阅读说明：本技术 高效分离人脑组织来源的神经干细胞的方法 (The method for efficiently separating the neural stem cell in human brain tissue source ) 是由 朱景敏 南炫 南都铉 洪丞彻 延济英 于 2018-02-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及培养和分离神经干细胞的方法,通过该方法神经干细胞可以大规模快速增殖并高效分离,以及涉及由其培养和分离的中风患者来源的人成体神经干细胞,其用于移植。(The present invention relates to cultivating and the method for separation neural stem cell, it extensive fast breeding and can be efficiently separated by this method neural stem cell, and be related to people's adult neural stem cell by its culture and isolated paralytic source, be used to transplant.)

高效分离人脑组织来源的神经干细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种培养神经干细胞并高效分离神经干细胞的方法，以及由此培养和分离的用于移植的人成体神经干细胞。

背景技术

中风被定义为脑组织血流紊乱。这可能是大脑特定部位的病症，或者例如，可能是当心脏泵血完全受损时，所有血流显著减少。更常见的是，当通过大脑的血管堵塞或破裂而中断到大脑特定部位的血流时，就会发生中风。血管阻塞通常发生在向大脑供血的动脉中，例如，通过形成栓塞或血栓发生，这被称为缺血性中风。

中风是发达国家的第三大死亡原因。在美国，由于中风死亡而导致的治疗费用和生产力损失估计约为40万亿美元。同时，有效治疗中风的唯一方法是施用血栓溶解剂，例如组织纤溶酶原激活物(t-PA)，其酶促裂解产生血栓的蛋白质以消除血栓。然而，t-PA的施用可能在太晚时引起诸如出血之类的副作用，因此t-PA可能仅在第一症状出现后3小时内施用。此外，t-PA仅可用于缺血性中风，并且当施用于出血性中风时，通常可发生诸如死亡之类的副作用。这些中风治疗方法仅用于紧急治疗或延迟疾病的进展，但仍然没有基本的治疗措施。

可分化成体内各种类型组织的干细胞，即未分化细胞，能够在适当条件下分化成各种组织细胞，因此可应用于诸如受损组织的再生等治疗。预期干细胞治疗剂能够使受损神经再生，并且已知通过分泌改善受损环境的各种物质来参与再生，以及直接参与再生。目前，关于间充质干细胞的研究是临床上最先进的，但是对于其治疗中风或其他神经退行性疾病的有效性存在矛盾的观点。虽然胎儿来源的神经干细胞对中风和脊髓损伤患者的临床试验正在进行中，但仍有许多技术问题和伦理问题。

发明内容

【技术问题】

因此，本发明的发明人发现，从突发中风患者的手术期间提取的脑组织分离的神经干细胞可以通过在特定条件下培养而快速大量增殖和高效分离，从而完成了本发明。

【技术方案】

为达到上述目的，本发明提供了一种培养神经干细胞的方法，包括：从脑组织中收集细胞；用胶原酶和脱氧核糖核酸酶I(DNase I)，或木瓜蛋白酶、半胱氨酸和脱氧核糖核酸酶I处理收集的细胞以分离单个细胞；将单个细胞分到两个或多个管中，将每个管中的单个细胞与Percoll混合，并将每个混合物离心以回收细胞；原代培养回收的细胞；并对原代培养细胞进行传代培养。

在本发明的一实施方案中，脑组织可以是在突发中风患者的手术期间提取的脑组织，例如，从脑或脊髓提取的组织。例如，脑组织可包括来自颞叶癫痫的组织、中风手术样品(包括颞叶)、创伤组织(包括颞叶)等。

在本发明的一实施方案中，神经干细胞可以是用于移植的人成体神经干细胞，其源自中风患者。人成体神经干细胞可以自体移植或同种异体移植。

在本发明的一实施方案中，可以使用贴壁培养方法进行原代培养和/或传代培养。

在本发明的一实施方案中，传代培养可以进行三次或更少次。

本发明还提供了一种用于移植的源自脑组织的人成体神经干细胞，其通过根据本发明的培养神经干细胞的方法培养。

【有益效果】

本发明不仅可以通过从中风患者自身的脑组织中分离和培养神经干细胞来解决伦理问题，而且还可以容易地提供可移植的人成体神经干细胞。

根据本发明，神经干细胞可以在特定的分离和培养条件下快速大量增殖。特别地，从脑组织分离的单细胞可以分到两个管中并与Percoll混合以回收细胞，从而将神经干细胞的产量增加约2倍。另外，可以使用贴壁培养方法进行原代培养或传代培养，从而与现有的球形方法相比，可稳定地提高培养效率和提高纯度。另外，足够数量的待移植到患者体内的细胞可以通过进行三次或更少的传代培养来培养，从而能够快速增殖培养，特别是将细胞快速移植到突发中风患者体内。

附图简要说明

图1示出了根据本发明的一实施方案培养神经干细胞的过程。

图2示出了根据本发明的一实施方案的根据Percoll处理的细胞数。

图3示出了根据本发明的一实施方案的区分神经干细胞的方法。

图4是显示根据本发明的一实施方案，确认根据分化条件神经干细胞分化成神经元和星形胶质细胞的能力的结果的一组图像。

具体实施方式

本发明提供了一种培养神经干细胞的方法，包括：从脑组织中收集细胞；用胶原酶和脱氧核糖核酸酶I，或木瓜蛋白酶、半胱氨酸和脱氧核糖核酸酶I处理细胞以分离单个细胞；将单个细胞分到两个或多个管中，将每个管中的单个细胞与Percoll混合，并将每个混合物离心以回收细胞；原代培养回收的细胞；并对原代培养细胞进行传代培养。

本发明的神经干细胞是从中风患者手术期间提取的脑组织中分离出来的，可以自体移植到该中风患者体内或同种异体移植。

通常，使用Percoll对从生物组织分离的单细胞进行去除杂质的过程。在本发明的方法中，可将单细胞分到两个管中并与Percoll混合，然后离心以回收细胞，由此与在传统的单个管中单细胞与Percoll混合的情况相比，细胞产量增加约2倍(见图2)。

用于本发明的原代培养或传代培养的培养基可以是通常用于培养干细胞的任何培养基。例如，可以使用含有血清(例如胎牛血清、马血清和人血清)的培养基。可用于本发明的培养基可以是，例如，RPMI系列，例如RPMI 1640(Moore等人，J.Amer.Med.Assoc.199:519(1967))，Eagles的MEM(Eagle最低必需培养基，Eagle,H.Science 130:432(1959))，α-MEM(Stanner,C.P.等人,Nat.New Biol.230:52(1971))，Iscove's MEM(Iscove,N.等人,J.Exp.Med.147:923(1978))，199培养基(199medium)(Morgan等人,Proc.Soc.Exp.Bio.Med.,73:1(1950))，CMRL 1066，F12(Ham,Proc.Natl.Acad.Sci.USA53:288(1965))，F10(Ham,R.G.Exp.Cell Res.29:515(1963))，DMEM(Dublecco改良Eagle培养基，Dulbecco,R.等人,Virology8:396(1959))，DMEM和F12的混合物(Barnes,D.等人,Anal.Biochem.102:255(1980))，Way mouth的MB752/1(Waymouth,C.J.Natl.CancerInst.22:1003(1959))，McCoy的5A(McCoy,T.A.,等人,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.100:115(1959))和MCDB系列(Ham,R.G.等人,In Vitro 14:11(1978))，但是本发明不限于此。培养基可包括其他组分，例如抗生素或抗真菌剂(例如青霉素和链霉素)、谷氨酰胺等。

干细胞的传代培养通常进行七次或九次或更多次。然而，在本发明的方法中，由于在两个管中与Percoll混合并使用贴壁培养方法，可以进行三次或更少的传代培养过程，从而可以获得用于移植的足够量的神经干细胞。

参考下面详细描述的实施例，本发明的优点和特征以及实现它们的方法将变得显而易见。在下文中，将参考以下实施例进一步详细描述本发明。然而，提供这些实施例是为了具体解释本发明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例1.神经干细胞的获得

人神经干细胞的分离和培养

获取通过外科手术(三星医疗中心神经外科)从中风患者中取出的脑组织(侧脑室外顶部区域中的脑组织(在用于清除出血或脑室穿刺的途径中的脑组织))，并且根据如图1所示的方法培养。

首先，将获得的脑组织浸入通过将3％抗生素-抗真菌剂(Gibco)或3％青霉素/链霉素(Gibco)加入Hank's平衡盐溶液(HBSS，Welgene)制备的溶液中并储存，在手术后最多12个小时内，分离细胞。在难以立即进行细胞分离的情况下，将得到的脑组织在4℃冷藏，然后进行细胞分离。

将获得的脑组织称重，然后用无菌PBS溶液冲洗两次或三次，然后用剪刀或剃刀刀片机械粉碎，并储存在通过混合胶原酶(0.4mg/ml，Gibco)和脱氧核糖核酸酶I(0.01mg/ml至1mg/ml，Roche)或者通过混合木瓜蛋白酶(10单位/ml，Sigma)、DL-半胱氨酸(400ng/ml，Sigma)和脱氧核糖核酸酶I(0.01mg/ml至1mg/ml，Roche)而制备的酶溶液中，在CO₂培养箱中于37℃保温1小时。此后，酶溶液用DMEM：F12(Gibco)和1％FBS溶液处理，其量等于或大于该酶溶液，使酶失活，然后用移液管吸移，粉碎，并通过70μM尼龙网获得单细胞。

将Percoll(Sigma)在37℃水浴中温热约5分钟，然后将9mL Percoll和1mL 10XPBS加入50mL无菌超速离心管中以将其浓度调节至1X。将获得的单细胞悬浮液用1X PBS稀释至总体积为40mL，然后分入两个50mL锥形管，每个体积为20mL，并将Percoll加入每个管中以调节每个管的总体积至30mL。然后，将每个管在20,000rpm和18℃下离心20分钟以除去红细胞和其他组织和细胞。离心后形成的白色层用移液管分离，然后用DMEM：F12(Gibco)溶液洗涤两次。

将最终细胞悬浮于基于DMEM：F12(Gibco)溶液的培养液中，该培养液含有0.5％至1％FBS、1x B27补充物(Gibco)、bFGF(R&D)和EGF(R&D)，确认细胞数量，然后在细胞培养之前用聚-L-鸟氨酸(Sigma)预处理100个皮氏培养皿(100pi dishes)，然后培养至4×10⁵个细胞/皿的密度。此时，以3天至4天的间隔仅更换培养液的一半，并且通常培养10天至14天直至首次传代培养。

作为比较例，以与上述实施例相同的方式培养神经干细胞，不同之处在于将单个细胞与Percoll在单个管中混合，并将结果与其中在两个管混合Percoll的上述实施例的结果进行比较。如图2所示，在单个管中混合Percoll的情况下，细胞数为5×10⁵个，而在根据本实施例的在两个管中混合Percoll的情况下，显示1×10⁶个细胞。

传代培养

当在上述培养过程中细胞占据每个培养皿总面积的约70％至80％时，细胞进行传代培养。

首先，除去现有的细胞培养液，然后用DPBS洗涤一次。然后，用0.05％胰蛋白酶/EDTA(T/E，Gibco)或Accutase处理细胞，使细胞浸入其中，在5％CO₂培养箱中37℃储存2分钟至3分钟，然后用添加有DMEM：F12(Gibco)和1％FBS的溶液处理，使酶失活。使用离心机沉淀细胞，然后除去上清液并悬浮在细胞培养溶液中。

对细胞进行计数，然后将4×10⁵个细胞置于100个皮氏培养皿中的每一个中并培养。当进行一次传代培养时，细胞数平均增加10倍，并且当进行三次传代培养时获得10³倍细胞。

一次传代培养的平均时间为3天至4天，并且可在2周内进行三次传代培养，因此在一个月内获得1×10 ⁸个细胞。

当进行7次或更多次的传代培养时，细胞的生长减慢，并且在许多情况下细胞采取与衰老相似的形式，例如细胞长度增加等，因此，干细胞的特征渐渐失去。此外，长期培养导致基因突变增加。

当使用本发明的方法进行培养时，进行三次或更少的传代培养可以获得足够数量的用于多剂量施用和自体移植的细胞。

实施例2.神经干细胞的分化

为了证实实施例1中获得的神经干细胞的分化能力，如图3所示，使神经干细胞分化。

首先，将神经干细胞在聚-L-鸟氨酸(PLO)包被的培养皿上培养3天，当细胞占每个培养皿总面积的70％至80％时，将培养基更换为分化培养基(DMEM/F12，1％P/S，1×B27，0.5％FBS，100ng/mL bFGF，100ng/mL EGF和0.5mM IBMX)。在分化后第2天和第4天，将细胞固定并用巢蛋白(Nestin)(一种是未分化标记物)、MAP2(一种神经元特异性标记物)和GFAP(一种星形胶质细胞标记物)进行免疫荧光染色，然后用荧光显微镜观察。

如在图4中所示，证实神经干细胞分化为神经元和星形胶质细胞。在分化条件下，即分化前(0DIV)和分化后(2,5,9DIV)证实神经干细胞分化为神经元(MAP2+)和星形胶质细胞(GFAP+)的能力，并且也证实了随着分化的进行，作为未分化标记的巢蛋白的表达降低。

已经参考本发明的示例性实施例描述了本发明。本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的基本特征的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。因此，所公开的实施例应该被认为是说明性的而不是限制性的。本发明的范围由所附权利要求限定，而不是由前面的描述限定，并且在其等同物范围内的所有差异应当被解释为在本发明的范围内。