特异性针对MMP9蛋白ZnMc结构域的单域抗体及产品与应用
阅读说明：本技术 特异性针对MMP9蛋白ZnMc结构域的单域抗体及产品与应用 (Single-domain antibody specifically aiming at ZnMc structural domain of MMP9 protein, product and application ) 是由 苏志鹏 孟巾果 赵泽英 于 2019-12-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医学技术领域,具体而言,提供了一种特异性针对MMP9蛋白ZnMc结构域的单域抗体及产品与应用。本发明提供的单域抗体包括互补决定区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3,CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.29-SEQ ID NO.34中的任一种；CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.35-SEQ ID NO.41中的任一种；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.42-SEQ ID NO.50中的任一种。该单域抗体的亲和力明显,可替代传统单克隆抗体快速表达用于检测MMP-9蛋白或改变其活性。(The invention relates to the technical field of biomedicine, and particularly provides a single domain antibody specifically aiming at a ZnMc structural domain of MMP9 protein, a product and application thereof. The single domain antibody provided by the invention comprises Complementarity Determining Regions (CDRs) including CDR1, CDR2 and CDR3, wherein the amino acid sequence of the CDR1 is any one of SEQ ID NO.29-SEQ ID NO. 34; the amino acid sequence of the CDR2 is any one of SEQ ID NO.35-SEQ ID NO. 41; the amino acid sequence of the CDR3 is any one of SEQ ID NO.42-SEQ ID NO. 50. The single-domain antibody has obvious affinity, can replace the traditional monoclonal antibody to quickly express and be used for detecting MMP-9 protein or changing the activity of the MMP-9 protein.)
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种特异性针对MMP9 蛋白ZnMc结构域的单域抗体及产品与应用。
背景技术
基质金属蛋白酶(MMP)属于涉及到细胞外基质形成和重塑的细胞外酶家族。这些酶含有一个保守的催化结构域，其中锌原子经三个组氨酸残基配位。该家族成员组织成包括胶原酶类、明胶酶类、基质溶解素类、基质溶素类、釉质溶解素类及膜MMP类在内的多个群组。
MMP-9(基质金属蛋白酶-9)属于基质金属蛋白酶的明胶酶群组。 MMP-9基因位于染色体20q11.1～13.1，26～27kbp，具有13个外显子和9个内含子。MMP-9主要功能是降解和重塑细胞外基质(extracellular matris) 的动态平衡，基质金属蛋白酶家族包含多个机制金属蛋白酶，分别负责不同底物的水解和平衡。
MMP-9是锌依赖的肽链内切酶，对基质蛋白的水解是使其在白血球迁移过程中发挥重要的作用。MMP-9在骨吸收过程中也扮演一定的角色，可以水解I型和V型明胶以及IV型和V型胶原。该酶的辅因子一般为Zn2+或Ca2+，一个MMP-9可以结合2个Zn2+或者3个Ca2+，MMP-9的酶活性可以被组胺素-3 1/24(组氨酸-5)抑制。MMP-9能分解呼吸道和肺内的结构复合物如ECM和基底膜，因此能参与呼吸道和肺的重建，还能调节其他蛋白酶及细胞因子的活性，降解α1抗胰蛋白酶，保护中性粒细胞弹性蛋白酶活性，同时，能加强胶原质胶体中胶原细胞和MMP-13的溶胶原活动，并且MMP-9还能从白细胞介素8(CXCL8/CL8)上分解一个62氨基酸肽, 使其向中性粒细胞的趋化活性增加10倍，但它也抑制其他中性粒细胞的趋化因子。此外，MMP-9结合CD44可释放储存的TGF-β1，另外，MMP-9 可通过释放血管内皮生长因子(VEGF)以参与血管生成。
MMP-9与诸多疾病都有相关性，例如血管性疾病(心、脑)和呼吸系统疾病，另外，有研究表明，MMP-9在肺癌等多种恶性肿瘤中异常高表达，与癌细胞的侵袭转移密切相关。
目前的MMP-9抗体均为传统单克隆抗体，传统单克隆抗体技术一般是指基于小鼠杂交瘤细胞制备的针对目标蛋白的单克隆抗体，该技术成熟，目前也有利用噬菌体展示技术分别展示抗体重链和轻链或者同时展示抗体的Fab片段来代替原来的杂交瘤技术，但是最终获得的都是与传统单克隆抗体结构相同或相似的抗体结构。传统单克隆抗体的特异性和功效并不完全令人满意，此外免疫异质性较高，改造空间小。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种特异性针对MMP9蛋白ZnMc结构域的单域抗体。
本发明的第二目的在于提供一种与本发明提供的单域抗体相关的生物材料。
本发明的第三目的在于提供本发明单域抗体的衍生抗体。
本发明的第四目的在于提供单域抗体的制备方法。
本发明的第五目的在于本发明提供的产品的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种特异性针对MMP9蛋白ZnMc结构域的单域抗体，包括互补决定区CDR，互补决定区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3；
CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.29-SEQ ID NO.34中的任一种；
CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.35-SEQ ID NO.41中的任一种；
CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.42-SEQ ID NO.50中的任一种。
在优选地实施方式中，单域抗体的互补决定区CDR为如下：
SEQ ID NO.29所示的CDR1、SEQ ID NO.35所示的CDR2和SEQ ID NO.42所示的CDR3；
或，SEQ ID NO.29所示的CDR1、SEQ ID NO.35所示的CDR2和SEQ ID NO.43所示的CDR3；
或，SEQ ID NO.30所示的CDR1、SEQ ID NO.36所示的CDR2和SEQ ID NO.44所示的CDR3；
或，SEQ ID NO.31所示的CDR1、SEQ ID NO.37所示的CDR2和SEQ ID NO.45所示的CDR3；
或，SEQ ID NO.32所示的CDR1、SEQ ID NO.38所示的CDR2和SEQ ID NO.46所示的CDR3；
或，SEQ ID NO.33所示的CDR1、SEQ ID NO.39所示的CDR2和SEQ ID NO.47所示的CDR3；
或，SEQ ID NO.34所示的CDR1、SEQ ID NO.40所示的CDR2和SEQ ID NO.48所示的CDR3；
或，SEQ ID NO.34所示的CDR1、SEQ ID NO.41所示的CDR2和SEQ ID NO.49所示的CDR3；
或，SEQ ID NO.34所示的CDR1、SEQ ID NO.41所示的CDR2和SEQ ID NO.50所示的CDR3。
在本发明中，单域抗体由互补决定区CDR和框架区FR组成。
在优选地实施方式中，框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4，其中， FR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.51-SEQ ID NO.59中的任一种；FR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.60-SEQ IDNO.65中的任一种；FR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.66-SEQ ID NO.72中的任一种；FR4的氨基酸序列为SEQ ID NO.73。
在优选地实施方式中，框架区FR为如下：
SEQ ID NO.51所示的FR1、SEQ ID NO.60所示的FR2、SEQ ID NO.66 所示的FR3和SEQ ID NO.73所示的FR4；
或，SEQ ID NO.52所示的FR1、SEQ ID NO.60所示的FR2、SEQ ID NO.66所示的FR3和SEQ ID NO.73所示的FR4；
或，SEQ ID NO.53所示的FR1、SEQ ID NO.61所示的FR2、SEQ ID NO.67所示的FR3和SEQ ID NO.73所示的FR4；
或，SEQ ID NO.54所示的FR1、SEQ ID NO.62所示的FR2、SEQ ID NO.68所示的FR3和SEQ ID NO.73所示的FR4；
或，SEQ ID NO.55所示的FR1、SEQ ID NO.62所示的FR2、SEQ ID NO.68所示的FR3和SEQ ID NO.73所示的FR4；
或，SEQ ID NO.56所示的FR1、SEQ ID NO.63所示的FR2、SEQ ID NO.69所示的FR3和SEQ ID NO.73所示的FR4；
或，SEQ ID NO.57所示的FR1、SEQ ID NO.64所示的FR2、SEQ ID NO.70所示的FR3和SEQ ID NO.73所示的FR4；
或，SEQ ID NO.56所示的FR1、SEQ ID NO.64所示的FR2、SEQ ID NO.71所示的FR3和SEQ ID NO.73所示的FR4；
或，SEQ ID NO.57所示的FR1、SEQ ID NO.65所示的FR2、SEQ ID NO.72所示的FR3和SEQ ID NO.73所示的FR4；
或，SEQ ID NO.58所示的FR1、SEQ ID NO.65所示的FR2、SEQ ID NO.72所示的FR3和SEQ ID NO.73所示的FR4；
或，SEQ ID NO.59所示的FR1、SEQ ID NO.65所示的FR2、SEQ ID NO.72所示的FR3和SEQ ID NO.73所示的FR4。
本发明提供的单域抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.14 中的任一种。
本发明中的单域抗体可以为人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。例如利用与上述单域抗体相关的生物材料进行生物表达得到单域抗体，优选地，生物材料为如下任一种：
(a)核酸分子，编码本发明提供的单域抗体；
(b)表达盒，含有(a)中核酸分子；
(c)重组载体，含有(a)中核酸分子或(b)中表达盒；
(d)重组真核细胞，含有(a)中核酸分子、(b)中表达盒或(c)中重组载体；
(e)重组原核细胞，含有(a)中核酸分子、(b)中表达盒或(c)中重组载体。
“核苷酸分子”可以是DNA，如cDNA或重组DNA，也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
“表达盒”包含多核苷酸序列，多核苷酸序列编码待表达的多肽(单域抗体)和控制其表达的序列如启动子以及任选地增强子序列，包括顺式作用转录性控制单元的任何组合。控制基因表达(即其转录和转录产物翻译) 的序列常称作调节单元。调节单元的大多数部分位于基因的编码序列上游并与之有效连接。表达盒也可以含有包含多聚腺苷化位点的下游3'非翻译区。
“重组载体”的载体可以为质粒、噬菌体或病毒。
“重组真核细胞”的宿主细胞可以为酵母或哺乳动物细胞等。
“重组原核细胞”的宿主细胞可以为细菌或藻等。
在优选地实施方式中，核酸分子的核苷酸序列为SEQ ID NO.15-SEQ ID NO.28中的任一种；或者，上述DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或，进行一个或几个碱基对的错义突变得到的核苷酸序列，只要该核苷酸序列编码本发明提供的单域抗体且具有单域抗体的活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。优选地，核酸分子为与SEQ ID NO.15-SEQ ID NO.28中的任一种具有75％以上同一性，且编码本发明提供的单域抗体的DNA。本发明中，“同一性”是指与天然核酸序列的序列相似性，具体是指与SEQ ID NO.15-SEQ ID NO.28中的任一种的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。
本发明提供的单域抗体的衍生抗体为如下(a)-(e)任一种：
(a)单链抗体，含有本发明提供的单域抗体；
(b)融合抗体，含有(a)中单链抗体或本发明提供的单域抗体；
(c)Fab，含有本发明提供的单域抗体；
(d)重链抗体，含有本发明提供的单域抗体；
(e)完整抗体，含有本发明提供的单域抗体。
本发明提供的单域抗体的制备方法，将编码本发明提供的单域抗体的核酸分子导入受体细胞得到转基因细胞，培养转基因细胞得到单域抗体。
在优选地实施方式中，受体细胞为微生物细胞或哺乳动物细胞。例如大肠杆菌、噬菌体或CHO细胞等等。
本发明还保护如下(a)-(h)任一项用途：
(a)本发明提供的单域抗体在制备肿瘤抑制剂、肿瘤细胞抑制剂、炎症性疾病药物或自身免疫病药物中的应用；
(b)本发明提供的生物材料在制备肿瘤抑制剂、肿瘤细胞抑制剂、炎症性疾病药物或自身免疫病药物中的应用；
(c)本发明提供的衍生抗体在制备肿瘤抑制剂、肿瘤细胞抑制剂、炎症性疾病药物或自身免疫病药物中的应用；
(d)本发明提供的制备方法制备肿瘤抑制剂、肿瘤细胞抑制剂、炎症性疾病药物或自身免疫病药物中的应用；
(e)本发明提供的单域抗体在制备抑制MMP-9活性或与MMP-9结合的产品中的应用；
(f)本发明提供的生物材料在制备抑制MMP-9活性或与MMP-9结合产品中的应用；
(g)本发明提供的衍生抗体在制备抑制MMP-9活性或与MMP-9结合产品中的应用；
(h)本发明提供的制备方法制备抑制MMP-9活性或与MMP-9结合产品中的应用。
上述产品可以为药物等；肿瘤例如为原发性直肠癌、胃癌、结肠癌、肝细胞癌以及相关腺癌等癌症类型；炎症性疾病和自身免疫病，例如为类风湿性关节炎、克罗恩病以及和炎症相关的其他疾病。
扩增编码本发明提供的单域抗体的核酸分子的引物对，也属于本发明的保护范围。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明使用生物基因工程技术，免疫内蒙古阿拉善双峰驼，筛选得到特异性针对MMP-9蛋白ZnMc结构域的单域抗体，限定了该单域抗体特定的互补决定区CDR序列，同时提供了编码单域抗体的基因序列和能够表达单域抗体的宿主细胞。该单域抗体的亲和力明显，并且通过原核表达即具有良好的结合活性，可替代传统单克隆抗体快速表达用于检测相关蛋白。
具体具有以下优势：
(1)该单域抗体适用的表达体系选择灵活，既可以在原核系统中表达也可以在酵母细胞或哺乳动物细胞的真核系统中表达，且其在原核表达系统中的表达成本低，可降低后期生产成本。
(2)由于该单域抗体为单结构域抗体，所以其抗体的多组合形式改造更为简单，通过基因工程的方式简单的串联即可以获得多价、多特异性的抗体，并且其免疫异质性很低，在不经过人源化改造的情况下也不会产生较强的免疫反应。
(3)该单域抗体的亲和力范围更为宽泛，在未进行亲和力成熟之前，其亲和力范围可以从nM级别至pM级别，为后期不同用途的抗体提供多个选择。
附图说明
为了更清楚地说明本发明
具体实施方式
或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中本公司自行表达的纯化后的MMP9蛋白和 ZnMc蛋白SDS-PAGE分析图片；
图2为本发明实施例1中对构建好的纳米抗体文库的片段***率分析结果图；
图3为本发明实施例2中对质控达标的文库进行靶标特异性淘选的数据结果；
图4为本发明实施例4中特异性针对MMP9蛋白的纳米抗体的表达后纯化SDS-PAGE分析图；
图5为本发明实施例9中在获得了纯化后的纳米抗体之后对纳米抗体进行了抗原亲和力初步鉴定的结果；
图6为本发明实施例10中融合抗体表达载体的多克隆位点示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1：针对MMP-9蛋白的单域抗体文库的构建：
(1)将1mg MMP-9锌离子结合域的蛋白ZnMc与等体积的弗氏完全佐剂混合(免疫用蛋白的纯度检测结果如图1所示)，免疫一只内蒙古阿拉善双峰驼，首次免疫后，利用蛋白ZnMc与等体积的弗氏不完全佐剂混合免疫，每周免疫一次，再连续免疫4次，共连续免疫5次；然后在第6次和第7次用1mg MMP-9全长蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合进行动物免疫，该免疫过程是为了集中刺激骆驼使其产生针对ZnMc结构域的抗体，该结构域可以与Zn结合后激活MMP-9的金属蛋白酶活性，获得可以阻断 MMP-9与Zn结合的抗体即可阻断其蛋白酶活性，从而影响下游信号通路。
(2)动物免疫结束后，抽取骆驼外周血淋巴细胞150mL并提取细胞的RNA，利用提取的总RNA合成cDNA，并通过套式PCR反应以cDNA 为模板扩增VHH(重链抗体可变区)，利用限制性内切酶分别酶切pMECS 载体和VHH片段，然后将酶切后的片段和载体链接，得到重组载体。
(3)将连接后的片段点转化至感受态细胞TG1中，构建MMP-9蛋白的噬菌体展示文库并测定库容，文库的库容大小约为1×109，同时，通过菌落PCR鉴定检测文库在目的片段的正确***率，结果如图2所示，本图数据是在文库构建完成后，利用文库中噬菌体载体特异性引物对文库中随机挑选的30个克隆进行PCR鉴定的结果，其目的是为了检测文库中噬菌体载体的正确片段大小的***率，阳性结果条带大小在600bp左右，无条带，条带>750bp或者<400bp均视为阴性克隆。该图中Negative Control是不加模板的情况下进行的PCR反应；VHH1-30是随机挑选的30个克隆摇菌后以菌液为模板做的PCR反应。从图可以看出，正确***率达到96.7％。
实施例2：针对MMP-9蛋白单域抗体的筛选：
(1)取200μL重组TG1细胞至2×TY培养基中培养，期间加入40μL 辅助噬菌体VCSM13侵染TG1细胞，并培养过夜以扩增噬菌体，次日利用 PEG/NaCl沉淀噬菌体，离心收集扩增噬菌体；
(2)将稀释在100mM pH 8.3的NaHCO3中的ZnMc蛋白500μg偶联在酶标板上，4℃放置过夜，同时设立阴性对照孔；
(3)第二天加入200μL的3％的脱脂乳，室温封闭2h；
(4)封闭结束后，加入100μl扩增后噬菌体文库(大约2×1011个噬菌体颗粒)，室温作用1h；
(5)作用1小时后，用PBS+0.05％Tween-20洗5遍，以洗掉未结合的噬菌体；
(6)用终浓度为25mg/mL的胰蛋白酶将与ZnMc结构域蛋白特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1细胞，37℃培养1h，产生并收集噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复1轮，逐步得到富集，当富集倍数达到10倍以上时，第三轮采用MMP9全长蛋白进行富集，直至富集倍数再达到10倍以上，富集效果如图3所示，本图是在文库正确大小片段***率检测合格后(一般应>85％)，以噬菌体展示技术为基础，通过生物淘选的方式对文库针对靶标蛋白进行富集的结果。该图中1-3Round是指淘选总共进行了三轮，每轮淘选都产生P/N和I/E两个富集参数，其中P/N是指每轮淘选后阳性孔和阴性孔洗脱出的噬菌体感染大肠杆菌后能生长的单克隆数的比值，I/E是指每轮淘选中加入的噬菌体与洗脱的噬菌体数量的比值，P/N在富集发生后应该越来越大，I/E在富集发生后应该逐渐趋近于1。
实施例3：用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选针对MMP-9的特异性阳性克隆:
(1)根据上述单域抗体筛选方法对MMP-9蛋白进行3轮筛选，筛选结束后，针对MMP-9蛋白的噬菌体富集因子达到10以上(约为10000)，从筛选获得的阳性克隆中挑选400个单菌落分别接种于含100μg/mL氨苄青霉素的TB培养基的96深孔板中，并设置空白对照，37℃培养至对数期后，加入终浓度为1mM的IPTG，28℃培养过夜；
(2)利用渗透涨破法获得粗提抗体；将MMP-9全长蛋白和ZnMc蛋白稀分别释至100mM pH 8.3的NaHCO3中并将100μg蛋白在酶标板中4℃包被过夜；
(3)将上述步骤中获得的抗体粗提液取100μL转移至加入抗原的 ELISA板上，室温孵育1h；
(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入100μl经1:2000稀释后的Mouse anti-HA tagantibody(鼠抗HA抗体，Thermo Fisher)，在室温孵育1h；
(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入100μl经1:20000稀释后的 Anti-Rabbit HRPconjugate(山羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体，购自于 Thermo Fisher)，在室温孵育1h；
(6)用PBST洗去未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶显色液，37℃下反应15min后，加入中止液，于酶标仪上450nm波长处，读取吸收值；
(7)当样品孔OD值大于对照孔5倍以上时，判定为阳性克隆孔；
(8)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/μl氨苄青霉素的LB培养基中以便提取质粒并进行测序；
(9)根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把 CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而序列不同的株视为不同克隆株，最终获得特异性针对MMP-9蛋白的单域抗体(单域抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.14中任一种，每种序列对应一种克隆株)。其抗体的氨基酸序列为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4结构，构成整个VHH。获得的单域抗体重组质粒可以在原核系统中进行表达，最终获得单域抗体蛋白。
实施例4：MMP-9蛋白的特异性单域抗体在宿主菌大肠杆菌中的纯化及表达：
(1)将上述测序分析所获得不同克隆株的质粒(pMECS-VHH)电转化到大肠杆菌HB2151中，并将其涂布在LB+amp+glucose即含有氨苄青霉素和葡萄糖的培养平板上，37℃培养过夜；
(2)挑选单个菌落接种在5mL含有岸边青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；
(3)接种1mL的过夜培养菌种至330mL TB培养液中，37℃摇床培养，培养到OD600nm值达到0.6-0.9时，加入1M IPTG，28℃摇床培养过夜；
(4)离心，收集大肠杆菌，利用渗透胀破法，获得抗体粗提液；
(5)通过镍柱亲和层析法纯化出抗体，纯化后的单域抗体，如图4所示。
实施例5：MMP9蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体真核表达载体的构建：
(1)将实施例3中获得的目标序列亚克隆至真核表达载体中：将实施例3中筛选出来的抗体经Sanger测序得到其核苷酸序列；
(2)通过序列合成的方式将密码子优化后的上述核苷酸序列合成至本公司设计改造的载体RJK-V4-hFC中，该载体的改造方法如实施例10所述；单域抗体是在实施例10所述的RJK-V4-hFc载体的基础上再通过Xba I/EcoR I的双酶切方式连接到表达载体中的；
(3)将公司构建好的重组真核表达载体转化至DH5α大肠杆菌中，培养进行质粒大提，去除内毒素；
(4)将大提后的质粒再进行序列测序鉴定；
(5)将确定无误后的重组载体准备后续真核细胞转染表达。
实施例6：MMP-9蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体在悬浮 ExpiCHO-S细胞中表达：
(1)转染前3天以2.5×105/ml细胞传代和扩大培养ExpiCHO-STM细胞，计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120ml(终体积)的 ExpiCHOTM表达培养基的500ml摇瓶中；使细胞浓度达到约4×106-6×106活细胞/mL；
(2)在转染前一天，将ExpiCHO-STM细胞稀释浓度至3.5×106活细胞/ mL，使细胞过夜培养；
(3)转染当天，测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约7×106-10×106活细胞/mL；
(4)用预热至37℃新鲜的ExpiCHOTM表达培养基将细胞稀释至6×106个活细胞/mL。计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100ml (终体积)的ExpiCHOTM表达培养基的500ml摇瓶中；
(5)使轻轻颠倒混匀ExpiFectamineTMCHO试剂，用3.7ml OptiPROTM培养基稀释ExpiFectamineTMCHO试剂，回荡或混匀；
(6)用冷藏的4ml OptiPROTM培养基稀释质粒DNA，回荡混匀；
(7)将ExpiFectamine CHO/质粒DNA复合物室温孵育1-5分钟，然后轻轻加入制备的细胞悬液中，加入过程中轻轻回荡摇瓶；
(8)将细胞在37℃、8％CO2、加湿的空气中震荡培养；
(9)转染后第1天(18-22小时后)添加600ul ExpiFectamineTMCHO Enhancer和24mlExpiCHO feed。
(10)在转染后约8天(细胞活率低于70％)收集上清。
实施例7：MMP-9蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体在悬浮293F 细胞中的表达：
重组单域抗体表达实验流程(以500ml摇瓶为例)：
(1)转染前3天以2.5×105/ml细胞传代和扩大培养293F细胞，计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120ml(终体积)的 OPM-293CD05 Medium培养基的500ml摇瓶中。使细胞浓度达到约 2×106-3×106活细胞/mL。
(2)转染当天，测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约2×106-3×106活细胞/mL。
(3)用预热的OPM-293CD05 Medium将细胞稀释至1×106个活细胞/ mL。计算出所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100ml(终体积) 的培养基的500ml摇瓶中。
(4)用4ml Opti-MEM培养基稀释PEI(1mg/ml)试剂，回荡或吹打混匀；用4ml Opt-MEM培养基稀释质粒DNA，回荡混匀，并用0.22um的滤头过滤。室温孵育5min。
(5)将稀释的PEI试剂加入稀释的DNA中，颠倒混匀。将PEI/质粒 DNA复合物室温孵育15-20分钟，然后轻轻加入制备的细胞悬液中，加入过程中轻轻回荡摇瓶。
(6)将细胞在37℃、5％CO2、120rpm震荡培养。
(7)转染后第24h、72h添加5ml OPM-CHO PFF05补料。
(8)在转染后约7天(细胞活率低于70％)收集上清。
实施例8：人源Fc重组单域抗体的纯化
(1)将实施例6或7中获得蛋白表达上清用0.45μm的一次性滤头过滤除掉不可溶杂质；
(2)将上述滤液使用蛋白纯化仪进行亲和层析纯化，利用人源Fc与 Protein A结合的能力，使用偶联Protein A的琼脂糖填料进行纯化；
(3)将滤液通过1mL/分钟的流速流穿Protein A预装柱，该步骤中滤液中的目标蛋白会与填料结合；
(4)通过低盐和高盐缓冲液将柱上结合的杂质蛋白洗涤；
(5)用低pH缓冲液将柱上结合的目标蛋白进行系统；
(6)将洗脱液迅速加入pH9.0的Tris-HCl溶液，进行中和；
(7)将上述中和后的蛋白溶液透析后，进行SDS-PAGE分析，确定蛋白纯度在95％以上，且浓度在0.5mg/mL以上后，低温保存备用。
实施例9：特异性针对MMP9蛋白的重组单域抗体与MMP9亲和力的ELISA检测
(1)将实施例4或8中纯化获得重组抗体对MMP9的亲和力进行初步检测；
(2)使用定量的蛋白质测定重组单域抗体与MMP9的亲和力步骤如下；
(3)将100ng/100μL标准BSA样品包被到ELISA板材上；
(4)使用脱脂奶粉对上述包被的板材进行封闭；
(5)加入实施例4或8中获得的针对BSA的重组单域抗体；
(6)加入特异性针对HA标签蛋白或人源Fc的检测抗体(HRP标记)；
(7)加入显色底物TMB；
(8)加入终止液终止反应；
(9)测量OD450值，如图5所示，本实验中共涉及14株抗体，ELISA 检测之后，这些抗体与抗原靶标均具有良好的结合活性，结合效果最低的克隆91号其P/N值(P Value/NValue)也达到了9。
实施例10：纳米抗体真核表达载体RJK-V4-hFc的构建
所提及纳米抗体通用的目标载体RJK-V4-hFC，为本公司在invitrogen 商业化载体pCDNA3.4(载体资料链接： https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_4_topo_ta_cl oning_kit_man.pdf)的基础上融合了人源IgG的重链编码序列(NCBI Accession No.:AB776838.1)中的Fc区段后改造而来的，即该载体包含了IgG重链的铰链区(Hinge)CH2和CH3区。具体改造方案如下：
(1)选取pcDNA3.4上的限制性酶切位点XbaI和AgeI；
(2)在Fc片段编码序列的5’端和3’端通过重叠PCR的方式分别引入多克隆位点(MCS，Multiple Cloning Site)和6×His标签，如图6所示；
(3)使用分别带有XbaI和AgeI酶切位点的一对引物通过PCR的方式将上述片段扩增；
(4)使用限制性内切酶XbaI和AgeI分别酶切pcDNA3.4和(3)中的重组DNA片段；
(5)将酶切后的载体和***片段在T4连接酶的作用下连接，然后将连接产物转化至大肠杆菌，扩增，测序核实，获得重组质粒。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京融捷康生物科技有限公司
<120> 特异性针对MMP9蛋白ZnMc结构域的单域抗体及产品与应用
<160> 73
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Asp Leu Ser
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Gly Val Ala Ala Ile Glu Lys Phe Gly Val Pro Ile Tyr Ala Asp Ser
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65 70 75 80
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<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
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Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Asp Leu Ser
20 25 30
Ser Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ala Ile Glu Lys Phe Gly Val Pro Ile Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Cys Ala Ala Asp Arg Tyr Cys Gly Ala Gly Pro Leu Glu Pro Leu Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Asp Leu Ser
20 25 30
Ser Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ala Ile Glu Lys Phe Gly Val Pro Ile Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Ala Ala Ser Lys Asp Tyr Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Asp Arg Tyr Cys Gly Val Gly Pro Leu Glu Pro Leu Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Tyr Thr Phe Ser
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Thr Ser Cys Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
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Gly Val Ala Gly Ile Leu Phe Asn Gly Leu Thr Ser Tyr Thr Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu
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Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
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Cys Ala Ala Val Ser Ser Pro Ala Gly Cys Leu Ala Pro Leu Arg Ala
100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu
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Trp Val Ser Ser Ile Asp Asn Gly Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
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Tyr Cys Ala Lys Asp Pro Ala Arg Ser Pro Leu Trp Ala Gly Asn Met
100 105 110
Ala Pro Ala Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
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Ser Val Ala Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu
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Trp Val Ser Ser Ile Asn Asn Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
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Ser Val Ala Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu
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Trp Val Ser Ser Ile Asn Asn Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Ala
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Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
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Thr Pro Ala Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Ala Ser Gly Tyr
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Ser Asp Cys Arg Tyr Arg Met Ser Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Cys
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
atggcccagg tgcagctgca ggagtctggg ggaggctcgg tgcaggctgg agggtctctg 60
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<212> DNA
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<400> 19
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<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
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accgtctcct ca 372
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<211> 372
<212> DNA
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<400> 26
atggcccagg tgcagctgca ggagtctggg ggaggctcgg tgcaggctgg agggtctctg 60
agactctcct gtgtagcctc tggatacacc tactgtggct accgcatgag ctggtaccgc 120
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tacgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc atctcccaag acaacgccaa gaacacggtg 240
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<400> 28
atggcccagg tgcagctgca ggagtctggg ggaggctcgg tgcagtctgg agggtctctg 60
agactctcct gtgtagcctc tggatacacc tactgtggct accgcatgag ctggtaccgc 120
caggctccag ggaaggagcg cgagttcgtc tcagctattc gtggtgatgg tagtacaagt 180
tacgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc atctcccaag acaacgccaa gaacacggtg 240
tacctgcaaa tgaacagcct gaaacctgag gacacggcca tgtattactg taaagcagac 300
cactcatggg acttcacgcc aaggtgccct acttcgatct ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
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<213> 人工序列
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1 5
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<213> 人工序列
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Ser Tyr Thr Phe Ser Thr Ser Cys
1 5
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<213> 人工序列
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Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr Ala
1 5
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<213> 人工序列
<400> 32
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Val Ala
1 5
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<213> 人工序列
<400> 33
Thr Ala Ser Gly Tyr Ser Asp Cys Arg Tyr Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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Ile Glu Lys Phe Gly Val Pro
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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Ile Asp Asn Gly Gly Ser Gly Thr
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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Ile Arg Gly Asp Gly Ser Thr
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<213> 人工序列
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Ala Ala Asp Arg Tyr Cys Gly Ala Gly Pro Leu Glu Pro Leu Arg Tyr
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Arg Tyr Trp
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<213> 人工序列
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Arg Tyr Trp
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<213> 人工序列
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Ala Ala Val Ser Ser Pro Ala Gly Cys Leu Ala Pro Leu Arg Ala Asp
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20
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<213> 人工序列
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Ala Lys Asp Pro Ala Arg Ser Pro Leu Trp Ala Gly Asn Met Ala Pro
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Ala Arg
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<213> 人工序列
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Ala Lys Asp Pro Ala Arg Ser Pro Leu Trp Ala Gly Asn Val Thr Pro
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Ala Arg
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<213> 人工序列
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Lys Ala Asp Leu Ser Ile Trp Ser Gly Arg Cys Pro Asn Thr Trp Gly
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Lys Trp
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<213> 人工序列
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Trp
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<213> 人工序列
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Lys Ala Asp His Ser Trp Asp Phe Thr Pro Arg Cys Pro Thr Ser Ile
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Trp
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<213> 人工序列
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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser
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Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
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Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser
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<213> 人工序列
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Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr
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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
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<213> 人工序列
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Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
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<213> 人工序列
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Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser
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<213> 人工序列
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Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
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<213> 人工序列
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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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Ala
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<213> 人工序列
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Gly
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<213> 人工序列
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Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Trp Val Ser
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Ser
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<213> 人工序列
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Met Ser Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser
1 5 10 15
Ser
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<213> 人工序列
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Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser
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Ser
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<213> 人工序列
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Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser
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Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 66
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35
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<211> 38
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<213> 人工序列
<400> 67
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20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
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<213> 人工序列
<400> 68
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20 25 30
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35
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<213> 人工序列
<400> 69
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20 25 30
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35
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
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<211> 38
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<213> 人工序列
<400> 72
Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
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<210> 73
<211> 10
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<213> 人工序列
<400> 73
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
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