阅读说明：本技术 基于2-甲基-5,7-二氯-8-羟基喹啉构筑的稀土配合物及其制备方法和应用 (Rare earth complex constructed based on 2-methyl-5, 7-dichloro-8-hydroxyquinoline and preparation method and application thereof ) 是由 邹华红 梁福沛 于 2019-11-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了两例基于2-甲基-5,7-二氯-8-羟基喹啉构筑的稀土配合物及其制备方法和应用。这两例配合物分别为配合物1和配合物2,配合物1的分子式为[Er(ClQ)<Sub>3</Sub>(H<Sub>2</Sub>O)],配合物2的分子式为[Ho(ClQ)<Sub>3</Sub>(H<Sub>2</Sub>O)],其中ClQ为2-甲基-5,7-二氯-8-羟基喹啉脱去羟基氢原子,带一个单位负电荷。本发明所述稀土配合物的制备方法为：取2-甲基-5,7-二氯-8-羟基喹啉和硝酸铒六水合物或硝酸钬六水合物,用混合溶剂溶解,在pH＝7.7-8.2且加热条件下反应,即得。申请人的试验结果表明,这两例稀土配合物对多种肿瘤细胞具有显著抗增殖作用,且对人正常肝细胞毒性低,有望开发成抗肿瘤药物。(The invention discloses two rare earth complexes constructed based on 2-methyl-5, 7-dichloro-8-hydroxyquinoline, and a preparation method and application thereof. The two complexes are respectively complex 1 and complex 2, and the molecular formula of the complex 1 is [ Er (ClQ) 3 (H 2 O)]The molecular formula of the complex 2 is [ Ho (ClQ) 3 (H 2 O)]Wherein ClQ is 2-methyl-5, 7-dichloro-8-hydroxyquinoline without hydroxyl hydrogen atom, and has a unit negative charge. The preparation method of the rare earth complex comprises the following steps: dissolving 2-methyl-5, 7-dichloro-8-hydroxyquinoline and erbium nitrate hexahydrate or holmium nitrate hexahydrate in a mixed solvent, and reacting under the heating condition at the pH value of 7.7-8.2 to obtain the compound preparation. The test results of the applicant show that the two rare earth complexes are used for treating various tumorsThe cell has obvious antiproliferative effect and low toxicity to normal human liver cells, and is expected to be developed into antitumor drugs.)

基于2-甲基-5,7-二氯-8-羟基喹啉构筑的稀土配合物及其制 备方法和应用

技术领域

本发明涉及稀土配合物，具体涉及基于2-甲基-5,7-二氯-8-羟基喹啉构筑的稀土配合物及其制备方法和应用。

背景技术

目前，肿瘤俨然是人类死亡的第二大疾病，严重危害国民身心健康。恶性肿瘤常见的有肺癌、***、乳腺癌、肝癌、淋巴癌、白血病等类型。临床上，铂类抗肿瘤药物依旧是***重要的化疗药物之一，它占临床化疗药物应用的50％以上。这类药物对抗癌症的主要靶点为双链DNA，其中的主要作用机制是干预肿瘤细胞中DNA的双链复制，从中发挥克制细胞生长的目标。尽管它们作为抗癌药物具有很重要的影响，但这些药物具有明显的副作用，加上其固有的耐药性不足促使研究人员开发新的铂和非铂化合物。这样的情况引发一系列以金属离子为特征的配合物的研究，其中钌化合物在临床试验中具有较成功的例子，因此也成为候选药物的最佳代表。在构筑配合物时，本领域的研究人员公认通过使用具有生物活性的配体来参与构筑是实现合成多功能化合物的有效方法，如此建构目标产物能理想地使金属中心和配体之间的产生协同效应。

喹啉和羟基喹啉被认为是一种特殊的结构，因为这些杂环广泛存在于天然和合成的生物活性分子中，其与不同的靶标相互作用，在多种疾病状态中诱导重要的功能变化。喹啉衍生物的化学研究在过去几年中甚至直到现在仍受到特别的关注，研究人员已经合成了多种以喹啉为载体的抗疟药、抗过敏药、抗病毒药、抗炎药和杀菌药等。已有的试验表明，2-甲基 -5,7-二氯-8-羟基喹啉对多种肿瘤细胞不具抗增殖活性(IC₅₀>50uM)，目前尚未见有以2-甲基-5,7-二氯-8-羟基喹啉为配体与镧系金属铒和钬进行构筑使所得配合物具有显著的肿瘤抑制活性的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供两例对多种肿瘤细胞具有显著抑制活性且对人正常肝细胞毒性低的基于2-甲基-5,7-二氯-8-羟基喹啉构筑的稀土配合物及其制备方法和应用。

本发明所述的基于2-甲基-5,7-二氯-8-羟基喹啉构筑的稀土配合物，具体为配合物1或配合物2，其中：

配合物1的分子式为：[Er(ClQ)₃(H₂O)]，其中ClQ为2-甲基-5,7-二氯 -8-羟基喹啉脱去羟基氢原子，带一个单位负电荷；

该配合物属于单斜晶系，C2/c空间群，晶胞参数为：

α＝90.00°，β＝119.199(2)°，γ＝90.00°；

配合物2的分子式为：[Ho(ClQ)₃(H₂O)]，其中ClQ为2-甲基-5,7-二氯 -8-羟基喹啉脱去羟基氢原子，带一个单位负电荷；

该配合物属于单斜晶系，C2/c空间群，晶胞参数为：

α＝90.00°，β＝119.095(2)°，γ＝90.00°。

本发明还提供上述基于2-甲基-5,7-二氯-8-羟基喹啉构筑的稀土配合物的制备方法，具体为：取2-甲基-5,7-二氯-8-羟基喹啉和硝酸铒六水合物或硝酸钬六水合物，用混合溶剂溶解，调节所得溶液的pH＝7.7-8.2，所得混合液于加热条件下反应，即得到相应的目标产物；其中，所述的混合溶剂为乙酸乙酯与水的组合物。

上述制备方法中涉及的2-甲基-5,7-二氯-8-羟基喹啉，可以参考现有文献(如JiantongCui,Synthesis of chlorquinaldol,Zhongguo Yiyao Gongye Zazhi,39(2008),733；或者是Oleg V.Larionov,Direct,catalytic,and regioselective synthesis of 2-alkyl-,aryl-,and alkenyl-substituted N-heterocycles from N-oxides,OrganicLetters,16(2014),864-867)等报道的方法进行制备，也可以自行设计方案合成，或者是直接购买。

上述制备方法中，所述的2-甲基-5,7-二氯-8-羟基喹啉和硝酸铒六水合物或硝酸钬六水合物的摩尔比为化学计量比，在实际操作过程中，硝酸铒六水合物或硝酸钬六水合物的量可相对过量一些。

上述制备方法中，所述的混合溶剂中，乙酸乙酯与水的体积比优选为 3-5：1。所述混合溶剂的用量可根据需要确定，通常以能溶解参加反应的原料为宜，具体地，以1mmol的2-甲基-5,7-二氯-8-羟基喹啉为基准计算，全部原料所用混合溶剂的总用量一般为5-10mL。在具体溶解的步骤中，可将稀土硝酸盐(硝酸铒六水合物或硝酸钬六水合物)与2-甲基-5,7-二氯-8- 羟基喹啉分别用混合溶剂溶解，再混合在一起反应，也可将稀土硝酸盐与2-甲基-5,7-二氯-8-羟基喹啉混合后再加混合溶剂溶解。

上述制备方法中，可以采用现有常用的碱性物质(如碳酸钠、吡啶或叔丁醇钠等)来调节溶液的pH值，优选是采用三乙胺调节溶液的pH值。本发明所述技术方案中，优选调节溶液的pH＝7.9-8.1。

上述制备方法中，通常是将调节pH值后所得的混合液置于容器中，密封之后再置于加热条件下反应。所述反应优选是在60-100℃条件下进行，在该温度范围内进行反应的时间通常控制在30-80h，也可以是80h 以上；优选是将反应时间控制在60-80h。反应更优选是在80-100℃条件下进行。通常采用一端封闭的厚壁硬质玻璃管来盛装调节pH值后所得的混合液。

本发明还包括上述任一基于2-甲基-5,7-二氯-8-羟基喹啉构筑的稀土配合物及其药效学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用，更具体的，是在制备治疗人膀胱癌和/或人卵巢癌和/或人***的药物中的应用。

本发明进一步包括一种药物组合物，其含有治疗上有效剂量的上述任一稀土配合物或其药效学上可接受的盐。

与现有技术相比，本发明提供了两例结构新颖的基于2-甲基-5,7-二溴 -8-羟基喹啉构筑的稀土配合物及其制备方法，申请人的试验结果表明，这两例稀土配合物对多种肿瘤细胞具有显著抗增殖作用(活性显著高于顺铂)，而且它们对人正常肝细胞毒性低，有望开发成抗肿瘤药物。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的最终产物的晶体结构图。

图2为本发明实施例4制得的最终产物的晶体结构图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。

以下各实施例中涉及的2-甲基-5,7-二氯-8-羟基喹啉(以下也简称为配体或配体H-ClQ)按下述合成路线进行制备：

具体的制备方法为：将0.1mol 2-甲基-8羟基喹啉加入到100mL冷的冰醋酸中，然后把0.05mol(13.74g)二氯海因分成两份，分批(隔20min) 加入到底物的冰醋酸溶液中。每份加完后，继续在冰水浴中反应。3h后反应结束，将反应液倒入到冰水中，不断地搅拌，得到黄色的沉淀。抽滤，滤饼用冰水冲洗三次，常温下干燥，得到黄色的固体。粗品用甲醇重结晶，得到目标产物2-甲基-5,7-二氯-8-羟基喹啉。元素分析(％)(C₁₀H₇NOCl₂)，实验值:C，52.83，H，3.19，N，6.06；理论值:C,52.63，H，3.07，N， 6.14。IR(KBr,cm^-1):2833(w)，2468(w)，1610(m)，1437(s)，1321(s)，1244(s)，1167(m)，946(s)，849(m)，762(m)，695(w)。

实施例1：配合物1(即配合物[Er(ClQ)₃(H₂O)])的制备

将45mg(0.2mmol)配体H-ClQ和46mg(0.1mmol)Er(NO₃)₃·6H₂O 加到一端封闭长约18cm的Pyrex管中，加入1.25mL由乙酸乙酯和水组成的混合溶剂(乙酸乙酯和水的体积比为4：1)，滴加2滴Et₃N(搅拌均匀后体系的pH值为8.0)，将Pyrex管抽真空，将其另一端封口。将封好的Pyrex管放进80℃的烘箱中，反应72h，缓慢冷却至室温，可观察到Pyrex 管底部有黄色条状晶体析出，收集晶体，干燥。产率为67.9％(以 Er(NO₃)₃·6H₂O计算)。

对本实施例所得产物进行表征：

1)元素分析(％)(C₃₀H₂₀Cl₆ErN₃O₄)，实验值:C，41.43，H，2.43，N， 4.80；理论值:C，41.58，H，2.33，N，4.85。

2)红外光谱：IR(KBr,cm^-1):3786(w)，2919(w)，1546.49(s)，1444(s)， 1372(s)，1252.3(m)，1109(m)，951.3(m)，824(w)，752.35(s)，652(w)， 545.4(w)，431(w)。

3)晶体结构分析：

通过X-射线衍射测定表面结构完好的黄色条状晶体以确定其晶体结构，所得晶体结构数据如下述表1所示，部分键长键角数据如下述表2所示，所得黄色条状晶体的晶体结构如图1所示，确定所得黄色条状晶体为配合物1(即配合物[Er(ClQ)₃(H₂O)]，其中ClQ为2-甲基-5,7-二氯-8-羟基喹啉脱去羟基氢原子，带一个单位负电荷)。

表1：配合物1和2的晶体结构数据表

^aR₁＝Σ||F_o|–|F_c||/Σ|F_o|；^bwR₂＝[Σw(F_o ²–F_c ²)²/Σw(F_o ²)²]^1/2.

表2：配合物1和2的部分键长键角表

配合物2

X-射线衍射分析，配合物1属单斜晶系，C2/c空间群，配位构型为单帽三角棱柱，铒离子为七配位，分别与三个2-甲基-5,7-二氯-8-羟基喹啉配体上的三个酚羟基氧原子(O1，O2，O3)、三个氮原子(N1，N2，N3)配位, 一个水分子上的氧原子(O4)配位，键长分别为Er1-O1：

Er1-O2：

Er1-O3：

Er1-O4：

Er1-N1：

Er1-N2：

Er1-N3：

所有的稀土Er原子与配位原子N、O之间的键长都处于正常的Ln-N与Ln-O键长范围内。

对比例1-1

重复实施例1，不同的是，将混合溶剂改为乙酸乙酯、甲醇、乙腈、二氯甲烷、氯仿、DMF或DMSO等单一的溶剂。结果没有晶体或其它形状(如粉末)产物生成。

对比例1-2

重复实施例1，不同的是，将混合溶剂中的乙酸乙酯用石油醚、氯仿、 DMF或DMSO替代。结果没有晶体或其它形状(如粉末)产物生成。

对比例1-3

重复实施例1，不同的是，用Er(C₂H₃O₂)₃·4H₂O、高氯酸铒六水合物或ErCl₃·6H₂O代替Er(NO₃)₃·6H₂O，希望得到配合物1亦或是新的结构的配合物，但均未得到晶体，说明用其它铒盐无法达到形成铒配合物和结晶的热力学条件。

实施例2：配合物1的制备

重复实施例1，不同的是：将混合溶剂中乙酸乙酯和水的体积比更改为3：1，用Et₃N调节体系的pH＝7.7，将反应改在60℃条件下进行，反应的时间为80h。

结果得到黄色条状晶体。产率62％(基于Er(NO₃)₃·6H₂O)。

对本实施例所得产物进行元素分析、红外分析及X-射线衍射分析，确定所得的黄色条状晶体为目标产物配合物1。

实施例3：配合物1的制备

重复实施例1，不同的是：将混合溶剂中乙酸乙酯和水的体积比更改为5：1，用Et₃N调节体系的pH＝8.2，将反应改在100℃条件下进行，反应的时间为36h。

结果得到黄色条状晶体。产率65％(基于Er(NO₃)₃·6H₂O)。

对本实施例所得产物进行元素分析、红外分析及X-射线衍射分析，确定所得的黄色条状晶体为目标产物配合物1。

实施例4：配合物2(即配合物[Ho(ClQ)₃(H₂O)])的制备

将45mg(0.2mmol)配体H-ClQ和46mg(0.1mmol)Ho(NO₃)₃·6H₂O 加到一端封闭长约20cm的Pyrex管中，加入1.25mL由乙酸乙酯和水组成的混合溶剂(乙酸乙酯和水的体积比为4：1),滴加2滴Et₃N,(搅拌均匀后体系的pH值为8.1)，将Pyrex管抽真空，将其另一端封口。待封好的Pyrex 管放进80℃的烘箱中，反应72h，缓慢冷却至室温，可观察到Pyrex管底部有黄色条状晶体析出，收集晶体，干燥。产率约为71.2％(以 Ho(NO₃)₃·6H₂O计算)。

对本实施例所得产物进行表征：

1)元素分析(％)(C₃₀H₂₀Cl₆HoN₃O₄)，实验值:C，41.43，H，2.46，N，4.80；理论值:C，41.58，H，2.33，N，4.85。

2)红外光谱：IR(KBr,cm^-1):2929(w)，1549(m)，1444(s)，1367(s)， 1262(m)，1107(m)，961(m)，823(w)，776(m)，741.48(s)，545(w)，430 (w)。

3)晶体结构分析：

通过X-射线衍射测定表面结构完好的黄色条状晶体以确定其晶体结构，所得晶体结构数据如上述表1所示，部分键长键角数据如上述表2所示，所得黄色条状晶体的晶体结构如图2所示，确定所得黄色条状晶体为配合物2(即配合物[Ho(ClQ)₃(H₂O)]，其中ClQ为2-甲基-5,7-二氯-8-羟基喹啉脱去羟基氢原子，带一个单位负电荷)。

由X-射线衍射分析结果可知，配合物2和配合物1的晶体结构和配位方式类似，不同的是中心金属为钬离子。

对比例4-1

重复实施例4，不同的是，将混合溶剂改为乙酸乙酯、甲醇、乙腈、二氯甲烷、氯仿、DMF或DMSO等单一的溶剂。结果没有晶体或其它形状(如粉末)产物生成。

对比例4-2

重复实施例4，不同的是，将混合溶剂中的乙酸乙酯用二氯甲烷、氯仿、DMF或DMSO替代。结果没有晶体或其它形状(如粉末)产物生成。

对比例4-3

重复实施例4，不同的是，不同的是，用Ho(C₂H₃O₂)₃·4H₂O、高氯酸钬六水合物或氯化钬六水合物代替Ho(NO₃)₃·6H₂O，希望得到配合物2亦或是新的结构的配合物，但均未得到晶体，说明用其它钬盐无法达到形成钬配合物和结晶的热力学条件。

实施例5：配合物2的制备

重复实施例4，不同的是：用吡啶调节体系的pH＝8.1，将反应改在50℃条件下进行，反应的时间为80h。

结果得到黄色条状晶体。产率65％(基于Ho(NO₃)₃·6H₂O)。

对本实施例所得产物进行元素分析、红外分析及X-射线衍射分析，确定所得的黄色条状晶体为目标产物配合物2。

实施例6：配合物2的制备

重复实施例4，不同的是：将混合溶剂中乙酸乙酯和水的体积比更改为5：1，用碳酸钠饱和溶液调节体系的pH＝7.8，将反应改在100℃条件下进行。

结果得到黄色条状晶体。产率63％(基于Ho(NO₃)₃·6H₂O)。

对本实施例所得产物进行元素分析、红外分析及X-射线衍射分析，确定所得的黄色条状晶体为目标产物配合物2。

实验例：配合物1和2的体外活性试验

1.1实验用到的仪器及试剂

实验用到的仪器和部分试剂分别如表3和4所示。

表3：实验用到的仪器及型号

表4：实验所用部分药品部分信息

1.2所用细胞株

卵巢腺癌SK-OV-3、膀胱癌细胞株T-24、***细胞HeLa、和正常人肝细胞HL-7702。

1.3细胞的接种与培养

所选取的细胞株均放到37℃、5％CO₂的培养箱里，采用含10％新生牛血清以及青链霉素各100U/mL的RPMI-1640培养液或DMEM培养液进行培养。每间隔12h运用倒置显微镜察看细胞生长状况，细胞使用0.25％胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用在细胞活性和机制实验研究。

1.4药物细胞水平的活性初筛

本实验对配体H-ClQ及金属配合物[Er(ClQ)₃(H₂O)](配合物1)、 [Ho(ClQ)₃(H₂O)](配合物2)，进行了抗肿瘤药物抑制体外细胞增殖的活性筛选和IC₅₀值的测定。配合物1以及配合物2与配体的纯度≥95％。用二甲基亚砜(DMSO)配置100μg/mL浓度配合物和配体，DMSO的浓度不大于1％。

1.5细胞生长抑制实验(MTT法)

Mosmann发明的MTT法(全名 [4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrabr-omide)是一种可以很方便地测试活细胞健康、反映细胞生长情况的比色波长分析法。检测原理：琥珀酸脱氢酶它只存在活细胞线粒体表层膜电位中，能在一定外力下还原为一种不溶于水的蓝紫色结晶—甲瓒，并能在细胞中沉积。作用于细胞中甲瓒能够被二甲基亚砜(DMSO)溶解。之后在电脑上运用酶标仪检测细胞在490 nm波长的吸光度值。在规定范围内的细胞数量，甲瓒结晶的量与癌细胞存活数成正比例。细胞增殖力越强，细胞群体中存活细胞比例越大，吸光度也就越强。

实验步骤：

①用25％胰蛋白酶消化细胞，并取处于对数生长的细胞放置于96孔培养板中，每孔180μL(约4500-5000个细胞)含10％血清的培养基；放入培养箱中孵育。

②待细胞贴壁生长，且显微镜下观察没有染菌和坏死细胞后，每孔加入20 μL量的稀释后的药品，每个药品设5个复孔，同时设置相应的空白对照组；

③继续培养48h后，取出，用排枪每孔轻缓的加入10μL MTT试剂(浓度为5mg/mL)；

④继续孵育4h后，将培养液吸走丢弃(注意不能碰到低层细胞)，向每个孔加进150μL DMSO，轻微震荡反应8～10min，使参与反应的细胞结晶颗粒能够充分溶解；

⑤转移到酶标仪前，设置空白对照组为零，测定每个96孔板的细胞吸光度值。

用spass软件计算各配合物和配体的抑制率。对初筛效果好的配合物，以顺铂为阳性对照，用5个浓度梯度继续做相应细胞株的IC₅₀值测试，所有试验反复3次后取其平均值。

1.6实验结果与讨论

表5和6分别为配体H-ClQ、配合物1和配合物2对卵巢腺癌SK-OV-3、膀胱癌细胞株T-24、***细胞HeLa及正常人肝细胞HL-7702的抑制率和IC₅₀值测定结果。总的来说，本发明所述配合物的活性均较为显著，对3种肿瘤细胞的抑制率都高于50％，且都比配体H-ClQ要强。进一步的IC₅₀值测定显示，在3种癌细胞株中，本发明所述的两例配合物都对 SK-OV-3卵巢癌细胞株的IC₅₀值最低，并且它们的抑制活性明显大于配体 H-ClQ，为继续筛选其他肿瘤细胞奠定了相应的实验基础。值得关注的是，两个配合物对HL-7702正常人肝细胞的细胞毒性很小，抑制率均为20％左右，远比配体的要小(34.15±1.03％)，实现了利用稀土金属中的Er和Ho 金属减小配体5,7-二氯-2-甲基-8-羟基喹啉H-ClQ毒性的目标。此外，从实验结果也可以看出，配合物Er和Ho对各个细胞株的抑制作用都比较好，其活性均大于相应的配体H-ClQ，然而就对正常HL-7702细胞的毒性的小，表中实验结果一致。

表5：配合物1、2、配体H-ClQ和顺铂对所选的四种人细胞的抑制率(％)

表6：配合物1、2、配体H-ClQ和顺铂对所选的四种人细胞的IC₅₀值(μM)

由表5和6可知，配合物1和2对3种人肿瘤细胞(人膀胱癌细胞T-24、人卵巢癌细胞SK-OV-3、人***细胞HeLa)和1种人正常细胞(正常肝细胞HL-7702)的抑制率和IC₅₀。MTT实验结果表示，配合物1和2对3种肿瘤细胞都表现出不同差别程度的增殖抑制作用，对SK-OV-3细胞株的抑制作用尤其明显，IC₅₀值分别为1.79±0.49μΜ和0.92±1.10μΜ，两个配合物的活性均比配体H-ClQ和顺铂好。此外，配合物1和2对人正常肝细胞(HL-7702)的抑制率比较低，说明这两个配合物具有选择性抑制SK-OV-3肿瘤细胞的生长，而且实现了利用稀土金属中的钬和铒减小配体 5,7-二氯-2-甲基-8-羟基喹啉毒性的目标。鉴于当今很多顺铂耐药性肿瘤细胞株在临床上没有得到很好的治疗，本研究为设计合成新型8-羟基喹啉镧系抗肿瘤活性化合物提供了新的思路。