阅读说明：本技术 引导分子药物缀合物的连续制造 (Continuous manufacture of guided molecular drug conjugates ) 是由 H.保尔森 J.克吕格 K.凯泽 V.林根 M.戈特弗里德 于 2018-07-12 设计创作，主要内容包括：本文描述了用于连续、病原体减少地处理引导分子(例如肽或蛋白或核酸和接头的缀合物)的修饰单元(37),其包括以下组件：至少一个含有在缓冲溶液中的引导分子的储液器(1)和/或至少一个用于含有在缓冲溶液中的引导分子的产物流的入口,至少一个含有在溶液中的接头的储液器(2),至少一个混合装置(3),至少两个阀(7,8),一个用于引导分子的计量加入且一个用于接头分子的计量加入,至少一个用于包含引导分子-接头复合物的产物流的出口和/或用于容纳引导分子-接头复合物的储液器(5),进一步包括至少一个停留时间装置以确保限定的停留时间,即,确保在混合后,引导分子和接头分子总是在连续处理中度过相似的时间量。(Described herein is a modification unit (37) for the continuous, pathogen-reducing treatment of a guide molecule (e.g. a peptide or protein or a conjugate of a nucleic acid and a linker) comprising the following components: at least one reservoir (1) containing a guide molecule in a buffer solution and/or at least one inlet for a product stream containing a guide molecule in a buffer solution, at least one reservoir (2) containing a linker in a solution, at least one mixing device (3), at least two valves (7,8), one for the metered addition of a guide molecule and one for the metered addition of a linker molecule, at least one outlet for a product stream comprising a guide molecule-linker complex and/or a reservoir (5) for containing a guide molecule-linker complex, further comprising at least one residence time device to ensure a defined residence time, i.e. to ensure that after mixing the guide molecule and linker molecule are always treated continuously for a similar amount of time.)

具体实施方式

实施例1：连续修饰

将具有15.3 mg/mL的初始浓度的抗体溶液，用100 mM磷酸钾(KPi)-缓冲液(pH 7.5)稀释至10.72 g/L的终浓度。制备浓度为1.56 g/L的接头溶液，在此为DMA中的SPDB接头(N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)。

将这些溶液填充到储液器中，并以特定流速(对于AB溶液为284.3 mL/h且对于接头-溶液为20 mL/h)泵送，直到系统达到稳定状态。系统达到稳定状态(例如基本恒定的泵速)所需的这段时间称为启动阶段。在这个实施例中，启动阶段被定义为前五个停留时间，其中一个停留间隔等于产物流的给定部分流过修饰单元所需的时间量。在启动期间，所有产生的材料都被引导到废物出口。

在启动阶段之后，系统从启动模式切换到生产模式。因此，将AB-溶液和接头-溶液以特定流速(对于AB-溶液为284.3 mL/h且对于接头-溶液为20 mL/h)泵送至混合装置中，在此使用来自Ehrfeld的静态Cascade-Micromixer，其具有以下设置[非对称Cascade混合器，最大内径150 µm，11个混合阶段]。通过混合装置后，产物流通过停留时间装置，在此使用Masterflex Tygon管，其内径为3.1 mm，具有6.3 mL的总体积。此后，将产物流收集在储液器中，在此是具有Bola-连接器的Schott-Flask。

为了收集样品材料，还将产物流引导至样品储液器。在实验期间，采集20 mL的样品。

对于关闭处理，再次将流引导到废物出口，停止泵，并使用溶剂和水冲洗所有相互连接的部件，将其填充到先前分别含有抗体和接头溶液的储液器中，进行清洗。如果采用单次使用的器材，则将其丢弃。

为了证明在连续处理条件下的修饰反应是成功的，必须证实所产生的抗体-接头复合物具有与在分批处理中产生的抗体-接头复合物相同的特征。为此，在标准条件下将产生的抗体-接头复合物与毒性基团缀合，并测定其单体含量及其二聚体含量和所获得的药物与抗体的比率。

对于所述分析，用2 mL磷酸盐缓冲液和0.209 mL二甲基乙酰胺(DMA)稀释2.25 mL样品的等分试样。然后，加入40.9 µL的20 mM毒性基团在DMA中的溶液。在18小时的反应时间后，通过PD10柱将缓冲液交换为His/Gly(pH 5.5)，而终止反应。进行尺寸排阻色谱，且显示96.4％的单体含量和2.8％的二聚体含量。将这个样品的等分试样稀释，并通过UV-测量分析，显示3.4的药物与抗体的比率(DAR)。使用特异性HPLC分析，确定ULAR (未缀合的接头与抗体的比率)低于0.03，在所述特异性HPLC分析中，使用二硫化物裂解剂处理样品，去除蛋白，且HPLC检测释放的巯基吡啶。

换言之，显示连续处理条件不影响最终缀合物的稳定性，因为否则单体含量会更低。此外，在连续条件下产生的抗体-接头复合物需要与分批处理中相同量的毒性基团/抗体-接头复合物，因为否则DAR和ULAR值会更高或更低。

实施例2：连续缀合

使用缀合反应，作为ADC生产的模式处理中在上述修饰后的第二反应步骤。装置的设置类似于上述用于修饰反应的设置。

使用100 mM KPi-缓冲液(pH 7.5)，将修饰抗体的溶液稀释至约6 g/L的终浓度。制备美登木素生物碱DM4 (14S,16S,32S,33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-氯-14-羟基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二氧代-7-氮杂-1(6,4)-亚噁嗪基-3(2,3)-亚环氧乙烷基-8(1,3)-亚苯并环十四碳-10,12-二烯-4-基 N-(4-巯基-4-甲基戊酰)-N-甲基-L-丙氨酸酯)在DMA中的3.3 mM溶液。

将这些溶液填充到储液器中，并以特定流速(对于抗体-接头-溶液为169.6 mL/h且对于DM4-溶液为10.0 mL/h)泵送。在启动处理期间，所有产生的材料都被引导到废物出口。为了收集样品材料，将流引导至样品储液器。在实验期间，在2小时36分钟的反应时间后，采集20 mL的样品。

对于关闭处理，将流引导到废物出口，停止泵，并将储液器更换成清洗溶液(用于清洗的水，1 mol NaOH以猝灭DM4)，使用水和NaOH-溶液冲洗整个设置，进行清洗。可选地，在单次使用的情况下，可以丢弃所述设置。

反应后，浓缩溶液，并通过超滤/渗滤(UF/DF)将缓冲液交换为His/Gly (pH 5.5)。所得混合物的SEC (尺寸排阻色谱)显示96.7％的单体含量和3.03％的二聚体含量。将这个样品的等分试样稀释并通过UV测量分析，显示3.3的药物与抗体的比率。UF/DF后，这个反应的产率为87％。

因此，总体而言，这些结果证实，使用如本文所述的缀合单元在连续处理中产生的抗体-接头复合物与分批处理中产生的那些相当。

附图

图1：本文所述的用于连续、病原体减少地处理引导分子和接头的修饰单元的实例的概况，其包括以下组件：含有在缓冲溶液中的引导分子的储液器(1)，含有在溶液中的接头的储液器(2)，混合装置(3)，停留时间装置(4)，用于引导分子的计量加入的泵(7)，用于接头分子的计量加入的泵(8)，用于容纳引导分子-接头复合物的储液器(5)，废物出口(6)和三通阀(9)，其用于引导产物流从停留时间装置(4)排出到废物出口(6)或用于容纳引导分子-接头复合物的储液器(5)。在操作期间，经由两个泵(7)和(8)，将缓冲溶液中的引导分子和接头溶液以受控方式添加到混合装置(3)。混合之后，产物流在这个实例中流过停留时间装置(4)。此后，在储液器(5)中收集产物流。

图2描绘了本文所述的用于连续、病原体减少地处理引导分子和接头的修饰单元的实例的示意图。在这个实例中，修饰单元与下游单元流体连通。因此，不需要用于容纳引导分子接头复合物的储液器，因为产物流连续地流向下一单元操作。在这个实例中，修饰单元包括以下组件：含有在缓冲溶液中的引导分子的储液器(1)，含有在溶液中的接头的储液器(2)，混合装置(3)，停留时间装置(4)，用于引导分子的计量加入的泵(7)，用于接头分子的计量加入的泵(8)，废物出口(6)以及与下一单元操作的连接(10)。在操作期间，经由两个泵(7)和(8)，将缓冲溶液中的引导分子和接头溶液以受控方式添加到混合装置(3)。混合之后，产物流在这个实例中流过塞流式反应器(4)。此后，产物流经由连接(10)连续地流向后续单元操作，例如图3中描绘的一个单元操作。

应注意的是，如果这是有益的，则可以在与下一单元操作的连接(10)中包括中间储液器/储存容器(未描绘)。

此外，应注意，如上所述，可以从连续产生和纯化所述抗体的上游处理提供抗体，代替在储液器(1)中提供抗体。

此外，在这个实例中，采用两个任选的质量流量控制器(26)。

图3描绘了进行缀合的示例性单元操作的示意图。在这个实例中，所述用于缀合的单元操作包括与先前单元操作的连接(10)和与后续单元操作的连接(11)，含有缓冲溶液的储液器(12)，含有毒性基团的储液器(13)，混合装置(14)，在此为静态混合器，停留时间装置(15)，两个均质回路(16)和(17)，几个用于控制不同流体流的计量加入的泵(18a-f)，两个废物出口(19a和19b)，和含有用于后续单元操作的缓冲溶液的储液器(20)。

在操作期间，在先前单元操作(即本文所述的用于修饰的单元)中产生的包含抗体-接头复合物的产物流，经由连接(10)进入用于缀合的单元操作，并经由均质回路(16)添加来自储液器(12)的缓冲液，随后从含有毒性基团的储液器(13)向含有抗体-接头复合物的产物流计量加入毒性基团溶液。然后，将包含抗体-接头复合物和毒性基团的产物流混合，并且在装置(14)中混合之后，产物流在这个实例中流过塞流式反应器(15)，并且任选地经由UV-测量分析。然后，经由均质回路(17)，从储液器(20)添加缓冲液到产物流，以调节pH和浓度，并且抗体-接头-毒性基团缀合物连续地流向后续单元操作，例如图4中描绘的一个单元操作。

图4描绘了用于连续超滤的示例性单元的示意图，包括与先前单元操作的连接(11)和与后续单元操作的连接(21)，超滤装置(22)，深度过滤器(23)，废物出口(24)，另一个过滤器(25)，检测装置(26)，缓冲袋(27)和几个用于控制流体流动的泵(28a-d)。

在操作期间，包含抗体-接头-毒性基团缀合物的产物流在这个实例中经由连接(11)进入这个单元操作，流过过滤器(25)，超滤装置(22)，检测装置(26)，缓冲袋(27)和深度过滤器(23)，且然后通过连接(21)到图5中描绘的后续单元操作。

图5：描绘了用于连续透析的示例性单元的示意图，包括与先前单元操作的连接(21)，含有缓冲溶液的储液器(29)，透析模块(30)，检测装置(31)，废物出口(32)，过滤器(33)，用于储存最终产物(即，经超滤和透析的抗体-接头-毒性基团缀合物)的储液器(34)，以及用于控制流体流的泵(35-b)。

在操作期间，包含抗体-接头-毒性基团缀合物的产物流在这个实例中经由连接(21)进入这个单元操作，并流过透析模块(30)，在此由来自储液器(29)的缓冲液交换先前的抗体-接头-毒性基团缀合物的缓冲液。将先前的缓冲液丢弃至废物出口(32)。包含抗体-接头-毒性基团缀合物的产物流经由检测装置(31)和过滤器(33)从超滤模块流向用于储存最终产物的储液器(34)。

如上所述，可以在上游添加用于产生抗体的连续细胞培养、连续细胞分离以及抗体的连续纯化的单元操作，以使得能够从细胞发酵开始连续产生抗体接头缀合物。

此外，可以在用于储存最终产物的储液器的下游，添加用于配制的单元操作，例如添加稳定剂和调节最终药物的pH。

图6：本文所述的用于连续、病原体减少地处理引导分子接头复合物和生物活性物质的缀合单元(38)的实例的概况，其包括以下组件：含有在缓冲溶液中的引导分子接头复合物的储液器(39)，含有在溶液中的生物活性物质(在此为毒性基团)的储液器(40)，混合装置(3)，停留时间装置(4)，用于引导分子接头复合物的计量加入的泵(7)，用于毒性基团的计量加入的泵(8)，用于容纳引导分子接头毒性基团缀合物的储液器(5)，废物出口(6)和三通阀(9)，其用于引导产物流从停留时间装置(4)排出到废物出口(6)或用于容纳引导分子接头毒性基团缀合物的储液器(5)中。在操作期间，经由两个泵(7)和(8)，将缓冲溶液中的引导分子接头复合物和毒性基团溶液以受控方式添加到混合装置(3)。混合之后，产物流在这个实例中流过塞流式反应器(4)。此后，在储液器(5)中收集产物流。

参考标记的列表：

1. 含有引导分子的储液器(1)，

2. 含有在溶液中的接头的储液器(2)，

3. 混合装置(3)，

4. 停留时间装置(4)，

5. 储液器(5)，

6. 废物出口(6)，

7. 泵(7)，

8. 泵(8)，

9. 三通阀(9)，

10. 单元之间的连接(10)，

11. 单元之间的连接(11)，

12. 含有缓冲溶液的储液器(12)，

13. 含有毒性基团的储液器(13)，

14. 混合装置(14)，

15. 停留时间装置(15)，

16. 均质回路(16)，

17. 均质回路(17)，

18. 泵(18a-f)

19. 废物出口(19a和19b)，

20. 含有缓冲溶液的储液器(20)，

21. 单元之间的连接(21)，

22. 超滤装置(22)，

23. 深度过滤器(23)，

24. 废物出口(24)，

25. 过滤器(25)，

26. 检测装置(26)，

27. 缓冲袋(27)，

28. 泵(28a-d)，

29. 含有缓冲溶液的储液器(29)，

30. 透析模块(30)，

31. 检测装置(31)，

32. 废物出口(32)，

33. 过滤器(33)，

34. 用于储存最终产物的储液器(34)，

35. 泵(35a和35b)，

36. 质量流量控制器(36)，

37. 修饰单元(37)，

38. 缀合单元(38)，

39. 含有修饰抗体的储液器(39)，

40. 含有毒性基团的储液器(40)。