构建三维工程化神经组织的方法、三维工程化神经组织及其用途
阅读说明：本技术 构建三维工程化神经组织的方法、三维工程化神经组织及其用途 (Method for constructing three-dimensional engineered neural tissue, three-dimensional engineered neural tissue and application thereof ) 是由 孟晓婷 王放 董智勇 杜颖珊 于希尧 于 2019-11-10 设计创作，主要内容包括：本发明涉及构建三维工程化神经组织的方法、三维工程化神经组织及其用途。方法。包括以下步骤：一、分离培养动物神经干细胞；二、施加生理电场；将所述步骤一中分离培养出的神经干细胞传代至第5代,取直径100～200μm的神经球离心备用,将基质胶Matrigel冰上预融备用,通过生理电场施加设备连续施加生理电场刺激7天～14天,每天1小时～2小时；三、优化适合工程化神经组织生长的培养液：DMEM/F12,加入1/50 B27,1/100 N2,10～20ng/ml bFGF,1％胎牛血清；四、施加生理电场7～14天,得到三维工程化神经组织。解决了现有神经干细胞在神经组织工程应用过程中存在的神经元分化的数量极少和在三维生长环境中不能诱导神经突起有序生长形成发达的神经网络的技术问题。(The invention relates to a method for constructing a three-dimensional engineered neural tissue, the three-dimensional engineered neural tissue and application thereof. A method. The method comprises the following steps: firstly, separating and culturing animal neural stem cells; secondly, applying a physiological electric field; the neural stem cells separated and cultured in the first step are subcultured to the 5 th generation, neurospheres with the diameter of 100-200 mu m are taken for centrifugation for later use, Matrigel is pre-melted on ice for later use, and physiological electric field stimulation is continuously applied for 7-14 days through physiological electric field applying equipment, wherein the physiological electric field stimulation lasts for 1-2 hours every day; thirdly, optimizing a culture solution suitable for the growth of the engineered nervous tissue: DMEM/F12, adding 1/50B27,1/100N2, 10-20ng/ml bFGF and 1% fetal calf serum; and fourthly, applying the physiological electric field for 7-14 days to obtain the three-dimensional engineering nerve tissue. Solves the technical problems that the quantity of neuron differentiation is very small and neurite can not be induced to grow orderly to form a developed neural network in a three-dimensional growth environment in the application process of the existing neural stem cells in the neural tissue engineering.)
技术领域
本发明涉及构建三维工程化神经组织的方法、三维工程化神经组织及其用途。
背景技术
全球每年大约新增13.3万至26.2万脊髓损伤患者，因病至残、瘫痪所需护理和治疗的经济费用高达上百亿美元，对社会发展造成了巨大的负担。神经系统损伤后导致损伤部位组织崩解、细胞凋亡，相应结构所承载的功能也随之受损或丧失。工程化神经组织是近年兴起的多学科交叉领域，集生物学、材料学、信息学和临床医学于一体。工程化神经组织是以神经细胞为种子细胞，以生物活性材料为支架在体外构建的具有三维组织结构的有序神经组织。工程化神经组织被移植入损伤部位后其中移植的细胞成分会大量存活，形成新生组织并可整合入宿主神经组织，以充填损伤后形成的缺损。同时还可以创造适宜的微环境，为伤者自身的和移植的组织或细胞的再生提供条件，共同影响宿主损伤神经组织的病理改变，改变周边未受损的神经组织对损伤的反应，减慢或降低变性过程。工程化神经组织的构建和临床移植治疗必将为因中枢神经系统损伤而致残的病人和家庭带来新的曙光，有着社会和经济的双重效益。
由于神经组织的极度复杂性，工程化神经组织的研究尚处于起步阶段，目前亟待解决的问题很多，其中包括：种子细胞的组成成份，生物活性材料的三维结构构建、种子细胞与生物材料的复合性，以及三维有序神经组织结构的形成等。目前应用于工程化神经组织的种子细胞包括胚胎干细胞、神经干细胞、星形胶质细胞等。支架材料包括天然聚合物和人工合成的高分子材料、神经营养因子修饰的纳米材料等。
神经干细胞具有在体外增殖与多向分化潜能的特性，可以分化为神经元，星型胶质细胞和少突胶质细胞，是理想的可应用于体外构建工程化神经组织的种子细胞。但神经干细胞在神经组织工程应用过程中，存在的二个较为突出的问题：一个是其在体外自然分化方向主要是向星型胶质细胞分化，而向神经元分化的数量极少；另一个是在三维生长环境中如何诱导神经突起有序生长形成发达的神经网络。
发明内容
本发明提供一种构建三维工程化神经组织的方法，以解决现有神经干细胞在神经组织工程应用过程中存在的神经元分化的数量极少和在三维生长环境中不能诱导神经突起有序生长形成发达的神经网络的技术问题。
为了解决以上技术问题，本发明采取的技术方案是：
一种构建三维工程化神经组织的方法，其特征是，包括以下步骤：
一、分离培养动物神经干细胞；
二、施加生理电场；
将所述步骤一中分离培养出的神经干细胞传代至第5代，取直径100～200μm的神经球离心备用，将Matrigel冰上预融备用，通过生理电场施加设备连续施加生理电场刺激7天～14天，每天1小时～2小时；
三、优化适合工程化神经组织生长的培养液：以“杜氏改良Eagle培养基：营养混合物F-12”(Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12，DMEM/F12)为基础培养基，加入1/50神经细胞培养补充剂B27,1/100神经细胞培养补充剂N2,10～20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，1％胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)。
四、施加生理电场7～14天，得到三维工程化神经组织。
2、如权利要求1所述的构建三维工程化神经组织的方法，其特征是，所述动物为小鼠。
所述步骤一包括以下步骤：
(一)取胚胎14～16天小鼠全脑，放入冷DMEM/F12基础培养基中，解剖镜下移去脑脊膜后将胎脑放入平皿中，用眼科纤维镊子机械切割脑组织成组织碎块，将组织碎块转移到离心管；
(二)离心去上清移除脑脊膜碎片，将剩余的组织碎块中加入神经干细胞生长培养基,用吸管轻柔的吹打分离细胞。静止后将细胞悬液上清通过cell strainer获得单细胞悬液；
(三)调节细胞浓度2～5×104cells/ml,将细胞种到培养瓶中，每3天换一次液，每6～7天传代。
所述步骤二包括以下步骤：
(1)用玻璃刀将22mm×22mm盖玻片切割成相同的两个22mm×11mm小盖玻片(盖玻片1和盖玻片2)，高压灭菌；
(2)用高真空硅脂将所述盖玻片1和盖玻片2平行黏贴在平皿底部中间，确定盖玻片底部均匀的铺满薄层硅脂，保持两个盖玻片之间有1cm～2cm的间距；
(3)以1:10比例将神经球悬液加入基质胶(Matrigel)中，冰上混合均匀后种入内径7mm的模具中，在37℃下静置30分钟，待Matrigel凝固成胶后，取出，进行加电小室构建；
(4)用高真空硅脂将盖玻片3(22mm×22mm)架在盖玻片1和盖玻片2上方，形成顶盖，用眼科镊子轻轻压盖玻片3，使硅脂均匀的黏贴在盖玻片1和盖玻片2上，在三个盖玻片之间形成一个两端开放的半封闭小室；
(5)用硅脂分别在小室开放两端的上方，盖玻片3边缘建筑平行的2道硅脂墙，再用少量硅脂封闭空隙以及连接处，确保除开放端以外，没有其它地方可以通过液体；
(6)小室架构完成后，先加入几滴培养液防止Matrigel风干；
(7)在小室开放端一侧慢慢补充适量的培养液，使得培养液从平皿一侧慢慢通过小室流入另一侧；
(8)将钻有2个直径8mm小孔的平皿盖盖到平皿上，使两个小孔分别在小室开放端的两侧；
(9)准备玻璃桥：直径6mm长26cm的玻璃管高温弯曲成等臂U管，内充以5～10％小牛血清DMEM/F12为溶液配置的2％琼脂胶；
(10)准备2个100ml玻璃瓶，内装50ml 5～10％小牛血清的DMEM/F12，pH 7.4；
(11)2个玻璃桥的一端分别与2个玻璃瓶连接，另一端分别放入平皿盖子上的2小孔；
(12)将无菌的Ag/AgCl电极分别放入2个玻璃瓶中，并分别通过正负电线与直流电源连接；
(13)将直流电源电压设定为‘0’，打开电源，用电压表测量小室两端的电压，调节电压至要求电压值；
(14)每天施加100～150mV/mm生理电场2小时，连续施加7～14天。
所述步骤三中每隔2天更换新鲜培养液。
在采用了上述技术方案后，由于以具有多向分化潜能的动物神经干细胞为种子细胞，以具有良好生物相容性的Matrigel为三维基质支架，创新性的利用生理电场与bFGF的协同作用，优化出能够获得一定数量功能性神经元和神经突起有序生长的培养条件，构建具有发达神经网络的三维工程化神经组织，解决了现有神经干细胞在神经组织工程应用过程中存在的神经元分化的数量极少和在三维生长环境中不能诱导神经突起有序生长形成发达的神经网络的技术问题。为了进一步促进神经突起的生长，本发明采用的技术解决方案是根据神经细胞的生长特性，构建适合三维神经组织生长体外培养体系，使这种培养体系能够与生理电场的刺激协同作用：将两种神经细胞培养补充剂B27和N2分别按1:50和1:100的比例配置，并在培养体系中加入能够促进突起生长的细胞生长因子，10～20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子。再利用生理电场的导向性作用使新生神经元突起在三维生物材料中呈现一定程度的有序生长，构建具有生理结构的工程化神经组织。在生物材料构建三维结构问题上，选择基质胶Matrigel来实现这一构想。因为Matrigel在室温条件下可以聚合形成具有生物活性的三维基质，可以模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化。Matrigel有多种不同直径的孔状结构，表面张力较低；结构稳定性较强，多孔状结构使其具有较大的表面/体积比和较高的空隙率；粘弹性与中枢神经组织相似；可根据修复组织情况任意塑型、可形成具有活体组织结构等优点。目前Matrigel已广泛应用于细胞生长、分化以及组织的损伤修复研究，技术较为成熟有利于产品的快速形成。
本发明还提供了由上述方法获得的三维工程化神经组织。
本发明还提供了上述三维工程化神经组织的用途，用于动物三维工程化神经组织实验研究。
本发明还提供了上述三维工程化神经组织的用途，用于神经系统疾病的体外研究模型。
本发明还提供了上述三维工程化神经组织的用途，用于直接替换动物神经组织。
本发明还提供了上述三维工程化神经组织的用途，用于人类三维工程化神经组织实验研究。
附图说明
图1是不同条件下三维Matrigel支架中的细胞生长状态与细胞网络形成。
图2是Nissl Stains染色检测不同条件下三维Matrigel支架中的细胞生长状态。
图3是生理电场刺激的三维Matrigel支架中细胞活力检测。
图4是生理电场刺激的三维Matrigel支架中细胞凋亡检测。
图5是施加生理电场7天后免疫荧光检测并逐层扫描重建三维神经组织结构。
图6是高倍镜下的逐层扫描重建三维神经组织结构。
图7是透射电子显微镜技术检测工程化神经组织的超微结构。
具体实施方式
本发明提供能够在体外构建出具有一定数量的功能性神经元和神经突起有序生长的三维工程化神经组织：通过100mV/mm～150mV/mm生理电场的作用诱导神经干细胞向神经元分化，获得一定数量的神经元；构建适合三维神经组织生长体外培养体系，简要方法如下：
1.小鼠神经干细胞的分离培养
2.生理电场施加
神经干细胞传代至第5代，取直径100～200μm的神经球离心备用，将Matrigel冰上预融备用。设置生理电场施加设备。
3.连续施加生理电场刺激14天，每天2小时。
4.工程化神经组织培养液：DMEM/F12，加入1/50B27,1/100N2,10～20ng/ml bFGF，1％胎牛血清。
5.施加生理电场7～14天，应用免疫荧光化学染色，电镜技术检测工程化神经组织的细胞结构与组织结构特性。
6.本发明的结果：本发明以小鼠神经干细胞为种子细胞，以Matrigel基质水凝胶为支架，应用生理电场的刺激，诱导Matrigel中的神经干细胞向神经元分化，利用生理电场的导向性作用使新生神经元突起在三维水凝胶中呈现一定程度的有序生长，构建具有生理结构的工程化神经组织。本专利以具有多向分化潜能的小鼠神经干细胞为种子细胞，以具有良好生物相容性的Matrigel为三维基质支架，创新性的应用生理电场导向性作用与bFGF协同引导工程化神经组织的构建，获得有活性的三维培养小鼠神经组织，可以应用于神经系统疾病的体外研究模型，为人类三维工程化神经组织的实验研究奠定基础。
详细方法为：
一、分离培养动物神经干细胞
取胚胎14～16天小鼠全脑，放入冷DMEM/F12基础培养基中，解剖镜下在移去脑脊膜后将胎脑放入35mm平皿中，用眼科纤维镊子机械切割脑组织成组织碎块，将组织碎块转移到15ml离心管，800rpm离心3min去上清以移除脑脊膜碎片。剩余的组织碎块中加入2ml生长培养基：DMEM/F12含20ng/ml bFGF，20ng/ml EGF，1/100N2神经培养补充剂,用1ml吸管轻柔的吹打分离细胞。静止1分钟后将细胞悬液上清通过cell strainer获得单细胞悬液，调节细胞浓度2～5×104cells/ml,将细胞种到25ml培养瓶中，每3天换一次液，每6天传代。
二、施加生理电场
(1)用玻璃刀将22x 22mm盖玻片切割成22x 11mm，高压灭菌；
(2)用高真空硅脂将两个22x 11mm盖玻片平行黏贴在100mm平皿底部中间，确定盖玻片底部均匀的铺满薄层硅脂，2个盖玻片之间间距1cm～2cm；
(3)以1:10比例将神经球悬液加入Matrigel中，冰上混合均匀后种入直径5mm模具中，37℃30分钟，待Matrigel凝固成胶后，取出，进行加电小室构建；
(4)用高真空硅脂将22x 22mm盖玻片架在2个22x 11mm盖玻片上方形成顶盖，用眼科镊子轻轻压22x 22mm盖玻片，使硅脂均匀的黏贴在2个22x 11mm盖玻片上，在三个盖玻片之间形成一个两端开放的封闭小室；
(5)用硅脂分别在小室开放两端的上方，22x 22mm盖玻片边缘建筑平行的2道硅脂墙，再用少量硅脂封闭空隙以及连接处，确保除开放端以外，没有其它地方可以通过液体；
(6)小室架构完成后，先加入几滴培养液防止Matrigel风干；
(7)在小室开放端一侧慢慢补充适量的培养液，使得培养液从平皿一侧慢慢通过小室流入另一侧；
(8)将钻有2个直径8mm小孔的平皿盖盖到平皿上，使两个小孔分别在小室开放端的两侧；
(9)准备玻璃桥：直径6mm长26cm的玻璃管高温弯曲成等臂U管，内充以5～10％小牛血清DMEM/F12为溶液配置的2％琼脂胶；
(10)准备2个100ml玻璃瓶，内装50ml 5～10％小牛血清的DMEM/F12，pH 7.4；
(11)2个玻璃桥的一端分别与2个玻璃瓶连接，另一端分别放入平皿盖子上的2小孔；
(12)将无菌的Ag/AgCl电极分别放入2个玻璃瓶中，并分别通过正负电线与直流电源连接；
(13)将直流电源电压设定为‘0’，打开电源，用电压表测量小室两端的电压，调节电压至要求电压值；
(14)每天施加100～150mV/mm 2小时，连续施加7～14天；
三、优化适合工程化神经组织生长的培养液：以“杜氏改良Eagle培养基：营养混合物F-12”(Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12，DMEM/F12)为基础培养基，加入1/50神经细胞培养补充剂B27,1/100神经细胞培养补充剂N2,10-20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，1％胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)。每隔2天更换新鲜培养液。
四、施加生理电场7～14天，得到三维工程化神经组织。
构建结果
1.神经球种植密度的优化：筛选出体外应用神经干细胞构建三维神经组织的细胞种植密度及Matrigel最适厚度。
不同于二维培养，具有一定三维结构的工程化神经组织在体外的培养必须解决支架内细胞的营养供给和细胞代谢产物的***。细胞种植密度起着关键作用。过低或过高的细胞密度都会影响支架内细胞存活与活力。
我们将培养获得直径100～200μm的神经球以10个/mm3,20个/mm3,30个/mm3 3个梯度分别接种于～150微米，体积25μl、～300微米，体积50μl和～500微米厚，体积70μl的Matrigel中，每个培养体系设置3个平行对照，培养7天后，利用倒置相差显微镜观察细胞生长状态及突起生长状态，观察发现神经球接种密度过低则细胞突起之间不易形成网络，密度过高则影响细胞存活质量，Matrigel厚度过厚细胞生长杂乱不易观察，如图1所示。应用Nissl Stains检测试剂盒检测工程化神经组织内细胞生长及凋亡情况，发现以20个/mm3的密度接种于300微米厚度的Matrigel中的神经元及突起生长最为良好，如图2所示。筛选出体外应用神经干细胞构建三维神经组织的细胞种植密度及Matrigel最适厚度。
2.工程化神经组织培养条件的优化：
为获得具有三维有序生长的神经组织，我们首先筛选适合三维神经组织的培养基。实验观察发现只含有10％胎牛血清的培养基无法为具有一定厚度的三维组织提供充足营养。因此，我们针对神经组织细胞的生长特性，在培养基内加入神经细胞培养补充剂和成纤维细胞生长因子bFGF-BNb：即以DMEM/F12为基础培养基，加入1/50B27,1/100N2,10～20ng/ml bFGF，以及1％胎牛血清，这种含有bFGF的培养体系，能够与生理电场协同作用，促进神经细胞的分化以及突起生长，能够获得具有发达神经网络的三维神经组织。
(1)细胞活力与凋亡检测：应用Live/Dead与TUNEL检测试剂盒检测工程化神经组织内细胞活力与凋亡情况。
我们应用150mV/mm生理电场刺激三维神经组织，检测生理电场的刺激是否影响细胞的存活与生长，7天后应用荧光live/dead检测试剂盒与细胞凋亡检测试剂盒分别检测细胞活力与细胞凋亡情况。结果表明，细胞活力如图3所示以及凋亡如图4所示，与无生理电场刺激组相比没有明显差异，说明生理电场的刺激不影响神经细胞的存活与生长。
图1中红色荧光为死细胞，绿色荧光为活细胞
图2中蓝色荧光为DAPI标记的细胞核，绿色荧光为FITC标记的凋亡细胞
(2)组织学检测：
Tuj1：Tubulinβ3是神经元特异性标记物；GFAP：glial fibrillary acidicprotein是星型胶质细胞特异性标记物。抗Tuj1和GFAP免疫荧光化学染色后，共聚焦激光显微镜下检测神经干细胞分化为神经元的比例及神经元突起的生长；逐层扫描重建三维神经组织结构,检测细胞在支架中的分布、形态、突起延伸程度及神经网络的形成。
激光共聚焦显微镜逐层扫描重建三维神经组织结构,检测细胞在支架中的分布、形态、突起延伸程度及神经网络的形成：可见在生理电场刺激7天后，神经干细胞分化为Tuj1阳性神经元的数量明显高于无生理电场刺激组，对照组10％FBS细胞多分化为GFAP阳性星型胶质细胞；但单纯生理电场刺激虽然能够获得较多数量的神经元，却没有形成发达的神经突起。当生理电场刺激的细胞在BNb培养液中生长，生理电场与bFGF协同作用，获得了发达的细胞突起，并且细胞之间形成发达的神经网络，如图5所示。三维重建后，测量培养的神经组织在100μm～150μm之间，如图6所示。
(3)透射电子显微镜技术检测工程化神经组织的超微结构
透射电子显微镜下观察生理电场与bFGF协同作用下构建的三维工程化神经组织，可见组织内的细胞超微结构和细胞之间的连接。我们观察到具有神经元特征性超微结构的细胞，增厚的细胞膜如图7A所示；细胞之间形成的突触连接，突触内大量的突触小泡如图7B所示。
本发明还提供了一种三维工程化神经组织，由上述构建三维工程化神经组织的方法构建而成。
本发明还提供了上述三维工程化神经组织的用途，应用于神经系统疾病的体外研究模型。
本发明还提供了上述三维工程化神经组织的用途，用于动物三维工程化神经组织实验研究。
本发明还提供了上述三维工程化神经组织的用途，用于直接替换动物神经组织。
本发明还提供了上述三维工程化神经组织的用途，用于人类三维工程化神经组织实验研究。