAAGTACAACGTAGACATCATACTGATGTTTCTTTTATTATGGATAGATTTGTACAAATTAAACCAGTTAGTCCAACTCATGTAATTGATTTAATGCAAACACATCAACACGGTGGAGGAGGAGGTTCTGGAGGAGGTGGATCTGCAACAAGACGTGGAGATTTAGGTTCATTAGCAGCTCGTTTAGCAGCTCAATTACCAGCAAGTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGATCTGCTACAAGAAGAGGAGATTTAGGTTCTTTAGCTGCACGATTGGCAGCTCAATTACCTGCTAGTGGAGGTGGAGGAAGTGGAGGTGGTGGTTCAGAAACTCAAGTACAAAGAAGACAACATACTAATGTTGGTTTTATTATGGATCGTTTTGTTAAAATTCCATCTCAAAGTCCAACTCATGTTATTGATTTAATGCAGACACATCAACACGGAGGTGGAGGTGGTTCAGGTGGTGGAGGTTCAAATGCAGGACGTCGTGGTGATTTAGGAAGTTTAGCAGCTAGAGTTGCAGCTCAATTACCAGCTGGTGGAGGTGGTTCAGGAGGTGGAGGTAGTCGTCATAAACAACGTATTATTGCTCCTGCTAAACAATTGGGAGGTGGAGGATCTGGAGGAGGTGGTTCTGCAGCTATTGAATTTTTCGAAGGAATGGTTCATGATAGTATTAAAGGAGGTGGAGGATCAGGTGGAGGTGGTTCATCTTTTCATCAATTACCAGCTAGATCTCCATTACCTTAGAAGCTT。

本发明中，所述基因TB1-Co1是通过在***多表位TB1序列的C端融合了M细胞的靶向配体Co1的序列得到；所述TB1序列是通过将若干多表位基因按照重复串联的策略连接到一起得到；所述TB1序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，全长为1190bp，具体为(5’-3’)：CCATGGGTATGAAAAAGAAAATTATTTCAGCAATTCTTATGTCTACAGTTATTTTAAGTGCTGCAGCTCCACTTTCAGGTGTTTATGCTATTAGTATTTCAGAAATTAAAGGTGTTATTGTTCATAAAATTGAAACAATTCTTTTTGGAGGAGGTGGATCAGGTGGAGGTGGATCTGAAACACAAGTTCAACGTAGATATCATACTGATGTTGGATTTTTAATGGATCGTTTTGTTCAAATTAAACCAGTTGGACCTACACATGTTATTGATCTTATGCAAACTCATCAACATGGTGGAGGTGGAGGTAGTGGAGGTGGAGGTTCACAAAATCGTAGAGGAGATTTAGGTCCATTAGCAGCTAGATTAGCAGCTCAATTACCTGCATCAGGTGGAGGTGGAAGTGGTGGTGGAGGTTCACATAAACAAAAAATTATTGCACCTGCTAAACAACTTTTGGGTGGTGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTAGTGAAACTCAAGTACAACGTAGACATCATACTGATGTTTCTTTTATTATGGATAGATTTGTACAAATTAAACCAGTTAGTCCAACTCATGTAATTGATTTAATGCAAACACATCAACACGGTGGAGGAGGAGGTTCTGGAGGAGGTGGATCTGCAACAAGACGTGGAGATTTAGGTTCATTAGCAGCTCGTTTAGCAGCTCAATTACCAGCAAGTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGATCTGCTACAAGAAGAGGAGATTTAGGTTCTTTAGCTGCACGATTGGCAGCTCAATTACCTGCTAGTGGAGGTGGAGGAAGTGGAGGTGGTGGTTCAGAAACTCAAGTACAAAGAAGACAACATACTAATGTTGGTTTTATTATGGATCGTTTTGTTAAAATTCCATCTCAAAGTCCAACTCATGTTATTGATTTAATGCAGACACATCAACACGGAGGTGGAGGTGGTTCAGGTGGTGGAGGTTCAAATGCAGGACGTCGTGGTGATTTAGGAAGTTTAGCAGCTAGAGTTGCAGCTCAATTACCAGCTGGTGGAGGTGGTTCAGGAGGTGGAGGTAGTCGTCATAAACAACGTATTATTGCTCCTGCTAAACAATTGGGAGGTGGAGGATCTGGAGGAGGTGGTTCTGCAGCTATTGAATTTTTCGAAGGAATGGTTCATGATAGTATTAAATAGAAGCTT；所述TB1序列编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，具体为：MGMKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYAISISEIGKVIVKHIEGIFLLGGGGSGGGGSETQVQRRYHTDVGFLMDRFVQIKPVGPTHVIDLMQTHQHGGGGGSGGGGSQNRRGDLGPLAARLAAQLPASGGGGSGGGGSHKQKIIAPAKQLLGGGGSGGGGSETQVQRRHHTDVSFIMDRFVQIKPVSPTHVIDLMQTHQHGGGGGSGGGGSATRRGDLGSLAARLAAQLPASGGGGSGGGGSATRRGDLGSLAARLAAQLPASGGGGSGGGGSETQVQRRQHTNVGFIMDRFVKIPSQSPTHVIDLMQTHQHGGGGGSGGGGSNAGRRGDLGSLAARVAAQLPAGGGGSGGGGSRHKQRIIAPAKQLGGGGSGGGGSAAIEFFEGMVHDSIK；所述TB1序列具体如下(+代表Linker：GGGGSGGGGS，如SEQ ID NO：5所示，都是结构简单或具有特殊功能的氨基酸，如Gly、Ser、Pro、Ala和Thr，尤其是Gly和Ser最为常用，它们能提供了足够的空间及柔软性)：TB1{Usp45信号肽/通用型辅助性T细胞表位+FMDV/A/MM[VP1(21～60aa)+VP1(140～160aa)+VP1(200～212aa)]+FMDV/A/WHHP[VP1(21～60aa)+VP1(140～160aa)+VP1(140～160aa)]+FMDV/A/AF72[VP1(21～60aa)+VP1(140～160aa)+VP1(200～212aa)]+3A(21～35aa)}。

本发明中，所述基因TB1-Co1具体如下(+代表Linker：GGGGSGGGGS，如SEQ ID NO：4所示)：TB1-Co1{Usp45信号肽/通用型辅助性T细胞表位+FMDV/A/MM[VP1(21～60aa)+VP1(140～160aa)+VP1(200～212aa)]+FMDV/A/WHHP[VP1(21～60aa)+VP1(140～160aa)+VP1(140～160aa)]+FMDV/A/AF72[VP1(21～60aa)+VP1(140～160aa)+VP1(200～212aa)]+3A(21～35aa)+Co1}。本发明所述基因TB1-Co1是根据乳酸菌密码子偏好对该融合基因进行优化得到；本发明具体实施过程中，所述基因TB1-Co1由南京金斯瑞生物技术有限公司全基因合成。

本发明中，所述靶向配体Co1是从噬菌体展示库中筛选出来的，通过与补体C5a受体的相互作用。

本发明中，所述***病毒优选的为***A型病毒。

本发明还提供了一种包含上述方案所述基因TB1-Co1的重组载体；所述重组载体优选的以质粒pNZ8148作为原始载体；所述基因TB1-Co1优选的***在质粒pNZ8148上的NcoI和HindⅢ之间；本发明对构建重组载体的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。

本发明还提供了一种包含上述方案所述重组载体的重组乳酸乳球菌；所述重组乳酸乳球菌的原始菌株优选为乳酸乳球菌NZ9000；所述重组乳酸乳球菌优选的采用以下方法制备获得：将所述重组载体导入到乳酸乳球菌，得到重组乳酸乳球菌；所述导入的方式优选为电转化；所述电转化的电压优选为2500V，电容优选为25μF，电阻优选为200，脉冲时间优选为1.5～5ms。

得到重组乳酸乳球菌后，本发明优选的还包括将重组乳酸乳球菌接种于含10μg/mL氯霉素的GM17液体培养基中，30℃培养至OD值为0.4，并以浓度为5ng/mL乳链菌肽(Nisin)为诱导剂，诱导表达4h得到***病毒抗原。

本发明所用的乳酸乳球菌表达系统(NICE)具有很多优点：a、Nisin是食品级防腐剂，极少量的Nisin即可以诱导外源蛋白的大量表达，而乳酸乳球菌对其有免疫防御功能，生长不会受到抑制；b、表达调控系统严苛，无诱导物时目的蛋白处于不可检测水平，不消耗或消耗极少的细胞资源和不影响细菌的正常生长，这种特性还有利于毒性蛋白的表达；c、可以通过诱导物的量控制蛋白表达水平，诱导物浓度与蛋白产量在一定范围内成线性关系；d、表达的外源蛋白是可溶性的，无包涵体；e、无芽孢等。因此我们可以获得可溶性的外源蛋白表达产物，可以直接用重组乳酸乳球菌进行口服免疫，这样就省去了常规原核表达系统表达后的复杂的纯化过程和复性过程。

本发明还提供了上述方案所述的重组乳酸乳球菌在制备A型***口服疫苗中的应用。

本发明还提供了上述方案所述的重组乳酸乳球菌在A型***黏膜免疫活载体中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1 TB1和TB1-Co1基因的获得

1材料与方法

1.1材料及来源

乳酸乳球菌NZ9000以及表达质粒pNZ8148购于德国MoBiTec，感受态大肠杆菌Top10以及克隆载体pUC57购于南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.2试验方法

1.2.1基因的改造及合成

在真核或原核生物中，蛋白质在翻译合成后，或分泌出细胞外或储存在细胞内。信号肽是蛋白分泌出细胞外的决定因素。信号肽是位于分泌蛋白N端的一段氨基酸序列，通常由21～30个氨基酸残基组成，合成时与分泌肽一同转录和翻译，共同构成前肽，前肽被正确定位后，信号肽被信号肽酶水解，前肽被加工为成熟的蛋白质并实现跨膜运输。信号肽的选择是蛋白质高效分泌的重要因素之一，信号肽没有严格的专一性，Usp45信号肽是一种来自乳酸乳球菌的内源信号肽，为目前已知乳酸乳球菌中引导外源蛋白分泌效率最高的信号肽，是乳酸乳球菌中外源蛋白分泌表达时常用的一种信号肽。

在多表位疫苗的制备中，加入通用型辅助性T细胞表位(promiscuous T helpercell epitope)对诱导机体产生免疫应答是有益的，而且在表位抗原中加入通用型辅助性T细胞表位可以克服不同种类动物和不同个体的MHC限制，能诱导更有效的免疫应答反应。

通过查阅相关文献，选取代表性毒株FMDV/A/MM、FMDV/A/WHHP和FMDV/A/AF72的若干抗原表位，分别为VP1(21～60aa)、VP1(140～160aa)、VP1(200～212aa)和3A(21～35aa)，这些短肽是决定各种亚型FMDV免疫原性的主要抗原决定簇片段，此外，FMDV表面VP1上的140～160位氨基酸多肽链中包含三肽RGD环，它是FMDV吸附感染宿主细胞所必须的氨基酸序列，次位点诱导产生的抗体可封闭FMDV表面的相应位点，阻断FMDV和宿主细胞的结合，对于预防FMDV入侵宿主细胞具有重要意义。

M细胞靶向配体Co1是从噬菌体展示库中筛选出来的，通过与补体C5a受体的相互作用，通过与补体C5a受体的相互作用，不仅能递送与配体结合的模型抗原进入到M细胞，而且能激发抗原特异性免疫应答，包括系统性免疫应答和局部的黏膜免疫应答。在黏膜免疫中，靶向目的抗原能够增强抗原的摄取，这在多表位疫苗的设计中是一个值得重视的因素。

基于以上说明，本实验得到了多表位TB1和TB1-Co1的序列，具体如下(+代表Linker：GGGGSGGGGS)：

TB1{Usp45信号肽/通用型辅助性T细胞表位+FMDV/A/MM[VP1(21～60aa)+VP1(140～160aa)+VP1(200～212aa)]+FMDV/A/WHHP[VP1(21～60aa)+VP1(140～160aa)+VP1(140～160aa)]+FMDV/A/AF72[VP1(21～60aa)+VP1(140～160aa)+VP1(200～212aa)]+3A(21～35aa)}。

TB1-Co1{Usp45信号肽/通用型辅助性T细胞表位+FMDV/A/MM[VP1(21～60aa)+VP1(140～160aa)+VP1(200～212aa)]+FMDV/A/WHHP[VP1(21～60aa)+VP1(140～160aa)+VP1(140～160aa)]+FMDV/A/AF72[VP1(21～60aa)+VP1(140～160aa)+VP1(200～212aa)]+3A(21～35aa)+Co1}。根据乳酸菌密码子偏好对该融合基因进行优化，改造后序列由南京金斯瑞生物技术有限公司全基因合成，克隆到载体pUC57上，受体菌为大肠杆菌Top10，将得到的两株重组菌分别命名为Top10/pUC57-TB1和Top10/pUC57-TB1-Co1，优化序列送上海桑尼公司进行序列测定。

2试验结果

获得的TB1-Co1基因的碱基序列如SEQ ID NO:2所示。

测序结果表明，人工合成的TB1和TB1-Co1与原设计的DNA序列完全相同，共1190bp和1256bp。连接肽Linker为编码10个氨基酸序列(GGGGSGGGGS)，都是结构简单或具有特殊功能的氨基酸，如Gly、Ser、Pro、Ala和Thr，尤其是Gly和Ser最为常用，它们能提供了足够的空间及柔软性。

实施例2重组表达载体pNZ8148-TB1和pNZ8148-TB1-Co1的获得

1材料与方法

1.1材料及来源

限制性内切酶Nco I和HindⅢ、T4 DNA连接酶均购自NEB公司；DNA Marker DL5，000购自大连宝生物公司；溶菌酶购自美国Amresco公司；M17干粉培养基、琼脂粉、葡萄糖均购自英国OXOID公司；质粒小提(革兰氏阴性菌)试剂盒以及DNA凝胶回收试剂盒购自美国OmegaBio-Tek公司；质粒小提(革兰氏阳性菌)试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；克隆载体pUC57由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。

1.2试验方法

实施例1的重组质粒pUC57-TB1和pUC57-TB1-Co1分别以Nco I/HindⅢ双酶切后的小片段，与经同样双酶切的乳酸乳球菌表达载体pNZ8148大片段连接(图1)、转化、溶菌酶裂解法提质粒，用电泳、酶切方法鉴定转化子，得到阳性重组质粒命名为pNZ8148-TB1和pNZ8148-TB1-Co1。

2试验结果

重组质粒pNZ8148-TB1和pNZ8148-TB1-Co1经双酶切的片段与预计大小相符，说明重组质粒构建成功(图2)。

实施例3表达A型***病毒抗原TB1和TB1-Co1重组菌的制备及检测

1材料与方法

1.1材料及来源

(1)诱导物：乳链菌肽(Nisin)购自美国Sigma公司；

(2)抗生素：氨苄霉素(Amr)、氯霉素(Chr)购自美国Amresco公司。

1.2试验方法

1.2.1目的基因在乳酸乳球菌NZ9000中的电转化与抗性菌株的筛选：电转化后的乳酸乳球菌NZ9000置于30℃的恒温水浴锅中复壮3h，然后将1mL的菌液浓缩成200μL涂布于含10μg/mL氯霉素的GM17固体培养基上(密封)，在30℃恒温培养箱中培养48h。将平板上的菌落挑斑后分别于含10μg/mL氯霉素的GM17液体培养基中过夜培养。

1.2.2不同浓度诱导物浓度对目的基因诱导表达的影响：将上述菌液以1:100的接种率接种于含10μg/mL氯霉素的GM17液体培养基中，30℃培养至OD值为0.4(大约3h)，在培养基中加入诱导物Nisin，诱导物的终浓度分别为1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL，确定诱导物的浓度后4h取菌液。同样诱导含有空载体pNZ8148的乳酸乳球菌，作为对照组，诱导结束后分别处理菌体沉淀和培养液上清做电泳分析，通过Westernblot得出最佳的诱导物浓度。

1.2.3表达产物的SDS-PAGE分析：收集菌体沉淀。用预冷的PBS洗涤3次，用适量的PBS重悬菌体沉淀后进行超声破碎，功率为250W，每个循环工作2秒，间隔2秒，共30min。取30μL破碎液加入10μL4×SDS上样缓冲液，吹打混匀。沸水浴10min，冷却后，4℃，12,000×g，离心5min，取上清10ul上样进行SDS-PAGE电泳分析。

1.2.4重组乳酸乳球菌的Western blot检测：取10mL经Nisin诱导的重组乳酸乳球菌超声破碎上清，加入一定体积的上样缓冲液，煮沸10min，按常规法电泳、转印、封闭、漂洗，FMD阳性猪血清室温孵育3h，漂洗后以辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗猪IgG室温振荡孵育2h，漂洗后进行ECL显色。

2试验结果

2.1重组乳酸乳球菌的获得：电转化涂板后所长的菌落在液体培养基中培养，经提取质粒后双酶切鉴定，条带大小合适；实验证明电转化的电压为2500V，电容25μF，电阻200，脉冲时间为1.5～5ms参数是最合适的，电转化效率最高。

2.2不同浓度诱导物浓度对目的基因诱导表达的影响：活化的种子菌以1％接种率接种于含10μg/mL氯霉素的GM17液体培养基中，30℃培养至OD值为0.4，在培养基中加入诱导物Nisin，诱导物浓度在5ng/mL时诱导表达蛋白量最高。

2.3可溶性表达产物：在超声破碎后的菌体上清，通过SDS-PAGE电泳和Westernblot检测到目的蛋白表达，图3初步证明目的蛋白能够表达并且是可溶性蛋白(其中，M为蛋白质分子质量标准；1：诱导的空载体对照；2:未诱导的NZ9000/pNZ8148-TB1；3:未诱导的NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1；4～5:诱导的NZ9000/pNZ8148-TB1；6～7:诱导的NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1)。这样就省去了常规原核表达系统表达后的复杂的纯化过程和复性过程，试验通过对乳酸乳球菌表达系统(NICE)的理想表达条件的探索，为更好利用该系统表达目的蛋白奠定了基础。

2.4重组乳酸乳球菌的Western blot检测：重组乳酸乳球菌的菌体上清经电泳和转膜后，结果显示：表达蛋白能被***病毒阳性猪血清抗体识别，经诱导的重组菌株在约40kD处可见明显的的特异性免疫反应条带，而未诱导的空载体菌株有非常微弱的暗带(图4)。说明目的基因在重组乳酸乳球菌中已表达，且所表达的蛋白具有反应原性。

实施例4动物免疫试验

1材料与方法

1.1材料及来源

诱导的重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1，诱导的重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1，以及乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148；试验用小鼠为Balb/c雌性小鼠，137只，7周龄、体重在18～20g左右，购于中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心；A型***灭活苗购自中农威特生物技术股份有限公司；APC标记的大鼠抗小鼠CD3抗体、RPE标记的大鼠抗小鼠CD4抗体、FITC标记的大鼠抗小鼠CD8抗体、FITC标记的羊抗鼠IgG购自AbDSerotec公司；红细胞裂解液购自美国BD biosciences公司；淋巴细胞分离液购自美国MPbiomedicals公司；ConA、CFSE、DMSO均购自美国sigma公司；HANK’S、RPMI-1640培养基；1M的HEPES缓冲液均购自美国Gibio公司；HRP标记的兔抗羊IgG抗体、羊抗小鼠IgA抗体、HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体、HRP标记的羊抗小鼠IgA抗体均购自美国abcam公司；多聚甲醛购自国药集团化学试剂有限公司；DAPI购自北京中衫金桥生物有限公司。

1.2试验方法

1.2.1动物分组及免疫接种

将Balb/c小鼠随机分成5组，每组25只，分别为PBS空白对照组(A组)、乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148空载体阴性对照组(B组)、重组菌株NZ9000/pNZ8148-TB1组(C组)、重组菌株NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1组(D组)、A型FMDV灭活疫苗阳性对照组(E组)。前4组小鼠进行灌胃免疫，免疫间隔为7天，每次连续免疫3天，每天1次。A型***灭活苗阳性对照组小鼠采用后肢内侧肌肉注射的方法免疫，在首免时免疫一次，然后7天之后再免疫1次。在该试验开始前，需对实验动物禁食禁水6h。具体分组见表1。共免疫三次，每次连续免疫三天，每两次免疫间隔时间为7d，免疫时间点分别为第1/2/3d；11/12/13d和21/22/23d。

表1动物免疫分组情况

1.2.2黏膜样品中(肠液和肺液)sIgA的检测

小鼠灌胃接种后，从五组小鼠中每组随机选取不同时间段(10d、20d、30d、37d、44d、51d)的小鼠各3只采集免疫小鼠的肠黏液和肺液样品以检测sIgA水平。方法如下：

(1)抗原包被：按照1:20的比例用抗原包被稀释液稀释A型FMDV灭活抗原，ELISA板每孔加入100μL的抗原稀释液，4℃包被孵育过夜。

(2)洗涤：取出过夜包被的ELISA板，到掉包被液并拍干，每孔加入200μL的PBST在摇床上振荡洗涤5min，倒掉PBST后拍干继续加入PBST洗板5遍。

(3)封闭：用含5％脱脂奶粉PBST，每孔加入200μL，置于37℃恒温箱中封闭2h，封闭完成后用PBST洗涤5遍并拍干。

(4)上样：每孔加入100μL的小鼠待检样品，每个样品设置复孔对照，37℃孵育1h，用PBST洗涤5遍并拍干。

(5)孵育二抗：每孔加入100μL HRP标记的羊抗小鼠IgA二抗(1:10,000稀释)，置于37℃恒温培养箱中孵育1h，用PBST洗涤5遍并拍干。

(6)显色：每孔加入100μL的TMB显色液，37℃孵育15min；

(7)终止及保存：迅速向每孔加入50μL的终止液终止反应，终止反应15min内在酶标仪上读取450nm波长下的OD值并保存结果。

1.2.3血液中IgA、IgG的检测

每组随机选取免疫后不同时间段(10d、20d、30d、37d、44d、51d)的实验小鼠各3只进行眼眶静脉采血，检测IgA的方法同上。IgG检测方法如下：

(1)抗原包被：按照1:20的比例用抗原包被稀释液稀释A型FMDV灭活抗原，96孔板每孔加入100μL的抗原稀释液，4℃包被孵育过夜。

(2)洗涤：取出过夜包被的96孔板，到掉包被液并拍干，每孔加入200μL的PBST洗板5遍并拍干。

(3)封闭：用含5％脱脂奶粉PBST，每孔加入200μL，置于37℃恒温箱中封闭2h，封闭完成后用PBST洗涤5遍并拍干。

(4)上样：每孔加入100μL的小鼠待检血清样品(1:50稀释)，每个样品设置复孔对照，37℃孵育1h，用PBST洗涤5遍并拍干。

(5)孵育二抗：每孔加入100μL HRP标记的兔抗小鼠IgG二抗(1:1,000稀释)，置于37℃恒温培养箱中孵育1h，用PBST洗涤5遍并拍干。

(6)显色：每孔加入100μL的TMB显色液，37℃孵育15min；

(7)终止及保存：迅速向每孔加入50μL的终止液终止反应，终止反应15min内在酶标仪上读取450nm波长下的OD值。

1.2.4外周血CD4+、CD8+T细胞亚群的检测

采集首免后第30d小鼠的抗凝血500μL，进行CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的检测，具体操作步骤如下：

(1)通过眼球静脉丛采集小鼠抗凝血，按体积比1:1的比例与样本稀释液混匀。

(2)取一支离心管，先加入与稀释后样本等量的分离液，用吸管小心吸取稀释后的血液样本，缓慢轻柔的加到分离液液面上，4℃500×g离心30min。

(3)离心结束后，离心管从上到下分为血浆层、淋巴细胞层、分离液层和红细胞层，用吸管小心吸取第二层的淋巴细胞到标记好的离心管中，加入500μL的清洗液并吹打混匀，4℃250×g离心10min，轻缓的弃掉上清。

(4)用500μL的清洗液重悬离心洗涤细胞，4℃250×g离心10min，轻缓的弃掉上清。

(5)重复步骤(4)。

(6)加入100μL PBS(含0.5％FBS)重悬细胞沉淀，在避光的条件下孵育荧光抗体(4℃30min)：分别为10μLAPC标记的大鼠抗小鼠CD3抗体，10μL FITC标记的大鼠抗小鼠CD8抗体和10μLRPE标记的大鼠抗小鼠CD4抗体，轻轻涡旋混匀。设置空白对照。

(7)用含0.5％FBS的PBS加满离心管，4℃250×g离心10min，弃掉上清。

(8)加入100μL PBS(含0.5％FBS)重悬细胞沉淀，经300目尼龙筛网过滤后，使用流式细胞仪进行检测。

1.2.5脾淋巴细胞增殖试验

将首免后第30d小鼠处死，于75％酒精中短暂浸泡消毒后，在无菌条件下解剖小鼠并取其脾脏后，用适量的RPMI-1640培养基(含10％的FBS、1％双抗)冲洗后将其剪碎，然后置于筛网上，用无菌注射器中的活塞将小鼠脾脏轻轻磨碎。在研磨过程中间不断添加RPMI-1640培养基，制成细胞悬浮液共5mL于细胞培养皿中。向15mL的离心管中加入5mL的小鼠脾脏淋巴细胞分离液，再将5mL细胞悬浮液沿倾斜的管壁缓慢轻柔地加到淋巴细胞分离液的上，4℃500×g离心30min。结束后沿管壁小心的吸取白膜层细胞(脾脏淋巴细胞层)，并转移到另一个无菌的15mL离心管中，加入5mL的清洗液并吹打混匀，4℃500×g离心10min，轻缓的弃掉上清，重复3次。

用RPMI-1640培养基重悬脾脏淋巴细胞沉淀，调整细胞数为1.0×10⁷个/mL，加入到96孔细胞培养板中，每孔100μL。每组设立三个实验组，即阴性对照组：每孔仅加入100μL的RPMI-1640培养基；阳性对照组：每孔加入100μL的ConA溶液(RPMI-1640培养基稀释至终浓度为10μg/mL)；抗原刺激组：每孔加入100μL的A型FMDV灭活抗原(RPMI-1640培养基稀释至终浓度为10μg/mL)，置于37℃、5％CO₂细胞恒温培养箱中培养72h，每孔加入10μL MTS溶液，在酶标仪上读取490nm处的吸光光度值。

1.2.6细胞因子的检测

通过上海酶联商品化的细胞因子ELISA试剂盒检测不同时间段(10d、20d、30d、37d、44d及51d)血清中的细胞因子(IFN-γ，IL-5)的质量浓度。具体步骤如下：

(1)标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。

(2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

(3)加酶：每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外。

(4)温育：用封板膜封板后置37℃温育60min。

(5)配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

(6)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，拍干，每孔加满洗涤液，静置1min后弃去，如此重复5次，拍干。

(7)显色：每孔先加入50μL显色剂A，再加入50μL显色剂B，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15min。

(8)终止：每孔加终止液50μL，终止反应，此时加样孔中的颜色立刻由蓝色变为黄色。

(9)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的OD值，测定应在加终止液后15min以内进行。

1.2.7靶向M细胞的效果验证试验

将12只小鼠随机分为两组，每组6只，一组作为阴性对照，用诱导剂诱导的重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1菌液(109CFU/mL)每只灌胃接种200μL，另一组则接种诱导剂诱导的重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1菌液(109CFU/mL)每只灌胃接种200μL。从接种开始每隔20min从各组中随机选取2只小鼠处死后，取新鲜小肠组织做以下处理：

(1)固定：将新鲜小肠组织切成小块，固定于4％多聚甲醛过夜。凝固组织中的物质成分，尽可能保持其活体时的结构。同时能使组织硬化，有利于切片的进行。

(2)脱水：为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70％、85％、95％直至纯酒精(无水乙醇)，脱水时间分别为3h、2h和1h。固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。

(3)透明：加入透明剂有二甲苯10min，二甲苯是石蜡的溶剂。纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精。材料块在透明剂浸渍过程称透明。

(4)浸蜡：先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1h。先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1h。

(5)包埋：以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定。

(6)切片：切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度。通常切片厚度为4μm，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片。

(7)贴片与烤片：一般使用恒温水浴锅，温度控制在37℃，有利于石蜡切片的展开，贴好的切片置于60℃恒温箱内干燥2小时。

(8)切片脱蜡及水化：干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡10min，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95％、85％、70％进行水化。

(9)染色：将脱蜡后的切片放入染色缸；PBS洗3次，每次5min；将切片浸入5％破膜剂，室温浸泡10min；PBS洗3次，每次5min；滴加10％山羊血清封闭液，室温封闭切片1h；同时孵育一抗，4℃过夜；PBS洗3次，每次5min；滴加FITC标记的IgG二抗，37℃1h；滴加DAPI，室温孵育10min；PBS洗3次，每次5min。使用抗荧光衰减封片剂封片。

(10)照片采集：采用激光共聚焦显微镜进行扫描，光源分别用488nm和561nm波长的激光器激发绿色和红的的荧光，对切片进行图像采集，每张切片先于100倍下观察全部组织，再选取3个视野采集200倍显微图像。

2.试验结果

2.1黏膜样品中(肠液和肺液)sIgA的检测结果

检测结果参见图5和图6，结果显示：PBS组基本保持稳定的水平；乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148组较PBS组的值略高，说明NZ9000/pNZ8148作为抗原递呈的活载体对小鼠的黏膜免疫应答具有一定的促进和增强作用；重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1组和重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1组都诱使小鼠的黏膜免疫系统产生大量的sIgA，但从数据可以看出随着时间的增加，抗体sIgA的水平不断增加，在30d时达到峰值，说明多表位TB1能诱发较强的黏膜免疫。通过差异性分析，重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1组诱导的抗体水平比重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1组的明显要高，差异极显著(P<0.01)。故初步可以说明靶向蛋白Co1的存在可以增加机体对目的蛋白的摄取，从而激发更强的黏膜免疫应答；FMD灭活疫苗组的数值在整个实验周期中变化不大，说明灭活苗几乎不能诱发有效的黏膜免疫应答。因为sIgA是黏膜免疫的重要标志，所以检测sIgA的水平具有重要的意义。

2.2血液中IgG、IgA的检测结果

血清中IgG的实验结果如(图7)所示，乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148组和PBS组几乎不能刺激机体产生体液免疫应答；重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1组和重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1组都诱使机体产生体液免疫应答，而且随着时间的增加，IgG的水平也随之升高，在30d时达到峰值，由于后者比前者增加的快，通过差异性分析，这两组产生的抗体水平差异极其显著(P<0.01)，所以可进一步说明靶向蛋白Co1可增加机体对目的蛋白的摄取以及呈递，诱导机体产生更加有效的体液免应答。虽然重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1组能诱发较强的体液免疫应答，但还是没有灭活苗组产生的IgG水平高。血清中IgA的实验结果如(图8)所示，PBS组和灭活疫苗组对血液中IgA的产生无太大的作用；重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1组和重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1组都诱使机体产生黏膜免疫应答，通过差异性分析发现在免疫后且到第30d达到峰值后逐渐回落，在第44d、51d时两组的抗体水平差异显著(P<0.05)，这说明重组乳酸乳球菌不仅能够诱导小鼠产生黏膜免疫应答，而且也能诱导机体产生体液免疫应答。

2.3外周血CD4+、CD8+T细胞亚群的检测结果

PBS组和乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148组的CD4+含量相比，差异极其显著(P<0.0001)，而与两者的CD8+含量相比发现差异显著(P<0.05)，说明在体液免疫和细胞免疫应答反应中，乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148起着重要的免疫增强作用。与PBS组和乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148组相比，重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1组和重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1组的CD4+、CD8+T淋巴细胞均出现不同程度的增高且以重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1组的增长最高，差异性分析后极其显著(P<0.001)说明多表位蛋白具有良好的免疫原性，且以TB1-Co1为最佳。灭活疫苗能引起较强的体液免疫应答，但却不能诱发明显的细胞免疫应答。由于重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1组和重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1组的CD8+T淋巴细胞的含量比其他组都有一定的增幅，说明它们也能诱导机体产生细胞免疫应答。综合以上实验结果可得出：重组乳酸乳球菌不仅能诱导小鼠机体产生体液免疫应答，也能诱导细胞免疫应答。从CD4+、CD8+T淋巴细胞的含量百分比可以看出，因为CD4+T淋巴细胞的含量明显高于CD8+T淋巴细胞，所以以乳酸乳球菌为活载体的黏膜疫苗诱发的免疫应答主要以体液免疫为主(图9、图10)。

2.4脾淋巴细胞增殖试验结果

采用MTS测小鼠脾淋巴细胞的增殖能力，通过差异性分析，在阴性对照组(RPMI-1640培养基)中NZ9000/pNZ8148-TB1和NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1的脾淋巴细胞增殖无显著性差异，PBS和灭活疫苗的脾淋巴细胞增殖也无显著性差异；在抗原刺激组(A型FMDV灭活抗原)中NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1的脾淋巴细胞增殖明显比NZ9000/pNZ8148-TB1的脾淋巴细胞增殖高，且差异极显著(P<0.01)，NZ9000/pNZ8148-TB1的明显高于灭活疫苗组差异极显著(P<0.001)；在阳性对照组(ConA)中NZ9000/pNZ8148-TB1和NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1的脾淋巴细胞增殖无显著性差异。说明经重组乳酸乳球菌灌胃后的小鼠脾淋巴细胞在遇到FMDV时具有较强的增殖能力，并且以NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1为最优，这对于引发机体产生免疫应答以抵御FMDV具有重要作用(图11)。

2.5细胞因子的检测结果

将不同时间段的小鼠血清进行细胞因子定量检测，图12中在免疫后第10d时NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1的IL-5含量和NZ9000/pNZ8148-TB1的无显著性差异，但其他时间段都有显著差异(P<0.05)；从上述分析中可以得出重组乳酸乳球菌能诱导机体产生有效的体液免疫应答且以NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1引发的效果最好。

从图13中可知重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1组和重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1组的IFN-γ的水平在首免30d后达到最高，之后逐渐降低；PBS组和灭活疫苗组的IFN-γ的水平变化不大；但乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148组的IFN-γ的水平有不同幅度的变化，没有重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1组和重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1组的变化明显。差异性分析可以看出在第20d、44d和第51d时NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1的IFN-γ含量明显高于NZ9000/pNZ8148-TB1的含量，差异显著(P<0.05)；从上述分析可以得出：重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1经灌胃后能更好地诱导机体产生细胞免疫应答，并且而且活载体乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148对细胞免疫具有一定的辅助作用。

2.6靶向M细胞的效果验证结果

通过目的蛋白结合图14小鼠小肠PP结中的M细胞，初步探究M细胞对目的蛋白TB1和TB1-Co1摄取程度的异同。结果表明，当目的蛋白有靶向配体Co1时，可以看出红色荧光和绿色荧光的结合较多，这是因为Co1介导的M细胞靶向与M细胞上的C5aR结合，以此来增强M细胞对目的蛋白的摄取。通过M细胞的呈递，最终引起更为强大的黏膜免疫应答和系统性免疫应答反应。在接种的1h内，重组乳酸乳球菌并没有发生大范围的转移，这一阶段应该是M细胞对多表位蛋白进行消化摄取，从而获得抗原肽的一个过程。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种***病毒抗原、表达***病毒抗原的基因及其重组载体和重组乳酸乳球菌

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 416

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val

1 5 10 15

Ile Leu Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Ile Ser Ile

20 25 30

Ser Glu Ile Gly Lys Val Ile Val Lys His Ile Glu Gly Ile Phe Leu

35 40 45

Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Thr Gln Val Gln

50 55 60

Arg Arg Tyr His Thr Asp Val Gly Phe Leu Met Asp Arg Phe Val Gln

65 70 75 80

Ile Lys Pro Val Gly Pro Thr His Val Ile Asp Leu Met Gln Thr His

85 90 95

Gln His Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asn Arg

100 105 110

Arg Gly Asp Leu Gly Pro Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro

115 120 125

Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Lys Gln Lys

130 135 140

Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln Leu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ser Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg His His Thr Asp Val Ser

165 170 175

Phe Ile Met Asp Arg Phe Val Gln Ile Lys Pro Val Ser Pro Thr His

180 185 190

Val Ile Asp Leu Met Gln Thr His Gln His Gly Gly Gly Gly Gly Ser

195 200 205

Gly Gly Gly Gly Ser Ala Thr Arg Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala

210 215 220

Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Ala Thr Arg Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala Ala

245 250 255

Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

260 265 270

Gly Gly Ser Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asn Val Gly

275 280 285

Phe Ile Met Asp Arg Phe Val Lys Ile Pro Ser Gln Ser Pro Thr His

290 295 300

Val Ile Asp Leu Met Gln Thr His Gln His Gly Gly Gly Gly Gly Ser

305 310 315 320

Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ala Gly Arg Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu

325 330 335

Ala Ala Arg Val Ala Ala Gln Leu Pro Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly

340 345 350

Gly Gly Gly Ser Arg His Lys Gln Arg Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln

355 360 365

Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ile Glu Phe

370 375 380

Phe Glu Gly Met Val His Asp Ser Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly

385 390 395 400

Gly Gly Gly Ser Ser Phe His Gln Leu Pro Ala Arg Ser Pro Leu Pro

405 410 415

<210> 2

<211> 1256

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccatgggtat gaaaaagaaa attatttcag caattcttat gtctacagtt attttaagtg 60

ctgcagctcc actttcaggt gtttatgcta ttagtatttc agaaattaaa ggtgttattg 120

ttcataaaat tgaaacaatt ctttttggag gaggtggatc aggtggaggt ggatctgaaa 180

cacaagttca acgtagatat catactgatg ttggattttt aatggatcgt tttgttcaaa 240

ttaaaccagt tggacctaca catgttattg atcttatgca aactcatcaa catggtggag 300

gtggaggtag tggaggtgga ggttcacaaa atcgtagagg agatttaggt ccattagcag 360

ctagattagc agctcaatta cctgcatcag gtggaggtgg aagtggtggt ggaggttcac 420

ataaacaaaa aattattgca cctgctaaac aacttttggg tggtggaggt tctggaggtg 480

gaggtagtga aactcaagta caacgtagac atcatactga tgtttctttt attatggata 540

gatttgtaca aattaaacca gttagtccaa ctcatgtaat tgatttaatg caaacacatc 600

aacacggtgg aggaggaggt tctggaggag gtggatctgc aacaagacgt ggagatttag 660

gttcattagc agctcgttta gcagctcaat taccagcaag tggaggtgga ggatctggtg 720

gaggtggatc tgctacaaga agaggagatt taggttcttt agctgcacga ttggcagctc 780

aattacctgc tagtggaggt ggaggaagtg gaggtggtgg ttcagaaact caagtacaaa 840

gaagacaaca tactaatgtt ggttttatta tggatcgttt tgttaaaatt ccatctcaaa 900

gtccaactca tgttattgat ttaatgcaga cacatcaaca cggaggtgga ggtggttcag 960

gtggtggagg ttcaaatgca ggacgtcgtg gtgatttagg aagtttagca gctagagttg 1020

cagctcaatt accagctggt ggaggtggtt caggaggtgg aggtagtcgt cataaacaac 1080

gtattattgc tcctgctaaa caattgggag gtggaggatc tggaggaggt ggttctgcag 1140

ctattgaatt tttcgaagga atggttcatg atagtattaa aggaggtgga ggatcaggtg 1200

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<210> 3

<211> 1190

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3