阅读说明：本技术 一种发酵生产谷氨酸的葡萄糖补料控制方法 (Glucose feeding control method for fermentation production of glutamic acid ) 是由 吕奎 霍星宇 戴京京 许慧 丁健 陈鹏程 于 2020-03-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种发酵生产谷氨酸的葡萄糖补料控制方法,属于生物技术领域。本发明提供了一种发酵生产谷氨酸的方法,此方法通过控制发酵产酸期发酵培养基中葡萄糖的流加大大提高了谷氨酸的产量,利用此方法将嗜乙酰乙酸棒杆菌基因工程菌接种至10L发酵罐中发酵35h,即可使发酵液中谷氨酸的产量高达127g/L。(The invention discloses a glucose feeding control method for producing glutamic acid by fermentation, belonging to the technical field of biology, and providing a method for producing glutamic acid by fermentation, which greatly improves the yield of glutamic acid by controlling the fed-batch of glucose in a fermentation medium in a fermentation acid production period of the fermentation, and by utilizing the method, corynebacterium acetoacidophilum genetic engineering bacteria are inoculated into a 10L fermentation tank for fermentation for 35 hours, so that the yield of glutamic acid in fermentation liquor can reach 127 g/L.)

一种发酵生产谷氨酸的葡萄糖补料控制方法

技术领域

本发明涉及一种发酵生产谷氨酸的葡萄糖补料控制方法，属于生物技术领域。

背景技术

谷氨酸是一种重要的氨基酸，在多个领域均具有广泛应用。例如，谷氨酸具有较浓的鲜味，可作为调味剂应用于食品行业；谷氨酸可用于合成表面活性剂，在化妆品领域具有重要的应用；谷氨酸被人体吸收后，易与血氨形成谷酰胺，能解除代谢过程中氨的毒害作用，可作为肝脏病患者的辅助药物在医药领域具有重要的应用，并且，谷氨酸作为神经中枢及大脑皮质的补剂，对于治疗脑震荡或神经损伤、癫痫以及对弱智儿童均有一定疗效。

谷氨酸的生产方法主要包括蛋白水解法、化学合成法和微生物发酵法这三种，其中，蛋白水解法具有操作复杂、费时费力、成本高和产物产量低等缺陷，化学合成法则存在严重的环境污染问题，因此，两者都不适合大规模的生产。与蛋白水解法和化学合成法相比，利用微生物发酵法生产谷氨酸具有环境友好、条件温和、成本低和易于工业化生产等优势，因此，目前工业上常利用微生物发酵法生产谷氨酸。

但是，现有的微生物发酵法仍具有一定缺陷，其中，产量低是限制谷氨酸的工业化生产进程的缺陷之一。例如，刘苗将改组菌株F343接种至发酵培养基中发酵40h，仅可使发酵液中谷氨酸的产量达78g/L(具体可见参考文献：刘苗.应用基因组改组技术选育耐高温谷氨酸生产菌[D].刘苗.江南大学.2009(05))；姚辉将谷氨酸棒杆菌S9114接种至发酵培养基中通过优化培养基中生物素的浓度发酵30h，仅可使摇瓶发酵液中谷氨酸的产量达82g/L(具体可见参考文献：谷氨酸棒杆菌S9114的发酵优化及生物素对谷氨酸发酵的调控[D].姚辉.江南大学.2013)。因此，急需找到一种产量高的发酵生产谷氨酸的方法以克服现有微生物发酵法存在的缺陷。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种产量高的发酵生产谷氨酸的方法。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一种发酵生产谷氨酸的方法，将谷氨酸生产菌株接种至发酵培养基中进行发酵，待发酵产酸期开始后，将耗糖量和耗氧量进行关联，根据耗氧量在发酵培养基中流加葡萄糖。

在本发明的一种实施方式中，将谷氨酸生产菌株接种至发酵培养基中进行发酵，待发酵产酸期开始后，以发酵4～5min作为一个控制周期，每个控制周期内先根据公式Y＝2.65671X-7.74394计算出该控制周期内葡萄糖的消耗量，再根据公式和S(k+1)V＝S(k)V+S_FL(k)-G(k)计算出该控制周期内葡萄糖的理论流加量，最后在发酵培养基中流加葡萄糖；

公式Y＝2.65671X-7.74394中，Y是正常发酵产酸期葡萄糖消耗量，X是正常发酵产酸期氧气消耗量；

公式和S(k+1)V＝S(k)V+S_FL(k)-G(k)中，S(k)是发酵k时刻的葡萄糖浓度，单位为g/L，S(k+1)是发酵k+1时刻的葡萄糖浓度，单位为g/L，V是发酵液体积，单位为L，S_F是葡萄糖流加溶液浓度，单位为g/L，L(k)是k到k+1间隔内，葡萄糖的实际流加量，单位为L，G(k)是k到k+1间隔内，葡萄糖的实际消耗量，单位为g，是k到k+1间隔内，葡萄糖的理论流加量，单位为L；

以发酵k时刻到发酵k+1时刻作为一个发酵周期，计算这一控制周期内葡萄糖的理论流加量时，先假定k+1时刻的S(k+1)要达到设定值则然后将S(k+1)代入葡萄糖物料平衡关系式S(k+1)V＝S(k)V+S_FL(k)-G(k)中，即可求解得到

在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖以葡萄糖溶液的形式流加至发酵培养基中。

在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖溶液的浓度为300～900g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖溶液的浓度为500g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述谷氨酸生产菌株为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium gulutamicum)所述谷氨酸生产菌株为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumgulutamicum)或在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium gulutamicum)的基础上进行改造获得的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为嗜乙酰乙酸棒杆菌基因工程菌。所述嗜乙酰乙酸棒杆菌基因工程菌记载于公开号为CN104371961A的专利申请文本中。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含C₆H₁₂O₆、K₂HPO₄、玉米浆、MgSO₄、尿素、MnSO₄、FeSO₄、硫胺素以及生物素。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含C₆H₁₂O₆80g/L、K₂HPO₄1.5g/L、玉米浆5g/L、MgSO₄0.8g/L、尿素5.5g/L、MnSO₄2×10^-3g/L、FeSO₄2×10^-3g/L、硫胺素5×10^-5g/L以及生物素3×10^-6g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的pH为7.0～7.2。

本发明提供了上述方法在生产谷氨酸中的应用。

[有益效果]

本发明提供了一种发酵生产谷氨酸的方法，此方法通过控制发酵产酸期发酵培养基中葡萄糖的流加大大提高了谷氨酸的产量，利用此方法将嗜乙酰乙酸棒杆菌基因工程菌接种至10L发酵罐中发酵35h，即可使发酵液中谷氨酸的产量高达127g/L。

附图说明

图1：耗糖量和耗氧量的线性关系。

具体实施方式

下述实施例中涉及的嗜乙酰乙酸棒杆菌基因工程菌记载于公开号为CN104371961A的专利申请文本中。

下述实施例中涉及的培养基如下：

种子培养基：C₆H₁₂O₆25g/L、K₂HPO₄1.5g/L、玉米浆40g/L、FeSO₄5×10^-3g/L、MnSO₄5×10^-3g/L以及尿素2.5g/L，pH为7.0～7.2。

发酵培养基：C₆H₁₂O₆80g/L、K₂HPO₄1.5g/L、玉米浆5g/L、MgSO₄0.8g/L、尿素5.5g/L、MnSO₄2×10^-3g/L、FeSO₄2×10^-3g/L、硫胺素5×10^-5g/L以及生物素3×10^-6g/L，pH为7.0～7.2。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

葡萄糖含量和谷氨酸含量的测定：采用Bio-SBA生物分析仪分析发酵液中葡萄糖和谷氨酸的含量，吸取25μL的标准液SBA进行标定，标定结束，取1mL发酵液进行稀释后，吸取25μL稀释后的发酵液进行测定，记录数据。

菌体浓度的测定：使用UV-2000Z紫外可见分光光度计测定在620nm处的吸光值。

实施例1：谷氨酸的生产

具体步骤如下：

挑取嗜乙酰乙酸棒杆菌基因工程菌的单菌落接种至种子培养基中，于温度为32℃、转速为200r/min的条件下摇床培养8h，得到种子液；将种子液以10％(v/v)接种量接种至含有发酵培养基的10L发酵罐中发酵35h，获得发酵液；发酵过程中，发酵初期、中期和后期分别将温度控制为32、34和36℃，溶氧浓度DO控制在10～50％(通过调节转速控制溶氧浓度DO)，pH控制在7.1±0.1(通过流加浓度为250g/L的氨水控制pH)，待发酵产酸期开始后，以发酵4min作为一个控制周期，每个控制周期内先通过尾气分析仪检测发酵尾气中氧气的体积分数，然后根据线性公式Y＝2.65671X-7.74394(具体可见图1)计算出该控制周期内葡萄糖的消耗量，再根据公式和S(k+1)V＝S(k)V+S_FL(k)-G(k)计算出该控制周期内葡萄糖的理论流加量，最后在发酵培养基中流加浓度为10g/L的葡萄糖溶液；公式Y＝2.65671X-7.74394中，Y是正常发酵产酸期葡萄糖消耗量，X是正常发酵产酸期氧气消耗量；公式和S(k+1)V＝S(k)V+S_FL(k)-G(k)中，S(k)是发酵k时刻的葡萄糖浓度，单位为g/L，S(k+1)是发酵k+1时刻的葡萄糖浓度，单位为g/L，V是发酵液体积，单位为L，S_F是葡萄糖流加溶液浓度，单位为g/L，L(k)是k到k+1间隔内，葡萄糖的实际流加量，单位为L，G(k)是k到k+1间隔内，葡萄糖的实际消耗量，单位为g，是k到k+1间隔内，葡萄糖的理论流加量，单位为L；以发酵k时刻到发酵k+1时刻作为一个发酵周期，计算这一控制周期内葡萄糖的理论流加量时，先假定k+1时刻的S(k+1)要达到设定值则然后将S(k+1)代入葡萄糖物料平衡关系式S(k+1)V＝S(k)V+S_FL(k)-G(k)中，即可求解得到整个发酵产酸期共流加0.87L葡萄糖。

检测发酵液中谷氨酸的产量，检测结果为：发酵液中谷氨酸的产量高达127g/L。

实施例2：谷氨酸的生产

具体步骤如下：

挑取嗜乙酰乙酸棒杆菌基因工程菌的单菌落接种至种子培养基中，于温度为32℃、转速为200r/min的条件下摇床培养8h，得到种子液；将种子液以10％(v/v)接种量接种至含有发酵培养基的10L发酵罐中发酵35h，获得发酵液；发酵过程中，发酵初期、中期和后期分别将温度控制为32、34和36℃，溶氧浓度DO控制在10～50％(通过调节转速控制溶氧浓度DO)，pH控制在7.1±0.1(通过流加浓度为250g/L的氨水控制pH)，待发酵产酸期开始后，以发酵5min作为一个控制周期，每个控制周期内先通过尾气分析仪检测发酵尾气中氧气的体积分数，然后根据线性公式Y＝2.65671X-7.74394(具体可见图1)计算出该控制周期内葡萄糖的消耗量，再根据公式和S(k+1)V＝S(k)V+S_FL(k)-G(k)计算出该控制周期内葡萄糖的理论流加量，最后在发酵培养基中流加浓度为10g/L的葡萄糖溶液；公式Y＝2.65671X-7.74394中，Y是正常发酵产酸期葡萄糖消耗量，X是正常发酵产酸期氧气消耗量；公式和S(k+1)V＝S(k)V+S_FL(k)-G(k)中，S(k)是发酵k时刻的葡萄糖浓度，单位为g/L，S(k+1)是发酵k+1时刻的葡萄糖浓度，单位为g/L，V是发酵液体积，单位为L，S_F是葡萄糖流加溶液浓度，单位为g/L，L(k)是k到k+1间隔内，葡萄糖的实际流加量，单位为L，G(k)是k到k+1间隔内，葡萄糖的实际消耗量，单位为g，是k到k+1间隔内，葡萄糖的理论流加量，单位为L；以发酵k时刻到发酵k+1时刻作为一个发酵周期，计算这一控制周期内葡萄糖的理论流加量时，先假定k+1时刻的S(k+1)要达到设定值则然后将S(k+1)代入葡萄糖物料平衡关系式S(k+1)V＝S(k)V+S_FL(k)-G(k)中，即可求解得到整个发酵产酸期共流加0.94L葡萄糖。

检测发酵液中谷氨酸的产量，检测结果为：发酵液中谷氨酸的产量高达118g/L。

对比例1：谷氨酸的生产

具体步骤如下：

挑取嗜乙酰乙酸棒杆菌基因工程菌的单菌落接种至种子培养基中，于温度为32℃、转速为200r/min的条件下摇床培养8h，得到种子液；将种子液以10％(v/v)接种量接种至含有发酵培养基的10L发酵罐中发酵35h，获得发酵液；发酵过程中，发酵初期、中期和后期分别将温度控制为32、34和36℃，溶氧浓度DO控制在10～50％(通过调节转速控制溶氧浓度DO)，pH控制在7.1±0.1(通过流加浓度为250g/L的氨水控制pH)，待发酵产酸期开始后，不断流加500g/L葡萄糖控制发酵液中葡萄糖的浓度为10g/L；整个发酵产酸期共流加0.83L葡萄糖溶液。

检测发酵液中谷氨酸的产量，检测结果为：发酵液中谷氨酸的产量仅有66g/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。