含有芳硝基的连接子、含连接子的抗体偶联药物及连接子的用途
阅读说明：本技术 含有芳硝基的连接子、含连接子的抗体偶联药物及连接子的用途 (Linker containing aromatic nitro group, antibody conjugate drug containing linker and application of linker ) 是由 周辛波 王彦明 李松 钟武 樊士勇 肖典 肖军海 郑志兵 李行舟 谢云德 曹瑞源 于 2018-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及式I所示的含有芳硝基的连接子,还涉及含有所述连接子的抗体偶联药物,还涉及所述连接子的用途,还涉及包含所述抗体偶联药物的药物组合物,还涉及这些抗体偶联药物用于治疗和/或预防疾病的用途。<Image he="605" wi="642" file="DDA0001783292210000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention relates to a linker containing an aromatic nitro group shown in a formula I, an antibody conjugated drug containing the linker, application of the linker, a pharmaceutical composition containing the antibody conjugated drug, and application of the antibody conjugated drug in treatment and/or prevention of diseases.)
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及芳硝基的连接子、含连接子的抗体偶联药物及连接子的用途，还涉及包含抗体偶联药物的药物组合物，还涉及这些抗体偶联药物 用于治疗和/或预防疾病的用途。
背景技术
抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，ADC)将单克隆抗体和细胞毒素有机的结合在一起，联合了抗体及细胞毒药物两者的优势，具有靶向性强、细胞毒性高、 毒副作用低、降解半衰期长等特点。ADC在结构上包括抗体(antibody)、小分子细 胞毒素(cytotoxin)和连接子(linker)三个组成部分，抗体的作用是实现靶向，细胞 毒素的作用是杀死靶细胞，而连接子的作用是实现抗体和细胞毒素结构上的有机结合， 使之形成一个有机整体。连接子的设计对ADC药物具有重要的意义，作为连接单克隆 抗体和小分子细胞毒素的枢纽和桥梁，连接子的性质直接影响ADC的药效以及用药安 全性。作为ADC的连接子，其本身必须使得药物在血液循环系统中保持稳定，以及到 达靶组织之后可以快速有效地释放活性毒素。连接子的构建已经成为制约ADC发展的 核心要素以及重大挑战。
关于ADC连接子的开发，存在着多种重要的考量因素，其中包括抗体的偶联位点、每分子抗体平均偶联细胞毒素的数量(drug to antibody ratio，DAR)、连接子的可裂 解性、连接子的亲水性等。连接子在循环系统中应具备较长时间的稳定性，其到达靶 细胞之后快速有效的释放细胞毒素，如此方能发挥出抗体靶向性和毒素高效力这两种 优势。现阶段连接子的设计思路主要是利用肿瘤细胞与血液循环系统环境上的差异， 实现在肿瘤组织选择性释放毒素。
根据连接子裂解释放毒素方式的不同，可以将其分为两大类：可裂解连接子和不可裂解连接子。包含可裂解型连接子的ADC通常在靶细胞内降解后，可以释放出游离 的母体毒素本身而发挥效力；与其对应的，包含不可裂解型连接子的ADC通常在靶细 胞被降解后起效的活性物质往往不是细胞毒素本身，而是毒素与连接子-抗体偶联位点 氨基酸残基形成的复合物。
可裂解连接子根据裂解机制的不同，分为化学可裂解型连接子和酶可裂解型连接子两种类型。酶可裂解型连接子在稳定性和释药选择性方面相比于化学裂解型连接子 具有着显著的优势。现阶段，酶可裂解型连接子已经成为ADC的主流选择。研究比较 成熟的酶解型连接子为依赖组织蛋白酶B裂解的二肽型连接子。
现有ADC释药酶，例如织蛋白酶B或β-葡萄糖醛酸酶，均为非肿瘤特异性酶， 其广泛存在于哺乳动物多数细胞的溶酶体中。对于那些不可避免的脱靶ADC，正常组 织溶酶体中的释药酶可将ADC降解并释放出高杀伤力的细胞毒药物例如MMAE，对 正常组织造成毒性；同时非离子态的游离细胞毒素通常可通过旁观者效应进一步透过 正常细胞膜对周边组织造成系统毒性。
现阶段主流的酶解型ADC的释药过程普遍存在缺乏肿瘤特异性问题，以及非特异性酶解所致的脱靶毒性。
发明内容
本发明涉及式I所示化合物或其盐，
其中：
R1为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
R2为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
R3为氟、氯、溴、碘或
R4为
X为氧原子(O)、氮原子(N)或硫原子(S)；
Ar为芳基、杂芳基、芳并杂环基或杂芳并杂环基，优选为五元或六元的芳基或杂芳基；优选地，Ar上的硝基与&位置的C处于芳香体系的共轭位置，并且更优选地， 当Ar为六元的芳基或杂芳基时，Ar上的硝基与&位置的C是对位或邻位；
R5为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、氟、氯、溴、碘、羟基或氰基；
R6为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、氟、 氯、溴、碘、羟基、硝基或氰基；
R7为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
R8为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
R9为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、氟、氯、溴、碘、羟基或氰基；
q为0、1、2或3；
p为0、1、2或3；
a为0、1、2、3或4；
L为-(CH2)iO(CH2)j-、-(CH2)iO(CH2)j-C(O)-、-(CH2)i-C(O)NH-(CH2)j-、 -(CH2CH2O)i-(CH2)j-C(O)-、-(CH2)i-(CH2CH2O)j-C(O)-、-(OCH2CH2)i-、-(CH2)m-、 -(CH2)r-C(O)-、
W表示连接基团，优选为-NH-CH2-C(O)-NH-、-NH-CH2-CH2-C(O)-NH-、 -C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-O-、-S-、-NH-、-N(CH3)-、-C(O)-或-NH-CH(R10)-C(O)-NH-， 进一步优选为-NH-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-或-O-；
R10为-H、-CH3、-C3H6、-CH-(CH3)2、-CH2-CH(CH3)2、-CH(CH3)-CH2-CH3、 -CH2-C6H5、-C8NH6、-CH2-C6H4-OH、-CH2-COOH、-CH2-CONH2、-(CH2)2-COOH、 -(CH2)4-NH2、-(CH2)2-CONH2、-(CH2)-S-CH3、-CH2-OH、-CH(CH3)-OH或-CH2-SH， 优选为-H或-CH3；
m为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
i为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
j为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
r为1、2、3、4、5、6、7、8或9。
在某些实施方案中，式I所示化合物或其盐具有式Ia所示的结构，
其中：
R1为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
R2为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
R3为氟、氯、溴、碘或
R4为
X为氧原子(O)、氮原子(N)或硫原子(S)；
Ar为芳基、杂芳基、芳并杂环基或杂芳并杂环基，优选为五元或六元的芳基或杂芳基；
优选地，Ar上的硝基与&位置的C处于芳香体系的共轭位置，并且更优选地，当 Ar为六元的芳基或杂芳基时，Ar上的硝基与&位置的C是对位或邻位；
R5为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、氟、氯、溴、碘、羟基或氰基；
R6为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、氟、 氯、溴、碘、羟基、硝基或氰基；
R7为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
R8为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
R9为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、氟、氯、溴、碘、羟基或氰基；
R10为-H、-CH3、-C3H6、-CH-(CH3)2、-CH2-CH(CH3)2、-CH(CH3)-CH2-CH3、 -CH2-C6H5、-C8NH6、-CH2-C6H4-OH、-CH2-COOH、-CH2-CONH2、-(CH2)2-COOH、 -(CH2)4-NH2、-(CH2)2-CONH2、-(CH2)-S-CH3、-CH2-OH、-CH(CH3)-OH或-CH2-SH， 优选为-H或-CH3；
q为0、1、2或3；
p为0、1、2或3；
a为0、1、2、3或4；
L为-(CH2)iO(CH2)j-、-(CH2)iO(CH2)j-C(O)-、-(CH2)i-C(O)NH-(CH2)j-、 -(CH2CH2O)i-(CH2)j-C(O)-、-(CH2)i-(CH2CH2O)j-C(O)-、-(OCH2CH2)i-、-(CH2)m-、 -(CH2)r-C(O)-、
m为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
i为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
j为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
r为1、2、3、4、5、6、7、8或9。
在某些实施方案中，式I或式Ia所示化合物或其盐中，R1为氢或甲基。
在某些实施方案中，式I或式Ia所示化合物或其盐中，R2为氢或甲基。
在某些实施方案中，式I或式Ia所示化合物或其盐中，R3为
在某些实施方案中，式I或式Ia所示化合物或其盐中，R4为R11优选为甲基、乙基、正丙基或异丙基，更优选为甲基。
在某些实施方案中，式I或式Ia所示化合物或其盐中，R4为
在某些实施方案中，式I或式Ia所示化合物或其盐中，X为氧原子(O)或氮原 子(N)，优选为氧原子(O)。
在某些实施方案中，式I或式Ia所示化合物或其盐中，Ar为苯环、呋喃环、咪唑 环或噻吩环。
在某些实施方案中，式I或式Ia所示化合物或其盐中，R5为氢、甲基、氟、氯或 溴；更优选地，R5为氢或甲基。
在某些实施方案中，式I或式Ia所示化合物或其盐中，R6为氢、甲基、乙基、氟、 氯或溴。
在某些实施方案中，式I或式Ia所示化合物或其盐中，R7为氢或甲基。
在某些实施方案中，式I或式Ia所示化合物或其盐中，R8为氢或甲基。
在某些实施方案中，式I或Ia所示化合物或其盐中，R10为氢或甲基。
在某些实施方案中，式I或式Ia所示化合物或其盐中，q为0或1。
在某些实施方案中，式I或式Ia所示化合物或其盐中，p为0或1。
在某些实施方案中，式I或式Ia所示化合物或其盐中，L为-(CH2)iO(CH2)j-C(O)-、-(CH2CH2O)i-(CH2)j-C(O)-、-(CH2)i-(CH2CH2O)j-C(O)-、-(CH2)m-、-(CH2)r-C(O)-、其中m为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选为4、5、6或7；i为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选为4、5、6或7；j为1、2、3、4、 5、6、7、8或9，优选为4、5、6或7；r为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选为4、 5或6。
在某些实施方案中，式I或式Ia所示化合物或其盐中，L为-(CH2)m-、-(CH2)r-C(O)-、
在某些实施方案中，式I或式Ia所示化合物或其盐中，
在某些实施方案中，式I或式Ia所示化合物具有式I-1、式I-2、式I-3、式I-4所 示的结构，
其中，R4、R10、L的定义如本发明所述。
在某些实施方案中，式I或式Ia所示化合物具有式I-5、式I-6、式I-7、式I-8所 示的结构，
其中，R10、L的定义如本发明所述。
在某些实施方案中，式I或式Ia所示化合物具有式I-9、式I-10、式I-11、式I-12 所示的结构，
其中，L的定义如本发明所述。
在某些实施方案中，式I或式Ia所示化合物选自：
本发明还涉及式I或式Ia所示化合物或其盐在制备抗体偶联药物中的用途。 本发明还涉及式II所示化合物或其盐，
其中：
R1为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
R2为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
R4为
X为氧原子(O)、氮原子(N)或硫原子(S)；
Ar为芳基、杂芳基、芳并杂环基或杂芳并杂环基，优选为五元或六元的芳基或杂芳基；优选地，Ar上的硝基与&位置的C处于芳香体系的共轭位置，并且更优选地， 当Ar为六元的芳基或杂芳基时，Ar上的硝基与&位置的C是对位或邻位；
R5为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、氟、氯、溴、碘、羟基或氰基；
R6为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、氟、 氯、溴、碘、羟基、硝基或氰基；
R7为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
R8为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
q为0、1、2或3；
p为0、1、2或3；
L为-(CH2)iO(CH2)j-、-(CH2)iO(CH2)j-C(O)-、-(CH2)i-C(O)NH-(CH2)j-、 -(CH2CH2O)i-(CH2)j-C(O)-、-(CH2)i-(CH2CH2O)j-C(O)-、-(OCH2CH2)i-、-(CH2)m-、 -(CH2)r-C(O)-、
W表示连接基团，优选为-NH-CH2-C(O)-NH-、-NH-CH2-CH2-C(O)-NH-、 -C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-O-、-S-、-NH-、-N(CH3)-或-C(O)-，进一步优选为 -NH-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-O-或-NH-CH(R10)-C(O)-NH-；
R10为-H、-CH3、-C3H6、-CH-(CH3)2、-CH2-CH(CH3)2、-CH(CH3)-CH2-CH3、 -CH2-C6H5、-C8NH6、-CH2-C6H4-OH、-CH2-COOH、-CH2-CONH2、-(CH2)2-COOH、 -(CH2)4-NH2、-(CH2)2-CONH2、-(CH2)-S-CH3、-CH2-OH、-CH(CH3)-OH或-CH2-SH； 进一步优选为-H或-CH3；
m为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
i为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
j为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
r为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
B为活性化合物，选自药物，细胞毒素，检测试剂，诊断试剂或靶向载体；优选 地，B为细胞毒素，抗肿瘤药物，抗病毒药物，抗感染药物或免疫调节剂药物；进一 步优选地，B为细胞毒素，例如微管蛋白抑制剂、DNA烷化剂、DNA嵌合剂、酶抑制 剂、抗代谢药物、肽或核苷酸；优选地，B通过活性化合物分子中的N原子或O原子 偶联至位点*或位点**；
t为0或1。
在某些实施方案中，式II所示化合物或其盐具有式IIa所示的结构，
其中：
R1为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
R2为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
R4为
X为氧原子(O)、氮原子(N)或硫原子(S)；
Ar为芳基、杂芳基、芳并杂环基或杂芳并杂环基，优选为五元或六元的芳基或杂芳基；优选地，Ar上的硝基与&位置的C处于芳香体系的共轭位置，并且更优选地， 当Ar为六元的芳基或杂芳基时，Ar上的硝基与&位置的C是对位或邻位；
R5为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、氟、氯、溴、碘、羟基或氰基；
R6为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、氟、 氯、溴、碘、羟基、硝基或氰基；
R7为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
R8为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
R10为-H、-CH3、-C3H6、-CH-(CH3)2、-CH2-CH(CH3)2、-CH(CH3)-CH2-CH3、-CH2-C6H5、-C8NH6、-CH2-C6H4-OH、-CH2-COOH、-CH2-CONH2、-(CH2)2-COOH、 -(CH2)4-NH2、-(CH2)2-CONH2、-(CH2)-S-CH3、-CH2-OH、-CH(CH3)-OH或-CH2-SH， 优选为-H或-CH3；q为0、1、2或3；
p为0、1、2或3；
L为-(CH2)iO(CH2)j-、-(CH2)iO(CH2)j-C(O)-、-(CH2)i-C(O)NH-(CH2)j-、 -(CH2CH2O)i-(CH2)j-C(O)-、-(CH2)i-(CH2CH2O)j-C(O)-、-(OCH2CH2)i-、-(CH2)m-、 -(CH2)r-C(O)-、
m为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
i为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
j为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
r为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
B为活性化合物，选自药物，细胞毒素，检测试剂，诊断试剂或靶向载体；优选 地，B为细胞毒素，抗肿瘤药物，抗病毒药物，抗感染药物或免疫调节剂药物；进一 步优选地，B为细胞毒素，例如微管蛋白抑制剂、DNA烷化剂、DNA嵌合剂、酶抑制 剂、抗代谢药物、肽或核苷酸；优选地，B通过活性化合物分子中的N原子或O原子 偶联至位点*或位点**；
t为0或1。
在某些实施方案中，式II或式IIa所示化合物或其盐中，R1为氢或甲基。
在某些实施方案中，式II或式IIa所示化合物或其盐中，R2为氢或甲基。
在某些实施方案中，式II或式IIa所示化合物或其盐中，R4为
在某些实施方案中，式II或式IIa所示化合物或其盐中，R4为
在某些实施方案中，式II或式IIa所示化合物或其盐中，X为氧原子(O)或氮 原子(N)，优选为氧原子(O)。
在某些实施方案中，式II或式IIa所示化合物或其盐中，Ar为苯环、呋喃环、咪 唑环或噻吩环。
在某些实施方案中，式II或式IIa所示化合物或其盐中，R5为氢、甲基、氟、氯 或溴；更优选地，R5为氢或甲基。
在某些实施方案中，式II或式IIa所示化合物或其盐中，R6为氢、甲基、乙基、 氟、氯或溴。
在某些实施方案中，式II或式IIa所示化合物或其盐中，R7为氢或甲基。
在某些实施方案中，式II或式IIa所示化合物或其盐中，R8为氢或甲基。
在某些实施方案中，式II或IIa所示化合物或其盐中，R10为氢或甲基。
在某些实施方案中，式II或IIa所示化合物或其盐中，R11为甲基、乙基、正丙基 或异丙基，优选为甲基。
在某些实施方案中，式II或式IIa所示化合物或其盐中，q为0或1。
在某些实施方案中，式II或式IIa所示化合物或其盐中，p为0或1。
在某些实施方案中，式II或式IIa所示化合物或其盐中，L为-(CH2)iO(CH2)j-C(O)-、 -(CH2CH2O)i-(CH2)j-C(O)-、-(CH2)i-(CH2CH2O)j-C(O)-、-(CH2)m-、-(CH2)r-C(O)-、其中m为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选为4、 5、6或7；i为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选为4、5、6或7；j为1、2、3、4、 5、6、7、8或9，优选为4、5、6或7；r为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选为4、 5或6。
在某些实施方案中，式I或式IIa所示化合物或其盐中，L为-(CH2)m-、-(CH2)r-C(O)-、
在某些实施方案中，式II或式IIa所示化合物或其盐中，B选自：奥里斯他汀(auristatin)，单甲基奥里斯他汀E(MMAE)，美登木素(maytansine)或其衍生 物(例如类美登木素、DM1、DM3、DM4)，紫杉醇，卡里奇霉素，倍癌霉素，多柔 比星，喜树碱，PBD(pyrrolobenzodiazepines)类细胞毒素及其衍生物；优选地，B 为单甲基奥里斯他汀E(MMAE)。
在某些实施方案中，式II或式IIa所示化合物或其盐中，
在某些实施方案中，式II或式IIa所示化合物具有式II-1、式II-2、式II-3或式II-4所示的结构，
其中，R4、R10、L、B的定义如本发明所述。
在某些实施方案中，式II或式IIa所示化合物具有式II-5、式II-6、式II-7或式II-8所示的结构，
其中，R10、L、B的定义如本发明所述。
在某些实施方案中，式II或式IIa所示化合物具有式II-9、式II-10、式II-11、式II-12或式II-13所示的结构，
其中，R10、B的定义如本发明所述。
在某些实施方案中，式II或式IIa所示化合物具有式II-14、式II-15、式II-16、 式II-17或式II-18所示的结构，
其中，B的定义如本发明所述。
在某些实施方案中，式II或式IIa所示化合物选自：
本发明还涉及式II或式IIa所示化合物或其盐在制备抗体偶联药物中的用途。
本发明还涉及式III所示化合物或其盐，
其中：
R1为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
R2为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
X为氧原子(O)、氮原子(N)或硫原子(S)；
Ar为芳基、杂芳基、芳并杂环基或杂芳并杂环基，优选为五元或六元的芳基或杂芳基；优选地，Ar上的硝基与&位置的C处于芳香体系的共轭位置，并且更优选地， 当Ar为六元的芳基或杂芳基时，Ar上的硝基与&位置的C是对位或邻位；
R5为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、氟、氯、溴、碘、羟基或氰基；
R6为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、氟、 氯、溴、碘、羟基、硝基或氰基；
R7为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
R8为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
q为0、1、2或3；
p为0、1、2或3；
L为-(CH2)iO(CH2)j-、-(CH2)iO(CH2)j-C(O)-、-(CH2)i-C(O)NH-(CH2)j-、 -(CH2CH2O)i-(CH2)j-C(O)-、-(CH2)i-(CH2CH2O)j-C(O)-、-(OCH2CH2)i-、-(CH2)m-、 -(CH2)r-C(O)-、
W表示连接基团，优选为-NH-CH2-C(O)-NH-、-NH-CH2-CH2-C(O)-NH-、 -C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-O-、-S-、-NH-、-N(CH3)-或-C(O)-，进一步优选为 -NH-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-O-或-NH-CH(R10)-C(O)-NH-；
R10为-H、-CH3、-C3H6、-CH-(CH3)2、-CH2-CH(CH3)2、-CH(CH3)-CH2-CH3、 -CH2-C6H5、-C8NH6、-CH2-C6H4-OH、-CH2-COOH、-CH2-CONH2、-(CH2)2-COOH、 -(CH2)4-NH2、-(CH2)2-CONH2、-(CH2)-S-CH3、-CH2-OH、-CH(CH3)-OH或-CH2-SH， 优选为-H或-CH3；
m为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
i为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
j为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
r为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
B为活性化合物，选自药物，细胞毒素，检测试剂，诊断试剂或靶向载体；优选 地，B为细胞毒素，抗肿瘤药物，抗病毒药物，抗感染药物或免疫调节剂药物；进一 步优选地，B为细胞毒素，例如微管蛋白抑制剂、DNA烷化剂、DNA嵌合剂、酶抑制 剂、抗代谢药物、肽或核苷酸；优选地，B通过活性化合物分子中的N原子或O原子 偶联至位点*或位点**；
t为0或1；
A为靶向化合物，选自蛋白、抗体、多肽、酶和小分子；优选地，A通过靶向化 合物分子中的S原子偶联至位点#上；
n为0.5至8.5之间的数，例如0.8至5之间的数，1至4之间的数，2至6之间的 数，3至7之间的数，4至8之间的数，3.5至8.5之间的数，3.5至4.5之间的数，或 6.5至8.5之间的数，优选地n约为4、5、6、7或8。
在某些实施方案中，式III所示化合物或其盐具有式IIIa所示的结构，
其中：
R1为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
R2为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
X为氧原子(O)、氮原子(N)或硫原子(S)；
Ar为芳基、杂芳基、芳并杂环基或杂芳并杂环基，优选为五元或六元的芳基或杂芳基；优选地，Ar上的硝基与&位置的C处于芳香体系的共轭位置，并且更优选地， 当Ar为六元的芳基或杂芳基时，Ar上的硝基与&位置的C是对位或邻位；
R5为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、氟、氯、溴、碘、羟基或氰基；
R6为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、氟、 氯、溴、碘、羟基、硝基或氰基；
R7为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
R8为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
R10为-H、-CH3、-C3H6、-CH-(CH3)2、-CH2-CH(CH3)2、-CH(CH3)-CH2-CH3、 -CH2-C6H5、-C8NH6、-CH2-C6H4-OH、-CH2-COOH、-CH2-CONH2、-(CH2)2-COOH、 -(CH2)4-NH2、-(CH2)2-CONH2、-(CH2)-S-CH3、-CH2-OH、-CH(CH3)-OH或-CH2-SH， 优选为-H或-CH3；
q为0、1、2或3；
p为0、1、2或3；
L为-(CH2)iO(CH2)j-、-(CH2)iO(CH2)j-C(O)-、-(CH2)i-C(O)NH-(CH2)j-、 -(CH2CH2O)i-(CH2)j-C(O)-、-(CH2)i-(CH2CH2O)j-C(O)-、-(OCH2CH2)i-、-(CH2)m-、 -(CH2)r-C(O)-、
m为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
i为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
j为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
r为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
B为活性化合物，选自药物，细胞毒素，检测试剂，诊断试剂或靶向载体；优选 地，B为细胞毒素，抗肿瘤药物，抗病毒药物，抗感染药物或免疫调节剂药物；进一 步优选地，B为细胞毒素，例如微管蛋白抑制剂、DNA烷化剂、DNA嵌合剂、酶抑制 剂、抗代谢药物、肽或核苷酸；优选地，B通过活性化合物分子中的N原子或O原子 偶联至位点*或位点**；
t为0或1；
A为靶向化合物，选自蛋白、抗体、多肽、酶和小分子；优选地，A通过靶向化 合物分子中的S原子偶联至位点#上；
n为0.5至8.5之间的数，例如0.8至5之间的数，1至4之间的数，2至6之间的 数，3至7之间的数，4至8之间的数，3.5至8.5之间的数，3.5至4.5之间的数，或 6.5至8.5之间的数，优选地n约为4、5、6、7或8。
在某些实施方案中，式III或式IIIa所示化合物或其盐中，R1为氢或甲基。
在某些实施方案中，式III或式IIIa所示化合物或其盐中，R2为氢或甲基。
在某些实施方案中，式III或式IIIa所示化合物或其盐中，X为氧原子(O)或氮 原子(N)，优选为氧原子(O)。
在某些实施方案中，式III或式IIIa所示化合物或其盐中，Ar为苯环、呋喃环、 咪唑环或噻吩环。
在某些实施方案中，式III或式IIIa所示化合物或其盐中，R5为氢、甲基、氟、 氯或溴；更优选地，R5为氢或甲基。
在某些实施方案中，式III或式IIIa所示化合物或其盐中，R6为氢、甲基、乙基、氟、氯或溴。
在某些实施方案中，式III或式IIIa所示化合物或其盐中，R7为氢或甲基。
在某些实施方案中，式III或式IIIa所示化合物或其盐中，R8为氢或甲基。
在某些实施方案中，III或IIIa所示化合物或其盐中，R10为氢或甲基。
在某些实施方案中，式III或式IIIa所示化合物或其盐中，q为0或1。
在某些实施方案中，式III或式IIIa所示化合物或其盐中，p为0或1。
在某些实施方案中，式III或式IIIa所示化合物或其盐中，L为 -(CH2)iO(CH2)j-C(O)-、-(CH2CH2O)i-(CH2)j-C(O)-、-(CH2)i-(CH2CH2O)j-C(O)-、 -(CH2)m-、-(CH2)r-C(O)-、
在某些实施方案中，式III或式IIIa所示化合物或其盐中，L为-(CH2)m-、 -(CH2)r-C(O)-、
在某些实施方案中，式III或式IIIa所示化合物或其盐中，t为1。
在某些实施方案中，式III或式IIIa所示化合物或其盐中，B选自：奥里斯他汀(auristatin)，单甲基奥里斯他汀E(MMAE)，美登木素(maytansine)或其衍生 物(例如类美登木素、DM1、DM3、DM4)，紫杉醇，卡里奇霉素，倍癌霉素，多柔 比星，喜树碱，PBD(pyrrolobenzodiazepines)类细胞毒素及其衍生物；更优选地， B为单甲基奥里斯他汀E(MMAE)。
在某些实施方案中，式III或式IIIa所示化合物或其盐中，A是以巯基为偶联位 点的单克隆抗体，或以巯基为偶联位点的定点突变或修饰的单克隆抗体，
优选地，A选自：抗HER2人源化单克隆抗体mil40、曲妥珠单抗(HERCEPTIN)， 帕妥珠单抗(PERJETA)，西妥昔单抗(ERBITUX)，帕尼单抗(VECTIBIX)， 利妥昔单抗(RITUXAN)，阿仑单抗(CAMPATH)，替伊莫单抗(ZEVALIN)， 托西莫单抗(BEXXAR)，奥法木单抗(ARZERRA)，贝伐单抗(AVASTIN)，伊 匹单抗(YERVOY)，地诺单抗(XGEVA)，派姆单抗(KEYTRUDA)，纳武单抗(Opdivo)，Avelumab(Bavencio)，Atezolizumab(Tecentriq)，durvalumab(Imfinzi)， sacituzumab，rovalpituzumab，及其生物类似物，
更优选地，A为抗HER2人源化单克隆抗体mil40。
在某些实施方案中，式III或式IIIa所示化合物或其盐中，n为2至7之间的数， 或者n为3至6之间的数或4至5之间的数，优选地，n约为4、5、6、7或8。
在某些实施方案中，式III或式IIIa所示化合物或其盐中，
选自：
在某些实施方案中，式III或式IIIa所示化合物具有式III-1、式III-2、式III-3或式III-4所示的结构，
其中，A、R10、L、B、n的定义如本发明所述。
在某些实施方案中，式III或式IIIa所示化合物具有式III-5、式III-6、式III-7、式III-8或式III-9所示的结构，
其中，A、B、R10、n的定义如本发明所述。
在某些实施方案中，式III或式IIIa所示化合物具有式III-10、式III-11、式III-12、 式III-13或式III-14所示的结构，
其中，A、B、n的定义如本发明所述。
在某些实施方案中，式III或式IIIa所示化合物选自：
其中，MAB为单克隆抗体，优选为抗HER2人源化单克隆抗体mil40，n的定义 如本发明所述。
本发明还涉及药物组合物，其包含至少一种式III或式IIIa所示化合物或其盐，以及一种或多种药用载体或赋形剂。
本发明还涉及式III或式IIIa所示化合物或其盐在制备用于治疗疾病或病症或减轻所述疾病或病症严重性的药物中的用途。
本发明还涉及治疗疾病或病症或减轻所述疾病或病症严重性的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的通式III或式IIIa所示化合物或其盐。
本发明还涉及式III或式IIIa所示化合物或其盐，其用于治疗疾病或病症或减轻所述疾病或病症严重性。
本发明还涉及诊断、预防或治疗疾病或病症的方法，包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的通式III或式IIIa所示化合物或其盐。
某些实施方案中，所述疾病或病症选自肿瘤、感染性疾病、血液学疾病、代谢性 疾病、炎症。
某些实施方案中，所述肿瘤选自癌症、淋巴瘤、淋巴样肿瘤、母细胞瘤、肉瘤和 白血病。
某些实施方案中，所述癌症选自：乳腺癌(例如，HER2阳性的乳腺癌)；鳞状 细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)；肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺 癌和肺的鳞癌；腹膜癌；肝癌；胃癌；胃肠癌；膜腺癌；胶质母细胞瘤；***；卵 巢癌；肝癌；膀肮癌；尿道癌；肝细胞瘤；乳腺癌；肠癌；结肠癌；直肠癌；结肠直 肠癌；子宫内膜癌；子宫癌；唾液腺癌；肾癌；***癌；外阴癌；甲状腺癌；肝癌； ***癌；***癌；黑色素瘤；多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤；脑癌；胆囊癌；食管癌； 胆管癌；头颈癌和相关转移瘤。
定义
如本文所用，术语“抗体”是一种常见的免疫性球蛋白，是免疫系统用来识别并中和外来物(如细菌和病毒)的Y形蛋白。抗体可以特异性识别外来靶标的独特部分(称 为抗原)，是由于Y形蛋白抗体的的每个尖端含有可对抗原特异性识别的位点，抗体 对特异性抗原结合后，可以介导多种相关的生物效应。抗体由两条相同的重链和两条 相同的轻链组成，各链间通过半肮氨酸残基中的巯基形成二硫键相连接。“单克隆抗 体”是单一特异性抗体，其所有抗体分子均由均作为唯一亲代细胞的克隆的相同免疫 细胞组成，因此所有抗体分子是相同的。
如本文所用，术语“细胞毒素”是指那些在癌细胞中释放后可对该细胞产生毒性的分子。在本发明中特别关注的毒素包括甲基奥里斯他汀E(MMAE)，奥里斯他汀、 美登木素或其衍生物(例如类美登木素、DM1、DM3、DM4)、卡里奇霉素、倍癌霉 素、多柔比星、喜树碱或PBD类细胞毒素。
如本文所用，术语“连接子”是具有两个反应活性末端的分子，其一个末端可与 抗体相偶联，另一个末端用于与活性化合物，例如细胞毒素相偶联。连接子的抗体偶 联性末端通常为能够通过抗体上的半胱氨酸的巯基或赖氨酸胺基相偶联的位点，连接 子的毒素的偶联性末端通常为能够通过毒素分子中的上的巯基、氨基、羧基或羟基等 活性位点，当术语连接子用于描述偶联形式的连接子时，由于连接子已与抗体和细胞 毒素中的一个或两个相反应形成共价键，因此，其可能将不再不包括一个或两个反应 性末端反应位点(如巯基反应性基团的离去基团、胺基反应性基团的离去基团)。
如本文所用，术语“抗体偶联药物”或“ADC”是各自通过连接子偶联多分子(通 常为1-8个)的细胞毒素于抗体分子上形成的产物。缀合于一个或多个细胞毒素的抗 体。抗体通常为对癌症的特异抗原具有选择性的单克隆抗体。
如本文所用，术语“约”可理解为在所述值的+/-20％、+/-18％、+/-15％、+/-12％、+/-10％、+/-9％、+/-8％、+/-7％、+/-6％、+/-5％、+/-4％、+/-3％、+/-2％、+/-1％、 +/-0.5％、+/-0.4％、+/-0.3％、+/-0.2％、+/-0.1％以内。除非另外根据上下文显而易见， 否则本文提供的所有数值都由术语“约”修饰。
本文所述的抗体偶联药物所关注的肿瘤疾病类型包括但不限于癌症、乳腺癌、淋巴瘤、淋巴样肿瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。这样的癌症的更具体的实例包括鳞状 细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)；肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺 癌和肺的鳞癌；腹膜癌；肝癌；胃癌，包括胃肠癌；膜腺癌；胶质母细胞瘤；***； 卵巢癌；肝癌；膀肮癌；尿道癌；肝细胞瘤；乳腺癌，包括例如HER2阳性乳腺癌； 结肠癌；直肠癌；结肠直肠癌；子宫内膜或子宫癌；唾液腺癌；肾癌；***癌；外 阴癌；甲状腺癌；肝癌；***癌；***癌；黑色素瘤；骨髓瘤和B细胞淋巴瘤；脑癌； 头颈癌和相关转移瘤。
如本文所用，术语“盐”指保留某化合物的生物有效性和性质的盐，它们对于用 于药物中在生物学或其它方面不适不符合需要的。在许多情况下，本文所公开的化合 物能够借助氨基和/或竣基或类似基团的存在形成酸和/或碱盐。药学上可接受的酸加成 盐可由无机酸和有机酸组成。可以衍生形成盐的无机酸包括，例如，盐酸、氢溴酸、 硫酸、硝酸、磷酸等。可以衍生形成盐的有机酸包括，例如，醋酸、丙酸、羟基乙酸、 丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、反丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、 肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。药学上可接受的碱加成 盐可由无机碱和有机碱组成。可以衍生形成盐的无机碱包括，比如，钠、钾、锂、铵、 钙、镁、铁、锌、铜、猛、铝等；特别优选的是铵，钾，钠，钙和镁盐。可以衍生形 成盐的有机碱包括，例如，伯，仲和叔胺，取代的胺，包括天然存在的取代胺，环胺， 碱性离子交换树脂等，具体地例如异丙胺，三甲胺，二乙胺，三乙胺，三丙胺和乙醇 胺。许多这类盐是本领域已知的，如W087/05297，Johnston等人描述的，出版于1987年9月11日(通过引用将其整体并入本文)。
如本文所用，术语“芳基”是指具有共轭π电子体系的一个单环或两个或多个稠 合环的5-14个碳原子的不饱和芳族碳环基。所述“芳基”优选具有5-10、5-8或5-6 个碳原子。“芳基”的典型实例包括但不限于苯基、萘基、蒽基等。
在本文中，术语“杂芳基”是指，至少一个环成员为选自氮、氧或硫的杂原子的如本文所定义的芳基。所述“杂芳基”优选具有5-10、5-8或5-6个环成员。“杂芳基” 的典型实例包括但不限于呋喃基，咪唑基，噻吩基、三氮唑基、吲哚基，四氮唑基、 吡啶基，蝶啶基，嘧啶基，***基，喹啉基，异喹啉基，喹唑啉基，喹喔啉基等。
在本文中，术语“芳并杂环基”是指具有两个或多个稠合环的环状基团，其中两 个或更多个碳为两个相邻环共用，其中至少一个环为本文所定义的芳基，并且至少一 个环为杂环基。
在本文中，术语“杂芳并杂环基”是指具有两个或多个稠合环的环状基团，其中 两个或更多个碳为两个相邻环共用，其中至少一个环为本文所定义的杂芳基，并且至 少一个环为杂环基。
在本文中，术语“杂环基”是指具有3至12个环成员的单环或二环或多个稠合环(包括稠合、桥连和螺环)的饱和或部分不饱和环状烃基，并且至少一个环成员为选自氮、氧或硫的杂原子。所述“杂环基”优选具有3－10，3－8，5－8，3－6或5－6个环成 员。“杂环基”的典型实例包括但不限于四氢呋喃基，四氢噻吩基，吡咯烷基，哌嗪 基，噻嗪基，哌啶基和吗啉基等。
缩写/缩略语
ADC(antibody-drug conjugate)：抗体偶联药物；
DAR(Drug to antibody ratio)：抗体药物摩尔比；
DCM(Dichloromethane)：二氯甲烷；
DIPEA(N,N-Diisopropylethylamine)：二异丙基乙胺；
NHS/SuOH(N-Hydroxysuccinimide)：N-羟基琥珀酰亚胺；
MMAE(Monomethyl auristatin E)：单甲基奥里斯他汀E；
TFA(Trifluoroacetic acid)：三氟乙酸；
THF(Tetrahydrofuran)：四氢呋喃；
DMF(N,N-Dimethylformamide)：N,N-二甲基甲酰胺；
DMSO(Dimethyl Sulphoxide)：二甲基亚砜；
HER2(Human epidermal growth factor receptor 2)：人表皮生长因子受体2；
MAB(Monoclonal Antibody)：单克隆抗体
MMAE(Monomethyl auristatin E)：单甲基奥里斯他汀E；
NAC(N-Acetyl-L-cysteine)：N-乙酰半胱氨酸；
TFAA(Trifluoroacetic anhydride)：三氟乙酸酐；
EA(Ethyl acetate)：乙酸乙酯；
EDCI(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide Hydrochloride)：1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
HOBt(1-Hydroxybenzotriazole)：1-羟基苯并***；
DCC(Dicyclohexylcarbodiimide)：二环己基碳二亚胺；
EDCI：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
本文中使用的化合物名称与化学结构式不一致时，以化学结构式为准。
如本文所述的药物组合物包含本发明式III所示化合物，或其盐、溶剂化物，与常规药用载体或赋形剂。该药物组合物可通过例如口服或非肠道，例如静脉注射、腹腔 注射、肌肉注射、皮下注射，等途径给药。
如本文所用，术语“有效量”是指足以实现所需治疗效果的量，例如，实现减轻 与待治疗疾病相关的症状的量。
另外需要指出，本发明化合物使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢 速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。优选的使用剂量介于0.01－100 mg/kg体重/天。
本发明所提供的连接子中含有芳硝基片段，具有良好酶裂解性能。本发明提供的含有所述连接子的抗体偶联药物(ADC)结构稳定性良好，酶解释药性能理想，且具 有缺氧依赖性，具备较为理想的体内外药效及安全性。
某些具体实施方案中，本发明所述的ADC的合成路线如下：
其中：r、n的定义如本发明所述，
以马来酸酐(1)以及对应的氨基酸(2)为初始原料，加热条件下经过酰化和脱 水反应制备得到化合物(3)，在三氟乙酸酐的作用下与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 进一步缩合制备得到马来酰胺类接头化合物(4)；以4-羟基-3-硝基苯甲醛(5)为初 始原料，经还原反应得到化合物(6)，与Boc-甘氨酸发生酰化反应得到化合物(7)， 与对硝基溴苄在碱性条件下反生成醚反应得到化合物(8)，在酸性下脱除Boc保护基 得到化合物(9)，与接头(4)反应得到化合物(10)，再与二(对硝基苯基)碳酸 酯反应得到连接子(11)；与MMAE相连得到对应的ADC荷载(12)，进一步与抗 体相偶联得到最终的ADC产物(13)。
某些具体实施方案中，本发明所述的ADC的另一合成路线如下：
其中：r、n的定义如本发明所述，
以肌氨酸(14)为初始原料，加热条件下经过酯化反应制备得到化合物(15)， 与甲酸乙酯反应得到酰化化合物(16)，在氢化钠的作用下进一步与甲酸乙酯反应生 成化合物(17)，在加热条件下与HCl反应中间体化合物(18)，与氨基腈反应得到 环化产物(19)，酸性条件下与NaNO2反应得到硝化产物(20)，经水解反应得到化 合物(21)，经还原反应得到中间体(22)，与甲磺酰氯反应得到氯代产物(23)。 中间体化合物(7)与氯代产物(23)在碱性条件下反生成醚反应得到中间体(24)， 在酸性下脱除Boc保护基得到中间体(25)，与接头(4)反应得到中间体化合物(26)， 与二(对硝基苯基)碳酸酯反应得到连接子(27)；连接子(27)与MMAE相连得到 对应的ADC荷载(28)，进一步与抗体相偶联得到最终的ADC产物(29)。
某些具体实施方案中，本发明所述的ADC的另一合成路线如下：
其中：r、n的定义如本发明所述，
反应过程类似于合成路线3：4-硝基-1-呋喃甲酸(30)经硼氢化钠还原得到还原产物4-硝基-1-呋喃甲醇(31)，与甲磺酰氯反应得到氯代产物(32)。中间体化合物 (7)与氯代产物(32)在碱性条件下反生成醚反应得到中间体(33)，在酸性下脱除 Boc保护基得到中间体(34)，与接头(4)反应得到中间体化合物(35)，与二(对 硝基苯基)碳酸酯反应得到连接子(36)；连接子(36)与MMAE相连得到对应的 ADC荷载(37)，进一步与抗体相偶联得到最终的ADC产物(38)。
附图说明
图1为ADC-1以及NAC-L01-MMEA在血浆中的稳定性评价结果。
图2为缺氧环境下，ADC-1随时间的降解曲线，其中，Hypoxia表示缺氧(氧气 浓度为0.1％)，Oxygen表示常氧；E表示硝基还原酶(Human NADPH CYP-reducates)， N表示还原物质NADPH。
图3为不同条件下，ADC-1的毒素MMAE释放曲线，其中Hypoxia表示缺氧(氧 气浓度为0.1％)，Oxygen表示常氧；E表示硝基还原酶(Human NADPH CYP-reducates)，N表示还原物质NADPH。
图4-A1至图4-C2为在给药24h后，经ADC-1处理的NCI-N87和BT-474细胞 提取物中MMEA含量检测结果，其中：图4-A1为毒素MMAE的检测色谱峰，图4-A2 为定量标准曲线；图4-B1为MMAE在NCI-N87细胞中的色谱检出峰，图4-B2为B1 对应的空白对照；图4-C1为MMAE在BT-474细胞中的色谱检出峰，图4-C2为C1 对应的空白对照。结果显示，ADC-1处理的NCI-N87和BT-474的细胞提取物的HPLC 保留时间与MMAE标准的保留时间非常接近，证明在0.1％的O2分压条件下，ADC-1 能够在体外培养的NCI-N87和BT-474细胞内部顺利释放出所携带的细胞毒素MMAE， 进而通过所释放的细胞毒素诱导肿瘤细胞的凋亡。
图5为给药后，在人乳腺癌细胞系BT-474的异种移植模型中肿瘤体积随时间的变化曲线。结果显示，ADC-1表现出了优于裸抗体的体内肿瘤抑制活性，中剂量给药组 (3mg/kg)的受试动物即可出现部分的肿瘤消失，并且停药后肿瘤出现持续性消退。
图6为不同给药剂量下，在人乳腺癌细胞系BT-474的异种移植模型中ADC-1的 抑瘤效果。结果显示，受试动物的肿瘤消退表现出了明显的剂量-药效依赖关系，ADC-1 低中剂量(0.75mg/kg，1.5mg/kg，3.0mg/kg)给药组受试动物肿瘤出现抑制和部分 消失，而高剂量组(6.0mg/kg)受试动物肿瘤基本可实现完全消失和持续性消退。
图7为接受ADC-1治疗后，人乳腺癌细胞系BT-474的异种移植模型动物体重变 化曲线。结果显示，ADC-1治疗组中的受试动物在治疗过程以及停药观察期内均未出 现明显的体重下降，表明ADC-1在治疗剂量下具有初步的安全性。
图8为不同给药剂量下，在人胃癌细胞系NCI-N87的异种移植模型中ADC-1的 抑瘤效果。结果显示，ADC-1在人胃癌细胞系NCI-N87的异种移植模型中同样也表现 出了明显的剂量依赖关系。
图9和图10为给药后，在人胃癌细胞系NCI-N87的异种移植模型中肿瘤体积随 时间的变化曲线。结果显示，与溶媒空白组以及等剂量(5mg/kg)的裸抗受试组相比， ADC-1均表现出了具有显著性差异的治疗优势(P(Vehicle VS ADC)＝0.0178，P(mAb VS ADC)＝0.0028)。此外，相比于单独给药，联合给药组抑瘤活性最佳，联合给药 组的药效虽然显著优于ADC-1单药受试组(P＝0.0097)，但相比于化疗药则并没有 显著性的治疗优势(P＝0.6430)。
图11为接受ADC-1治疗后，人胃癌细胞系NCI-N87的异种移植模型动物体重变 化曲线。结果显示，所有ADC-1受试组的动物体重均稳中有升，相反化疗药(Doxetaxel) 则出现体重明显下降(P(Vehicle VS Doxetaxel)＝0.0422)，这从一定程度上反映出了 ADC-1的安全性优于化疗药。
图12为接受不同剂量的药物治疗后，CD-1小鼠体重变化曲线。结果显示，ADC-1 给药组中受试动物在10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg和160mg/kg给药剂 量下均未出现明显的不良反应、动物体重下降以及死亡，说明ADC-1具有极高的治疗 安全窗，在治疗剂量乃至较大剂量给药时，并不会导致受试动物产生明显的不耐受。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注 明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产 厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：ADC-1的制备
1)6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸(MCOH)的制备
将马来酸酐(4.86g，49.55mmol)加入到500mL三颈瓶中，采用乙酸(150mL) 全溶后加入6-氨基己酸(5.0g，38.11mmol)，反应液加热到120℃回流6h。反应 结束后，反应液冷却至室温，将其倾倒入蒸馏水之中，并采用适量的乙酸乙酯多次萃 取，合并有机相，采用饱和NaCl溶液洗涤，经无水Na2SO4干燥过夜，浓缩，采用柱 层析法纯化得到白色粉末状固体(5.92g，74％yield)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6) δ11.98(br,1H),7.01(s,2H),3.39(t,J＝7.3Hz,2H),2.17(t,J＝7.3Hz,2H),1.51-1.44 (m,2H),1.24-1.17(m,2H).MS(ESI)m/z:210.0[M-H]-.
2)(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(MCOSu) 的制备
将MCOH(4.66g，22mmol)加入到250mL三颈瓶中，采用THF(100mL) 溶解后，随后依次加入NHS(5.08g，44mmol)、2,4,6,-三甲基吡啶(10.65g，88mmol)， 加完后转移至-5℃的低温反应槽中搅拌降温；缓慢滴加三氟乙酸酐(TFAA，9.24g， 44mmol)，滴加完成后转移至室温继续反应1h。减压蒸除溶剂，所得残渣用EA(200 mL)复溶后，分别用1N盐酸、饱和NaHCO3、饱和NaCl洗涤3次，浓缩后的粗品 经柱层析进一步纯化得粘稠油状物，低温放置后变为白色块状固体(5.03g，69％yield)。 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.69(s,2H),3.53(t,J＝7.3Hz,2H),2.84(s,J＝3.6 Hz,2H),2.61(t,J＝7.3Hz,2H),1.78(m,2H),1.63(m,2H),1.45-1.37(m,2H).MS(ESI) m/z:309.4[M+H]+；331.2[M+Na]+.
3)甲氨基乙酸乙酯盐酸盐的制备
将SOCl2(107mL，1.48mol)缓慢滴加到装有0℃的乙醇溶液的500mL茄形 瓶中，搅拌状态下分批加入肌氨酸(120g，1.35mol)，继续搅拌30min之后，缓 慢升温至回流，继续反应2h。冷却至室温，减压蒸除溶剂，得白色结晶性固体。TLC 检测基本无原料剩余(接近定量反应)；未经进一步纯化直接进行下一步反应 (Procedure of Methyl sarcosinehydrochloride；Meng F,ect.Mol Cancer Ther,2012, 11(3):740-751.)。
4)(甲酰基-甲基-氨基)乙酸乙酯的制备
将甲氨基乙酸乙酯盐酸盐(188g，1.35mol)加入到1000mL三颈瓶中，加入乙 醇(250mL)使溶解，并向反应液中分别加入无水K2CO3(186g，1.35mol)和甲酸 乙酯(163mL，2.0mol)。反应液加热回流3h，过滤去除不溶性盐，浓缩后得目标 产物粗品为浅黄色油状物。未经进一步纯化，直接进行下一步反应(Procedure of Methyl 2-(N-methylformamido)acetate；Meng F,ect.Mol Cancer Ther,2012,11(3): 740-751.)。
5)(E)-2-乙酯基-2-(甲酰基-甲基-氨基)乙烯醇钠盐的制备
将(甲酰基-甲基-氨基)乙酸乙酯(31.4g，0.24mol)加入到500mL三颈瓶中，溶 解于甲酸乙酯(100mL)之后，置于低温反应槽中冷却至0℃。分批加入NaH(11.5 g，0.36mol)，反应1h之后缓慢升温至室温，继续搅拌反应过夜。反应液浓缩后， 得口香糖状黄色粘稠物。未经进一步纯化，直接进行下一步反应(Procedure of Sodium 3-methoxy-2-(N-methylformamido)-3-oxoprop-1-en-1-olate；Meng F,ect.Mol Cancer Ther,2012,11(3):740-751.)。
6)(E)-2-(甲酰基-甲基-氨基)-3-羟基丙烯酸乙酯的制备
将(E)-2-乙酯基-2-(甲酰基-甲基-氨基)乙烯醇钠盐(43.3g，0.24mol)加入到500mL 三颈瓶中，溶解于乙醇(150mL)之后，向反应液中加入浓盐酸(66mL)，加热回 流2h。反应液过滤去除不溶物，浓缩得到约40g的黑色油状物粗品。未经进一步纯 化，直接进行下一步反应(Procedure of Ethyl 3-hydroxy-2-(methylamino)acrylate； Meng F,ect.MolCancer Ther,2012,11(3):740-751.)。
7)2-氨基-3-甲基-3H-咪唑-4-羧酸乙酯的制备
将(E)-2-(甲酰基-甲基-氨基)-3-羟基丙烯酸乙酯(65.3g，0.45mol)加入到500mL三颈瓶中并溶于10％的乙酸(250mL)之中，之后向反应液中加入乙酸钠(111g，1.35 mol)、氨基腈(37.8g，0.9mol)。反应液加热回流2h。反应液减压浓缩去除乙酸， 并加入NaHCO3固体调pH约为8，水相经EA多次萃取后，合并有机相并用饱和NaCl 洗涤3次，Na2SO4干燥。减压蒸除溶剂，粗品经柱层析纯化得到橙色固体粉末(15g， 上述反应总收率为19％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.28(s,1H),6.20(s,1H), 4.15(q,J＝7.0Hz,2H),3.52(s,3H),1.23(t,J＝7.0Hz,3H).MS(EI)m/z:170.3 [M+H]+；192.1[M+Na]+.
8)3-甲基-2-硝基-3H-咪唑-4-羧酸乙酯的制备
将亚硝酸钠(42g，0.6mol)加入到1000mL三颈瓶中，溶解于蒸馏水(250mL) 中之后冷却至-5℃后，向其中滴加2-氨基-3-甲基-3H-咪唑-4-羧酸乙酯(8.5g，50mol) 的乙酸(70mL)溶液，加毕，缓慢升至室温继续反应16h。采用DCM多次萃取后合 并有机相，用饱和NaCl洗涤3次，Na2SO4干燥。减压蒸除溶剂，粗品经柱层析纯化 得到浅黄色固体粉末(6.25g，63％yield)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.75(s,1H), 4.40(q,J＝7.0Hz,2H),4.30(s,3H),1.41(t,J＝7.0Hz,3H).MS(ESI)m/z:200.2 [M+H]+；222.1[M+Na]+.
9)3-甲基-2-硝基-3H-咪唑-4-羧酸的制备
将3-甲基-2-硝基-3H-咪唑-4-羧酸乙酯(6.6g，33mol)加入到250mL三颈瓶中， 溶解于乙醇水溶液(120mL)之后，向其中加入NaOH(4g，100mmol)。室温下搅 拌反应16h后，采用浓HCl调其pH约为1。采用EA多次萃取后合并有机相，用饱 和NaCl洗涤3次，Na2SO4干燥。减压蒸除溶剂，得到浅黄色固体粉末(5.56g，97％ yield)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.83(br,1H),7.74(s,1H),4.18(s,1H).MS (ESI)m/z:172.2[M+H]+；169.9[M-H]-.
10)(3-甲基-2-硝基-3H-咪唑-4-基)甲醇的制备
将3-甲基-2-硝基-3H-咪唑-4-羧酸(1.0g，5.8mol)加入到250mL三颈瓶中，溶 解于无水THF(100mL)之后，向其中加入三乙胺(1.3mL，9.3mmol)，随后置于 低温反应槽中降温至-40℃。缓慢向其中滴入氯甲酸异丁酯(1.2mL，9.3mmol)，滴 加完毕后恢复至室温继续搅拌反应1h后。向反应液中加入NaBH4(4eq)和THF-H2O (3:1，5mL)。反应结束后过滤并浓缩，采用DCM多次萃取后合并有机相，用饱和 NaCl洗涤3次，Na2SO4干燥。减压蒸除溶剂，粗品经柱层析纯化得到浅黄色固体粉 末(0.76g，69％yield)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.12(s,1H),5.51(t,J＝5.4 Hz,1H),4.54(d,J＝5.4Hz,2H),3.92(s,3H).MS(ESI)m/z:158.4[M+H]+.
11)5-(氯甲基)-1-甲基-2-硝基-1H-咪唑的制备
将(3-甲基-2-硝基-3H-咪唑-4-基)甲醇(0.5g，3.2mol)加入到50mL茄形瓶中， 溶解于无水THF(10mL)之后，向其中加入DIPEA(0.67mL，3.8mmol)和甲磺 酰氯(0.30mL，3.8mmol)。室温下反应1h。反应结束后，反应液加入EA稀释， 并用1mol/L的盐酸洗涤2次。有机相采用无水Na2SO4干燥。减压蒸除溶剂，得到黄 色固体粉末(0.45g，81％yield)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.30(s,1H),5.03 (s,2H),3.94(s,3H).MS(ESI)m/z:176.2[M+H]+.
12)2-氨基-4-(羟甲基)苯酚的制备
将4-羟基-3-硝基苯甲醛(0.55g，3.3mmol)加入到100mL三颈瓶中，溶解于甲 醇(10mL)之后，并向其中加入催化量的Pd/C；采用氢气置换除去反应液中的空气 之后，在氢气的环境中室温搅拌4h。反应结束后，过滤去除不溶物，所得滤液浓缩后 经柱层析法进行纯化得到棕色固体粉末(0.38g，84％yield)。1H-NMR(400MHz, DMSO-d6)δ8.83(s,1H),6.56-6.65(m,2H),6.32(dd,1H),4.82(t,J＝5.7Hz,1H),4.47 (br,2H),4.25(d,J＝5.7Hz,2H).MS(ESI)m/z:140.2[M+H]+；138.0[M-H]-.
13)[(2-羟基-5-羟基甲基-苯氨基甲酰基)-甲基]-氨基甲酸叔丁酯的制备
将N-Boc-甘氨酸(0.40g，2.28mmol)加入到50mL茄形瓶中，溶解于DMF(15 mL)之后，向其中依次加入EDCI(0.53g，2.74mmol)、HOBt(0.37g，2.74mmol) 和DIPEA(0.44g，3.42mmol)。室温下搅拌反应90min后，加入2-氨基-4-(羟甲基) 苯酚(0.32g，2.28mmol)，室温下搅拌反应过夜。反应结束后，将反应液倒入10倍 体积的水中，并用EA多次萃取后，合并有机相用饱和NaCl洗涤3次，Na2SO4干燥。 减压蒸除溶剂，粗品经柱层析纯化得到橙色固体粉末(0.57g，84％yield)。1H-NMR (400MHz,DMSO-d6)δ9.81(s,1H),8.98(s,1H),7.92(s,1H),7.32(s,1H),6.85(d,J＝ 8.2Hz,1H),6.79(d,J＝8.2Hz,1H),5.00(br,1H),4.35(s,2H),3.72(s,2H),1.40(s,9H). MS(ESI)m/z:297.2[M+H]+；319.1[M+Na]+.
14){[5-羟甲基-2-(3-甲基-2-硝基-3H-咪唑-4-基-甲氧基)-苯氨基甲酰基]甲基}-氨基 甲酸叔丁酯的制备
将[(2-羟基-5-羟基甲基-苯氨基甲酰)-甲基]-氨基甲酸叔丁酯(0.10g，0.34mmol) 加入到50mL茄形瓶中，溶解于无水DMF(5mL)之后，向其中依次加入5-(氯甲基)-1- 甲基-2-硝基-1H-咪唑(70mg，0.39mmol)、CsCO3(165mg，0.51mmol)。室温下 搅拌反应4h后，将反应液倾倒入蒸馏水(40mL)中；采用EA多次萃取后，合并有 机相用饱和NaCl洗涤3次，Na2SO4干燥。减压蒸除溶剂，粗品经柱层析纯化得到黄 固体粉末(0.12g，81％yield)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.92(s,1H),8.01(s, 1H),7.37(s,1H),7.32(br,1H),7.22(d,J＝8.4Hz,1H),7.03(d,J＝8.4Hz,1H),5.30(s, 2H),5.15(t,1H),4.41(d,J＝5.6Hz,2H),4.00(s,3H),3.71(d,J＝5.9Hz,2H),1.34(s, 9H).MS(ESI)m/z:436.4[M+H]+；458,4[M+Na]+.
15)2-氨基-N-[5-羟甲基-2-(3-甲基-2-硝基-3H-咪唑-4-基-甲氧基)-苯基]-乙酰胺的 制备
将{[5-羟甲基-2-(3-甲基-2-硝基-3H-咪唑-4-基-甲氧基)-苯氨基甲酰基]甲基}-氨基 甲酸叔丁酯(1.44g，3.3mmol)加入到50mL茄形瓶中，溶解于DCM(10mL)之 后，向其中加入TFA(3.3mL)。室温下搅拌反应2h后，减压蒸除溶剂，得目标物 粗品(1.13g，99％yield)，未经进一步纯化直接进行下一步反应。MS(ESI)m/z:336.2 [M+H]+.
16)2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-己基氨基]-N-[5-羟甲基-2-(3-甲基-2-硝基 -3H-咪唑-4-基-甲氧基)-苯基]-乙酰胺的制备
将2-氨基-N-[5-羟甲基-2-(3-甲基-2-硝基-3H-咪唑-4-基-甲氧基)-苯基]-乙酰胺(1.0 g，2.2mmol，粗品)加入到50mL茄形瓶中，溶解于DMF(15mL)之后，向其中 加入过量DIPEA(1.0g，8.0mmol)室温搅拌10min后，加入中间体MCOSu(0.68g， 2.2mmol)，室温下搅拌反应过夜。反应结束后，浓缩并进行柱层析纯化，得到淡黄 色固体(0.85g，73％yield)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.95(s,1H),8.33(t,J ＝5.9Hz,1H),7.97(s,1H),7.38(s,1H),7.20(d,J＝8.4Hz,1H),7.03(d,J＝8.4Hz,1H), 6.99(s,2H),5.27(s,2H),5.15(t,J＝5.8Hz,1H),4.39(d,J＝5.6Hz,2H),3.83(d,J＝ 5.6Hz,2H).1.99(t,J＝12.0Hz,2H),1.43(m,4H),1.14(m,2H).MS(ESI)m/z:529.3 [M+H]+；551.3[M+Na]+；527.5[M-H]-.
17)碳酸3-{2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-己基氨基]-乙酰氨基}-4-(3-甲基 -2-硝基-3H-咪唑-4-基-甲氧基)-苄基酯4-硝基苯基酯(L01)的制备
以中间体2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-己基氨基]-N-[5-羟甲基-2-(3-甲基 -2-硝基-3H-咪唑-4-基-甲氧基)-苯基]-乙酰胺为原料(200mg，1eq)，将其溶解于无 水DMF(20mL)之后，依次加入二(对硝基苯基)碳酸酯(2eq)和DIPEA(2eq)， 室温下搅拌反应12h。反应结束后，减压浓缩去除溶剂，残渣采用***分散打浆后过 滤，得产物粗品，进一步经柱层析纯化得到目标产物为白色固体粉末(91％yield)。 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.06(s,1H),8.33(m,1H),8.31(dt,J＝9.0Hz,2H), 8.16(s,1H),7.57(dt,J＝9.0Hz,2H),7.41(s,1H),7.30(d,J＝8.7Hz,1H),7.22(dd,J＝ 8.4Hz,1H),6.99(s,2H),5.33(s,2H),5.24(s,2H),3.99(s,3H),3.86(d,J＝5.6Hz,2H), 3.32(m,2H),2.00(t,J＝7.4Hz,1H),1.43(m,4H),1.14(m,2H).MS(ESI)m/z:694.2 [M+H]+；716.3[M+Na]+；692.0[M-H]-.
18)L01-MMAE偶联物的制备
将连接子L01(53mg，0.06mmol)加入到10mL茄形瓶中，溶解于无水DMF (3mL)之后，依次加入HOBt(9.4mg，0.06mmol)、MMAE(50mg，0.07mmol， 购自Concortis Biosystems)和DIPEA(18.2μL)，室温下搅拌反应18h。反应结束 后，减压浓缩去除溶剂，残渣进一步经柱层析纯化，得到目标产物为白色固体粉末(75％ yield)。HRMS(ESI)m/z:1272.6876[M+H]+；1294.6697[M+Na]+；636.8487[M+2H]2+.
17)ADC-1的制备
采用文献(Int J Mol Sci.2017,18(9):e1860.)中所述的方法，将L01-MMAE偶 联物与抗HER2人源化单克隆抗体mil40(购买于浙江海正药业股份有限公司，为赫 赛汀的生物仿制药)相偶联得到目标抗体偶联药物ADC-1，其中，MAB表示单克隆 抗体，药物-抗体偶联比(Drug to Antibody Ratio，DAR)n约为4。
实施例2：ADC-2的制备：
1)4-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-甲基]-环己烷羧酸的制备
以合成MCOH的类似合成方法，将反-4-(氨甲基)环己烷甲酸(7.86g,50.0mmol) 和马来酸酐(4.90g,50.0mmol)加入到500mL三颈瓶中，采用DMF(250mL)溶 解后，加热到120℃回流6h。反应结束后，反应液冷却至室温，将其倾倒入蒸馏水 之中，并采用适量的乙酸乙酯多次萃取后合并有机相，采用饱和NaCl溶液洗涤后，经 无水Na2SO4干燥过夜。浓缩溶剂制得白色固体粉末(9.96g，84％yield)。直接用于 下一步反应。
2)4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基-甲基)-环己烷羧酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯 (SMCC)的制备
将N-羟基琥珀酰亚胺(23.0g，200mmol)加入到1000mL三颈瓶中，采用DMF (250mL)溶解后，在0℃条件下搅拌30min，并逐滴加入三氟乙酸酐(27.8mL,200 mmol)。反应混合物搅拌10min后，逐滴加入三甲基吡啶(26.4mL,200mmol)。搅拌 10min后，加入4-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-甲基]-环己烷羧酸(13.1g，55 mmol)，在0℃下继续反应2h后，缓慢升至室温继续反应18h。反应结束后，向反 应液中加入氯仿(300mL)和盐酸溶液(1mol/L，250mL)后采用DCM进行萃取。 萃取得到的有机层用盐酸溶液(1mol/L)洗两次(2×250mL)，无水硫酸钠干燥后的滤 液在真空条件下浓缩得到黄色固体粗品。使用***(3×200mL)将固体打浆，得到白 色粉末状固体(15g，90％yield)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.71(s,1H),3.39 (d,J＝7.0Hz,2H),2.82(d,J＝7.3Hz,4H),2.58(m,1H),2.15(m,2H),1.80(m,2H), 1.56(m,1H),1.54(m,2H),1.06(m,2H).MS(ESI)m/z:352.6[M+NH4]+；357.4 [M+Na]+.
3)4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基-甲基)]-环己烷羧酸{[5-羟甲基-2-(3-甲基-2-硝 基-3H-咪唑-4-基-甲氧基)-苯基氨基甲酰基]-甲基}酰胺的制备
制备方案参照实施例1中步骤16)记载的2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)- 己基氨基]-N-[5-羟甲基-2-(3-甲基-2-硝基-3H-咪唑-4-基-甲氧基)-苯基]-乙酰胺的制备 方法，得到浅黄色固体粉末(61％yield)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.06(s,1H),8.34(br,1H),8.31(dt,J＝9.0Hz,2H),8.16(s,1H),7.57(dt,J＝9.0Hz,2H),7.40(s, 1H),7.30(d,J＝8.7Hz,1H),7.22(dd,J＝8.4Hz,1H),6.99(s,2H),5.33(s,2H),5.24(s, 2H),3.99(s,1H),3.86(d,J＝5.6Hz,2H),3.32(m,2H),2.00(t,J＝7.4Hz,2H),1.43(m, 4H),1.15(m,2H).MS(ESI)m/z:694.2[M+H]+；716.3[M+Na]+；692.0[M-H]-.
4)碳酸3-(2-{[4-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基-甲基)环己烷羰基]-氨基}-乙酰氨 基)-4-(3-甲基-2-硝基-3H-咪唑-4-基-甲氧基)苄基酯4-硝基-苯基酯(L02)的制备
以中间体4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基-甲基)]-环己烷羧酸{[5-羟甲基-2-(3-甲 基-2-硝基-3H-咪唑-4-基-甲氧基)-苯基氨基甲酰基]-甲基}酰胺为原料，采用L01类似的 制备方法合成。得到淡黄色固体粉末(90％yield)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.01(s,1H),8.31(dt,J＝9.3Hz,2H),8.22(t,J＝5.7Hz,1H),8.17(s,1H),7.56(dt,J＝9.3Hz,2H),7.39(s,1H),7.30(d,J＝8.7Hz,2H),7.21(dd,J＝6.6Hz,1H),7.01(s,2H),5.32(s,2H),5.24(s,2H),3.99(s,3H),3.84(d,J＝5.6Hz,2H),3.23(d,J＝7.0Hz,2H),2.04(tt,J＝11.8Hz,1H),1.63(m,2H),1.48(m,1H),1.18(m,2H),0.86(qd,2H).MS (ESI)m/z:720.3[M+H]+；737.6[M+NH4]+；742.8[M+Na]+.
5)L02-MMAE偶联物的制备
以碳酸3-(2-{[4-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基-甲基)环己烷羰基]-氨基}-乙酰氨 基)-4-(3-甲基-2-硝基-3H-咪唑-4-基-甲氧基)苄基酯4-硝基-苯基酯(L02)为原料，采 用L01-MMAE偶联物类似的制备方法合成。目标产物为白色固体粉末(72％yield)。 HRMS(ESI)m/z:1298.7041[M+H]+；1320.6851[M+Na]+.
6)ADC-2的制备
采用文献(Int J Mol Sci.2017,18(9):e1860.)中所述的方法，将L02-MMAE偶 联物与抗HER2人源化单克隆抗体mil40相偶联得到目标抗体偶联药物ADC-2，其中， MAB表示单克隆抗体，药物-抗体偶联比(DAR)n约为4。
实施例3：ADC-3的制备
1){[5-羟基甲基-2-(4-硝基-苄氧基)苯基氨基甲酰基]甲基}氨基甲酸叔丁酯的制备
将[(2-羟基-5-羟基甲基-苯氨基甲酰基)-甲基]-氨基甲酸叔丁酯(0.15g，0.50mmol) 加入到50mL茄形瓶中，溶解于无水DMF(5mL)之后，向其中依次加入对硝基溴 苄(0.13mg，0.60mmol)、CsCO3(0.26mg，0.8mmol)。室温下搅拌反应5h后， 倾倒入蒸馏水(40mL)中析出固体不溶物，采用EA多次萃取后，合并有机相用饱和 NaCl洗涤3次，Na2SO4干燥。减压蒸除溶剂，得到淡黄固体粉末(0.12g，95％yield)。 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.11(s,1H),8.27(d,J＝8.7Hz,2H),8.02(s,1H),7.77 (d,J＝8.7Hz,2H),7.38(s,1H),7.04(d,J＝8.4Hz,1H),6.98(dd，J＝8.4Hz,1H),5.36 (s,2H),4.39(s,2H),3.76(d,J＝5.9Hz,2H),1.32(s,9H).MS(ESI)m/z:432.2[M+H]+； 454,4[M+Na]+.
2)2-氨基-N-[5-羟甲基-2-(4-硝基-苄氧基)-苯基]-乙酰胺的制备
将{[5-羟基甲基-2-(4-硝基-苄氧基)苯基氨基甲酰基]甲基}氨基甲酸叔丁酯(0.15g， 粗品)加入到10mL茄形瓶中，溶解于EA(1mL)之后，向其中加入2mol/L的HCl 的乙酸乙酯溶液(0.3mL)。室温下搅拌反应2h后，直接抽滤，得浅粉色粉末状固 体，粗品经EA进一步打浆纯化后得到目标物(0.1g，95％yield)。1H-NMR(400MHz, DMSO-d6)δ9.87(s,1H),8.25(t,J＝4.4Hz,2H),7.79(t,J＝8.6Hz,2H),7.03(m,2H), 5.38(s,1H),4.40(s,2H),3.81(m,4H).MS(ESI)m/z:332.12[M+H]+.
3)6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-己酸{[5-羟甲基-2-(4-硝基-苄氧基)-苯基氨基 甲酰]-甲基}酰胺的制备
将2-氨基-N-[5-羟甲基-2-(4-硝基-苄氧基)-苯基]-乙酰胺(0.5g，1.36mmol)加入 到50mL茄形瓶中，溶解于DMF(15mL)之后，向其中加入过量DIPEA(0.88g， 6.8mmol)室温搅拌10min后，加入中间体MCOSu(0.46g，1.5mmol)，室温下搅 拌反应过夜。反应结束后，浓缩并进行柱层析纯化，得到红棕色固体(0.23g，43％yield)。 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.9(s,1H),8.36(t,1H),8.25(d,J＝4.4Hz,2H),7.98 (s,1H),7.78(d,J＝8.7Hz,2H),7.04(d,J＝8.4Hz,1H),7.01(s,2H),6.98(d,2H),5.34 (s,2H),5.12(t,J＝5.8Hz,1H),4.39(d,J＝5.9Hz,2H),3.89(d,J＝5.6Hz,2H).3.33(t, J＝8.4Hz,2H),2.06(t,J＝7.6Hz,2H),1.43(m,4H),1.13(m,2H).MS(ESI)m/z: 525.5[M+H]+；547.5[M+Na]+.
4)碳酸3-{2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-己酰氨基]-乙酰氨基}-4-(4-硝基- 苄氧基)苄基酯4-硝基-苯基酯(L03)的制备
以6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-己酸{[5-羟甲基-2-(4-硝基-苄氧基)-苯基氨基 甲酰]-甲基}酰胺为原料，采用L01类似的制备方法合成。得到淡黄色固体粉末(63％ yield)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.21(s,1H),8.37(t,J＝5.5Hz,1H),8.31(dt, J＝9.2Hz,2H),8.27(dt,J＝9.0Hz,2H),8.15(s,1H),7.79(d,J＝8.7Hz,2H),7.57(dt, J＝9.2Hz,2H),7.18(dd,J＝8.4Hz,1H),7.13(d,J＝8.4Hz,1H),6.98(s,2H),5.40(s, 2H),5.22(s,2H),3.91(d,J＝5.6Hz,2H),3.31(m,2H),2.07(t,J＝7.4Hz,2H),1.43(m, 4H),1.14(m,2H).MS(ESI)m/z:690.4[M+H]+；712.5[M+Na]+.
5)L03-MMAE偶联物的制备
以碳酸3-{2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-己酰氨基]-乙酰氨基}-4-(4-硝基- 苄氧基)苄基酯4-硝基-苯基酯为原料，采用L01-MMAE偶联物的类似制备方法合成。 目标产物为白色固体粉末(72％yield)。HRMS(ESI)m/z:1268.6921[M+H]+； 1290.6636[M+Na]+.
6)ADC-3的制备
采用文献(Int J Mol Sci.2017,18(9):e1860.)中所述的方法，将L03-MMAE偶 联物与抗HER2人源化单克隆抗体mil40相偶联得到目标抗体偶联药物ADC-3，其中， MAB表示单克隆抗体，药物-抗体偶联比(DAR)n约为4。
实施例4：ADC-4的制备：
1)4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基-甲基)-环己烷羧酸{[5-羟甲基-2-(4-硝基-苄氧 基)-苯基氨基甲酰基]-甲基}-酰胺的制备
以2-氨基-N-[5-羟甲基-2-(4-硝基-苄氧基)-苯基]-乙酰胺为原料，将中间体MCOSu 替换为SMCC，按照实施例3中步骤3)中记载的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)- 己酸{[5-羟甲基-2-(4-硝基-苄氧基)-苯基氨基甲酰]-甲基}酰胺的制备方法合成。产物为 浅黄色固体粉末(61％yield)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.02(s,1H),8.33(t,J＝5.6Hz,1H),8.25(d,J＝8.7Hz,2H),8.02(s,1H),7.76(d,J＝8.7Hz,2H),7.03(d,J＝8.4Hz,1H),7.00(s,2H),6.97(dd,J＝8.1Hz,1H),5.34(s,2H),5.11(t,J＝5.8Hz,1H),4.38(d,J＝5.6Hz,2H),3.87(d,J＝5.6Hz,2H).3.19(d,J＝7.0Hz,2H),2.08(tt,J＝12.1Hz,1H),1.68(d,J＝12.32Hz,2H),1.55(d,J＝12.9Hz,2H),1.45(m,1H),1.22(qd,2H),0.78(qd,2H).MS(ESI)m/z:551.5[M+H]+；573.5[M+Na]+.
2)碳酸3-(2-{[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基-甲基)-环己烷羰基]-氨基}-乙酰氨 基)-4-(4-硝基苄氧基)苄基酯4-硝基-苯基酯(L04)的制备
以中间体4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基-甲基)-环己烷羧酸{[5-羟甲基-2-(4-硝 基-苄氧基)-苯基氨基甲酰基]-甲基}-酰胺为原料，以L01类似的制备方法合成。目标物 为淡黄色固体粉末(76％yield)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.14(s,1H),8.31(dt,2H),8.27(dt,2H),8.19(s,1H),7.78(d,J＝8.7Hz,2H),7.56(dt,J＝9.2Hz,2H),7.16 (m,2H),7.00(s,2H),5.40(s,2H),5.22(s,2H),3.90(d,J＝5.6Hz,2H),3.19(d,J＝7.0 Hz,2H),2.08(tt,J＝12.0Hz,1H),1.68(d,J＝13.2Hz,2H),1.53(d,J＝12.9Hz,2H), 1.44(m,1H),1.23(m,1H),0.80(qd,2H).MS(ESI)m/z:716.4[M+H]+；738.4[M+Na]+.
3)L04-MMAE偶联物的制备
以碳酸3-(2-{[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基-甲基)-环己烷羰基]-氨基}-乙酰氨 基)-4-(4-硝基苄氧基)苄基酯4-硝基-苯基酯为原料，以L01-MMAE的类似制备方法合 成。目标产物为淡黄色固体粉末(72％yield)。HRMS(ESI)m/z:1294.6976[M+H]+；1316.6980[M+Na]+.
4)ADC-4的合成
采用文献(Int J Mol Sci.2017,18(9):e1860.)中所述的方法，将L04-MMAE偶 联物与抗HER2人源化单克隆抗体mil40相偶联得到目标抗体偶联药物ADC-4，其中， MAB表示单克隆抗体，药物-抗体偶联比(DAR)n约为4。
实施例5：ADC-5的制备
1)(5-硝基呋喃-2-基)甲醇的制备
将5-硝基-呋喃-2-羧酸(0.91g，5.8mmol)溶解于无水THF(20mL)中，全部 溶解后置于-40℃的低温反应槽中降温。分别缓慢滴加三乙胺(1.3mL)和氯甲酸异 丁酯(1.2mL)，滴加完毕后继续反应30min，缓慢升温至-10℃，继续反应1h。分 批加入NaBH4(1.1g)，之后滴加少量的THF-H2O(3:1，1.2mL)混合溶液。待反 应结束后，向反应液中补加适量的THF，抽滤除去THF，水相采用EA多次萃取，合 并有机相，采用饱和NaCl洗涤3次，经无水Na2SO4干燥后，减压浓缩得到粗品，进 一步经柱层析纯化得到白色固体粉末(0.42g，51％yield)。1H-NMR(400MHz,CDCl3) δ7.30(d,1H),6.56(d,1H),4.73(s,2H),2.28(m,1H).MS(ESI)m/z:161.0[M+NH4]+； 142.9[M-H]-.
2)2-氯甲基-5-硝基-呋喃：
将反应(5-硝基呋喃-2-基)甲醇(0.35g，2.44mmol)溶解于无水THF(10mL)中， 全部溶解后，分别缓慢滴加DIPEA(0.51mL，2.93mmol)和甲磺酰氯(0.34g，2.93 mmol)，滴加完毕后继续反应30min，减压浓缩，得到粗品为黄色油状物，进一步经 柱层析纯化，得到黄色油状产物(0.32g，81％yield)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.28(d,1H),6.62(d,1H),4.60(s,2H).MS(ESI)m/z:324.4[2M+H]+.
3)碳酸3-{2-[6-(2,5-二氧-2,5-二氢-吡咯-1-基)-己酰氨基]-乙酰氨基}-4-(5-硝基-呋 喃-2-基-甲氧基)-苄基酯4-硝基-苯基酯(L05)的制备
参照实施例1中步骤16)记载的制备2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-己基氨 基]-N-[5-羟甲基-2-(3-甲基-2-硝基-3H-咪唑-4-基-甲氧基)-苯基]-乙酰胺的方法，制备得 到原料6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-己酸{5-羟甲基-2-(5-硝基-呋喃-2-基-甲氧基)- 苯基氨基甲酰基]-甲基}-酰胺。之后再以6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-己酸{5-羟 甲基-2-(5-硝基-呋喃-2-基-甲氧基)-苯基氨基甲酰基]-甲基}-酰胺为原料，以L01类似的 制备方法合成，得到目标连接子产物(L05)，白色固体粉末(73％yield)。1H-NMR (400MHz,DMSO-d6)δ9.06(s,1H),8.33(m,1H),8.31(dt,J＝9.0Hz,2H),8.16(s,1H), 7.57(dt,J＝9.0Hz,2H),7.30(d,J＝8.7Hz,1H),7.30(d,1H),7.22(dd,J＝8.4Hz,1H), 6.99(s,2H),6.68(d,1H),5.33(s,2H),5.24(s,2H),3.86(d,J＝5.6Hz,2H),3.32(m,2H), 2.00(t,J＝7.4Hz,1H),1.43(m,4H),1.14(m,2H).MS(ESI)m/z:680.2[M+H]+；689.3 [M+Na]+.
4)L05-MMAE偶联物的制备
以碳酸3-{2-[6-(2,5-二氧-2,5-二氢-吡咯-1-基)-己酰氨基]-乙酰氨基}-4-(5-硝基-呋 喃-2-基-甲氧基)-苄基酯4-硝基-苯基酯为原料，以L01-MMAE的类似制备方法合成。 目标产物为白色固体粉末(69％yield)。HRMS(ESI)m/z:1258.6811[M+H]+； 1280.6422[M+Na]+.
5)ADC-5的制备
采用文献(Int J Mol Sci.2017,18(9):e1860.)中所述的方法，将L05-MMAE偶 联物与抗HER2人源化单克隆抗体mil40相偶联得到目标抗体偶联药物ADC-5，其中， MAB表示单克隆抗体，药物-抗体偶联比(DAR)n约为4。
实施例6：抗体-Linker-毒素替代物的偶联物的制备
1)毒素替代物的制备路线及结构如下：
①Boc-Val-An的制备：
将N-Boc-缬氨酸(Boc-Val，2.17g，10mmol/L)溶解于无水THF(30mL)中， 然后向其中加入苯胺(0.93g，10mmol/L)和DCC(2.39g，11mmol/L)，室温下搅 拌反应过夜。反应结束后，过滤除去不溶性固体副产物二环己基脲(DCU)，所得到 的滤液减压浓缩后进一步经柱层析纯化，得目标产物为白色固体粉末(2.2g，75％ yield)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.98(s,1H),7.60(d,J＝7.6Hz,2H),7.30(d, J＝8.0Hz,2H),7.04(t,J＝7.4Hz,1H),6.90(d,J＝8.4Hz,1H),3.91(t,J＝7.0Hz,1H), 1.96(m,1H),1.39(s,9H),0.88(d,J＝6.7Hz,6H).MS(ESI)m/z:293.1[M+H]+；315.2 [M+Na]+.
②Val-An的制备：
将步骤①得到的产物Boc-Val-An(5.85g，20mmol/L)溶解于DCM(50mL) 中，然后向反应液中加入TFA(12.5mL)，室温下搅拌反应过夜。反应结束后，减压 浓缩后进一步经柱层析纯化，得目标产物为浅黄色油状液体(2.8g，88％yield)。 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.84(br,1H),7.63(dd,J＝8.7Hz,2H),7.30(d,J＝ 8.0Hz,2H),7.03(td,J＝7.4Hz,1H),3.10(d,J＝5.6Hz,1H),1.93(m,1H),0.88(d,J＝ 6.7Hz,6H).MS(ESI)m/z:193.1[M+H]+；215.1[M+Na]+.
③Boc-Val’-Val-An的制备：
将N-甲基-N-Boc-缬氨酸(Val’，0.58g，2.5mmol/L)溶解于DCM(10mL)中， 然后依次加入EDCI(0.58g，3mmol/L)、HOBt(0.41g，3mmol/L)、DIPEA(0.51 mL，3.0mmol/L)，室温下搅拌反应1h后，加入Val-An(0.48g，2.5mmol/L)， 室温下继续搅拌反应过夜。反应结束后，浓缩去除溶剂得粗品，进一步干燥得到类浅 粉色固体粉末(0.43g，42％yield)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.11(d,1H),7.95 (d,J＝8.3Hz,2H),7.58(d,J＝7.6Hz,2H),7.31(t,J＝8.0Hz,2H),7.05(t,J＝7.4Hz, 3H),4.23(t,J＝9.4Hz,2H),2.77(s,1H),2.04(m,2H),1.43(s,9H),0.87-0.78(m,12H). MS(ESI)m/z:406.2[M+H]+；428.3[M+Na]+.
④Val’-Val-An的制备：
将步骤③得到的Boc-Val’-Val-An(0.42g，1.04mmol/L)溶解于DCM(5mL) 中，然后向反应液中加入TFA(1.25mL)，室温下搅拌反应3h。反应结束后，减压 浓缩后，残渣用乙酸乙酯复溶，采用饱和碳酸氢钠洗涤2次，浓缩后产品经乙酸乙酯 重结晶，得到产物为白色粉末状固体(0.31g，99％yield)。1H-NMR(400MHz, DMSO-d6)δ10.16(s,1H),8.03(d,J＝9.0Hz,1H),7.59(d,J＝8.7Hz,2H),7.30(t,J＝ 7.1Hz,2H),7.04(t,J＝7.4Hz,1H),4.39(t,J＝8.0Hz,1H),2.69(d,J＝6.2Hz,1H), 2.20(s,3H),2.03(m,1H),1.76(m,1H),0.89(m,12H).MS(ESI)m/z:306.22 [M+H]+；328.20[M+Na]+.
2)L01-毒素替代物偶联物(LT-01)的制备
以连接子L01为原料，以L01-MMAE偶联物类似的制备方法合成L01-毒素替代 物偶联物(LT-01)。得到目标物为白色固体粉末(81％yield)。1H-NMR(400MHz, DMSO-d6)δ10.00(d,1H),8.99(s,1H),8.32(s,1H),8.08(s,1H),7.94(d,J＝8.9Hz, 1H),7.57(d,J＝7.8Hz,2H),7.39(s,1H),7.29(t,J＝7.9Hz,2H),7.24(d,J＝8.4Hz, 1H),7.11(m,2H),7.04(t,J＝7.2Hz,1H),6.98(s,2H),5.30(s,2H),5.04(m,2H),4.29 (m,1H),4.17(t,J＝8.0Hz,1H),3.98(s,3H),3.84(d,J＝5.6Hz,2H),3.39(m,2H),2.85 (s,3H),2.07(m,1H),1.99(t,J＝7.3Hz,2H),1.43(m,4H),1.14(m,1H),1.09(t,J＝7.0 Hz,2H),0.89-0.78(m,12H).MS(ESI)m/z:860.6[M+H]+；882.6[M+Na]+；898.6 [M+K]+；858.5[M-H]-；904.4[M+Cl]-.
3)抗体-连接子-毒素替代物的偶联物的制备
采用文献(Int J Mol Sci.2017,18(9):e1860.)中所述的方法，将偶联物LT-01与抗HER2人源化单克隆抗体mil40(以下简称裸抗mil40)相偶联，得到目标抗体偶联 药物，其中，MAB表示单克隆抗体，药物-抗体偶联比(DAR)n约为4。
实施例7：ADC(DAR约为4)体外细胞毒素评价
本实施例评估了实施例1-5制备的ADC以及毒素MMAE、裸抗mil40等受试药 的体外细胞毒性。测试的细胞系包括HER2抗原阳性的乳腺癌细胞系BT-474、 HCC1954、HER2抗原阳性的卵巢癌细胞系SK-OV-3、HER2抗原阳性的胃癌细胞系 NCI-N87，HER2抗原弱阳性的乳腺癌细胞系MCF-7，HER2抗原阴性的乳腺癌细胞 系MDA-MB-468(上述细胞系均购自ATCC)。
试验过程中的试剂、仪器和消耗品如下表所述：
试验过程如下所述：
①细胞解冻
在37℃水浴中温和搅拌装有目标细胞的小瓶使其解冻；
内容物解冻后，从水浴中取出小瓶，并通过浸入或用70％乙醇喷洒进行去污染；
将小瓶内容物转移到含有9mL完全培养基(细胞系BT-474、MCF-7使用DMEM 培养基，细胞系NCI-N87、HCC1954和MDA-MB-468使用RPMI1640培养基，细胞 系SK-OV-3使用Mccoy’s 5A培养基；下文所述的培养基与此处相同)的离心管中并 离心(200g；5min)；
用培养基重新悬浮细胞，沉淀并分配到面积为75cm2的培养瓶中；
将培养物在37℃，5％CO2的
②展开细胞
细胞在含有10％PBS(热灭活)和1％青霉素/链霉素溶液(Penicillin-Streptomycin) 的培养基中以1:4的比例每周传代三次；
对于传代细胞，首先用胰蛋白酶/EDTA溶液(3mL)冲洗贴壁细胞。然后加入胰 蛋白酶/EDTA(3mL，T75瓶)，并旋转均匀涂覆细胞。培养物在37℃下培养直到 细胞分离。在显微镜下验证细胞已经分离，加入等体积的细胞培养基灭活胰蛋白酶， 收集分离的细胞，200g离心细胞5分钟，然后重新悬浮在新鲜的培养基中。
③准备化合物
以1:3比例系列稀释化合物溶液，以使用培养基产生10点稀释(化合物母液为浓度约为2mg/mL的L-His缓冲盐溶液，采用PBS进行稀释，测试点初始最大浓度约为 500μg/mL)；
将10μL化合物溶液分配到384孔板中。
④细胞接播种
收集细胞并计数细胞数量；
将30μL具有调整密度的细胞悬液加入到指定的384孔细胞培养板中，最终的细 胞密度约为1000个细胞/孔。
盖上盖子，置于37℃5％CO2培养箱中孵育168h，培养箱中氧气浓度为0.1％。
⑤读板
168小时后，从培养箱中取出平板并在室温下平衡15分钟；
实验前将CellTiter Glo试剂在37℃孵育；
将40μL的CellTiter-Glo试剂加入到每个待检测的孔中(与培养基1:1)；
然后将板放置在室温下30min，然后在EnSpire阅读器上阅读，进行细胞计数。
⑥数据分析
抑制百分比表示为下式：
％Inhibition＝100×[1-(Sample-LC)/(HC–LC)]
其中HC是用仅用0.1％DMSO处理的细胞，LC没有细胞，只含有培养基。
⑦实验结果
实验结果如表1所示。
表1体外细胞毒性试验结果
结果显示，在缺氧环境中，通过受试ADC体外活性测试，验证了实施例1-5制备 的各ADC的体外细胞毒性显著优于所对应的MAB(裸抗mil40)。
实施例8：ADC-1的缺氧依赖性细胞毒性
本实施例对缺氧激活型ADC-1进行了缺氧依赖性体外细胞毒性研究，测试的细胞系为HER2抗原阳性的乳腺癌细胞系BT-474，细胞的培养过程如实施例7所述，细胞 培养箱中氧气浓度分别设置为0.1％、1.0％、5.0％、10.0％和20.0％。实验结果如表2 所示。结果显示，相比于常氧条件(氧气浓度为20％)，在缺氧条件下(氧气浓度为 0.1％)缺氧激活型ADC-1活性提高了10余倍，而对应的MAB(裸抗mil40)及其所 携带的连接子-毒素偶联物(L01-MMAE)则分别提高近2倍。
表2不同氧气环境下ADC-1对BT-474细胞的细胞毒性
实施例9：ADC-1的时间依赖性细胞毒性
本实施例对缺氧激活型ADC-1进行了时间依赖性体外细胞毒性研究，测试的细胞系为HER2抗原阳性的乳腺癌细胞系BT-474，细胞的培养过程如实施例7所述，细胞 培养箱中氧气的浓度为0.1％，培养时间分别设置为6h、12h、24h、48h、72h和 96h。结果如表3所示。结果显示，缺氧激活型ADC-1的体外细胞毒性表现出了对缺 氧时间的依赖性，且起效速度明显快于对应的MAB(裸抗mil40)。
表3不同缺氧时间下ADC-1对BT-474细胞的细胞毒性
实施例10：ADC-1的体外血浆稳定性
本实施例评估了ADC-1以及其对应的连接子-毒素偶联物偶联物L01-MMAE的体 外血浆稳定性；其中，ADC选择了平均DAR值约为4的组分，而L01-MMAE在进行 试验前先经NAC处理得到相应的NAC-L01-MMAE。NAC-L01-MMAE的制备方法参 见Y.Wang,S.Fan,W.Zhong,X.Zhou,S.Li,Int.J.Mo.l Sci.2017,18,e1860。简言之，向 900μL的水中加入125μL的NAC水溶液(0.1mmol/L)和125μL的PBS缓冲液(pH ＝7.4，30mmol/L)，混匀上述混合液体并向其中加入100μL的NAC的DMSO溶液 (10mmol/L)，37℃下孵育5min后，HPLC检测显示全部转化为NAC-L01-MMAE。
采用PBS缓冲液(pH＝7.4)将ADC-1以及NAC-L01-MMAE的浓度稀释为100 μg/mL，并加入等体积的人血浆进行稀释，混匀后在37℃无菌细胞培养箱中进行孵育， 并于设定的时间点(0h,3h,6h,12h,24h,36h,2d,3d,4d,5d,6d,7d)取样并放 于-80℃短期存储，待取样结束后统一进行LC/MS分析(脱靶MMAE的质量根据标 准曲线法进行定量)。结果显示，7天内，所检测的ADC-1及NAC-L01-MMAE均没 有显著的MMAE脱落(参见图1)。本实施例初步证明了本公开提供的该类基于芳硝 基的酶裂解型ADC具有理想的血浆稳定性。
实施例11：L01-MMAE偶联物的酶解释药性能评价
1、试剂及材料：Human NADPH CYP-reducates(购买于Cypex，#CYP004)、 NADPH(购买于ARK)、L01-MMAE偶联物、磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH＝7.4)、 DMSO、冷的MeOH等。
2、操作：
①待测物储备液的配制：待测物为L01-MMAE偶联物，在进行试验前先经NAC 处理得到相应的NAC-L01-MMAE。取NAC-L01-MMAE溶于DMSO中，配制成浓度 为10mmol/L的待测物储备液；
②辅因子(NADPH)溶液的配制：将50mg的NADPH溶于磷酸盐缓冲液(3mL) 中，以得到终浓度为20mmol/L的NADPH溶液；
③向装有390μL磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH＝7.4)的小瓶中通入氮气脱 氧，而后快速加入NADPH溶液(75μL，20mM)和Human NADPH CYP-reducates (10μL，3mg/mL；原酶稀释3倍)，37℃孵育10min；向上述孵育液中加入待测 物储备溶液(25μL，10mmol/L)引发反应，缺氧孵育(待测物初始浓度0.5mmol/L； DMSO占5％)；
④在规定的时间点(t＝0,0.5h,1h,2h,4h,12h,24h)分别从孵育液混合物中的 等量取试样(50μL)，并加入200μL冷的甲醇淬灭反应，并通过离心除去蛋白；取 上清液进行HPLC测定目标药物的释放量；
⑤通过LC/MS测定孵育液样品中各峰的分子量做定性参数(包括底物、目标产 物、还原后过渡态物质)。
3、实验结果
本实施例研究了基于芳硝基还原驱动释药的新型连接子的酶解释药性能。芳硝基的还原依赖于NADPH-CYP reducates(E.C.1.6.2.4)、还原态NADPH(NADH)、 以及缺氧环境。在缺氧环境中，当硝基还原酶和还原态NADPH同时存在时，底物 (NAC-L01-MMAE)可以迅速发生降解，而对应的空白组在24h内浓度基本不发生 明显的变化(参见图2)。与此同时，毒素MMAE的释放还表现出了对缺氧、还原酶 以及NADPH的依赖性(参见图3)。
实施例12：ADC-1在体外细胞中的释药性能评价
为探索缺氧激活ADC-1的起效机制，本实施例进一步验证ADC-1在体外细胞中 释放毒素MMAE的性能。测试的细胞系为HER2抗原阳性的乳腺癌细胞系BT-474和 HER2抗原阳性的胃癌细胞系NCI-N87(购买于ATCC)。
测试方法：以BT-474为例，BT-474细胞在内包含10％FBS、1％PS和0.01mg/mL 胰岛素的DMEM培养基中培养；在37℃，5％CO2，95％相对湿度的烧瓶中培养细胞。 当细胞达到80％～90％汇合时，开始分离并接种细胞。将数量约为2.0×106的BT-474 细胞接种在T75烧瓶中，在37℃，5％CO2，95％相对湿度下培养2天，达到50％～60％ 时进行汇合。同样将细胞分为空白组以及ADCs给药组，给药组包含两个重复。置换 培养基，给药组分别采用含有15mL包含约1500ng ADCs的上述培养基重新培养细 胞，空白对照组内不加入受试ADCs，处理完成后，于缺氧(1％O2)的条件下分别培 养细胞12h、24h和48h(表4和图4-A1至图4-C2)。弃去培养基，用胰蛋白酶/EDTA 分离细胞，加入含有过量血清的培养基灭活胰蛋白酶，120g离心5分钟，加入10mL 相应的培养基进行混合，使用自动细胞计数器( VisionCell Profiler)进行计数之后，用冷的PBS溶液离心并洗涤细胞沉淀两次。加入6mL冷甲 醇提取细胞沉淀；然后将悬浮液在-20℃保持30分钟，并以13000g离心20分钟。 通过吹氮气蒸发上清液。将得到的残余物重新溶解在600μL甲醇中，该甲醇含有内标 (IS＝100nmol/L阿普***)，通过LC-MS/MS分析样品。
试验结果证明，在给药24h后，通过LC/MS均检测到胞内大量的MMAE的存在 (参见图4-A1至图4-C2和表4)，而对应的空白组则没有细胞毒素MMAE被检出。 ADC-1处理的NCI-N87和BT-474的细胞提取物的HPLC保留时间与MMAE标准的 保留时间非常接近，证明在0.1％的O2分压条件下，ADC-1能够在体外培养的NCI-N87 和BT-474细胞内部顺利释放出所携带的细胞毒素MMAE，进而通过所释放的细胞毒 素诱导肿瘤细胞的凋亡(图4-A1至图4-C2)。
表4.ADC-1及对照组在BT-474和NCI-N87细胞系中的毒素检出结果
实施例13：ADC-1在BT-474人源乳腺癌细胞异种移植模型SCID小鼠体内的药 效评价
本实施例采用HER2表达的人乳腺癌细胞系BT-474(购自ATCC)的异种移植模 型对受试药物进行体内药效评价。其中，受试药物为ADC-1，设置4个剂量组，给药 剂量分别为0.75mg/kg、1.5mg/kg、3mg/kg和6mg/kg。同时设置裸抗体(mil40) 阳性对照组和溶媒空白对照组(生理盐水)。将受试药物溶解于生理盐水，并通过尾 静脉注射方式进行给药。
将BT-474人乳腺癌细胞(购买于ATCC)用含有灭活的10％胎牛血清，100U/mL 的青霉素和100μg/mL的链霉素以及2mmol/L谷氨酰胺的DMEM培养基在37℃、 5％CO2的培养箱中培养。细胞培养起始浓度为1×106个/毫升，每隔3～4天待细胞 长满后分瓶传代。将处于对数生长期的癌细胞接种到SCID小鼠(雌性，6-8周龄，18-22 g，购买于北京安凯毅博生物技术有限公司)的右侧胁肋部皮下，待肿瘤生长至150立 方毫米体积时，造模成功。然后开始给药，每个剂量组6只小鼠，每周按设定剂量给 药1次，给药体积均为5mL/kg，共给药4次。所有小鼠接种癌细胞的前一天开始皮 下注射***(兽用苯甲酸***注射液，4mg/2mL，购自四川蓝晟制药有限公司) 直到实验结束，每周两次，每次40μg/20μL。每周使用游标卡尺对肿瘤体积进行两次 的测量，测量肿瘤的长径和短径，其体积计算公式为：体积＝0.5×长径×短径2。在 进行肿瘤体积测量的同时，称量小鼠体重。记录小鼠体重的变化与给药时间的关系。 同时观察小鼠的存活情况和健康状况如给药期间动物活动、进食等一般状态。
结果显示，在BT-474人乳腺癌的SCID小鼠的异种移植模型中，ADC-1表现出 了优于裸抗体的体内肿瘤抑制活性，中剂量给药组(3mg/kg)的受试动物即可出现部 分的肿瘤消失，并且停药后肿瘤出现持续性消退(图5)；与此同时，在ADC-1的四 个给药剂量(0.75mg/kg，1.5mg/kg，3.0mg/kg，6.0mg/kg)中，受试动物的肿瘤消 退表现出了明显的剂量-药效依赖关系(图6)，ADC-1低中剂量(例如0.75mg/kg， 1.5mg/kg，3.0mg/kg)给药组受试动物肿瘤出现抑制和部分消失，而高剂量组(例如 6.0mg/kg)受试动物肿瘤基本可实现完全消失和持续性消退。此外，ADC-1治疗组中 的受试动物在治疗过程以及停药观察期内均未出现明显的体重下降，表明该ADC-1在 治疗剂量下具有初步的安全性(图7)。以上研究表明，本公开提供的基于芳硝基的 ADC具有较好的实体瘤治疗潜力。
实施例14：ADC-1在NCI-N87人源胃癌细胞异种移植模型裸鼠体内的药效评价
本实施例采用HER2表达的人胃癌细胞系NCI-N87(购自ATCC)的异种移植模 型对受试药物进行药效评价。其中，受试药物为ADC-1，设置3个剂量组，给药剂量 分别为1mg/kg、2.5mg/kg、和5mg/kg。同时设置裸抗体(mil40)阳性对照组，溶 媒空白对照组(生理盐水)，化疗药物(药用Doxetaxel，购买于浙江海正药业股份有 限公司)对照组，以及ADC-1与化疗药物联合给药组。将受试药物溶解于生理盐水， 并通过尾静脉注射方式进行给药。
将NCI-N87胃腺癌细胞(购买于ATCC)用含有灭活的10％胎牛血清，100U/mL 的青霉素和100μg/mL的链霉素以及2mM谷氨酰胺的DMEM培养基在37℃、5％ CO2的培养箱中培养。细胞培养起始浓度为1×106个/毫升，每隔3～4天待细胞长满 后分瓶传代。将处于对数生长期的癌细5×106个/0.1mL胞接种到BALB/c裸小鼠(雌 性，6-8周龄，18-22g，购买于北京安凯毅博生物技术有限公司)的右侧胁肋部皮下， 待肿瘤生长至150立方毫米体积时，造模成功。然后开始给药，每个剂量组6只小鼠， 每周按设定剂量给药1次，给药体积均为5mL/kg，共给药4次。每周使用游标卡尺 对肿瘤体积进行两次的测量，测量肿瘤的长径和短径，其体积计算公式为：体积＝0.5 ×长径×短径2。在进行肿瘤体积测量的同时，称量小鼠体重。记录小鼠体重的变化与 给药时间的关系。同时观察小鼠的存活情况和健康状况如给药期间动物活动、进食等 一般状态。
结果显示，ADC-1在人胃癌细胞系NCI-N87的异种移植模型中同样也表现出了明显的剂量依赖关系(图8)。与溶媒空白组以及等剂量(5mg/kg)的裸抗受试组相比， ADC-1均表现出了具有显著性差异的治疗优势(P(Vehicle VS ADC)＝0.0178，P(mAb VS ADC)＝0.0028)(图9)。此外，相比于单独给药，联合给药组抑瘤活性最佳；联 合给药组的药效虽然显著优于ADC-1单药受试组(P＝0.0097)，但相比于化疗药则 并没有显著性的治疗优势(P＝0.6430)(图10)，原因可能在于所选的剂量不够合理。 但是，在给药治疗的过程中，所有ADC-1受试组的动物体重均稳中有升，相反化疗药 (Doxetaxel)则出现体重明显下降(P(Vehicle VS Doxetaxel)＝0.0422)，这从一定程 度上反映出了ADC-1的安全性优于化疗药(图11)。
实施例15：ADC-1的体内安全性评价
为进一步证实该类ADC-1的安全性，本实施例进一步评估了ADC-1在正常CD-1 小鼠模型中的最大耐受剂量(MTD)。CD-1小鼠购买于北京维通利华实验动物技术 有限公司。所有动物实验均按照康龙化成(北京)新药技术有限公司的Institutional Animal Careand Use Committee批准的方案进行饲养。每个测试剂量组包括6只(3 只雄性和3只雌性)7～9周龄的CD-1小鼠，平均体重为22～40g(雄性)和20～35g (雌性)，通过尾静脉给予ADC-1或裸抗体mil40或ADC-6，共设置五个剂量组， ADC-1的给药剂量为10mg、20mg、40mg、80mg和160mg，而mil40-6的给药剂 量则为10mg、20mg、40mg、80mg和120mg。给药后所有试验动物每天监测一次 体重变化，并在鼠笼旁观察动物行为，每天两次。观察记录包括动物死亡或猝死，动 物的一般健康状况和药物毒性症状。详细的临床观察包括动物的皮肤，皮毛，眼睛和粘膜的变化，呼吸系统的变化，循环系统，自主神经和中枢神经系统，身体运动和行 为模式。在最后一次观察后，通过吸入90％～100％的二氧化碳使所有存活的动物安乐 死。
ADC-6的结构式如下所示(ADC-6制备方法参考文献International Journal ofMolecular Sciences,2017,18(9):1860.中的相关描述)。
参见图12，试验结果显示，同裸抗体mil40相似，ADC-1给药组中受试动物在10 mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg和160mg/kg给药剂量下均未出现明显的不良 反应、动物体重下降以及死亡，说明ADC-1具有极高的治疗安全窗，在治疗剂量乃至 较大剂量给药时，并不会导致受试动物产生明显的不耐受。作为对照，基于传统的组 织蛋白酶裂解的二肽型ADC-6则在80mg/kg剂量下给药的前6天出现体重持续下降， 并且试验后期普遍出现脱毛，结痂等不良反应；并且，ADC-6在120mg/kg剂量下， 给药后的一周内出现了半数的受试动物死亡。本实施例的试验数据说明，本公开提供 的基于芳硝基连接子的酶解型ADC的应用潜力优于传统的基于二肽型连接子的酶解 型ADC。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解： 依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不 脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。
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