阅读说明：本技术 一种发酵制备头孢菌素c的方法 (Method for preparing cephalosporin C through fermentation ) 是由 周如国 宋更申 高彬洁 顾洹 于 2019-12-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种发酵制备头孢菌素C的方法,包括如下步骤：(1)取顶头孢霉菌,制备一级种子、二级种子、三级种子；(2)取步骤(1)制备的三级种子,接种至发酵培养基中发酵,发酵过程中及时补加碳源、豆油、硫酸铵；其中,碳源为液体葡萄糖和秸秆液化糖的混合物；(3)将步骤(2)所得发酵液经过板框过滤后得到头孢菌素C溶液。本发明通过发酵过程中及时补加碳源、豆油、硫酸铵,使得头孢菌素C的效价达到了29951-35441U/mL,显著高于现有技术制备得到的头孢菌素C,同时,本发明发酵过程中补加的碳源为液体葡萄糖和秸秆液化糖的混合物代替了现有技术中的液体葡萄糖,不仅大大降低了生产成本,同时,也不会降低发酵液质量。(The invention relates to a method for preparing cephalosporin C by fermentation, which comprises the following steps: (1) taking cephalosporium acremonium, and preparing first-level seeds, second-level seeds and third-level seeds; (2) inoculating the three-stage seeds prepared in the step (1) into a fermentation culture medium for fermentation, and supplementing a carbon source, soybean oil and ammonium sulfate in time in the fermentation process; wherein the carbon source is a mixture of liquid glucose and straw liquefied sugar; (3) and (3) filtering the fermentation liquor obtained in the step (2) by using a plate frame to obtain a cephalosporin C solution. According to the invention, the carbon source, the soybean oil and the ammonium sulfate are timely supplemented in the fermentation process, so that the titer of the cephalosporin C reaches 29951-.)

一种发酵制备头孢菌素C的方法

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种发酵制备头孢菌素C的方法。

背景技术

头孢菌素C(cephalosporin C，CPC)是一种β-内酰胺类抗生素，具有抗菌谱广、活性高、疗效好、毒性低的特点，是当前应用最广的抗生素品种，其发酵生产菌株为顶头孢霉菌(Cephalosporium acremomium)。CPC是顶头孢霉菌的次级代谢产物。

头孢菌素C作为头孢类抗生素半合成的前体物质，其生产水平决定着头孢类抗生素的市场供应量，对制备头孢菌素C的发酵方法的深入研究和工艺优化，有着重要的社会和经济意义。如何优化发酵工艺，来提高发酵效价，进而提高生产效率，降低生产成本变得十分重要。

本发明的目的在于：提供一种发酵制备头孢菌素C的方法。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种发酵制备头孢菌素C的方法，它包括如下步骤：

(1)取顶头孢霉菌，制备一级种子、二级种子、三级种子；

(2)取步骤(1)制备的三级种子，接种至发酵培养基中发酵，发酵过程中及时补加碳源、豆油、硫酸铵；

所述的碳源为液体葡萄糖和秸秆液化糖的混合物；

其中，发酵培养基包含如下成分：以生活饮用水为介质，花生饼粉1.5-1.7g/L、葡萄糖0.17-0.19g/L、玉米浆4.9-5.1g/L、糊精3.1-3.3g/L、豆油5.0-5.2g/L、硫酸铵0.63-0.65g/L、磷酸二氢钾0.22-0.24g/L、七水硫酸镁0.18-0.20g/L、轻质碳酸钙0.37-0.39g/L、五水硫酸铜0.0019-0.0021g/L、七水硫酸锌0.0019-0.0021g/L、一水硫酸锰0.0019-0.0021g/L、七水硫酸亚铁0.0059-0.0061g/L、硫酸钙0.67-0.69g/L、DL-蛋氨酸0.45-0.47g/L、玉米粉1.12-1.14g/L、谷朊粉1.91-1.93g/L、消沫剂0.02-0.04g/L；

(3)将步骤(2)所得发酵液经过板框过滤后得到头孢菌素C溶液。

优选地，步骤(2)中发酵培养基包含如下成分：以生活饮用水为介质，花生饼粉1.69g/L、葡萄糖0.18g/L、玉米浆5.00g/L、糊精3.21g/L、豆油5.10g/L、硫酸铵0.64g/L、磷酸二氢钾0.23g/L、七水硫酸镁0.19g/L、轻质碳酸钙0.38g/L、五水硫酸铜0.002g/L、七水硫酸锌0.002g/L、一水硫酸锰0.002g/L、七水硫酸亚铁0.006g/L、硫酸钙0.68g/L、DL-蛋氨酸0.46g/L、玉米粉1.13g/L、谷朊粉1.92g/L、消沫剂0.03g/L。

优选地，步骤(1)中一级种子培养基包含如下成分：以生活饮用水为介质，花生饼粉2.55g/L、葡萄糖0.89g/L、黄豆饼粉2.55g/L、玉米浆4.48g/L、蔗糖2.23g/L、糊精0.89g/L、豆油0.95g/L、轻质碳酸钙0.45g/L、消沫剂0.04g/L；

一级种子制备条件如下：温度26-30℃、种龄：80-100h、PH＝6.8-7.8。

优选地，步骤(1)中二级种子培养基包含如下成分：以生活饮用水为介质，花生饼粉2.77g/L、葡萄糖0.97g/L、黄豆饼粉2.78g/L、玉米浆4.86g/L、蔗糖2.43g/L、糊精0.97g/L、豆油0.10g/L、轻质碳酸钙0.49g/L、消沫剂0.04g/L；

二级种子制备条件：温度26-30℃、种龄：45-55h、PH＝6.8-7.8。

优选地，步骤(1)中三级种子培养基包含如下成分：以生活饮用水为介质，花生饼粉2.52g/L、葡萄糖0.88g/L、黄豆饼粉2.52g/L、玉米浆4.77g/L、蔗糖2.23g/L、糊精0.44g/L、豆油1.35g/L、轻质碳酸钙0.45g/L、消沫剂0.03g/L；

三级种子制备条件：温度26-30℃、种龄：30-40h、PH＝6.8-7.8。

优选地，步骤(2)所述发酵的条件如下：发发酵时间：130-150h；发酵温度：40-50h之前为27-29℃，40-50h后为24-26℃；发酵pH为5.55-5.65。

优选地，步骤(2)中所述的碳源中液体葡萄糖和秸秆液化糖的质量比为1:0.8-1.2。

优选地，步骤(2)中补入碳源的工艺如下：

从50h开始补入碳源，具体速率如下：

50-54h：1.2g/L·h，55-59h：1.4g/L·h，60-64h：1.8g/L·h，65-69h：2.3g/L·h，70-110h：2.5g/L·h，111-115h：2.3g/L·h，116-120h：2.2g/L·h，121h-发酵结束：2.0g/L·h。

优选地，步骤(2)中补油工艺如下：在发酵65-75h时，开始补加豆油，控制油层含量在2-4％，停止发酵前5-7h时，停止补加豆油。

优选地，步骤(2)中补硫酸铵工艺如下：当氨氮值为1.5g/L时，开始补加硫酸铵，控制硫酸铵含量在1.2-1.5g/L，发酵85-95h时，停止补加硫酸铵。

本发明的有益效果在于：

本发明通过发酵过程中及时补加碳源、豆油、硫酸铵，使得制备得到的头孢菌素C的效价达到了29951-35441U/mL，显著高于现有技术制备得到的头孢菌素C，同时，本发明发酵过程中补加的碳源为液体葡萄糖和秸秆液化糖的混合物代替了现有技术中的液体葡萄糖，不仅大大降低了生产成本(秸秆液化糖的价格远远低于液体葡萄糖的价格)，同时，也不会降低发酵液质量。

具体实施方式

一种发酵制备头孢菌素C的方法，步骤如下：

(1)制备一级种子

一级种子培养基：以生活饮用水为介质，花生饼粉2.55g/L、葡萄糖0.89g/L、黄豆饼粉2.55g/L、玉米浆4.48g/L、蔗糖2.23g/L、糊精0.89g/L、豆油0.95g/L、轻质碳酸钙0.45g/L、消沫剂0.04g/L；

取顶头孢霉菌，活化，取浓度为120(mg/ml)的菌液，按照1％(v/v)接种量接种至种子培养基，在pH为6.8-7.8、28℃培养90h。

(2)制备二级种子

二级种子培养基：以生活饮用水为介质，花生饼粉2.77g/L、葡萄糖0.97g/L、黄豆饼粉2.78g/L、玉米浆4.86g/L、蔗糖2.43g/L、糊精0.97g/L、豆油0.10g/L、轻质碳酸钙0.49g/L、消沫剂0.04g/L；

取一级种子，按照5％(v/v)接种量接种至种子培养基，在pH为6.8-7.8、28℃培养50h。

(3)制备三级种子

三级种子培养基：以生活饮用水为介质，花生饼粉2.52g/L、葡萄糖0.88g/L、黄豆饼粉2.52g/L、玉米浆4.77g/L、蔗糖2.23g/L、糊精0.44g/L、豆油1.35g/L、轻质碳酸钙0.45g/L、消沫剂0.03g/L；

取二级种子，按照1.5％(v/v)接种量接种至种子培养基，在pH为6.8-7.8、28℃培养35h。

(4)发酵

发酵培养基：以生活饮用水为介质，花生饼粉1.69g/L、葡萄糖0.18g/L、玉米浆5.00g/L、糊精3.21g/L、豆油5.10g/L、硫酸铵0.64g/L、磷酸二氢钾0.23g/L、七水硫酸镁0.19g/L、轻质碳酸钙0.38g/L、五水硫酸铜0.002g/L、七水硫酸锌0.002g/L、一水硫酸锰0.002g/L、七水硫酸亚铁0.006g/L、硫酸钙0.68g/L、DL-蛋氨酸0.46g/L、玉米粉1.13g/L、谷朊粉1.92g/L、消沫剂0.03g/L。

取步骤(3)制备的三级种子，按照18％的(v/v)接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵140h，0-45h为28℃，46-140h为25℃，pH为5.55-5.65。

发酵过程中及时补加碳源、豆油、硫酸铵；

其中，碳源为质量比为1:1的液体葡萄糖和秸秆液化糖的混合物；

补入碳源的工艺如下：

从50h开始补入碳源，具体速率如下：

50-54h：1.2g/L·h，55-59h：1.4g/L·h，60-64h：1.8g/L·h，65-69h：2.3g/L·h，70-110h：2.5g/L·h，111-115h：2.3g/L·h，116-120h：2.2g/L·h，121h-140h：2.0g/L·h。

补油工艺如下：在发酵70h时，开始补加豆油，控制油层含量在2-4％，停止发酵前6h时，停止补加豆油。

补硫酸铵工艺如下：当氨氮值为1.5g/L时，开始补加硫酸铵，控制硫酸铵含量在1.2-1.5g/L，发酵90h时，停止补加硫酸铵。

(5)过滤：将发酵液经过板框过滤后得到滤液。效价检测：取1mL滤液于50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，检测其效价为35441U/mL，菌浓为58％。