阅读说明：本技术 一种发酵生产α型谷氨酸的方法 (Method for producing α -type glutamic acid by fermentation ) 是由 程士清 尤学波 赵杰 王小平 于 2019-12-16 设计创作，主要内容包括：本发明属于氨基酸生产技术领域,公开了一种优化的谷氨酸发酵培养基,其包括发酵培养基A和发酵培养基B；所述发酵培养基A首先添加,然后间隔12h以上添加发酵培养基B。本发明发酵培养基采用两部分组成,发酵培养基A侧重于菌株增殖的提升,发酵培养基B侧重于谷氨酸的合成和分泌；两种发酵相互配合,提高了谷氨酸产量。(The invention belongs to the technical field of amino acid production, and discloses an optimized glutamic acid fermentation medium which comprises a fermentation medium A and a fermentation medium B; the fermentation medium A is added firstly, and then the fermentation medium B is added at an interval of more than 12 h. The fermentation medium of the invention consists of two parts, wherein the fermentation medium A emphasizes on the improvement of the proliferation of strains, and the fermentation medium B emphasizes on the synthesis and the secretion of glutamic acid; the two fermentations are mutually matched, and the yield of the glutamic acid is improved.)

一种发酵生产α型谷氨酸的方法

技术领域

本发明属于氨基酸生产技术领域，具体涉及一种优化的谷氨酸发酵培养基。

背景技术

谷氨酸，是一种酸性氨基酸。分子内含两个羧基，化学名称为α-氨基戊二酸。谷氨酸是里索逊1856年发现的，为无色晶体，有鲜味，微溶于水，而溶于盐酸溶液，等电点3.22。大量存在于谷类蛋白质中，动物脑中含量也较多。谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。谷氨酸钠俗称味精，是重要的鲜味剂，对香味具有增强作用。谷氨酸钠广泛用于食品调味剂，既可单独使用，又能与其它氨基酸等并用。用于食品内，有增香作用。在食品中浓度为0.2%-0.5%，每人每天允许摄入量为0－120微克/千克(以谷氨酸计)。在食品加工中一般用量为0.2－1.5克/公斤。

谷氨酸主要以微生物发酵制备而得，通过优化发酵培养基，使得菌体增殖速率提高，可以提高氨基酸的产量。现有技术对谷氨酸发酵培养基优化进行了大量的研究，例如文献1“基于PB试验和响应面分析法对谷氨酸棒杆菌CNl021发酵培养基优化，中国酿造2014年”，通过最陡爬坡试验和响应面分析法对发酵培养基组成进行优化，得到谷氨酸棒杆菌最适发酵培养基组，较未优化培养基的发酵培养基产酸量提高了22.75%。文献2“混合硝酸稀土对谷氨酸产生菌的影响，氨基酸杂志”发现，在发酵培养基中添加一定量的稀土元素，能够提高谷氨酸的产量。申请人之前的专利技术“一种谷氨酸发酵培养基制备方法”，在常规培养基的基础上进行了改进，通过添加菌体蛋白浸膏来替代酵母膏氮源，不但节约了成本，还能提高氨基酸发酵产率，一举两得。

发明内容

在已有发酵培养基的基础上，申请人针对微生物发酵的特点，继续进行了改进，以提高发酵效率，据此，提出了一种发酵生产α型谷氨酸的方法。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种发酵生产α型谷氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将产谷氨酸的菌种子液接入装有发酵培养基A的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养12-24h，然后添加发酵培养基B，继续发酵培养24-36h，收集发酵液。

进一步地，所述方法包括如下步骤：

将产谷氨酸的黄色短杆菌按8-10％接种量将种子液接入装有60L发酵培养基A的100L发酵罐中进行发酵培养，发酵培养24h，然后添加10L发酵培养基B，继续发酵培养24h，收集发酵液用于生产α型谷氨酸；整个发酵培养过程中，控制发酵温度30-36℃，通风比1∶0.7-0.9，搅拌转速200-400r/min，溶氧维持在20-30％，流加葡萄糖溶液维持残糖不低于1.0％，流加消泡剂消泡。

进一步地，所述发酵培养基A的制备方法为：取各原料：葡萄糖，酵母浸膏，K₂HPO₄，MgSO₄·7H₂O，2-羟基乙胺，CeCl₃，MnSO₄·H₂O，FeSO₄·7H₂O，VB₁，生物素；将各原料搅拌均匀后，调节pH，灭菌，制得发酵培养基A。

进一步地，所述发酵培养基B的制备方法为：取各原料：琥珀酸，尿素，壳聚糖；将各原料搅拌均匀后，调节pH，灭菌，制得发酵培养基B。

优选地，所述发酵培养基A的制备方法为：取各原料：葡萄糖50-100g/L，酵母浸膏10-30g/L，K₂HPO₄ 1-5g/L，MgSO₄·7H₂O 20-200mg/L，2-羟基乙胺10-50mg/L，CeCl₃1-20mg/L，MnSO₄·H₂O 1-10mg/L，FeSO₄·7H₂O 1-10mg/L，VB₁5-50mg/L，生物素1-10μg/L；将各原料搅拌均匀后，调节pH为6-7，121℃灭菌，自然冷却，制得发酵培养基A。

更优选地，所述发酵培养基A的制备方法为：

取各原料：葡萄糖80g/L，酵母浸膏20g/L，K₂HPO₄ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 50mg/L，2-羟基乙胺40mg/L，CeCl₃10mg/L，MnSO₄·H₂O 3mg/L，FeSO₄·7H₂O 3mg/L，VB₁10mg/L，生物素7μg/L；将各原料搅拌均匀后，调节pH为6.5，121℃灭菌15min，自然冷却，制得发酵培养基A。

优选地，所述发酵培养基B的制备方法为：

取各原料：琥珀酸1-10g/L，尿素1-5g/L，壳聚糖20-100mg/L；将各原料搅拌均匀后，调节pH，灭菌，制得发酵培养基B；

更优选地，所述发酵培养基B的制备方法为：

取各原料：琥珀酸5g/L，尿素2g/L，壳聚糖80mg/L；将各原料搅拌均匀后，调节pH为6.5，121℃灭菌15min，自然冷却，制得发酵培养基B。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

本发明发酵培养基采用两部分组成，发酵培养基A侧重于菌株增殖的提升，发酵培养基B侧重于谷氨酸的合成和分泌；

前期细胞增殖时，2-羟基乙胺可以促进磷脂酰乙醇胺细胞壁组分的合成，从而提高菌株增殖速率，后期菌株增殖放缓，以产酸为主，2-羟基乙胺还能够作为阳离子表面活性剂，使得细胞壁疏松，提高细胞通透性，促进谷氨酸释放到胞外；

CeCl₃稀土盐能够促进菌株增殖，提高谷氨酸相关合成酶的活力，提高谷氨酸的产量；但是过高的浓度会造成菌株增殖放缓和死亡，谷氨酸产量相应下降；

发酵中后期，菌株增殖速度放缓，以产酸为主，壳聚糖上的氨基与细菌细胞壁中带负电荷的磷壁酸或脂多糖结合，并螯合金属阳离子,从而改变细胞壁的通透性，促进谷氨酸分泌到胞外。

发酵培养基中添加了琥珀酸，三羧酸循环有一定促进作用，而对乙醛酸循环途径具有抑制作用，从而导致中间代谢物更多地流向三羧酸循环途径，进而促进谷氨酸产量的增加。

说明书附图

图1：CeCl₃稀土盐对菌体浓度的影响；

图2：CeCl₃稀土盐对谷氨酸含量的影响；

图3：2-羟基乙胺对菌体浓度的影响；

图4：2-羟基乙胺对谷氨酸含量的影响；

图5：2-羟基乙胺对糖酸转化率的影响。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

一种优化的谷氨酸发酵培养基，其包括发酵培养基A和发酵培养基B；所述发酵培养基A首先添加，然后间隔24h添加发酵培养基B。

所述发酵培养基A的制备方法为：取各原料：葡萄糖80g/L，酵母浸膏20g/L， K₂HPO₄2g/L，MgSO₄·7H₂O 50mg/L，2-羟基乙胺40mg/L，CeCl₃10mg/L，MnSO₄·H₂O 3mg/L，FeSO₄·7H₂O 3mg/L，VB₁10mg/L，生物素7μg/L；将各原料搅拌均匀后，调节pH为6.5，121℃灭菌15min，自然冷却，制得发酵培养基A；

所述发酵培养基B的制备方法为：取各原料：琥珀酸5g/L，尿素2g/L，壳聚糖80mg/L；将各原料搅拌均匀后，调节pH为6.5，121℃灭菌15min，自然冷却，制得发酵培养基B；

采用常规发酵工艺：将黄色短杆菌GDK-9按8％接种量将种子液（OD_600nm为13.5）接入装有60L发酵培养基A的100L发酵罐中进行发酵培养，发酵培养24h，然后添加10L发酵培养基B，继续发酵培养24h，收集发酵液；整个发酵培养过程中，控制发酵温度35℃，通风比1∶0.7，搅拌转速300r/min，溶氧维持在20％，流加质量百分比浓度为20％的葡萄糖维持残糖不低于1.0％，流加消泡剂消泡。

实施例2

一种优化的谷氨酸发酵培养基，其包括发酵培养基A和发酵培养基B；所述发酵培养基A首先添加，然后间隔24h添加发酵培养基B。

所述发酵培养基A的制备方法为：取各原料：葡萄糖100g/L，酵母浸膏25g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 70mg/L，2-羟基乙胺20mg/L，CeCl₃5mg/L，MnSO₄·H₂O 2mg/L，FeSO₄·7H₂O 2mg/L，VB₁5mg/L，生物素5μg/L；将各原料搅拌均匀后，调节pH为6.5，121℃灭菌15min，自然冷却，制得发酵培养基A；

所述发酵培养基B的制备方法为：取各原料：琥珀酸7g/L，尿素2g/L，壳聚糖50mg/L；将各原料搅拌均匀后，调节pH为6.5，121℃灭菌15min，自然冷却，制得发酵培养基B；

采用常规发酵工艺：将黄色短杆菌GDK-9按8％接种量将种子液（OD_600nm为13.5）接入装有60L发酵培养基A的100L发酵罐中进行发酵培养，发酵培养24h，然后添加10L发酵培养基B，继续发酵培养24h，收集发酵液；整个发酵培养过程中，控制发酵温度35℃，通风比1∶0.7，搅拌转速300r/min，溶氧维持在20％，流加质量百分比浓度为20％的葡萄糖维持残糖不低于1.0％，流加消泡剂消泡。

实施例3

一、CeCl₃稀土盐对菌体浓度、谷氨酸含量以及糖酸转化率的影响。

发酵培养基为：葡萄糖80g/L，酵母浸膏20g/L， K₂HPO₄ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 50mg/L，CeCl₃ 0-40mg/L，MnSO₄·H₂O 3mg/L，FeSO₄·7H₂O 3mg/L，VB₁10mg/L，生物素7μg/L；

发酵工艺同实施例1，100L发酵罐中含有70L发酵培养基。

设置CeCl₃的添加浓度为0，2.5,5,10,20,40mg/L，如图1-2所示，随着CeCl₃添加量的增加，菌体浓度和谷氨酸含量均有所提升，当添加量为10mg/L时，菌体浓度和谷氨酸含量达到峰值，然后出现下降趋势，但是整个过程中，糖酸转化率没有明显改变（附图未显示）；说明CeCl₃稀土盐能够促进菌株增殖，提高谷氨酸相关合成酶的活力，提高谷氨酸的产量，但是过高的浓度会造成菌株增殖放缓和死亡，谷氨酸产量相应下降。

二、通过上述实验确定CeCl₃添加量为10mg/L，在此基础上，研究2-羟基乙胺对菌体浓度、谷氨酸含量以及糖酸转化率的影响。设置2-羟基乙胺的浓度为2.5，5,10,20,40,80,160mg/L，如图3-4所示，随着2-羟基乙胺添加量的增加，菌体浓度随之增加，相应地，谷氨酸含量和糖酸转化率也有所提升，当添加量为40mg/L时，菌体浓度和谷氨酸含量达到峰值，继续增加2-羟基乙胺的浓度，产生明显的抑菌效果，菌株密度下降明显；原因是，2-羟基乙胺可能促进磷脂酰乙醇胺细胞壁组分的合成，从而提高菌株增殖速率，但是浓度过大会导致抑菌现象，后期菌株增殖放缓，以产酸为主，2-羟基乙胺还能够作为阳离子表面活性剂，使得细胞壁疏松，提高细胞通透性，促进谷氨酸释放到发酵液，从而提高了谷氨酸产量和糖酸转化率。

三、通过上述实验确定CeCl₃添加量为10mg/L、2-羟基乙胺的添加量40mg/L，在此基础上，研究发酵培养基B对菌体浓度、谷氨酸含量以及糖酸转化率的影响。

对照组1采用发酵培养基A进行发酵，不采用发酵培养基B，100L发酵罐中含有70L发酵培养基A；发酵工艺参照实施例1。

对照组2：发酵培养基B中不添加琥珀酸，其余同实施例1。

对照组3：发酵培养基B中不添加壳聚糖，其余同实施例1。

对照组4：发酵培养基A中添加5g/L的琥珀酸，其余同对照组1。

实验组为实施例1。

具体结果见表1。

表1

组别	菌浓度OD<sub>600nm</sub>	谷氨酸产量g/L	糖酸转化率％
				对照组1	53.9	137.4	59.1
对照组2	54.2	141.2	61.8
				对照组3	54.5	145.8	62.6
对照组4	53.8	137.9	59.2
				实验组	55.3	150.7	64.1

结论：对照组1采用单一发酵培养基发酵，谷氨酸产量和糖酸转化率明显低于实验组，菌体浓度差异并不大；对照组4在对照组1的基础上添加了琥珀酸，对菌体浓度并没有影响，谷氨酸产量和糖酸转化率也没有明显差异，可能原因是，发酵前期以菌体增殖为主，产酸较少，琥珀酸对菌体增殖并没有明显的刺激作用；实验组和对照组3选用发酵中期添加琥珀酸，此时，菌体增殖放缓，以产酸为主，琥珀酸对三羧酸循环有正向促进作用，而对乙醛酸循环途径起抑制作用，从而导致谷氨酸产量的增加；梯度试验发现，琥珀酸添加量过大（大于10g/L），并不会对谷氨酸产量带来进一步的提升，综合成本考虑，选择低于10g/L的添加量较为合适。对照组2和实验组在发酵中后期添加壳聚糖，能够改变细胞壁的通透性，促进谷氨酸分泌到胞外，从而提升谷氨酸产量和糖酸转化率；但是壳聚糖添加量（超过100mg/L）过大会导致抑菌现象发生，进而造成菌株死亡。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，或在实施案例之外的树种实施本方法，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改，改进或范围的扩大，均属于本发明要求保护的范围。