一种谷氨酸的发酵方法
阅读说明：本技术 一种谷氨酸的发酵方法 (Fermentation method of glutamic acid ) 是由 杨玉岭 满德恩 郭脉海 仇南南 崔光军 王婷婷 杜英慧 王成秋 周明英 李国强 于 2020-12-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种谷氨酸的发酵方法,属于谷氨酸发酵技术领域,包括发酵菌株摇瓶培养阶段、一级种子罐扩大培养阶段、二级种子罐扩大培养阶段和发酵阶段,所述发酵阶段采用零底糖浓度的发酵培养基,并以开始就流加的方式替代了高浓度的葡萄糖初始添加的传统发酵方式；本发明的有益效果是：规避了高浓度葡萄糖会在高温灭菌过程中产生的严重的焦糖化反应和局部浓度过高的液氨与高浓度葡萄糖会产生副反应的问题,比现有高浓度的葡萄糖初始添加的传统发酵方式发酵时间上有了进一步地缩短的效果。(The invention discloses a fermentation method of glutamic acid, belonging to the technical field of glutamic acid fermentation, comprising a shake flask culture stage of a fermentation strain, an expanded culture stage of a first-stage seed tank, an expanded culture stage of a second-stage seed tank and a fermentation stage, wherein the fermentation stage adopts a fermentation medium with zero base sugar concentration and replaces the traditional fermentation mode of initial addition of high-concentration glucose in a mode of feeding in a flowing manner at first; the invention has the beneficial effects that: the problems that high-concentration glucose can generate serious caramelization reaction in the high-temperature sterilization process and the liquid ammonia with over-high local concentration and the high-concentration glucose can generate side reaction are solved, and the fermentation time is further shortened compared with the conventional fermentation method for initially adding the high-concentration glucose.)
技术领域：
本发明属于谷氨酸发酵技术领域，更具体地涉及一种谷氨酸的发酵方法。
背景技术：
谷氨酸发酵生产是谷氨酸产生菌在其生命活动过程中分解代谢营养物质、合成所需产物、谷氨酸的生化过程。目前工业上应用的谷氨酸产生菌有谷氨酸棒状杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌、噬氨短杆菌等。在发酵生产过程中，影响谷氨酸产生菌生长、繁殖、代谢及合成产物的因素很多，通过人工干预有目的地控制这些因素，使其最终满足谷氨酸菌种的代谢合成需要，可以达到增加产物降低消耗的目的。
谷氨酸产生菌既是反应过程的主体，也是反应过程的生物催化剂，它摄取原料的营养，通过细胞内特定的酶系进行复杂的生化反应。其底物中的反应物透过细胞壁和细胞膜进入细胞体内，在酶的作用下进行催化反应，将反应物转化为产物并释放出来，细胞的内在特性及其代谢规律是影响生化反应的关键因素。
谷氨酸发酵阶段大体分为：谷氨酸产生菌增殖阶段和谷氨酸产生菌产酸阶段，其中谷氨酸产生菌产酸阶段中谷氨酸的生物合成途径大致是：葡萄糖经糖酵解(EMP途径)和己糖磷酸支路(HMP途径)生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A(乙酰COA)，然后进入三羧酸循环，生成α-酮戊二酸。α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4 +存在的条件下，生成谷氨酸。
而谷氨酸产生菌增殖阶段需要将谷氨酸产生菌在短时间达到一定OD值，传统工艺的谷氨酸发酵工艺的发酵培养基中均含有10-15％甚至更高的初糖含量，来满足谷氨酸产生菌在生长初期快速生长的需求，如此之高的高浓度葡萄糖会在高温灭菌过程中产生严重的焦糖化反应，产生大量的色素对后续工序产生负担，同时也浪费一定量的葡萄糖，特别是因为后续还需要加入液氨进行调节，局部过高的液氨与高浓度葡萄糖会产生副反应，产生副产物导致产品品质下降，而且生成的副产物与谷氨酸物化性质相似，加大了后续提取和纯化的难度。
发明内容
：为解决上述问题，克服现有技术的不足，本发明提供了一种谷氨酸的发酵方法，能够有效的解决高浓度葡萄糖会在高温灭菌过程中产生严重的焦糖化反应和局部浓度过高的液氨与高浓度葡萄糖会产生副反应的问题。
本发明解决上述技术问题的具体技术方案为：谷氨酸的发酵方法，包括发酵菌株摇瓶培养阶段、一级种子罐扩大培养阶段、二级种子罐扩大培养阶段和发酵阶段；
具体步骤包括：
(1)发酵菌株摇瓶培养阶段：将低温保藏的菌种进行活化处理；并将活化的发酵菌株，接入摇瓶培养基中，初糖为0％，流加糖控制残糖浓度始终维持在0.6-1.0％，温度控制在32℃，摇床转速为100rpm，摇床培养8-10h，根据OD达到0.8-1.0，保存待用；
(2)一级种子罐扩大培养阶段：将一级种子罐培养基一次性加入罐中，126℃，25min高温灭菌，冷却后液氨调pH至7.0，菌种室钢瓶火焰接种，32℃计时发酵，初糖为0％，流加糖控制残糖浓度始终维持在0.6-1.0％，维持24h，终止发酵，根据OD达到0.5-0.8；冷却降温，4℃保存待用；
(3)二级种子罐扩大培养阶段：将二级种子罐培养基一次性加入罐中，126℃，25min高温灭菌，冷却后液氨调pH至7.0，接种一级种子罐，初糖为0％，温度32℃，流加糖控制残糖浓度始终维持在0.6-1.0％，发酵12-16h，残糖为0.1％，终止发酵，根据OD达到0.8-1.0,冷却降温，4℃保存待用；
所述的摇瓶培养基为无底糖培养基，包括1％豆粕水解液、0.1％丁二酸、0.05％蛋氨酸、0.15％硫酸镁、0.13％甜菜碱、0.4％磷酸二氢钾、0.2％玉米浆、10mg/L硫酸亚铁、10mg/L硫酸锰、300μg/L生物素、200μg/L VB1、0.55％尿素和0.5％酵母粉。
所述一级种子罐培养基为无底糖培养基，按照质量百分比包括葡萄糖0％、磷酸：0.2-0.3％、硫酸镁：0.1-0.2％、磷酸二氢钾：0.1-0.2％、丁二酸：0.2-0.4％、豆粕水解液：3-5％、蛋氨酸：0.04-0.05％，其余为水。
所述二级种子罐培养基为无底糖培养基，按照质量百分比包括葡萄糖0％、豆粕水解液：2.5-5％、丁二酸：0.3-0.5％、硫酸镁：0.1-0.2％、磷酸：0.25-0.5％、磷酸二氢钾:0.1-0.2％、蛋氨酸：0.0125-0.02％、硫酸亚铁：0.0008-0.001％、硫酸锰：0.0008-0.001％。
(4)所述发酵阶段：
Ⅰ：发酵罐空消，然后打入连消系统灭菌的氯化钾、硫酸镁、甜菜碱、蛋氨酸、硫酸锰、硫酸亚铁；控制底糖浓度为0％，冷却降温，打入经连消系统灭菌的玉米浆、豆粕水解液和磷酸，待温度降到55℃，液氨调节ph值至7.0；
Ⅱ：待培养基温度降到38℃，将二级种子罐移种，接种完计时发酵，发酵过程中流加糖、液氨和消泡剂，使培养基中残糖浓度始终维持在0.6-1.0％左右，发酵8-10h左右，OD增长至0.8-1.0，发酵提温至37℃，发酵转入产酸阶段；
Ⅲ：发酵至28-32h左右，进入发酵末期，耗糖产酸减慢，停止糖流加，待残糖消耗至0.2％左右，发酵结束，测定谷氨酸发酵的产酸量。
所述发酵阶段的培养基为无底糖培养基，按照质量百分比包括玉米浆5-8％、豆粕水解液：0.3-0.5％、磷酸：0.1-0.2％、糖：0％、氯化钾：0.1-0.3％、硫酸镁：0.1-0.2％、甜菜碱：0.1-0.2％、蛋氨酸：0.02-0.03％、硫酸锰：0.0008-0.001％、硫酸亚铁：0.0008-0.001％。
本发明的有益效果是：
本发明创造性的设置了零底糖浓度的发酵培养基，并以开始就流加的方式替代了高浓度的葡萄糖初始添加的传统发酵方式，从而规避了高浓度葡萄糖会在高温灭菌过程中产生的严重的焦糖化反应和局部浓度过高的液氨与高浓度葡萄糖会产生副反应的问题；
同时，本发明还意外地发现了采用零底糖浓度的发酵培养基，并以特定流速开始就流加的方式，并不会因单方面降低葡萄糖浓度导致谷氨酸菌前期生长慢，反而比现有高浓度的葡萄糖初始添加的传统发酵方式发酵时间上有了进一步地缩短的效果。
具体实施方式
：
在本发明的描述中具体细节仅仅是为了能够充分理解本发明的实施例，但是作为本领域的技术人员应该知道本发明的实施并不限于这些细节。另外，公知的结构和功能没有被详细的描述或者展示，以避免模糊了本发明实施例的要点。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
本发明的具体实施方式：
实施例一：
谷氨酸的发酵方法，包括发酵菌株摇瓶培养阶段、一级种子罐扩大培养阶段、二级种子罐扩大培养阶段和发酵阶段；
具体步骤包括：
(1)发酵菌株摇瓶培养阶段：将低温保藏的菌种进行活化处理；并将活化的发酵菌株，接入摇瓶培养基中，初糖为0％，流加糖控制残糖浓度始终维持在0.6-1.0％，温度控制在32℃，摇床转速为100rpm，摇床培养8-10h，根据OD达到0.8-1.0，保存待用；
(2)一级种子罐扩大培养阶段：将一级种子罐培养基一次性加入罐中，126℃，25min高温灭菌，冷却后液氨调pH至7.0，菌种室钢瓶火焰接种，32℃计时发酵，初糖为0％，流加糖控制残糖浓度始终维持在0.6-1.0％，维持24h，终止发酵，根据OD达到0.5-0.8；冷却降温，4℃保存待用；
(3)二级种子罐扩大培养阶段：将二级种子罐培养基一次性加入罐中，126℃，25min高温灭菌，冷却后液氨调pH至7.0，接种一级种子罐，初糖为0％，温度32℃，流加糖控制残糖浓度始终维持在0.6-1.0％，发酵12-16h，残糖为0.1％，终止发酵，根据OD达到0.8-1.0,冷却降温，4℃保存待用；
所述的摇瓶培养基为无底糖培养基，包括1％豆粕水解液、0.1％丁二酸、0.05％蛋氨酸、0.15％硫酸镁、0.13％甜菜碱、0.4％磷酸二氢钾、0.2％玉米浆、10mg/L硫酸亚铁、10mg/L硫酸锰、300μg/L生物素、200μg/L VB1、0.55％尿素和0.5％酵母粉。
所述一级种子罐培养基为无底糖培养基，按照质量百分比包括葡萄糖0％、磷酸：0.2-0.3％、硫酸镁：0.1-0.2％、磷酸二氢钾：0.1-0.2％、丁二酸：0.2-0.4％、豆粕水解液：3-5％、蛋氨酸：0.04-0.05％，其余为水。
所述二级种子罐培养基为无底糖培养基，按照质量百分比包括葡萄糖0％、豆粕水解液：2.5-5％、丁二酸：0.3-0.5％、硫酸镁：0.1-0.2％、磷酸：0.25-0.5％、磷酸二氢钾:0.1-0.2％、蛋氨酸：0.0125-0.02％、硫酸亚铁：0.0008-0.001％、硫酸锰：0.0008-0.001％。
(4)所述发酵阶段：
Ⅰ：发酵罐空消，然后打入连消系统灭菌的氯化钾、硫酸镁、甜菜碱、蛋氨酸、硫酸锰、硫酸亚铁；控制底糖浓度为0％，冷却降温，打入经连消系统灭菌的玉米浆、豆粕水解液和磷酸，待温度降到55℃，液氨调节ph值至7.0；
Ⅱ：待培养基温度降到38℃，将二级种子罐移种，接种完计时发酵，发酵过程中流加糖、液氨和消泡剂，使培养基中残糖浓度始终维持在0.6-1.0％左右，发酵8-10h左右，OD增长至0.8-1.0，发酵提温至37℃，发酵转入产酸阶段；
Ⅲ：发酵至28-32h左右，进入发酵末期，耗糖产酸减慢，停止糖流加，待残糖消耗至0.2％左右，发酵结束，测定谷氨酸发酵的产酸量。
所述发酵阶段的培养基为无底糖培养基，按照质量百分比包括玉米浆5-8％、豆粕水解液：0.3-0.5％、磷酸：0.1-0.2％、糖：0％、氯化钾：0.1-0.3％、硫酸镁：0.1-0.2％、甜菜碱：0.1-0.2％、蛋氨酸：0.02-0.03％、硫酸锰：0.0008-0.001％、硫酸亚铁：0.0008-0.001％。
为了更加直观的展现本发明的零初糖浓度培养基工艺优势，特以本发明采用零初糖浓度培养基发酵方法和对比例的方法进行对比，
对比例一：
制备方法同实施例一，所不同的是：本对比例的制备过程中，发酵培养基采用的是高浓度底糖培养基，底糖浓度为15％；其中发酵前期温度维持在33℃左右，发酵6-8h左右，初糖消耗差不多，开始进流加糖，使培养基中残糖浓度始终维持在1.0％左右；
对比例二：
制备方法同实施例一，所不同的是：本对比例的制备过程中，发酵培养基采用的是低浓度底糖培养基，底糖浓度为8％；其中发酵前期温度维持在33℃左右，发酵6-8h左右，初糖消耗差不多，开始进流加糖，使培养基中残糖浓度始终维持在1.0％左右；
根据味精工业手册(第二版)中关于半成品L-谷氨酸(麸酸)质量要求对谷氨酸的透光度和纯度进行测定:
表1：零初糖浓度培养基工艺对于产品品质的影响对比
发酵培养基
灭菌
发酵时间/h
透光率
纯度/％
实施例一
零浓度底糖
连消
26
8-10
97
对比例一
高浓度底糖
连消
32
1-3
95
对比例二
低浓度底糖
连消
30
2-5
95
根据表1数据分析可知：
零初糖浓度培养基工艺相对于高浓度底糖培养基工艺和低浓度底糖培养基工艺来说，发酵液的透光率具有本质性的改善，这是由于葡萄糖浓度的降低规避了连消过程中的焦糖化反应；
零初糖浓度培养基工艺相对于高浓度底糖培养基工艺和低浓度底糖培养基工艺来说，含量也有了一定的提高，这可能是由于零初糖浓度培养基避免了葡萄糖与液氨的反应生成葡萄糖酸铵，葡萄糖酸铵会对产品的纯度产生影响；
值得注意的是：零初糖浓度培养基工艺相对于高浓度底糖培养基工艺和低浓度底糖培养基工艺来说，发酵时间上有了进一步地缩短的效果，而高浓度底糖培养基工艺和低浓度底糖培养基工艺来说发酵时间差异性不大。
为了解决如何进一步地缩短发酵时间问题，还包括一种缩短谷氨酸的发酵时间的方法，发酵阶段的前期，在零初糖浓度培养基工艺的基础上，流加糖、液氨和消泡剂的同时流加三磷酸腺苷二钠，流加量为5-8g/L；具体的步骤是：
实施例二
谷氨酸的发酵方法，包括发酵菌株摇瓶培养阶段、一级种子罐扩大培养阶段、二级种子罐扩大培养阶段和发酵阶段，其特征在于所述发酵阶段包括：
(1)发酵罐空消，然后打入连消系统灭菌的氯化钾、硫酸镁、甜菜碱、蛋氨酸、硫酸锰、硫酸亚铁；控制底糖浓度为0％，冷却降温，打入经连消系统灭菌的玉米浆、豆粕水解液和磷酸，待温度降到55℃，液氨调节ph值至7.0；
(2)待培养基温度降到38℃，将二级种子罐的普通谷氨酸菌移种，接种完计时发酵，发酵过程中流加糖、液氨、三磷酸腺苷二钠和消泡剂，三磷酸腺苷二钠的流加量为5-8g/L；并使培养基中残糖浓度始终维持在0.6-1.0％左右，发酵8-10h左右，OD增长至0.8-1.0，发酵提温至37℃，发酵转入产酸阶段；
(3)发酵至28-32h左右，进入发酵末期，耗糖产酸减慢，停止糖流加，待残糖消耗至0.2％左右，发酵结束，测定谷氨酸发酵的产酸量。
对比例三：
制备方法同实施例二，所不同的是：本对比例的制备过程中，没有流加三磷酸腺苷二钠；
对比例四：
制备方法同实施例三，所不同的是：本对比例的制备过程中，没有流加三磷酸腺苷二钠；
对发酵液OD达到0.8-1.0进行发酵时间和综合产酸量的对比；
表2：零初糖浓度培养基与三磷酸腺苷二钠对于产品品质的影响对比
发酵培养基
三磷酸腺苷二钠
发酵时间/h
产酸量/％
糖酸转化率/％
实施例一
零浓度底糖
无
26
18-20.5
70-72
实施例二
零浓度底糖
有
23
19-21
70-72.5
对比例一
高浓度底糖
无
32
16-19
67-70
对比例二
低浓度底糖
无
30
17-20
69-72
对比例三
高浓度底糖
有
31
16.5-18.5
68-70
对比例四
低浓度底糖
有
29
18-20
68-71
根据表2数据分析可知：
发酵初期流加三磷酸腺苷二钠，对于上述实施例和对比例均能够对发酵时间有一定的提升，但是对于高浓度初糖培养基影响不大，其中随着葡萄糖浓度的降低上述效果更为显著，特别是对于零初糖浓度培养基能够缩短将近3小时；
通过添加三磷酸腺苷二钠，对于产酸量和糖酸转化率差异性不大，但是高浓度初糖培养基相对于零初糖浓度培养基在产酸量和糖酸转化率均效果较差。
因此，本发明创造性的通过在发酵初期流加三磷酸腺苷二钠，能够快速提高菌种对于葡萄糖的吸收，达到了菌体快速生长的目的；
这可能是由于三磷酸腺苷二钠能够为进行发酵产能的微生物的许多生命活动需要跨膜质子梯度产生的动力来提供能量,因此,这些微生物也具有ATP酶,用来消耗ATP产生跨膜的质子梯度。
特别是神奇的发现，通过本发明零底糖浓度的发酵培养基工艺配合加三磷酸腺苷二钠，与对比例一,即传统的高浓度底糖发酵方法相比，在产酸量和发酵时间上还有了进一步地提升。
综上所述：
(1)本发明创造性地设置了零底糖浓度的发酵培养基，并以开始就流加的方式替代了高浓度的葡萄糖初始添加的传统发酵方式，从而规避了高浓度葡萄糖会在高温灭菌过程中产生的严重的焦糖化反应和局部浓度过高的液氨与高浓度葡萄糖会产生副反应的问题；
(2)采用零底糖浓度的发酵培养基，并以特定流速开始就流加的方式，意外地发现了并不会因单方面降低葡萄糖浓度导致谷氨酸菌前期生长慢，反而比现有高浓度的葡萄糖初始添加的传统发酵方式发酵时间上有了进一步地缩短的效果；
(3)本发明创造性的通过在发酵初期流加三磷酸腺苷二钠，能够快速提高菌种对于葡萄糖的吸收，达到了菌体进一步地快速生长的目的。