一种头孢菌素c的发酵方法
阅读说明：本技术 一种头孢菌素c的发酵方法 (Fermentation method of cephalosporin C ) 是由 党建宁 王强 寇韩涛 杨丽丽 赵佳美 何彬 于 2020-07-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种头孢菌素C的发酵方法,具体步骤包括：采用顶头孢霉菌依次制备一级种子、二级种子、三级种子,然后将得到的三级种子进行发酵的同时在培养基中流加玉米浆,制得发酵液,然后将发酵液分离纯化,制得到头孢菌素C。本发明采用的玉米浆为湿磨法生产玉米淀粉的副产物,玉米浆中含有大量的亚硫酸、多肽、多糖、蛋白质及多种氨基酸如精氨酸、缬氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸以及半胱氨酸等,这些成分均是发酵头孢菌素C的前体成分,在发酵过程中流加玉米浆能为菌体生长代谢提供全面的营养成分,从而达到提高头孢菌素C的发酵水平和头孢菌素C的发酵产量、降低发酵成本,具有优秀的产业化前景。(The invention discloses a fermentation method of cephalosporin C, which comprises the following specific steps: sequentially preparing a first-level seed, a second-level seed and a third-level seed by adopting acremonium, fermenting the obtained third-level seed, adding corn steep liquor into a culture medium at the same time to prepare fermentation liquor, and then separating and purifying the fermentation liquor to prepare the cephalosporin C. The corn steep liquor adopted by the invention is a byproduct of corn starch produced by a wet milling method, the corn steep liquor contains a large amount of sulfurous acid, polypeptide, polysaccharide, protein and a plurality of amino acids such as arginine, valine, histidine, phenylalanine, methionine, cysteine and the like, the components are precursor components of fermentation cephalosporin C, and the corn steep liquor added in the fermentation process can provide comprehensive nutrient components for the growth and metabolism of bacteria, so that the fermentation level of the cephalosporin C and the fermentation yield of the cephalosporin C are improved, the fermentation cost is reduced, and the method has excellent industrialization prospect.)
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种头孢菌素C的发酵方法。
背景技术
头孢菌素C由顶头孢霉(Cephalosporiumacremonuim)产生，是顶头孢霉菌的初级代谢在特定条件下的继续与发展的产物，是继青霉素之后又一重要的β-内酰胺类抗生素。目前提高头孢菌素C生产水平的主要途径为：一是改变菌种原有性能，进行诱变筛选或基因工程技术获得高产菌种，二是优化发酵工艺。
目前国外头孢菌素C发酵水平明显高于国内，因此，提供一种新的发酵头孢菌素C的发酵方法以提高发酵水平，从而提高头孢菌素C产量、降低发酵成本是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种头孢菌素C的发酵方法；
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
头孢菌素C的发酵方法，包括以下步骤：
(1)制备一级种子
取顶头孢霉菌置于茄子瓶斜面，制备质量体积比为20-25％的菌悬液，按照1％-2％的接种量接种至一级种子培养基中，温度为27-29℃的条件下培养50h，得到一级种子；
(2)制备二级种子
取步骤(1)所得一级种子，按照8％-10％的接种量接种于二级种子培养基中，在PH为6.5-7.4、温度为27-29℃的条件下培养45-50h，得到二级种子；
(3)制备三级种子
取步骤(2)所得二级种子，按照8％-10％的接种量接种于三级种子培养基中，在PH为6.5-7.4、温度为27-29℃的条件下培养45-50h，得到三级种子；
(4)发酵
取步骤(3)所得三级种子，按照25-33％的接种量接种至发酵培养基中培养，在发酵过程发酵培养40-100h后开始流加玉米浆，发酵130h后即得发酵液；
(5)将步骤(4)依次经过陶瓷膜过滤发酵液流量控制在15-30m3/h、纳滤浓缩流量控制在60-80m3/h、树脂吸附流量控制在50-80m3/h、解析分离纯化流量控制在30-60m3/h，即得所述头孢菌素C。
与现有技术相比本发明的有益技术效果在于：本发明采用的玉米浆为湿磨法生产玉米淀粉的副产物，玉米浆中含有大量的亚硫酸、多肽、多糖、蛋白质及多种氨基酸如精氨酸、缬氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸以及半胱氨酸等，这些成分均是发酵头孢菌素C的前体成分，在发酵过程中流加玉米浆能为菌体生长代谢提供全面的营养成分，从而达到提高头孢菌素C的发酵水平和头孢菌素C的发酵产量、降低发酵成本，具有优秀的产业化前景。
进一步，上述步骤(1)中，顶头孢霉菌的保藏编号为ATCC36225。
进一步，上述步骤(1)中，一级种子培养基的组成为：葡萄糖浆18-32g/L、大豆油8-15g/L、玉米浆50-100g/L、糊精7.5-15g/L、白砂糖18-36g/L、黄豆饼粉20-40g/L、花生饼粉20-40g/L、轻质碳酸钙3.6-7.2g/L。
进一步，上述步骤(2)中，二级种子培养基的组成为：黄豆饼粉22-32g/L、白砂糖22-32g/L、糊精8-12g/L、花生饼粉22-32g/L、轻质碳酸钙4-6g/L、玉米浆50-100g/L、葡萄糖浆18-32g/L、大豆油8-15g/L。
进一步，上述步骤(3)中，三级种子培养基的组成为：硫酸铵9-13g/L、无水硫酸钙4-6g/L、谷朊粉9-13g/L、DL-蛋氨酸2-4g/L、玉米粉8-12g/L、糊精12-18g/L、花生饼粉12-16g/L、轻质碳酸钙4-7g/L、玉米浆50-100g/L、葡萄糖浆14-18g/L、大豆油20-30g/L。
进一步，上述步骤(4)中，发酵培养基的组成为：硫酸铵10-26g/L、无水硫酸钙10-13g/L、谷朊粉20-26g/L、DL-蛋氨酸5-6g/L、玉米粉15-20g/L、糊精17-22g/L、花生饼粉16-20g/L、轻质碳酸钙5-8g/L、玉米浆50-100g/L、大豆油10-60g/L、棉籽油10-60g/L。
进一步，上述步骤(4)中，补入玉米浆的具体步骤为：
发酵40-80h使补加玉米浆流速为0.1-0.8L/m3·h；发酵80-100h时补加玉米浆流速为0.2-1.0L/m3·h。；玉米浆的干物质浓度为100-400g/L。
优选地，上述步骤(4)中，补入玉米浆的具体步骤为：
补玉米浆：发酵40-80h使补加玉米浆流速为0.2-0.7L/m3·h；发酵80-100h时补加玉米浆流速为0.3-0.9L/m3·h。
所述玉米浆的干物质浓度为100-400g/L。
进一步，上述步骤(4)中，发酵培养的条件为：发酵时间为130h；发酵0-40h的温度为28℃，发酵40-130h的温度为24℃；发酵pH为5.6。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
发酵生产头孢菌素C的方法
(1)制备一级种子
取保藏编号为ATCC 36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液为25％(mg/mL)，按照2％的接种量接种至一级种子培养基中，在PH为7.0、温度为27.5℃的条件下培养50h；
一级种子培养基：葡萄糖浆22g/L、大豆油8g/L、玉米浆60g/L、糊精8g/L、白砂糖25g/L、黄豆饼粉25g/L、花生饼粉24g/L、轻质碳酸钙5g/L。
(2)制备二级种子
取顶头孢霉菌置于茄子瓶斜面，制备质量体积比为23％的菌悬液，按照1％的接种量接种至一级种子培养基中，温度为27℃的条件下培养50h，得到一级种子；
二级种子培养基：黄豆饼粉25g/L、白砂糖26g/L、糊精9g/L、花生饼粉24g/L、轻质碳酸钙5g/L、玉米浆60g/L、葡萄糖浆20g/L、大豆油9g/L。
(3)制备三级种子
取二级种子按照8％的接种量接种于三级种子培养基中，在PH为6.5、温度为27℃的条件下培养50h；
三级种子培养基：硫酸铵10g/L、无水硫酸钙6g/L、谷朊粉10g/L、DL-蛋氨酸2g/L、玉米粉11g/L、糊精16g/L、花生饼粉12g/L、轻质碳酸钙6g/L、玉米浆70g/L、葡萄糖浆16g/L、大豆油25g/L。
(4)发酵
取三级种子按照25％的接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0-40h为28℃；40-130h为24℃，pH为5.6，得到发酵液；
发酵培养基：硫酸铵10g/L、无水硫酸钙12g/L、谷朊粉22g/L、DL-蛋氨酸5g/L、玉米粉16g/L、糊精19g/L、花生饼粉18g/L、轻质碳酸钙7g/L、玉米浆60g/L、大豆油30g/L、棉籽油30g/L。
补入玉米浆的具体步骤为：
补玉米浆：40-80h，0.2L/m3·h；80-100h，0.5L/m3·h。
所述玉米浆的干物质浓度为200g/L。
(5)过滤
取发酵液依次经过陶瓷膜过滤、纳滤浓缩、树脂吸附和解析分离纯化，即得头孢菌素C。
实施例2
发酵生产头孢菌素C的方法
(用于发酵生产头孢菌素C的方法，步骤(1)-(5)的操作均同实施例1，补入玉米浆的具体步骤为：
补玉米浆：40-80h，0.3L/m3·h；80-100h，0.6L/m3·h。
实施例3
发酵生产头孢菌素C的方法
(用于发酵生产头孢菌素C的方法，步骤(1)-(5)的操作均同实施例1，补入玉米浆的具体步骤为：
补玉米浆：40-80h，0.4L/m3·h；80-100h，0.5L/m3·h。
实施例4
发酵生产头孢菌素C的方法
(用于发酵生产头孢菌素C的方法，步骤(1)-(5)的操作均同实施例1，补入玉米浆的具体步骤为：
补玉米浆：40-80h，0.3L/m3·h；80-100h，0.6L/m3·h。
实施例5
发酵生产头孢菌素C的方法
(用于发酵生产头孢菌素C的方法，步骤(1)-(5)的操作均同实施例1，补入玉米浆的具体步骤为：
补玉米浆：40-80h，0.3L/m3·h；80-100h，0.1L/m3·h。
对比例1
不流加玉米浆制备头孢菌素C
(1)制备一级种子
取保藏编号为ATCC 36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液为25％(mg/mL)，按照2％的接种量接种至一级种子培养基中，在PH为7.0、温度为27.5℃的条件下培养50h；
一级种子培养基：葡萄糖浆22g/L、大豆油8g/L、玉米浆60g/L、糊精8g/L、白砂糖25g/L、黄豆饼粉25g/L、花生饼粉24g/L、轻质碳酸钙5g/L。
(2)制备二级种子
取顶头孢霉菌置于茄子瓶斜面，制备质量体积比为23％的菌悬液，按照1％的接种量接种至一级种子培养基中，温度为27℃的条件下培养50h，得到一级种子；
二级种子培养基：黄豆饼粉25g/L、白砂糖26g/L、糊精9g/L、花生饼粉24g/L、轻质碳酸钙5g/L、玉米浆60g/L、葡萄糖浆20g/L、大豆油9g/L。
(3)制备三级种子
取二级种子按照8％的接种量接种于三级种子培养基中，在PH为6.5、温度为27℃的条件下培养50h；
三级种子培养基：硫酸铵10g/L、无水硫酸钙6g/L、谷朊粉10g/L、DL-蛋氨酸2g/L、玉米粉11g/L、糊精16g/L、花生饼粉12g/L、轻质碳酸钙6g/L、玉米浆70g/L、葡萄糖浆16g/L、大豆油25g/L。
(4)发酵
取三级种子按照25％的接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0-40h为28℃；40-130h为24℃，pH为5.6，得到发酵液；
发酵培养基：硫酸铵10g/L、无水硫酸钙12g/L、谷朊粉22g/L、DL-蛋氨酸5g/L、玉米粉16g/L、糊精19g/L、花生饼粉18g/L、轻质碳酸钙7g/L、玉米浆60g/L、大豆油30g/L、棉籽油30g/L。
发酵培养整个过程不流加玉米浆。
2、实验结果
发酵结束后，取发酵罐发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。
效价检测：取1g滤液于50ml的容量瓶中加水至刻度遥匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测效价。
色谱条件如下:色谱柱：HypersilODS5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1ml/min，进样量：20μL。
将本发明实施例1-5产品及对比例1的产品参数及发酵结果进行归纳，见表1。
表1 发酵结果比较
由表1可以看出：与现有方法对比，使用本发明方法发酵头孢菌素C时，可使头孢菌素C的发酵水平提高1.87％以上，大大提高了头孢菌素C的产量。
在优选范围内(实施案例2和实施案例3记载的工艺范围)，头孢菌素C的发酵水平可以提高3.54％以上；在最佳的工艺参数下(实施案例2的工艺参数)头孢菌素C的发酵水平可提高8.28％，显著降低了生产成本。
综上，本发明方法通过特定的发酵方法，可达到大幅提高头孢菌素C的发酵单位，降低生产成本，工业应用前景良好。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种筛选厌氧合成生物表面活性剂菌株的方法