阅读说明：本技术 一种新型香豆素类双光子巯基氨基酸荧光探针 (Novel coumarin two-photon sulfhydryl amino acid fluorescent probe ) 是由 吕正亮 孙鑫 范春华 于 2019-12-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种检测巯基氨基酸的双光子荧光探针,属于分析化学技术领域。该探针由制备的新型香豆素染料和2,4-二硝基苯磺酰氯在二氯甲烷中室温下制备而得。本发明所述的的荧光探针的制备原料易得,合成方法简单,对巯基氨基酸具有高选择性、高灵敏性、低检测限等优点。本发明所述荧光探针可应用于环境或细胞中的巯基氨基酸的检测。(The invention discloses a two-photon fluorescent probe for detecting sulfhydryl amino acid, belonging to the technical field of analytical chemistry. The probe is prepared from the prepared novel coumarin dye and 2, 4-dinitrobenzenesulfonyl chloride in dichloromethane at room temperature. The fluorescent probe provided by the invention has the advantages of easily available preparation raw materials, simple synthesis method, high selectivity, high sensitivity, low detection limit and the like on the sulfhydryl amino acid. The fluorescent probe can be applied to detection of sulfhydryl amino acid in environment or cells.)

一种新型香豆素类双光子巯基氨基酸荧光探针

技术领域

本发明提供了一种检测巯基氨基酸的双光子荧光探针，属于荧光探针技术领域。

技术背景

半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）是细胞中非常重要的三种巯基氨基酸，也被称为生物硫醇。它们在生物体内不但参与氧化还原反应过程保护细胞等免受氧化应激的损伤，还可以调节生物体内的细胞稳态和细胞代谢。首先，在生物生长发育的过程中，半胱氨酸（Cys）的缺乏会导致生长迟缓、毛发色素脱失、肝脏损伤。其次，人体血浆中，同型半胱氨酸（Hcy）含量的增加与阿尔兹海默病、心血管疾病以及骨质疏松等疾病密切相关。谷胱甘肽（GSH）在维持细胞还原环境的过程中发挥着重要作用，包括保持蛋白质中的半胱氨酸（Cys）处于还原状态以及通过捕获容易损伤DNA和RNA的自由基来保护细胞免受氧化应激影响。由于生物硫醇重要的生理作用，发展一种快速、灵敏、简便的检测生物硫醇的方法对于学术研究和潜在的疾病诊断非常重要。

目前，如高效液相色谱法、质谱法、气相色谱法及电化学方法等等都可以用于生物硫醇的检测。然而这些方法具有操作步骤复杂、所用仪器昂贵、响应时间长、激发波长短等缺点。相比较而言，荧光探针具有的高灵敏度、操作简单、检测时间短、低成本，以及能够实现对细胞和活体的实时可视化示踪的优点恰恰能够弥补传统检测方法的不足。针对于这些不足，本发明开发一种能够用于检测生物体内巯基氨基酸的双光子荧光探针，这将为环境或者化学生物学以及医学等相关领域的协同发展提供理论基础。

发明内容

本发明所述的一种检测巯基氨基酸的双光子荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的化学结构式

所示：

上述检测巯基氨基酸的荧光探针以如下方法制备：

在氮气保护、冰浴下，将0.31克化合物Ⅱ与0.23克的2,4-二硝基苯磺酰氯溶解于干燥的二氯甲烷中，在加入三乙胺，室温搅拌过夜，真空浓缩得粗产物，经柱层析分析得化合物I，收率为20％。

本发明所述的荧光探针可用于水溶液中的巯基氨基酸的同时检测。

进一步优选的，所述荧光探针用于在pH7.4的DMSO与PBS缓冲液（体积比为2：98）混合液中的生物硫醇的快速检测。该探针相对于半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽的检测限分别为2.5,1.7和0.84 nM。

本发明所述荧光探针用于在pH7.4的DMSO与PBS缓冲液混合液（体积比为2：98,1mMCTAB）中对巯基氨基酸具有快速响应性能。本发明通过实验验证，所述荧光探针在pH7.4的DMSO与PBS缓冲液混合液（体积比为2：98,1mM CTAB）中以480nm波长的光源作为激发光，其溶液几乎不发光。随着生物硫醇的加入，溶液在480nm的光激发时，溶液在617nm处发出强烈的橙色荧光，荧光增强倍数高达20倍。其它非巯基氨基酸的加入对巯基氨基酸的荧光没有影响。因此，本发明的荧光探针化合物对生物硫醇具有很高的选择性。此外，该化合物I对于巯基氨基酸的响应可以在2秒内完成，这种快速响应的特点使其可以用于细胞内巯基氨基酸的跟踪。

本发明的荧光探针化合物I在DMSO与PBS缓冲液混合液（体积比为2：98,1mM CTAB）中，巯基氨基酸的浓度的与荧光强度呈现线性关系。对于半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽，该探针的浓度工作范围分别为0-160nM、0-140nM、0-80nM，因此，可以定量测定溶液中巯基氨基酸的含量。

本发明所述的荧光探针可用于细胞中巯基氨基酸的检测。

本发明所述荧光探针可以应用于细胞内巯基氨基酸的检测。具体检测方法为：在37℃下HeLa细胞在化合物I (10 μM)的培养液中孵育10分钟，在488nm和880nm的激发光下，细胞发出都可以强的红色荧光。说明该化合物I可以以单光子和双光子的模式检测内源性巯基氨基酸，这在生物医学等方面具有潜在的应用价值。

本发明的有益效果：

本发明所涉及的一种检测生物硫醇的双光子荧光探针，具有以下优势：1、该探针能快速与生物硫醇发生反应（2秒完成），具有较强的荧光强度发射(荧光强度增加20倍)；2、该探针在检测生物硫醇过程中具有较高的选择性；3、该探针对于活细胞中内源性生物硫醇的检测。

附图说明

图1是化合物I的¹H NMR谱图。

图2是化合物I的选择性荧光光谱图。

图3是480nm激发下化合物I随半胱氨酸浓度变化荧光光谱图。

图4是在488nm激光激发下的化合物I与半胱氨酸的细胞成像图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。实施例中的各种原料均来自于市场购买。

实施例1 化合物I的合成

氮气氛围、冰浴下，将2,4-二硝基苯磺酰氯和化合物II加入20mL干燥的二氯甲烷，滴加三乙胺。室温搅拌过夜，反应结束真空浓缩，柱层析分离得深红色固体化合物I。图1为该探针的核磁图。

实施例2 化合物I的选择性分析

在含有巯基氨基酸的DMSO溶液一次性添加到浓度为10 μM的化合物I的DMSO与PBS缓冲液混合液（体积比为2：98,1mM CTAB）中，使巯基氨基酸的最终浓度为50 μM，混匀后检测溶液的荧光强度变化，结果如图2。当激发光波长为480nm时,探针化合物I对谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸在617nm出有强烈的橙色荧光，而且探针化合物I对其他非巯基氨基酸没有重要响应。说明探针化合物I对谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸具有优异的选择性。

实施例3 探针化合物I对巯基氨基酸浓度变化响应分析

将含有不同浓度的谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸的溶液加入到10 μM探针化合物I的DMSO与PBS缓冲液混合液（体积比为2：98,1mM CTAB）中，在617nm处的荧光强度随谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸量的增加呈规律性变化，如图3所示结果。以荧光强度对浓度作图，呈线性关系，说明探针化合物I对各种巯基氨基酸的浓度进行检测。

实施例4 探针化合物I在活细胞中检测巯基氨基酸

将20 μM的化合物I加入到Hela细胞的培养液中，在37℃下孵育10分钟，以880nm的激发光激发下成像，结果如图4所示。实验表明，探针化合物I对细胞内源性巯基氨基酸可以进行单光子和双光子成像。