阅读说明：本技术 一种吲哚二萜类化合物及其制备方法和用途 (Indole diterpenoid compound and preparation method and application thereof ) 是由 李德海 周国亮 朱天骄 顾谦群 车茜 于 2018-09-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及用南极海绵来源真菌<I>Aspergillus candidus</I> HDN15-152(保藏编号:CGMCC No.15991)生产包含吲哚二萜类化合物的制备方法,同时涉及该类化合物在抗感染、抗结核中的用途,其结构式为：<Image he="80" wi="179" file="430340DEST_PATH_IMAGE001.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>；其可通过真菌<I>Aspergillus candidus</I> HDN15-152(保藏编号:CGMCC No.15991)发酵培养来获取含有该类化合物的发酵产物,然后采用VLC正相柱层析分离、C-18 ODS反相柱层析分离和半制备HPLC等方法分离纯化得到。本发明旨在从真菌来源的次级代谢产物中提供一种结构新颖的具有抗感染以及抗结核活性的新化合物的方法。(The invention relates to a fungus from Antarctic sponge Aspergillus candidus HDN15-152 (preservation number: CGMCC No.15991) is used for producing a preparation method containing indole diterpenoid compounds, and simultaneously relates to the application of the compounds in resisting infection and tuberculosis, wherein the structural formula is as follows: (ii) a It can pass through fungi Aspergillus candidus HDN15-152 (preservation number: CGMCC No.15991) is fermented and cultured to obtain fermentation product containing the compound, and then separated and purified by methods such as VLC normal phase column chromatography separation, C-18ODS reverse phase column chromatography separation and semi-preparative HPLC, etc. to obtain the productAnd (4) obtaining. The present invention aims at providing a novel compound with anti-infection and anti-tuberculosis activity, which has a novel structure, from secondary metabolites of fungal origin.)

一种吲哚二萜类化合物及其制备方法和用途

技术领域：

本发明涉及用真菌Aspergillus candidus HDN15-152(保藏编号是:CGMCC15991；保藏日 期：2018年7月10日；保藏单位:中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址是北京市朝阳区 北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101)生产吲哚二萜类化合物的方法；本 发明还涉及该类化合物在抗感染以及抗结核中的用途。

背景技术：

本发明人从一株南极海绵共附生真菌Aspergillus candidus HDN15-152液体发酵产物中分 离出一个抗感染吲哚二萜类化合物。研究发现所示吲哚二萜类化合物具有显著的抑菌活性， 表明上述吲哚二萜类化合物具有进一步开发成新型抗感染以及抗结核药物的潜力。

发明内容

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本发明旨在提供一种结构新颖的具有抗感染以及抗结核活性的新化合物。其结构式是

本发明的式Ⅰ化合物可通过微生物发酵培养来获取含有该类化合物的发酵物，然后对发 酵粗提物采用VLC正相柱层析、C-18ODS反相柱层析和半制备HPLC等方法分离纯化得到。

本发明的下述实施例中列举了利用真菌Aspergillus candidus HDN15-152制备本发明式Ⅰ 化合物的实例。

具体实施方式

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在如下的实施例中所指的化合物Ⅰ的化学结构(结构式中的***数字是化学结构中碳 原子的标位)是：

实施例1化合物Ⅰ的发酵生产及分离精制

1发酵生产

生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取真菌Aspergillus candidusHDN15-152 适量，接种到PDA固体斜面培养基上，在28℃培养箱中培养4天。

取斜面培养4天的真菌Aspergillus candidus HDN15-152适量，接种到装有300mL培养 基[培养基组成(克/升)：可溶性淀粉40.0，味精2.0，麦芽糖30.0，酵母膏1.0，蔗糖40.0,黄 豆粉0.5，MgSO₄·7H₂O 0.3，KH₂PO₄ 0.5，蛋白胨2.0]的1000mL锥型瓶中，在28℃条件下 静置培养30天，获得发酵产物。

2浸膏的获得

发酵液用纱布将上清液和菌丝体分离。将菌丝体用甲醇处理三次，减压浓缩至无甲醇， 所得水相用等量乙酸乙酯萃取三次。发酵液直接用等量乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相， 减压浓缩，得粗浸膏，共38.0克。

3化合物的分离精制

浸膏(38.0克)用甲醇溶解后，以甲醇-二氯甲烷为洗脱体系进行正相层析柱层析，分为 8个流份。组分3先以甲醇-水为流动相进行C-18ODS反相柱层析，梯度洗脱后再经反相半 制备高效液相色谱(乙腈：水＝60:40)得化合物Ⅰ(2.2mg)。

化合物Ⅰ为白色固体,分子式C₂₈H₃₉NO₃,HR-ESI-MS m/z 438.2998[M+H]⁺,计算值438.3003)；IR(KBr)ν_max 3349,2929,2856,1683,1457,1385,1301,1207,1139,1099,1037,741, 723cm^-1；¹H and ¹³C NMR见表1。

表1化合物Ⅰ的¹H和¹³C NMR数据(500和125MHz，in DMSO-d₆)^a

a)本表信号归属基于DEPT、HMQC及HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)、m(多重峰) 表示。

b)此栏中的数字和代号分别代表在¹H-¹H COSY谱中与相应行中的¹H给出偶合相关信号的 ¹H核。

c)此栏中的数字和代号分别代表在HMBC谱中与相应行中的¹H给出偶合相关信号的¹³C 核。

实施例2化合物的抑菌活性测试

1实验样品及实验方法

被测样品溶液的配制测试样品为上述实施例1中分离精制的化合物Ⅰ纯品。精密称取适量样品，用DMSO配置成40mmol/L的母液，供给抑菌活性使用。以制霉菌素为真菌的 阳性对照药，以环丙沙星为细菌的阳性对照药。阳性药配置成40mmol/L，供测活性。

致病菌培养液的配制配置MH培养基，将致病菌从甘油管活化，三区划线，放入28度培养箱培养，24h后，取3-5个菌落接入100mL的MH液体培养基中，然后放入28度摇 床摇瓶培养，转速为180 rpm/min，24 h后，取5μL加入20 ml的对应液体培养基中混匀。此 时浓度约为10⁶ cfu/mL。

抑菌活性测试方法：96孔板法

将致病菌培养液加入96孔板中，第一行每孔198μL；以下七行为100μL。加化合物以及阳性药各2μL放入第一行中；搅匀后取100μL放入第二行，再搅匀后放入第三行，依次 往下，到最后一行时，混匀后吸出100μL扔掉，最后，再在每个孔中加入100μL菌液。此 时，每孔共200μL菌液。(化合物和药浓度为40 mmol/L。此时，第一个孔的化合物浓度为 200μmol/L。)放入28℃培养，24 h后观察，完全澄清孔的最小所在浓度即为MIC。本研究 以制霉菌素为真菌的阳性对照药，以环丙沙星为细菌的阳性对照药。

2实验结果

在抑菌活性测试中，化合物Ⅰ对变形杆菌，枯草杆菌，白色念珠菌以及草分枝杆菌活性 结果见表2。

表2化合物Ⅰ抑菌活性测试

3结论

化合物Ⅰ活性筛选结果显示化合物Ⅰ对变形杆菌，枯草杆菌以及草分枝杆菌均有明显的 抑制作用，可作为新型抗感染药及抗结核药，用于预防和治疗细菌感染以及结核杆菌感染治 疗。