阅读说明：本技术 检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器及其构建与应用 (Whole-cell biosensor for detecting heavy metal ions in water-soluble sample and construction and application thereof ) 是由 卓敏 李爽 胡日荣 吴柏华 彭晓春 于 2018-09-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器及其构建与应用。本发明的操作对象为大肠杆菌,无致病风险,操作简单易行。利用SRRz裂解基因作为报告元件,导致微生物菌体裂解,菌液浑浊度明显发生改变,既可通过可见光分光光度计检测,也可通过肉眼直接观察获得结果；且响应迅速,从接触样品到获得结果,仅需30～60min。利用X-gal对释放到胞外的β-半乳糖苷酶进行检测,操作简便。应用无需使用到昂贵的仪器,大大减小了检测成本,并使现场检测成为可能。利用含有oNPG的显色凝胶对胞外β-半乳糖苷酶酶活进行准确定量,检出限低,检测结果准确。本发明为日常重金属污染检测和突发重金属污染检测提供技术支持。(The invention discloses a whole-cell biosensor for detecting heavy metal ions in a water-soluble sample and construction and application thereof.A working object of the biosensor is escherichia coli, which has no risk of causing diseases and is simple and easy to operate, an SRrz cracking gene is used as a report element, so that microbial thalli are cracked, the turbidity of bacterial liquid is obviously changed, a result can be obtained by detecting through a visible spectrophotometer or directly observing through naked eyes, the response is rapid, only 30-60 min is needed from the contact of a sample to the result, β -galactosidase released to the outside of a cell is detected by using X-gal, the operation is simple and convenient, no expensive instrument is needed in application, the detection cost is greatly reduced, the field detection is possible, the accurate quantification of the activity of the extracellular β -galactosidase by using a developing gel containing oNPG is realized, the detection limit is low, and the detection result is accurate.)

检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器及其构建 与应用

技术领域

本发明属于环境生物技术领域，特别涉及一种高灵敏检测水溶性样品中重金属离子(二价汞离子或铅离子)的全细胞生物传感器及其构建与应用。

背景技术

随着工业的发展，重金属污染日益严重，成为突出的环境问题之一。重金属毒性较大，容易在生物体内富集并难以降解，进入食物链后对人体健康带来巨大威胁，因此重金属离子的检测技术显得尤为重要。重金属离子的检测技术主要包括原子吸收光谱法，原子荧光光谱法，电感耦合等离子体法，紫外-可见分光光度法，高效液相色谱法，电化学分析法，生物检测法，化学显色法。其中原子吸收光谱法，原子荧光光谱法，电感耦合等离子体法，紫外-可见分光光度法，高效液相色谱法具有高灵敏性和高特异性等优点，但所需仪器价格昂贵、操作复杂、不便携带，主要用于实验室检测，不能作为现场检测的技术。电化学分析法，化学显色法操作简单，容易小型化，可以作为现场检测的技术，但其灵敏度无法往往无法满足要求。由于我国重金属污染严重，操作简便，灵敏度高的重金属的现场实时检测越来越受到重视。

特异性的微生物传感器检测是基于工程化菌株对特定小分子物质做出的响应构建而来，其功能主要由两个元件执行。1.由调控蛋白以及其调控的启动子组合而成的感应元件，其通过与特定小分子物质作用后引起基因表达的变化，引起一系列的现象。2.由感应元件控制的，易于检测的蛋白组成的报告元件。1997年Misteli等人从多管水母属AequoreaVictoria中分离得到天然的绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)。由于其自身具有荧光不需要外加底物，并且较为稳定，作为一个报告元件广泛地应用于微生物传感器当中。2002年Roberto FF等人以GFP为报告元件制作了检测As的微生物传感器；2006年Lian VH等人基于GFP报告元件检测土壤中的重金属离子；2016年Lara Bereza-Malcolm以GFP为报告元件制作了能特异性检测铅的微生物传感器。

微生物传感器检测其优点是廉价，操作简单，特异性高，灵敏度较好，但现行的生物检测法还存在一下问题。一是检测周期较长，绿色荧光蛋白虽然有着多种优点，但是其成熟时间较长，往往需要2～3小时才能完全成熟，不利于快速检测。再者GFP的定量需要使用昂贵的仪器，并且仪器不容易携带，不利于进行现场实时的检测。

本发明所述大肠杆菌可以克服这些不足，构建一种敏感，快速检测水中重金属离子的大肠杆菌，为开发一种廉价，便携的微生物现场检测技术奠定基础。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器。

本发明的另一目的在于提供上述检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器的构建方法。

本发明的另一目的在于提供上述检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器的应用。

本发明的再一目的在于提供一种利用上述全细胞生物传感器快速检测重金属离子的方法。该方法操作便利、灵敏度高、耗时短、成本低、可视性好、易于定量。

具有重金属耐受性的微生物在受到相应的重金属的刺激时，会引起一系列重金属耐受性相关的基因的表达。这些基因的表达主要是由以MerR家族蛋白为代表的一类调控蛋白，其可以激活非最优的σ70依赖的启动子，此类启动子的-35区与-10区相差碱基数大于能被σ70因子识别的最优长度17±1bp。当MerR蛋白与汞离子特异性结合后能够使此类启动子的构型发生改变从而使得该启动子能被σ70因子正确识别，从而启动下游基因的转录。本发明就是利用MerR蛋白及其类似调控的启动子，从而控制下游报告基因的表达，实现对环境中的重金属离子进行定性、定量的检测。

大肠杆菌的λ噬菌体是目前研究最清楚、应用最广泛的噬菌体之一。噬菌体中导致细胞裂解的基因包括S、R和Rz三个基因，其中R基因编码的是一种可溶于水的转糖基酶(transglycosylase)，可以引起肽键的水解，分解细胞壁的肽聚糖。Rz基因的产物可能是一种肽链内切酶(endopepidase)，它可以切割肽聚糖和寡糖之间和/或者肽聚糖与细胞壁外膜之间的连接。R和Rz基因产物的功能都是降解细胞壁，而S基因产物的作用是改变细胞质膜的通透性，在细胞质膜上形成多孔的结构，以使R和Rz基因的产物穿过细胞质膜，并作用于细胞壁，使细胞壁破碎，释放胞内物质。

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)广泛存在于各种微生物中，它能催化β-半乳糖苷化合物中的β-半乳糖苷键水解，是最成熟的一种报告蛋白。其能催化X-gal(5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactoside，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)水解产物显蓝色，易于观察和检测，同时能够催化oNPG(o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside，邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷)水解，产物呈黄色，β-半乳糖苷酶与oNPG的反应常用于β-半乳糖苷酶的酶活测试中。

本发明利用重组大肠杆菌作为重金属离子检测菌。该菌株是将特定的重金属离子响应的调控蛋白以及其对应的启动子序列与噬菌体裂解蛋白SRRz基因相连接，与质粒载体连接后导入大肠杆菌，形成能够在重金属离子刺激下发生裂解的大肠杆菌，既为本发明中所用的重组大肠杆菌。当重组大肠杆菌遇到相应的重金属离子后，重金属离子进入菌体内与调控蛋白结合，从而启动裂解基因SRRz的表达，导致大肠杆菌裂解，并释放β-半乳糖苷酶。通过本发明构建的X-gal凝胶显色方法，既可以利用X-gal进行快速半定量检测，也可以利用酶标仪进行精确的定量检测。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器，该全细胞生物传感器是将重金属离子诱导的基因表达系统转化大肠杆菌中构建得到的；

所述的重金属离子诱导的基因表达系统中自5′到3′端依次连接大肠杆菌终止子、重金属离子响应元件、噬菌体裂解基因、大肠杆菌终止子；

所述的重金属离子响应元件可为重金属离子响应的任意元件，优选为含有双向启动子序列的重金属离子响应元件；更优选为含有双向启动子序列的汞(Hg²⁺)响应蛋白(SEQID No.1)或含有双向启动子序列的铅(Pb²⁺)响应蛋白(SEQ ID No.2)。

所述的噬菌体裂解基因，可为任意一种噬菌体裂解基因，优选为lambda噬菌体的裂解基因SRRz，具有序列表中SEQ ID No.3的核苷酸序列。

所述的大肠杆菌终止子可为任意一种大肠杆菌终止子，优选为终止子T_rrnB，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

所述的重金属离子诱导的基因表达系统所用的出发载体可为任意一种大肠杆菌载体，优选pSB1C3，pBluescript，pUC18，pUC19，pET系列等克隆表达载体。更优选为以pSB1C3为出发载体，构建的大肠杆菌裂解载体为pSB1C3-MHg和pSB1C3-MPb。

所述的大肠杆菌优选为E.coli BL21。

一种检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器的构建方法，具体包括如下步骤：以pSB1C3为出发载体：

(1)分别合成汞和铅离子响应的响应蛋白和双向启动子序列，见SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，序列从5′到3′依次为EcoRI、NotI、XbaI、响应蛋白反向互补编码基因、双向启动子、SpeI、NotI和PstI；

(2)合成裂解基因SRRz，其序列见SEQ ID No.3，序列从5′到3′依次为EcoRI、NotI、XbaI、SRRz裂解基因、SpeI、NotI和PstI；

(3)合成终止子T_rrnB，其序列见SEQ ID No.4，序列从5′到3′依次为EcoRI、NotI、XbaI、T_rrnB终止子、SpeI、NotI和PstI；

(4)将含有汞离子响应蛋白和双向启动子序列SEQ ID No.1用XbaI和PstI双酶切，含有终止子T_rrnB序列SEQ ID No.4用EcoRI和SpeI双酶切，载体pSB1C3用EcoRI和PstI双酶切，三者在连接酶作用下环化形成pSB1C3-T_rrnB-HgR，其中T_rrnB-HgR的连接是依靠SpeI和XbaI酶切产生同尾序列进行连接的；

(5)将含有铅离子响应蛋白和双向启动子序列SEQ ID No.2用XbaI和PstI双酶切，含有终止子T_rrnB序列SEQ ID No.4用EcoRI和SpeI双酶切，载体pSB1C3用EcoRI和PstI双酶切，三者在连接酶作用下环化形成pSB1C3-T_rrnB-PbR，其中T_rrnB-PbR的连接是依靠SpeI和XbaI酶切产生同尾序列进行连接的；

(6)将含有SRRz裂解基因的序列SEQ ID No.3用EcoRI和SpeI双酶切，含有终止子T_rrnB序列SEQ ID No.4用XbaI和PstI双酶切，载体pSB1C3用EcoRI和PstI双酶切，三者在连接酶作用下环化形成pSB1C3-SRRz-T_rrnB，其中SRRz-T_rrnB的连接是依靠SpeI和XbaI酶切产生同尾序列进行连接的；

(7)质粒pSB1C3-T_rrnB-HgR采用SpeI和PstI双酶切，质粒pSB1C3-SRRz-T_rrnB采用XbaI和PstI双酶切，目的片段纯化后连接获得汞离子响应载体，命名为pSB1C3-MHg。

(8)质粒pSB1C3-T_rrnB-PbR采用SpeI和PstI双酶切，质粒pSB1C3-SRRz-T_rrnB采用XbaI和PstI双酶切，目的片段纯化后连接获得铅离子响应载体，命名为pSB1C3-MPb。

(9)将步骤(7)和(8)所得的载体分别转入到E.coli BL21感受态细胞，获得重金属检测用的重组大肠杆菌，即全细胞生物传感器。

所述的检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器在快速检测水溶性样品中重金属离子中的应用。

所述的传感器细胞可专一地在15～40℃、pH4～9条件下在30～45min完成样品检测。

所述的重金属离子优选为汞(Hg²⁺)或铅(Pb²⁺)。

所述的传感器细胞可专一性地在15～40℃、pH 4～9条件下在30～45min完成0～80nM无机二价汞离子污染溶液的检测。

所述的传感器细胞可专一性地在15～40℃、pH 4～9条件下在30～45min完成0～2000nM无机二价铅离子污染溶液的检测。

通过检测生物传感器细胞菌体密度(分光光度计定量测定)或肉眼观察菌液浑浊度，即可对待测溶液所含的重金属离子(无机二价汞离子或铅离子)含量进行定性。

一种利用上述全细胞生物传感器快速检测重金属离子的方法，包括如下步骤：将全细胞生物传感器(重组大肠杆菌)与重金属离子孵育，大肠杆菌细胞裂解并释放β-半乳糖苷酶；表现为大肠杆菌菌体密度显著下降，既可通过分光光度计定量检测，也可肉眼观察可见，实现对待测样品是否含有重金属离子的定性检测。

通过检测释放到生物传感器细胞外的beta-半乳糖苷酶酶活，即可对待测溶液所含的重金属离子(无机二价汞离子或铅离子)含量进行定量。酶活检测方案见如下方案之一：

方案一：将裂解液与预制好的含有X-gal或oNPG的凝胶块孵育，对凝胶拍照转变为灰度照片，把白色与黑色之间按对数关系分成若干级，范围从0到255，白色为255，黑色为0；建立重金属离子浓度与凝胶灰度值之间的关系，绘制显色凝胶标准曲线；对待测样品中重金属离子浓度进行半定量分析，计算出离子浓度。

方案二：也可以利用酶标仪对β-半乳糖苷酶进行酶活检测，通过标准曲线，精确定量样品中的离子浓度。

具体包括如下步骤：

方案一：显色凝胶法半定量半定量检测重金属离子

(A)制备大肠杆菌检测液；

(B)在Z buffer中加入2％(m/v)琼脂粉，加热溶解后再加入X-gal溶液或oNPG溶液至终浓度为1mg/mL，混匀后加入到96孔板中，室温冷却凝固，制得显色凝胶，备用；

(C)将大肠杆菌检测液与不同浓度梯度的重金属离子标准样品混合，同时以添加同体积纯溶剂的大肠杆菌检测液作对照；样品均在35～37℃，220rpm条件下继续培养20min；取培养液上清加入到含有显色凝胶的小孔中，35～37℃孵育30min；对凝胶拍照转变为灰度照片，把白色与黑色之间按对数关系分成若干级，范围从0到255，白色为255，黑色为0；建立重金属离子浓度与凝胶灰度值之间的关系，绘制显色凝胶标准曲线；

(D)将待测样品与大肠杆菌检测液混合，在35～37℃，220rpm条件下继续培养20min；取培养液上清加入到含有显色凝胶的小孔中，35～37℃孵育30min；对凝胶拍照转变为灰度照片，获得凝胶灰度值；根据步骤(C)的显色凝胶标准曲线，计算得出待测样品中重金属离子的浓度。

方案二：酶标仪法检测重金属离子

(A)制备大肠杆菌检测液；

(B)将大肠杆菌检测液与不同浓度梯度的重金属离子标准样品混合，同时以添加同体积纯溶剂的大肠杆菌检测液作对照；样品均在35～37℃，220rpm条件下继续培养20min；取培养液上清与底物X-gal溶液或oNPG溶液混合，35～37℃反应30min，测定β-半乳糖苷酶酶活；建立β-半乳糖苷酶酶活与重金属离子浓度的关系，绘制标准曲线；

(C)将待测样品与大肠杆菌检测液混合，在35～37℃，220rpm条件下继续培养20min；培养液上清与底物X-gal溶液或oNPG溶液混合，35～37℃反应30min，测定β-半乳糖苷酶酶活；根据步骤(B)的标准曲线，计算得出待测样品中重金属离子的浓度。

优选的，步骤(一)(B)中所述的Z buffer：以50mL计，在50mL 1×PBS缓冲溶液中添加0.12g MgSO₄和45μLβ-巯基乙醇。

优选的，步骤(一)(C)中所述的显色凝胶标准曲线如下：

Hg²⁺，Y＝212.5-2.099X-0.02141X²，R²＝0.9922(0<X≤40nM)

Pb²⁺，Y＝244.7-0.13X-2.509*10^-5X²，R²＝0.9850(0<X≤2000nM)

其中，X表示重金属离子浓度(nM)，Y表示凝胶灰度值，R²为拟合曲线的相关系数。

优选的，步骤(二)(B)中所述的标准曲线如下：

Hg²⁺，Y＝6.761*X-133.0，R²＝0.997(0<X≤80)

Pb²⁺，Y＝0.2208*X-25.68，R²＝0.982(0<X≤2000)

其中，X表示重金属离子浓度(nM)，Y表示胞外酶活(U/mL)，R²为拟合曲线的相关系数。

所述的大肠杆菌检测液的制备方法，包括如下步骤：

(a)将重组大肠杆菌用LB固体培养基进行培养，使其复苏活化；

(b)挑取单菌落接入到LB液体培养基中进行震荡培养过夜；

(c)以1：50～100体积比接种到新鲜的LB液体培养基中，培养至菌液OD₆₀₀为0.4～0.8，加入IPTG并培养30min，得到大肠杆菌检测液。

优选的，步骤(a)中所述的培养的条件为37℃条件下培养14h。

优选的，步骤(b)中所述的震荡培养过夜的条件为在37℃、220rpm条件下培养12～16h。

优选的，步骤(c)中所述的培养的条件为在35～37℃，220rpm条件下培养。

优选的，所述的菌液OD₆₀₀为0.4～0.5。

优选的，所述的IPTG的浓度为0.1mM。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)操作对象为大肠杆菌，无致病风险，操作简单易行。

(2)利用SRRz裂解基因作为报告元件，响应迅速，从接触样品到获得结果，仅需30～60min。

(3)利用SRRz裂解基因作为报告元件，导致微生物菌体裂解，微生物菌液浑浊度明显发生改变，既可以通过常见的可见光分光光度计检测，也可以通过肉眼直接观察获得结果。

(4)利用X-gal对释放到细胞外的β-半乳糖苷酶进行检测，操作简便。应用无需使用到昂贵的仪器，大大减小了检测的成本，并且使现场检测成为可能。

(5)利用含有oNPG的显色凝胶对胞外β-半乳糖苷酶酶活进行准确定量，检出限低，检测结果准确。

(6)该方法可为日常重金属污染检测和突发重金属污染检测提供技术支持。

附图说明

图1是重金属响应载体构建示意图。

图2是不同检测菌接触不同重金属离子水样0.5小时菌液浑浊度变化。

图3是各测试菌与不同重金属离子接触后，胞外β-半乳糖苷酶酶活。

图4是各测试菌与不同浓度重金属离子接触0.5小时，显色凝胶图。其中1，2，3分别代表重复样。

图5是重金属离子显色凝胶标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1重金属离子响应重组菌的获得

以pSB1C3为出发载体(iGEM，http://parts.igem.org/Part:pSB1C3)，构建重金属响应载体。重金属响应载体构建示意图如图1所示。具体构建方法如下：

1、分别合成汞和铅离子响应的响应蛋白和双向启动子序列(SEQ ID No.1和SEQID No.2)，序列从5′到3′依次为EcoRI、NotI、XbaI、响应蛋白反向互补编码基因、双向启动子、SpeI、NotI和PstI。

2、合成裂解基因SRRz，其序列见SEQ ID No.3，序列从5′到3′依次为EcoRI、NotI、XbaI、SRRz裂解基因、SpeI、NotI和PstI。

3、合成终止子T_rrnB，其序列见SEQ ID No.4，序列从5′到3′依次为EcoRI、NotI、XbaI、T_rrnB终止子、SpeI、NotI和PstI。

4、将含有汞离子响应蛋白和双向启动子序列SEQ ID No.1用XbaI和PstI双酶切，含有终止子T_rrnB序列SEQ ID No.4用EcoRI和SpeI双酶切，载体pSB1C3用EcoRI和PstI双酶切，三者在连接酶作用下环化形成pSB1C3-T_rrnB-HgR，其中T_rrnB-HgR的连接是依靠SpeI和XbaI酶切产生同尾序列进行连接的。

5、将含有铅离子响应蛋白和双向启动子序列SEQ ID No.2用XbaI和PstI双酶切，含有终止子T_rrnB序列SEQ ID No.4用EcoRI和SpeI双酶切，载体pSB1C3用EcoRI和PstI双酶切，三者在连接酶作用下环化形成pSB1C3-T_rrnB-PbR，其中T_rrnB-PbR的连接是依靠SpeI和XbaI酶切产生同尾序列进行连接的。

6、将含有SRRz裂解基因的序列SEQ ID No.3用EcoRI和SpeI双酶切，含有终止子T_rrnB序列SEQ ID No.4用XbaI和PstI双酶切，载体pSB1C3用EcoRI和PstI双酶切，三者在连接酶作用下环化形成pSB1C3-SRRz-T_rrnB，其中SRRz-T_rrnB的连接是依靠SpeI和XbaI酶切产生同尾序列进行连接的。

7、质粒pSB1C3-T_rrnB-HgR采用SpeI和PstI双酶切，质粒pSB1C3-SRRz-T_rrnB采用XbaI和PstI双酶切，目的片段纯化后连接获得汞离子响应载体，命名为pSB1C3-MHg。

8、质粒pSB1C3-T_rrnB-PbR采用SpeI和PstI双酶切，质粒pSB1C3-SRRz-T_rrnB采用XbaI和PstI双酶切，目的片段纯化后连接获得铅离子响应载体，命名为pSB1C3-MPb。

9、将步骤7和8所得的载体分别按常规方法转入到E.coli BL21感受态细胞，获得重金属检测用的重组大肠杆菌，即全细胞生物传感器。

实施例2菌体裂解效率快速检测样品重金属离子浓度

1、重组大肠杆菌的复苏活化

将重组大肠杆菌从-80℃冰箱中划线于LB平板培养基中，在37℃条件下恢复培养14h。挑取单菌落，接种至LB培养基中，在37℃、220rpm条件下培养12～16h。

2、大肠杆菌检测液制备

将复苏活化的菌液以1：50体积比例接种至新鲜LB培养基，在35～37℃，220rpm条件下培养至OD₆₀₀到0.4～0.8，加入0.1mM IPTG至锥形瓶中，继续培养0.5h，得到大肠杆菌检测液。

3、与受试样品接触

将锥形瓶内的大肠杆菌检测液分装到不同试管中，每个试管5mL，将受试样品10μL加入到试管内，在35～37℃，220rpm条件下继续培养20min。

4、样品检测

取菌液用分光光度计测定OD₆₀₀。

取菌液在17000g，4℃条件下离心2min，取上清在96孔板中，按表1配制β-半乳糖苷酶酶活检测体系。

表1酶活检测体系配制

试剂	体积
		Z buffer	136μL
oNPG(4mg/mL)	44μL
		裂解液离心上清	0.2OD<sub>600</sub>

其中Z buffer配制方法：在50mL 1×PBS缓冲溶液中添加0.12g MgSO₄和45μL β-巯基乙醇。

β-半乳糖苷酶酶活定义：

U＝1000×[(OD₄₂₀-1.75×OD₅₅₀)]/(T×V×OD₆₀₀)

其中，OD₄₂₀、OD₅₅₀和OD₆₀₀为在相应波长下的样品吸光值，T为加入反应底物oNPG后的反应时间，V是样品稀释后的体积(单位：mL)。

实验结果表明，当测试菌与含有不同重金属离子浓度的样品接触时，测试菌发生菌体裂解，释放胞内的β-半乳糖苷酶，且释放的酶量与离子浓度有相关，如图2所示。

根据检测图，相应重金属离子的检测标准曲线如图3所示。

Hg²⁺，Y＝6.761*X-133.0，R²＝0.997(0<X≤80)

Pb²⁺，Y＝0.2208*X-25.68，R²＝0.982(0<X≤2000)

其中，X表示重金属离子浓度(nM)，Y表示胞外酶活(U/mL)，R²为拟合曲线的相关系数。

实施例3结合显色凝胶法的重金属离子凝胶半定量快速检测

1、显色凝胶制备

1.1在20mL Z buffer中加入0.4g琼脂粉，微波炉加热溶解后在70℃水浴中保温备用。

1.2在上述溶液中加入40mg/mL的X-gal溶液至终浓度为1mg/mL，混匀后吸取200μL加入到96孔板中，室温冷却凝固后4℃保存备用。可保存3个月以上。

2、显色凝胶标准曲线绘制

按实施例2步骤1-3将测试菌活化、培养并与待测试样品接触。取10μL菌液加入到含有检测凝胶的小孔中，37℃孵育30min。不同金属离子浓度，凝胶会呈现不同深浅的蓝色(图4)。

利用相机对凝胶拍照转变为灰度照片，把白色与黑色之间按对数关系分成若干级，范围从0到255，白色为255，黑色为0。建立金属离子浓度与凝胶灰度值之间的关系(图5)，绘制显色凝胶标准曲线；拟合曲线相关系数分别达到R²＝0.9922(Hg²⁺)和R²＝0.9850(Pb²⁺)。

根据图5，显色凝胶标准曲线如下：

Hg²⁺，Y＝212.5-2.099X-0.02141X²，R²＝0.9922(0<X≤40nM)

Pb²⁺，Y＝244.7-0.13X-2.509*10^-5X²，R²＝0.9850(0<X≤2000nM)

其中，X表示重金属离子浓度(nM)，Y表示凝胶灰度值，R²为拟合曲线的相关系数。

3、重金属离子样品检测

按实施例2步骤1～3将测试菌活化、培养并与待测试样品接触。取10μL菌液加入到含有检测凝胶的小孔中，37℃孵育30min。扫描凝胶拍照，根据显色凝胶标准曲线，计算得出样品中对应的重金属离子浓度。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

广州德隆环境检测技术有限公司

<120> 检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器及其构建与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 549

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<222> (1)..(22)

<223> 对应的酶切位点依次为EcoRI、NotI、XbaI

<220>

<222> (23)..(457)

<223> 汞离子响应蛋白编码基因的反向互补序列

<220>

<222> (458)..(528)

<223> 双向启动子序列

<220>

<222> (529)..(549)

<223> 对应的酶切位点依次为SpeI、NotI和PstI

<400> 1

gaattcgcgg ccgcttctag agttaaaccg catcagcacc acgcggttct ttttcacctt 60

gcagagacgc gatcagcggg caagaaacgt taccctgacg cgcgtggcac gcgaaaacca 120

gttcagacag aacggtttcc atacgcgcca gatcggtcat tttttcacga acatcctgta 180

atttgtgttc agccagagaa gacgcttctt cgcagtgggt accatcatcc agacgcagca 240

gttcagcgat ttcatccaga gagaaaccca gacgctgcgc agatttaacg aaacgaacac 300

gggtaacatc agcttcacca taacgacgga tgctaccata cggtttatcc ggttccggca 360

gcagaccttt acgctgatag aaacggatgg tttcaacgtt aacacccgca gctttcgcga 420

aaacaccgat ggtcaggttt tccaggtttt tctccatatc gcttgactcc gtacattggt 480

acggaagtaa gcttaagcta tccaatccag atttgaaagg acaagcgtta ctagtagcgg 540

ccgctgcag 549

<210> 2

<211> 563

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<222> (1)..(22)

<223> 对应的酶切位点依次为EcoRI、NotI、XbaI

<220>

<222> (23)..(457)

<223> 铅离子响应蛋白编码基因的反向互补序列

<220>

<222> (458)..(542)

<223> 双向启动子序列

<220>

<222> (543)..(563)

<223> 对应的酶切位点依次为SpeI、NotI和PstI

<400> 2

gaattcgcgg ccgcttctag agttagccgc tggtctggct gttggtcgcg ctttcgccgt 60

ggcagttacc cagaccttgc aggatgccgc acgcttccac gctacggctg ccagagcatt 120

tttcacgcag atcaaccagg tgacgtttca gctggagcag cgcgctaaca cgcatttcaa 180

cctgctggat gtgcgcttcc agcagggtga taacttcgcc gcaatcctgc atcgggttat 240

cacgcagacc cagcagcgca cggatttcgc tcagggtcat atccaggcta cggcagtgac 300

ggatgaattg cagacgttcg atgtgcgctt cgccgtacag acggaagttg ccgccagaac 360

gcgccggttt cggcagcagg ccttcttttt cgtagtaacg gatggtaaca acttcgcagc 420

cgctacgctt cgccagatca ccgatacgga tttccatgca tcaatctcca attatcactt 480

gactctatag tgactataga gattttaatg gaggctgaat agaagatttt caggagttac 540

tctactagta gcggccgctg cag 563

<210> 3

<211> 1592

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<222> (1)..(22)

<223> 对应的酶切位点依次为EcoRI、NotI、XbaI

<220>

<222> (1572)..(1592)

<223> 对应的酶切位点依次为SpeI、NotI和PstI

<400> 3

gaattcgcgg ccgcttctag aggccactgt ctgtcctgaa ttcattagta atagttacgc 60

tgcggccttt tacacatgac cttcgtgaaa gcgggtggca ggaggtcgcg ctaacaacct 120

cctgccgttt tgcccgtgca tatcggtcac gaacaaatct gattactaaa cacagtagcc 180

tggatttgtt ctatcagtaa tcgaccttat tcctaattaa atagagcaaa tccccttatt 240

gggggtaaga catgaagatg ccagaaaaac atgacctgtt ggccgccatt ctcgcggcaa 300

aggaacaagg catcggggca atccttgcgt ttgcaatggc gtaccttcgc ggcagatata 360

atggcggtgc gtttacaaaa acagtaatcg acgcaacgat gtgcgccatt atcgcctggt 420

tcattcgtga ccttctcgac ttcgccggac taagtagcaa tctcgcttat ataacgagcg 480

tgtttatcgg ctacatcggt actgactcga ttggttcgct tatcaaacgc ttcgctgcta 540

aaaaagccgg agtagaagat ggtagaaatc aataatcaac gtaaggcgtt cctcgatatg 600

ctggcgtggt cggagggaac tgataacgga cgtcagaaaa ccagaaatca tggttatgac 660

gtcattgtag gcggagagct atttactgat tactccgatc accctcgcaa acttgtcacg 720

ctaaacccaa aactcaaatc aacaggcgcc ggacgctacc agcttctttc ccgttggtgg 780

gatgcctacc gcaagcagct tggcctgaaa gacttctctc cgaaaagtca ggacgctgtg 840

gcattgcagc agattaagga gcgtggcgct ttacctatga ttgatcgtgg tgatatccgt 900

caggcaatcg accgttgcag caatatctgg gcttcactgc cgggcgctgg ttatggtcag 960

ttcgagcata aggctgacag cctgattgca aaattcaaag aagcgggcgg aacggtcaga 1020

gagattgatg tatgagcaga gtcaccgcga ttatctccgc tctggttatc tgcatcatcg 1080

tctgcctgtc atgggctgtt aatcattacc gtgataacgc cattacctac aaagcccagc 1140

gcgacaaaaa tgccagagaa ctgaagctgg cgaacgcggc aattactgac atgcagatgc 1200

gtcagcgtga tgttgctgcg ctcgatgcaa aatacacgaa ggagttagct gatgctaaag 1260

ctgaaaatga tgctctgcgt gatgatgttg ccgctggtcg tcgtcggttg cacatcaaag 1320

cagtctgtca gtcagtgcgt gaagccacca ccgcctccgg cgtggataat gcagcctccc 1380

cccgactggc agacaccgct gaacgggatt atttcaccct cagagagagg ctgatcacta 1440

tgcaaaaaca actggaagga acccagaagt atattaatga gcagtgcaga tagagttgcc 1500

catatcgatg ggcaactcat gcaattattg tgagcaatac acacgcgctt ccagcggagt 1560

ataaatgcct atactagtag cggccgctgc ag 1592

<210> 4

<211> 290

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<222> (1)..(22)

<223> 对应的酶切位点依次为EcoRI、NotI、XbaI

<220>

<222> (270)..(290)

<223> 对应的酶切位点依次为SpeI、NotI和PstI

<400> 4

gaattcgcgg ccgcttctag agaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg 60

ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc 120

gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg tggcgggcag gacgcccgcc 180

ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg acggatggcc tttttgcgtt 240

tctacaaact cttcctgtcg tcatatctat actagtagcg gccgctgcag 290