阅读说明：本技术 一种用于神经干细胞快速扩增的培养基 (Culture medium for rapid amplification of neural stem cells ) 是由 胡俊杰 于 2019-11-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种用于神经干细胞快速扩增的培养基,所述培养基包括：基础培养基和营养成分,基础培养基为DMEM与F12的混合液,营养成分包括：葡萄糖、谷氨酰胺、NaHCO<Sub>3</Sub>、青霉素、链霉素、胰岛素、转铁蛋白、黄体酮、腐胺和硒。本发明中的培养基中含有胰岛素和硒,胰岛素对于细胞的存活和生长有重要作用,为细胞的存活和生长提供了充分的营养物质,同时,硒是谷胱甘肽产生的合作因子,有助于过氧化物和超氧化物的水解,可以防止细胞的损伤,为细胞的存活和快速增殖提供了有利的条件,保证了其完整性,在使用方法中对培养基使用CO<Sub>2</Sub>进行平衡,添加了多次培养基,保证了培养基中营养物质的充分性,且培养基的含量逐次减半,节省了资源。(The invention discloses a culture medium for rapid expansion of neural stem cells, which comprises: the culture medium comprises a basic culture medium and nutrient components, wherein the basic culture medium is a mixed solution of DMEM and F12, and the nutrient components comprise: glucose, glutamine, NaHCO 3 Penicillin, streptomycin, insulin, transferrin, progesterone, putrescine and selenium. The culture medium of the invention contains insulin and selenium, wherein the insulin plays an important role in the survival and growth of cells, provides sufficient nutrient substances for the survival and growth of the cells, and simultaneously, the selenium is a cooperative factor generated by glutathione, is beneficial to the hydrolysis of peroxide and superoxide, can prevent the damage of the cells, provides favorable conditions for the survival and rapid proliferation of the cells, ensures the integrity of the cells, and uses CO to the culture medium in the using method 2 The balance is carried out, the multiple culture medium is added, the sufficiency of nutrient substances in the culture medium is ensured, the content of the culture medium is gradually reduced by half, and resources are saved.)

一种用于神经干细胞快速扩增的培养基

技术领域

本发明涉及神经干细胞领域，具体的是一种用于神经干细胞快速扩增的培养基。

背景技术

神经干细胞是指存在于神经系统中，具有分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，从而能够产生大量脑细胞组织，并能进行自我更新，并足以提供大量脑组织细胞的细胞群。神经干细胞的***能力强，在进行培养时，需要长时间存在于培养基中进行生长。

现有的培养基中营养成分单一，给神经干细胞的增殖带来了不利的生存环境，在相同时间内增殖的数量低，增殖的干细胞质量差，不利于后期的研究或者使用。同时，培养基中的营养成分并没有保护细胞的功能，增殖后的干细胞容易死亡，也给其他干细胞的存活带来了不理的环境。

发明内容

为解决上述背景技术中提到的不足，本发明的目的在于提供一种用于神经干细胞快速扩增的培养基，本发明中的培养基中含有胰岛素和硒，胰岛素对于细胞的存活和生长有重要作用，为细胞的存活和生长提供了充分的营养物质，同时，硒是谷胱甘肽产生的合作因子，有助于过氧化物和超氧化物的水解，可以防止细胞的损伤，为细胞的存活和快速增殖提供了有利的条件，保证了其完整性；

同时，本发明培养基的使用方法中对培养基使用CO₂进行平衡，保证了培养基的平衡性，同时，添加了多次培养基，保证了培养基中营养物质的充分性，且培养基的含量逐次减半，节省了资源。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种用于神经干细胞快速扩增的培养基，所述培养基包括：基础培养基和营养成分；

所述基础培养基为DMEM与F12的混合液，体积比为1:1；

所述营养成分包括：葡萄糖、谷氨酰胺、NaHCO₃、青霉素、链霉素、胰岛素、转铁蛋白、***、腐胺和硒。

进一步地，所述营养成分的各组份之间的含量为：葡萄糖6-15g/L，谷氨酰胺3*10^{- 3}mol/L-8*10^-3mol/L，NaHCO₃ 5*10^-3mol/L-12*10^-3mol/L，青霉素60-90mg/ml，链霉素65-85mg/ml，胰岛素2.8-3.5μg/ml，转铁蛋白130-250ng/ml，***8*10^-9mol/L-15*10^-9mol/L、腐胺30*10^-6mol/L-50*10^-6mol/L，硒50*10^-9mol/L-60*10^-9mol/L。

进一步地，所述营养成分的各组份之间的含量为：葡萄糖10g/L，谷氨酰胺5*10^{- 3}mol/L，10*10^-3mol/L，青霉素75mg/ml，链霉素75mg/ml，胰岛素3.0μg/ml，转铁蛋白190ng/ml，***12*10^-9mol/L、腐胺40*10^-6mol/L，硒55*10^-9mol/L。

一种用于神经干细胞快速扩增的培养基的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：

一、将培养基置于无菌箱中，使用CO₂进行平衡30-40分钟；

二、将神经干细胞放置在培养基内培养，静置培养5-10小时；

三、向无菌箱内再次加入步骤一中的培养基，重复步骤二，如此反复多次，添加培养基的次数为3-5次；

四、待神经干细胞细胞达到85-92％融合度后消化，按照1:2或者1:4比例传代培养，制得神经干细胞。

进一步地，所述步骤一中的CO₂浓度为5％-10％，温度为32-34℃。

进一步地，所述步骤二中每隔2小时将无菌箱内温度升温0.5℃，直至温度升高至36.5-37.5℃。

进一步地，所述步骤三中添加的培养基的含量逐次减半。

本发明的有益效果：

1、本发明中的培养基中含有胰岛素和硒，胰岛素对于细胞的存活和生长有重要作用，为细胞的存活和生长提供了充分的营养物质，同时，硒是谷胱甘肽产生的合作因子，有助于过氧化物和超氧化物的水解，可以防止细胞的损伤，为细胞的存活和快速增殖提供了有利的条件，保证了其完整性；

2、本发明培养基的使用方法中对培养基使用CO₂进行平衡，保证了培养基的平衡性，同时，添加了多次培养基，保证了培养基中营养物质的充分性，且培养基的含量逐次减半，节省了资源。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

一种用于神经干细胞快速扩增的培养基，培养基包括：基础培养基和营养成分，其中基础培养基为DMEM与F12的混合液，体积比为1:1；营养成分包括：葡萄糖、谷氨酰胺、NaHCO₃、青霉素、链霉素、胰岛素、转铁蛋白、***、腐胺和硒。

实施例1：

取基础培养基1L，营养成分的各组份之间的含量为：葡萄糖6g/L，谷氨酰胺3*10^{- 3}mol/L，NaHCO₃5*10^-3mol/L，青霉素60mg/ml，链霉素65mg/ml，胰岛素2.8μg/ml，转铁蛋白130ng/ml，***8*10^-9mol/L、腐胺30*10^-6mol/L，硒50*10^-9mol/L。

将上述培养基用于神经干细胞的制备，包括以下步骤：

一、将培养基置于无菌箱中，使用CO₂进行平衡30-40分钟，CO₂浓度为5％-10％，温度为32-34℃；

二、将神经干细胞放置在培养基内培养，每隔2小时将无菌箱内温度升温0.5℃，直至温度升高至36.5-37.5℃，静置培养5-10小时；

三、向无菌箱内再次加入步骤一中的培养基，重复步骤二，如此反复多次，添加培养基的次数为3-5次，添加的培养基的含量逐次减半；

四、待神经干细胞细胞达到85-92％融合度后消化，按照1:2或者1:4比例传代培养，制得神经干细胞。

实施例2：

取基础培养基1L，营养成分的各组份之间的含量为：葡萄糖15g/L，谷氨酰胺8*10^{- 3}mol/L，NaHCO₃12*10^-3mol/L，青霉素90mg/ml，链霉素85mg/ml，胰岛素3.5μg/ml，转铁蛋白250ng/ml，***15*10^-9mol/L、腐胺50*10^-6mol/L，硒60*10^-9mol/L。

将上述培养基用于神经干细胞的制备，包括以下步骤：

一、将培养基置于无菌箱中，使用CO₂进行平衡30-40分钟，CO₂浓度为5％-10％，温度为32-34℃；

二、将神经干细胞放置在培养基内培养，每隔2小时将无菌箱内温度升温0.5℃，直至温度升高至36.5-37.5℃，静置培养5-10小时；

三、向无菌箱内再次加入步骤一中的培养基，重复步骤二，如此反复多次，添加培养基的次数为3-5次，添加的培养基的含量逐次减半；

四、待神经干细胞细胞达到85-92％融合度后消化，按照1:2或者1:4比例传代培养，制得神经干细胞。

实施例3：

取基础培养基1L，所述营养成分的各组份之间的含量为：葡萄糖10g/L，谷氨酰胺5*10^-3mol/L，10*10^-3mol/L，青霉素75mg/ml，链霉素75mg/ml，胰岛素3.0μg/ml，转铁蛋白190ng/ml，***12*10^-9mol/L、腐胺40*10^-6mol/L，硒55*10^-9mol/L。

将上述培养基用于神经干细胞的制备，包括以下步骤：

一、将培养基置于无菌箱中，使用CO₂进行平衡30-40分钟，CO₂浓度为5％-10％，温度为32-34℃；

二、将神经干细胞放置在培养基内培养，每隔2小时将无菌箱内温度升温0.5℃，直至温度升高至36.5-37.5℃，静置培养5-10小时；

三、向无菌箱内再次加入步骤一中的培养基，重复步骤二，如此反复多次，添加培养基的次数为3-5次，添加的培养基的含量逐次减半；

四、待神经干细胞细胞达到85-92％融合度后消化，按照1:2或者1:4比例传代培养，制得神经干细胞。

对比例：

取基础培养基1L，所述营养成分的各组份之间的含量为：葡萄糖10g/L，谷氨酰胺5*10^-3mol/L，10*10^-3mol/L，青霉素75mg/ml，链霉素75mg/ml，转铁蛋白190ng/ml，***12*10^-9mol/L、腐胺40*10^-6mol/L。

将上述培养基用于神经干细胞的制备，包括以下步骤：

一、将培养基置于无菌箱中，使用CO₂进行平衡30-40分钟，CO₂浓度为5％-10％，温度为32-34℃；

二、将神经干细胞放置在培养基内培养，每隔2小时将无菌箱内温度升温0.5℃，直至温度升高至36.5-37.5℃，静置培养5-10小时；

三、向无菌箱内再次加入步骤一中的培养基，重复步骤二，如此反复多次，添加培养基的次数为3-5次，添加的培养基的含量逐次减半；

四、待神经干细胞细胞达到85-92％融合度后消化，按照1:2或者1:4比例传代培养，制得神经干细胞。

分别使用实施例1-3和对比例中的含量得到神经干细胞，然后使用显微镜观察，观察结果如下：

实施例1-3中得到的神经干细胞数量正常，对比例中得到的神经干细胞数量明显低于实施例1-3中得到的神经干细胞数量，且对比例中存在一定数量的死亡后干细胞。

对比例中的含量缺少胰岛素和硒，胰岛素对于细胞的存活和生长有重要作用，为细胞的存活和生长提供了充分的营养物质。同时，硒是谷胱甘肽产生的合作因子，有助于过氧化物和超氧化物的水解，可以防止细胞的损伤，为细胞的存活和快速增殖提供了有利的条件，保证了其完整性。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。