阅读说明：本技术 基于恒温催化反应过程中实时测定吸光度的酶活测定方法 (Enzyme activity determination method based on real-time absorbance determination in constant-temperature catalytic reaction process ) 是由 姜文侠 田晓丽 张笑然 孙瑞雪 于 2019-11-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于恒温催化反应过程中实时测定吸光度的酶活测定方法。该方法包括：在待测酶恒温催化反应的同时实时测定反应体系吸光度；如吸光度随时间变化曲线为直线,则任意选择两个时间点测定的吸光度计算待测酶酶活；如包含直线部分,则选择此直线部分中任意两个时间点测定的吸光度计算待测酶酶活；如不为直线且不包含直线部分,则改变或优化测定条件,重新测定,直至变化曲线为直线或包含直线部分止；以上所有直线部分均至少有三个吸光度值且斜率不为零。本发明实现酶催化温度及时间的精确计量,简化操作。且以初始催化反应速率计算酶活,缩短检测时间,降低底物和待测酶液浓度,节省成本。该方法无终止催化反应操作,缩短检测总时间。(The invention discloses an enzyme activity determination method based on real-time absorbance determination in a constant-temperature catalytic reaction process. The method comprises the following steps: measuring the absorbance of a reaction system in real time while carrying out constant-temperature catalytic reaction on the enzyme to be measured; if the time-varying curve of the absorbance is a straight line, the absorbance measured at two time points is arbitrarily selected to calculate the enzyme activity of the enzyme to be measured; if the linear part is included, selecting the absorbance measured at any two time points in the linear part to calculate the enzyme activity of the enzyme to be measured; if the curve is not a straight line and does not contain a straight line part, changing or optimizing the measurement condition, and re-measuring until the curve is a straight line or contains a straight line part; all the above straight-line portions have at least three absorbance values and the slope is not zero. The invention realizes the accurate measurement of enzyme catalysis temperature and time and simplifies the operation. And the enzyme activity is calculated according to the initial catalytic reaction rate, the detection time is shortened, the concentrations of a substrate and the enzyme solution to be detected are reduced, and the cost is saved. The method has no termination of catalytic reaction operation, and shortens the total detection time.)

基于恒温催化反应过程中实时测定吸光度的酶活测定方法

技术领域

本发明涉及酶活测定领域，具体涉及一种基于恒温催化反应过程中实时测定吸光度的酶活测定方法。

背景技术

酶活是酶和酶制剂的挖掘、创制、研究、生产、分离纯化及应用的一个必不可少的参数，以其在特定的温度等试验条件下所催化的反应的速率表示。

分光光度法是最常用的酶活测定技术，利用分光光度法测定酶活的过程，一般是将酶催化反应体系在某设定温度维持一定时间，然后用加热煮沸的方式灭酶或加入酶的抑制剂以终止反应，通过酶催化反应前后反应体系的吸光度(OD)的变化测定酶催化产物的生成量或酶催化底物的消耗量，进而计算得到酶活[Miyabe R,Takahashi Y,Matsufuji H,Ogihara J,Itou K,Kawai Y,et al.Purification and partial characterization ofan X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase from Lactobacillus gasseri ME-284.FoodScience and Technology Research.2015；21(3):445-51.][Mejias L,Cerda A,BarrenaR,Gea T,Sanchez A.Microbial strategies for cellulase and xylanase productionthrough solid-state fermentation of digestate frombiowaste.Sustainability.2018；https://doi.org/10.3390/su10072433.][Alhelli AM,Abdul Manap MY,Mohammed AS,Mirhosseini H,Suliman E,Shad Z,et al.Responsesurface methodology modelling of an aqueous two-phase system for purificationof protease from Penicilliumcandidum(PCA1/TT031)under solid statefermentation and its biochemical characterization.International Journal ofMolecular Sciences.2016；https://doi.org/10.3390/ijms17111872]。该方法由于仅测定催化反应前后两个时间点的吸光度值，我们称之为“两点法”。在这样的测定过程中，由于酶的催化反应过程与吸光度的检测在时间和空间上是相互分离的，即反应和检测不在同一容器中同时进行，导致操作复杂，且容易出现误差。

酶催化的反应温度和反应时长的计量是酶活检测准确与否的重要影响因素。现有的“两点法”，酶催化反应体系在反应起始阶段的试剂混和与温度控制过程，在终止酶催化反应的阶段均存在较大的系统误差和偶然误差。具体表现是：在反应的起始阶段，酶催化反应的试剂溶液、待测酶液的温度一般是室温，而酶催化反应的设定温度多不是室温；上述多种液体混和形成反应体系，即开始了酶催化反应；混和而成的反应体系通常在水浴中需要一段时间才能达到设定温度；因此，酶催化反应开始的时间点不是达到设定催化温度的时间点。在终止反应阶段，不论是加热煮沸还是加入酶的抑制剂来终止酶催化反应，终止的操作过程均需消耗一段时间，因而也不能准确地确定反应终止的时间点。为了减少上述因素引起的误差，往往通过较高浓度的底物和较长的酶催化反应时长(通常控制在10～60min)，来减少计量误差的影响[Miyabe R,Takahashi Y,Matsufuji H,Ogihara J,Itou K,KawaiY,et al.Purification and partial characterization of an X-prolyl-dipeptidylaminopeptidase from Lactobacillus gasseri ME-284.Food Science and TechnologyResearch.2015；21(3):445-51.][Mejias L,Cerda A,Barrena R,Gea T,SanchezA.Microbial strategies for cellulase and xylanase production through solid-state fermentation of digestate from biowaste.Sustainability.2018；https://doi.org/10.3390/su10072433.][Alhelli AM,Abdul Manap MY,Mohammed AS,Mirhosseini H,Suliman E,Shad Z,et al.Response surface methodology modellingof an aqueous two-phase system for purification of protease fromPenicilliumcandidum(PCA1/TT031)under solid state fermentation and itsbiochemical characterization.International Journal of MolecularSciences.2016；https://doi.org/10.3390/ijms17111872]。

酶反应动力学的研究表明，在酶反应的最初阶段，底物或产物的变化量随反应时间的增加而呈线性增加，酶的催化反应速率最大，此时的酶的反应速率称为初始催化反应速率。随着反应时间的延长，底物的消耗速率或产物的生成速率下降，酶的催化反应速率下降。造成酶反应速率下降的因素很多，随着反应的延续，底物浓度不断降低，产物不断增加，逆向反应从无到有逐渐变得显著，同时酸、碱、热等因素也在慢慢地起作用，使酶破坏失活。因此，真正能代表酶的催化活性的只能是酶的初始催化反应速率[居乃琥.酶工程手册.北京：中国轻工业出版社；2011：172.]，是能用于酶催化活性比对的标准化的特征指标。而现行的“两点法”，只测定反应开始及结束时的底物或产物浓度，无法判断在反应过程中底物浓度是否一直处于使酶保持初始催化反应速率的浓度范围之内[Hu HL,van den Brink J,Gruben BS,Wosten HAB,Gu JD,de Vries RP.Improved enzyme production by co-cultivation of Aspergillus niger and Aspergillus oryzae and with otherfungi.International Biodeterioration&Biodegradation.2011；65(1):248-52.][Alberto Batista-Garcia R,Balcazar-Lopez E,Miranda-Miranda E,Sanchez-Reyes A,Cuervo-Soto L,Aceves-Zamudio D,et al.Characterization of lignocellulolyticactivities from a moderate halophile strain of Aspergillus caesiellusisolated from a sugarcane bagasse fermentation.Plos One.2014；https://doi.org/10.1371/journal.pone.0105893.][Ding ZY,Chen YZ,Xu ZH,Peng L,Xu GH,Gu ZH,etal.Production and characterization of laccase from Pleurotus ferulae insubmerged fermentation.Annals of Microbiology.2014；64(1):121-9.]，测定的结果实际上是两个测定时间点之间的平均催化速率，影响到酶活检测结果的准确性和可比性，也是酶活标准混乱的原因之一。

此外，至今还没有在线检测酶活的成熟的设备及方法，在酶的研究、生产、分离纯化及应用中，无法实施及时的反馈控制。

因此，如果能简化操作，提高计量精度，大幅度缩短检测时间，测定酶的初始催化反应速率，及时获得更加准确的检测结果，则不仅有助于建立酶活测定方法的通用标准，还可为研制酶活的在线检测系统奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于恒温催化反应过程中实时测定吸光度的酶活快速测定方法。

本发明提供了一种基于分光光度法测定酶活的方法，可包括如下步骤：

(1)酶的恒温催化反应过程与吸光度值的检测在同一时空进行，即：在待测酶的恒温催化反应的同时对该反应体系进行吸光度值的实时测定；

(2)绘制吸光度值随时间的变化曲线；如果吸光度值随时间的变化曲线为一条斜率不变的直线，则任意选择两个时间点测定的吸光度值计算所述待测酶的酶活；如果吸光度值随时间的变化曲线中包含直线部分，则选择此直线部分中任意两个时间点测定的吸光度值计算所述待测酶的酶活；如果吸光度值随时间的变化曲线不为一条斜率不变的直线，且不包含直线部分，则改变或优化测定条件，重新进行步骤(1)，直至吸光度值随时间的变化曲线为一条斜率不变的直线或包含直线部分止；以上所有的所述直线部分均至少有三个吸光度值且斜率不为零。

本方法可通过直线部分的R²值判断酶活测定数值的准确性，其中R²值的限定范围通过在实际操作中所需测定结果的准确程度进行确定。为区别现行的“两点法”，将本发明建立的方法称为“多点法”。

进一步地，步骤(1)中，所述进行吸光度值的的实时测定为至少测定3个时间点的吸光度值，前两个时间点的吸光度值可用于计算酶活的检测值，最后的吸光度值可用于校验至少3个时间点的吸光度值随时间的变化是否为直线的校验值。

进一步地，步骤(2)中，所述直线或所述直线部分应是在使所述待测酶保持初始催化反应速率的情况下所得。

更进一步地，步骤(2)中所述直线或所述直线部分对应的吸光度值应是在反应体系中底物浓度在不低于使所述待测酶保持初始催化反应速率的最低浓度的情况下测定的；步骤(2)中所述直线或所述直线部分对应的吸光度值应是在反应过程中使所述待测酶保持初始催化反应速率的最大时长范围内测定的。

其中，能够使所述待测酶保持初始催化反应速率的所述底物的最低浓度和能够使所述待测酶保持初始催化反应速率的最大时长可通过吸光度值随时间的变化曲线确定。

进一步地，步骤(2)中，所述改变或优化测定条件具体可为稀释待测酶液和/或提高底物浓度。

在步骤(1)中，进行所述待测酶的催化反应时，具体可在可以测定吸光度的设备中能够透过紫外光和/或可见光的容器(如分光光度计的比色皿)中进行，通过介质(如循环水浴)准确控制该容器内酶催化反应体系的温度；在进行所述待测酶的恒温催化反应的同时实时测定催化体系的吸光度。

为了避免因反应初期催化体系的温度未达到设定温度而引起的误差，在所述方法的步骤(1)中，事先使所述待测酶的酶液和酶活测定所用的试液的温度与催化反应温度相同，比如置于与催化反应温度相同的水浴中进行充分的水浴恒温。

在所述方法中，所述待测酶可为能够用分光光度法检测其底物或产物浓度变化的酶。

进一步地，所述待测酶可为催化底物包括溶解氧的酶和催化底物不包括溶解氧的酶。

进一步地，所述催化底物包括溶解氧的酶可为氧化酶。

更进一步地，所述氧化酶为漆酶。

本发明所述的“底物”是指：酶作用的物质，经酶作用可形成产物。

本发明的“溶解氧”是水溶液中溶解的分子态氧。水溶液中的溶解氧的含量与空气中氧的分压、溶液的温度有关。

在本发明的

具体实施方式

中，所述待测酶具体为如下任一：

(A)催化底物包括溶解氧的酶，如：漆酶或葡萄糖氧化酶；

(B)催化底物不包括溶解氧的酶，如：α-胰凝乳蛋白酶、氨肽酶、乙醇脱氢酶、辣根过氧化物酶、锰过氧化物酶或过氧化氢酶。

另外，本发明所提供的上述方法的如下用途也属于本发明的保护范围：对不同酶或不同酶制剂进行活力比较。

本发明使酶的恒温催化反应与吸光度的检测在同一时空进行，实现了检测过程中酶催化反应温度的精确控制及催化反应时长的精确计量，大幅度降低了因计量而引起的误差。由于可以在酶恒温催化反应的同时实时监测产物(或底物)浓度及反应速率的变化，一方面，可以避免反应过程中因底物的消耗而引起测定结果的误差，确保通过初始催化反应速率计算酶活，测定结果准确。另一方面，由于初始催化反应速率是酶的重要特征，因而更便于不同酶及其制剂活力的比较。在此基础上，本发明不仅显著缩短了检测所需的时间，而且大幅度降低了底物和待测酶液的浓度，节省试剂成本。由于本发明不需要终止催化反应，大幅度简化了操作程序，进一步缩短了检测全过程消耗的总时间。

附图说明

图1为水浴恒温比色皿架示意图。1为比色皿；2为外接的循环管路。

图2为α-胰凝乳蛋白酶酶活检测过程中吸光度值随时间的变化。

图3为氨肽酶酶活检测过程中吸光度值随时间的变化。

图4为乙醇脱氢酶酶活检测过程中吸光度值随时间的变化。

图5为辣根过氧化物酶酶活检测过程中吸光度值随时间的变化。

图6为锰过氧化物酶酶活检测过程中吸光度值随时间的变化。

图7为三种不同温度漆酶酶活检测的酶催化体系中溶解氧浓度随时间的变化。

图8为不同漆酶浓度的酶活检测体系中溶解氧浓度的变化。

图9为漆酶酶活检测过程中吸光度值随时间的变化。其中，(a)为稀释待测酶液前；(b)为稀释待测酶液后。

图10为葡萄糖氧化酶酶活检测过程中吸光度值随时间的变化。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、恒温反应分光光度系统及酶催化反应过程中催化体系吸光度的测定

紫外-可见分光光度计使用水浴恒温比色皿架(如图1示意)，通过管路2外接恒温循环水浴，以准确地控制比色皿内反应体系的温度，箭头方向为循环水流向。在比色皿1中进行酶的恒温催化反应，在酶的恒温催化反应的同时检测该催化体系的吸光度，即酶的恒温催化反应过程与吸光度检测在同一时空进行。

以下实施例均通过本系统进行。

实施例2、α-胰凝乳蛋白酶酶活的测定

将α-胰凝乳蛋白酶待测酶液和酶活测定所用的试液预先于25℃水浴恒温。取1.5mLTris缓冲溶液(0.969g三羟甲基氨基甲烷和1.47mg二水氯化钙溶于80mL蒸馏水中，用1mol/L盐酸调pH至7.8，定容至100mL)和1.4mL底物溶液(33.5mg苯甲酰-L-酪氨酸乙酯溶于50％的甲醇中，用50％的甲醇定容至100mL)置于光程为1cm的比色皿中，加入0.1mLα-胰凝乳蛋白酶待测酶液，振荡混和启动反应，将比色皿置于比色皿架内，通过恒温循环水浴使比色皿内反应体系保持在25℃，于256nm波长连续读取5次酶催化反应过程中的吸光度，读取吸光度值的时间间隔为1s。以加热煮沸5min的相同浓度的灭活酶液作对照。

得到5个吸光度读取时间点的吸光度，见图2。5个读数相连为一条斜率不变的直线，直线部分拟合方程为y＝0.0141x+0.03，R²值为1。任意选择两个吸光度计算α-胰凝乳蛋白酶待测酶液的酶活。

酶活计算公式为：

式中，U为待测酶液的α-胰凝乳蛋白酶酶活(U/mL)；V为反应总体积(mL)；ΔOD为256nm处吸光度的变化；0.964为浓度为1μmol/L苯甲酰-L-酪氨酸乙酯水解物的吸光度(256nm)；v为待测酶液的体积(mL)；t为催化反应时长(min)。

酶活的定义：以每分钟水解1μmol苯甲酰-L-酪氨酸乙酯所需的酶量为一个酶活单位(U)。

本实施例，计算得到α-胰凝乳蛋白酶待测酶液的酶活为0.078U/mL。

实施例3、氨肽酶酶活的测定

将氨肽酶待测酶液和酶活测定所用的试液预先于60℃水浴恒温。取2.8mL氨-氯化铵缓冲溶液(0.04mol/L，pH 8.0)和0.1mL 60mmol/L甲硫氨酸对硝基苯胺溶液置于光程为1cm的比色皿中，加入0.1mL氨肽酶待测酶液，振荡混和启动反应，将比色皿置于比色皿架内，通过恒温循环水浴使比色皿内反应体系保持在60℃，于380nm波长连续读取3次酶催化反应过程中的吸光度，读取吸光度值的时间间隔为1s。以加热煮沸5min的相同浓度的灭活酶液作对照。

得到3个吸光度读取时间点的吸光度，见图3。3个读数相连为一条斜率不变的直线，拟合方程为y＝0.124x+0.089，R²值为1。任意选择两个吸光度计算氨肽酶待测酶液的酶活。

以吸光度为横坐标，以对硝基苯胺浓度(μmol/L)为纵坐标，得到标准曲线为y＝812.38x-45.618。通过标准曲线可将酶活测定体系中吸光度的变化(ΔOD)换算成对硝基苯胺浓度(Δn)的变化。

酶活计算公式为：

式中，U为待测酶液的氨肽酶酶活(U/mL)；V为反应总体积(mL)；Δn为体系中对硝基苯胺浓度的变化；v为待测酶液的体积(mL)；t为催化反应时长(min)。

酶活的定义：以每分钟水解氨基酸对硝基苯胺产生1μmol对硝基苯胺所需的酶量为一个酶活单位(U)。

本实施例，通过酶活计算公式计算出氨肽酶待测酶液的酶活为99.21U/mL。

实施例4、乙醇脱氢酶酶活的测定

将乙醇脱氢酶待测酶液和酶活测定所用的试液预先于20℃水浴恒温。取1.94mL重磷酸钠-氢氧化钠缓冲液(0.03mol/L，pH 8.8)，0.06mL 95％乙醇，1.0mL 17.94g/Lβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)溶液置于光程为1cm的比色皿中，加入0.10mL乙醇脱氢酶待测酶液，振荡混和启动反应，将比色皿置于比色皿架内，通过恒温循环水浴使比色皿内反应体系保持在20℃，于340nm波长连续读取3次酶催化反应过程中的吸光度，读取吸光度值的时间间隔为1s。以加热煮沸5min的相同浓度的灭活酶液作对照。

得到3个吸光度读取时间点的吸光度，见图4。3个读数相连为一条斜率不变的直线，拟合方程为y＝0.063x+0.034，R²值为1。任意选择两个吸光度计算乙醇脱氢酶待测酶液的酶活。

酶活计算公式为：

式中，U为待测酶液的乙醇脱氢酶酶活(U/mL)；V为反应总体积(mL)；ΔOD为340nm处吸光度的变化；ε₃₄₀＝6200M^-1cm^-1为NADH的摩尔消光系数；v为待测酶液的体积(mL)；t为催化反应时长(min)；L为比色皿的光程(cm)。

酶活的定义：以每分钟还原1μmol NAD所需的酶量为一个酶活单位(U)。

本实施例，计算得到乙醇脱氢酶待测酶液的酶活为18.9U/mL。

实施例5、辣根过氧化物酶酶活的测定

将辣根过氧化物酶待测酶液和酶活测定所用的试液预先于25℃水浴恒温。取2.7mL含有0.077mmol/L愈创木酚的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.2mol/L，pH 6.0)、0.2mL 1.5mmol/L的过氧化氢溶液置于光程为1cm的比色皿中，加入0.1mL辣根过氧化物酶待测酶液，振荡混和启动反应，将比色皿置于比色皿架内，通过恒温循环水浴使比色皿内反应体系保持在25℃，于465nm波长连续读取5次酶催化反应过程中的吸光度，读取吸光度值的时间间隔为1s。以加热煮沸5min的相同浓度的灭活酶液作对照。

得到5个吸光度读取时间点的吸光度，见图5。5个读数相连的曲线包含直线部分，直线部分拟合方程为y＝0.0064x+0.03，R²值为1。任意选择直线部分的两个吸光度计算辣根过氧化物酶待测酶液的酶活。

酶活计算公式为：

式中，U为待测酶液的辣根过氧化物酶酶活(U/mL)；V为反应总体积(mL)；ΔOD为465nm处吸光度的变化；v为待测酶液的体积(mL)；t为催化反应时长(min)。

酶活的定义：以每分钟氧化愈创木酚OD值增加0.1所需要的酶量为一个酶活单位(U)。

本实施例，通过酶活计算公式计算出辣根过氧化物酶待测酶液的酶活为4608U/mL。

实施例5的对比例：GB/T 32131—2015《辣根过氧化物酶活性检测方法比色法》

所用试剂及样品溶液测定前于25℃±2℃恒温箱中孵育30min。于1cm比色皿中，按次序加入2.8mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液(0.1mol/L，pH 7.0)、0.1mL浓度为20mmol/L的愈创木酚溶液、0.05mL过氧化氢溶液和0.05mL蒸馏水作为参比溶液。于另只1cm比色皿中，按次序加入2.8mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液(0.1mol/L，pH 7.0)、0.1mL浓度为20mmol/L的愈创木酚溶液、0.05mL过氧化氢溶液和0.05mL待测酶液，快速混匀后，于分光光度计436nm波长测定初始时和2min的吸光度值，两者之差即为ΔA(ΔA的值在0.008～0.400之间方为有效，如大于0.4应调整稀释度)。

对比例中所述的辣根过氧化物酶酶活检测方法：(1)耗时较长。(2)虽然所有试剂及样品溶液在测定前进行了预热处理，但是酶反应过程未进行温度控制处理，使酶活测定结果存在较大的误差，影响到酶活检测结果的准确性和可比性。(3)只测定反应开始及结束时的产物浓度，无法判断在反应过程中底物及过氧化氢浓度是否一直处于使辣根过氧化物酶保持初始催化反应速率的浓度范围之内，测定的结果实际上是两点之间的平均催化速率，通过简单的ΔA值的限定无法得到更为准确的酶活测定值。

实施例6、锰过氧化物酶酶活的测定

将锰过氧化物酶待测酶液和酶活测定所用的试液预先于30℃水浴恒温。取2.7mL含有0.1mmol/L过氧化氢和1mmol/L硫酸锰的酒石酸钠-酒石酸缓冲液(0.1mol/L，pH 4.5)及0.2mL 1mmol/L 2,6-二甲氧基酚置于光程为1cm的比色皿中，加入0.1mL锰过氧化物酶待测酶液，振荡混和启动反应，将比色皿置于比色皿架内，通过恒温循环水浴使比色皿内反应体系保持在30℃，于470nm波长连续读取3次酶催化反应过程中的吸光度，读取吸光度值的时间间隔为1s。以加热煮沸5min的相同浓度的灭活酶液作对照。

得到3个吸光度读取时间点的吸光度，见图6。3个读数相连为一条斜率不变的直线，拟合方程为y＝0.011x+0.073，R²值为1。任意选择两个吸光度计算锰过氧化物酶待测酶液的酶活。

酶活计算公式为：

式中，U为待测酶液的锰过氧化物酶酶活(U/mL)；V为反应总体积(mL)；ΔOD为470nm处吸光度的变化；ε₄₇₀＝49600M^-1cm^-1为2,6-二甲氧基酚氧化产物的摩尔消光系数；v为待测酶液的体积(mL)；t为催化反应时长(min)；L为比色皿的光程(cm)。

酶活的定义：以每分钟氧化1μmol2,6-二甲氧基酚所需要的酶量为一个酶活单位(U)。

本实施例，通过酶活计算公式计算出锰过氧化物酶待测酶液的酶活为2.00U/mL。

实施例7、氧化酶酶活检测过程中溶解氧浓度对测定值准确性的影响

在氧化酶的催化过程中，溶解氧也是一种参与反应的底物，反应体系中的溶解氧的浓度是该催化氧化反应的重要影响因素。但是，与其他底物相比，溶解氧浓度更加不易被检测和控制。因此，本实施例以漆酶为例考察氧化酶酶活测定过程中溶解氧对测定结果的影响。

为了寻找在设定的酶活测定反应过程中适宜的溶解氧浓度范围。将装有27mL含有100mmol/L 2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2,2'-Amino-di(2-ethyl-benzothiazolinesulphonic acid-6)ammonium salt，ABTS)的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(0.5mol/L，pH 5.0)的试剂瓶(容积为50mL)充分振荡后置于不同设定温度的恒温水浴中，将溶解氧测定仪探头置于装有混和溶液的试剂瓶中，待其中的溶解氧浓度恒定后，加入1mL浓度为n的待测酶液启动反应，测定反应体系中的溶解氧浓度。考察在不同温度漆酶酶活检测的酶催化反应体系中当ABTS浓度足够大时溶解氧的变化，结果见图7。

反应体系中起初溶解氧及ABTS浓度均足够高，漆酶催化反应速率最大并在短时间内保持不变，此时的反应速率可以代表漆酶的最大催化能力，体现了该酶分子的特性，这样的检测结果使不同来源、不同纯度的漆酶及其酶制剂的酶活数据更具有可比性，甚至用于对不同底物、不同作用条件的酶活对比。但随着反应的进行，溶解氧消耗，反应速率逐渐减小，甚至趋向于零，因而此时ABTS或溶解氧的消耗速率均无法真正反映漆酶的最大催化能力。此时，用现有“两点法”检测反应数分钟的催化反应速率是两个检测点之间的平均反应速率，如果不同批次的检测选取的检测点不同，则其平均催化反应速率可能不同，因而影响检测结果的重现性。为此，应该降低待测酶液浓度并缩短催化反应时间，从而与溶解氧和ABTS的浓度相匹配。

将装有27mL含有100mmol/L ABTS的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(0.5mol/L，pH 5.0)的试剂瓶(容积为50mL)充分振荡后置于设定温度为55℃的恒温水浴中，将溶解氧测定仪探头置于装有混合溶液的试剂瓶中，待其中的溶解氧浓度恒定后，加入1mL不同浓度的待测酶液启动反应，测定反应体系中的溶解氧浓度。考察不同酶浓度(C_lac)的酶活检测体系中溶解氧浓度的变化(图8)。通过图8曲线的变化趋势得到表1中V_O2-I(初始催化反应速率)、C_minO2(使酶保持初始催化反应速率的溶解氧最低浓度)及t_max(使酶保持初始催化反应速率的最大时长)。

表1 C_lac对V_O2-I，C_minO2及t_max的影响

由图8可见，随着酶浓度的增加，初始曲线斜率增大，V_O2-I升高，而且V_O2-I与C_lac呈正比关系(表1)，说明当ABTS及溶解氧浓度足够大时，初始催化反应速率可以反映酶的活力，同时也进一步证实了准确测定初始催化反应速率对于酶活力定量测定的重要性。使漆酶保持初始催化反应速率时溶解氧的最低浓度(C_minO2)是漆酶酶活检测的关键数值，随着C_lac的增加，此值逐渐增大(表1)，这是由于C_lac越高，使酶饱和所需要的溶解氧浓度越高。由图8可以看出，随着反应的进行，当溶解氧浓度低于C_minO2，曲线斜率开始变小，催化反应速率下降。因此，在酶活测定过程中，底物及溶解氧浓度均不应低于使漆酶保持初始催化反应速率时的最低浓度。

通过表1还发现，随着C_lac的增加，在反应过程中t_max逐渐缩短。当反应时间超过t_max时，其检测结果就不是酶的初始催化反应速率。该结果进一步说明：规定了固定反应时长(比如10～60min)且只测定反应开始及结束时底物或产物浓度的“两点法”，测定的结果是固定反应时长内的平均反应速率，可能无法保证测定结果的准确性。

实施例8、漆酶酶活的测定

将漆酶待测酶液和酶活测定所用的试液预先于55℃水浴恒温。取2.7mL含有0.065mmol/L ABTS的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(0.5mol/L，pH 5.0)置于光程为1cm的比色皿中，加入0.1mL待测酶液，振荡混和启动反应，将比色皿置于比色皿架内，通过恒温循环水浴使比色皿内反应体系保持在55℃，于420nm波长读取5次酶催化反应过程中的吸光度，读取吸光度值的时间间隔为1s。以加热煮沸5min的相同浓度的灭活酶液作对照。

得到5个吸光度读取时间点的吸光度，见图9中的(a)图。5个读数相连的曲线无直线部分，拟合方程为y＝0.01x+0.2688，R²值为0.9462。因此，将漆酶待测酶液稀释5倍，重新按照上述步骤进行测定。测定结果见图9中的(b)图。5个读数相连为一条斜率不变的直线，拟合方程为y＝0.0032x+0.03，R²值为1。任意选择两个吸光度计算漆酶待测酶液的酶活。

酶活计算公式为：

式中，U为待测酶液的漆酶酶活(U/mL)；V为反应总体积(mL)；ΔOD为420nm处吸光度的变化；ε₄₂₀＝36000M^-1cm^-1为ABTS氧化产物的摩尔消光系数；v为待测酶液的体积(mL)；t为催化反应时长(min)；L为比色皿的光程(cm)。

酶活的定义：以每分钟氧化1μmol ABTS所需要的酶量为一个酶活单位(U)。

本实施例，通过酶活计算公式计算出漆酶待测酶液的酶活为24.0U/mL。

实施例8的对比例：DB41/T 1615—2018《食用菌菌丝纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活力检测技术规程》

取3支具塞试管，一支为空白管，两支为样品管。向空白管中加入0.1mL蒸馏水，向样品管中加入0.1mL漆酶待测酶液，向三支试管中分别加入1.7mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH5.0)及0.2mL浓度为0.5mmol/L的ABTS溶液，室温反应6min，加入0.5mL浓度为0.4mmol/L的三氯乙酸溶液终止反应，于420nm测定空白管及样品管中体系的吸光度值(A₀，A)，通过吸光度值差计算漆酶待测酶液的酶活。

对比例中所述的漆酶酶活检测方法：(1)耗时较长。(2)酶的催化反应过程与吸光度的检测不在同一容器中同时进行，导致操作复杂，容易产生误差。(3)在该方法中，加入三氯乙酸终止酶的催化反应过程需消耗一段时间，因而不能准确地确定测定A的时间点，由此带来较大的误差。(4)反应温度没有控制，室温的变化影响检测结果。(5)只测定反应开始及结束时的产物浓度，无法判断在反应过程中底物及溶氧浓度是否一直处于使漆酶保持初始催化反应速率的浓度范围之内，测定的结果实际上是两个测定点之间的平均催化速率，影响到酶活检测结果的准确性、重现性和可比性。

实施例9、葡萄糖氧化酶酶活的测定

将葡萄糖氧化酶待测酶液和酶活测定所用的试液预先于30℃水浴恒温。取0.5mL100g/Lβ-D-葡萄糖溶液，0.1mL在冰水中冷却过的过氧化物酶溶液(60U/mL)和2.4mL邻-联二茴香胺溶液置于光程为1cm的比色皿中，加入0.1mL葡萄糖氧化酶待测酶液，振荡混和启动反应，将比色皿置于比色皿架内，通过恒温循环水浴使比色皿内反应体系保持在30℃，于436nm波长读取3次酶催化反应过程中的吸光度，读取吸光度值的时间间隔为1s。以加热煮沸5min的相同浓度的灭活酶液作对照。

得到3个吸光度读取时间点的吸光度，见图10。3个读数相连为一条斜率不变的直线，拟合方程为y＝0.065x+0.028，R²值为1。任意选择两个吸光度计算葡萄糖氧化酶待测酶液的酶活。

酶活计算公式为：

式中，U为待测酶液的葡萄糖氧化酶酶活(U/mL)；V为反应总体积(mL)；ΔOD为436nm处吸光度的变化；ε₄₃₆＝8300M^-1cm^-1为邻-联二茴香胺氧化产物的摩尔消光系数；v为待测酶液的体积(mL)；t为催化反应时长(min)；L为比色皿的光程(cm)。

酶活的定义：以每分钟产生1μmol葡糖酸和过氧化氢所需的酶量为一个酶活单位(U)。

本实施例，计算得到葡萄糖氧化酶待测酶液的酶活为14.57U/mL。

实施例9的对比例：DB41/T 1729—2018《饲料添加剂葡萄糖氧化酶活力的测定分光光度法》

取3支试管，分别移取0.2mL辣根过氧化物酶液，加入4mL一水磷酸二氢钠-二水磷酸氢二钠缓冲液(pH6.0)，振摇3s，加入0.6mL浓度为180g/L的葡萄糖溶液，振摇3s，加入0.8mL浓度为11g/L的苯酚溶液，振摇3s，再加入0.2mL浓度为50g/L的4-氨基安替比林溶液，振荡混匀。30±0.2℃水浴5min，取出。向其中1支试管中加入0.2mL水，作为空白调零。向另外2支试管中加入0.2mL葡萄糖氧化酶试样溶液，振荡混和，立即用1cm比色皿，在500nm处测定吸光度为A₀，再准确反应1min，读取吸光度值A₁，得出ΔA＝A₁-A₀。

对比例中所述的葡萄糖氧化酶酶活检测方法：(1)耗时较长。(2)酶的催化反应过程与吸光度的检测不在同一容器中同时进行，导致操作复杂，容易产生误差。(3)在该方法中，测定A₀时，无法确定反应体系温度是否已达到设定催化温度；在测定A₁时，将反应液倒入比色皿中、将比色皿放入紫外-可见分光光度计以及测定吸光度等操作过程均需消耗一段时间，因而不能准确地确定测定A₁的时间点，由此带来较大的偶然误差和系统误差。