一种金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因、克隆方法及应用

文档序号：1434009 发布日期：2020-03-20 浏览：25次 >En<

阅读说明：本技术 一种金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因、克隆方法及应用 (Goldfish hypoxia inducible factor HIF-1 α gene, cloning method and application ) 是由李春艳姜巨峰刘克明孟一耕蔡超刘肖莲白晓慧于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因,所述金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。本发明首次公开了金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因的核苷酸序列和氨基酸序列,并通过qPCR技术验证该基因在金鱼低氧胁迫中所发挥的作用,利用实时荧光定量qPCR对金鱼缺氧诱导因子HIF-1α在肝脏、脑、心脏和鳃组织中的表达模式进行分析,结果表明金鱼在低氧胁迫条件下,四种组织中的HIF-1α基因表达模式不同,可以为鱼类低氧适应机制、低氧信号传导途径及培育耐低氧鱼类新品种提供基础数据和参考。(The invention relates to a goldfish hypoxia inducible factor HIF-1 α gene, wherein the nucleotide sequence of the goldfish hypoxia inducible factor HIF-1 α gene is SEQ ID NO. 1. the invention discloses the nucleotide sequence and amino acid sequence of the goldfish hypoxia inducible factor HIF-1 α gene for the first time, verifies the function of the gene in the low oxygen stress of goldfish by qPCR technology, analyzes the expression modes of the goldfish hypoxia inducible factor HIF-1 α in liver, brain, heart and gill tissues by using real-time fluorescent quantitative qPCR, and shows that the HIF-1 α gene expression modes in the four tissues are different under the low oxygen stress condition of the goldfish, and can provide basic data and reference for a fish low oxygen adaptation mechanism, a low oxygen signal conduction path and the cultivation of a new species of low oxygen resistant fish.)

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其是一种金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因、克隆方法及应用。

背景技术

氧气对大多数生物都是必不可少的。一般情况下，人类及其他哺乳类耐氧能力差，长时间的缺氧都可能引起机体组织衰竭甚至导致死亡。然而，海洋无脊椎动物和鱼类等具有较强的耐低氧能力，在一段时间的低氧甚至无氧条件也可以存活。为了应对缺氧环境，这些生物体可以通过控制相关基因的表达来调节葡萄糖运输、糖酵解和血红细胞生成等生理过程，从而增强机体对低氧的耐受性。

缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor,HIF-1)是存在于各种动物和人体内的一种重要转录因子，可以对多种基因进行调控，并且与生物体的生长、发育及一些疾病的发生都存在密切关系。HIF-1α是HIF-1的活性亚基，在缺氧的情况下，HIF-1α通过激活***、葡萄糖转运蛋白、糖酵解酶对生物体进行调节，从而增加氧气的交换或促进新陈代谢来适应缺氧环境。

金鱼(Carassius auratus)隶属于脊索动物门，硬骨鱼纲，鲤科鲫属鲫的一种，具有极强的缺氧耐受性，是进行耐低氧研究的理想模式生物。目前，关于金鱼HIF-1α基因结构及特征，如何对低氧/缺氧环境应答尚未见报道。开展金鱼缺氧诱导因子HIF-1α的克隆及应用研究，能够为研究鱼类低氧适应机制、低氧信号传导途径及培育耐低氧鱼类新品种提供基础数据和参考。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因、克隆方法及应用，可以为鱼类低氧适应机制、低氧信号传导途径及培育耐低氧鱼类新品种提供基础数据和参考。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因，所述金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

如上所述的金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因编码的氨基酸，所述氨基酸的序列为SEQ ID NO.2。

如上所述的金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因的克隆方法，步骤如下：

步骤1：提取金鱼肝脏、鳃、脑、心脏组织总RNA，反转录得到cDNA；

步骤2：从NCBI数据库下载鲤鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因的mRNA序列和蛋白序列，与金鱼转录组序列进行比对，该金鱼转录组序列的序列为SEQ ID NO.3，调取金鱼HIF-1α基因序列，设计3对引物对调取的转录组序列进行验证，以金鱼cDNA为模板，进行PCR扩增，胶回收，PCR产物纯化和测序，序列拼接得到金鱼HIF-1α基因中间片段；

步骤3：获取HIF-1α基因5’端序列；

步骤4：获取HIF-1α基因3’端序列；

步骤5：将步骤2-4获得的序列片段进行拼接，获得HIF-1α基因全长序列；

步骤6：根据HIF-1α基因的全长序列，利用FGENESH和ORF Finder软件预测该基因的开放阅读框ORF。

而且，所述步骤2中3对引物序列为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9。

而且，所述步骤3中需使用引物，引物序列为SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQID NO.12。

而且，所述步骤4中需使用引物，引物序列见SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14。

而且，所述步骤6中开放阅读框长2343bp，编码780个氨基酸。

如上所述的金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因在低氧环境下的调控方面中的应用。

如上所述的金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因编码的氨基酸在低氧环境下的调控方面中的应用。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明首次公开了金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因的核苷酸序列和氨基酸序列，并通过qPCR技术验证该基因在金鱼低氧胁迫中所发挥的作用，利用实时荧光定量qPCR对金鱼缺氧诱导因子HIF-1α在肝脏、脑、心脏和鳃组织中的表达模式进行分析，结果表明金鱼在低氧胁迫条件下，四种组织中的HIF-1α基因表达模式不同，可以为鱼类低氧适应机制、低氧信号传导途径及培育耐低氧鱼类新品种提供基础数据和参考。

2、本发明方法从金鱼的肝脏、鳃、脑、心脏组织提取总RNA，反转录得到cDNA，利用序列比对的方法从已有转录组数据调取金鱼HIF-1α基因部分序列，采用RACE法克隆得到基因全长。该基因开放阅读框长2343bp，编码780个氨基酸。

附图说明

图1为本发明中金鱼HIF-1α基因中间扩增片段图；

图2为本发明中5’RACE扩增图；

图3为本发明中3’RACE扩增图；

图4为本发明中金鱼低氧胁迫试验基因HIF-1α表达图(也可称为金鱼HIF-1α基因在不同溶氧条件下不同组织中的差异表达图)，其中，图中大写字母为试验分组，其中C为对照组，A为低氧胁迫组，R复氧组。小写字母代表同一组织在不同试验条件下的差异显著性。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因，所述金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

如上所述的金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因编码的氨基酸，所述氨基酸的序列为SEQ ID NO.2。

如上所述的金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因的克隆方法，步骤如下：

步骤1：提取金鱼肝脏、鳃、脑、心脏组织总RNA，反转录得到cDNA；

步骤2：从NCBI数据库下载鲤鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因的mRNA序列和蛋白序列，与金鱼转录组序列(SEQ ID NO.3)进行比对，调取金鱼HIF-1α基因序列，设计3对引物对调取的转录组序列进行验证，以金鱼cDNA为模板，进行PCR扩增，胶回收，PCR产物纯化和测序，序列拼接得到金鱼HIF-1α基因中间片段；

步骤3：获取HIF-1α基因5’端序列；

步骤4：获取HIF-1α基因3’端序列；

步骤5：将步骤2-4获得的序列片段进行拼接，获得HIF-1α基因全长序列；

步骤6：根据HIF-1α基因的全长序列，利用FGENESH和ORF Finder软件预测该基因的开放阅读框ORF。

较优地，所述步骤2中3对引物序列为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9。

较优地，所述步骤3中需使用引物，引物序列为SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQID NO.12。

较优地，所述步骤4中需使用引物，引物序列见SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14。

较优地，所述步骤6中开放阅读框长2343bp，编码780个氨基酸。

如上所述的金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因能够应用在低氧环境下的调控方面中。

如上所述的金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因编码的氨基酸能够应用在低氧环境下的调控方面中。

相关制备及检测如下：

一、金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因编码区基因序列的获得

步骤1：金鱼cDNA的合成

解剖分离金鱼的肝脏、鳃、脑、心脏组织，置于-80℃冰箱冷冻保存。组织液氮研磨后，利用TRIZOLReagent(Introvigen)试剂盒提取总RNA，具体操作按照实际和说明书进行。利用超微量紫外分光光度计检测浓度。

以总RNA为模板，使用反转录试剂盒Revert Aid First Strand cDNA SynthesisKit(Fermentas公司)合成cDNA第一链，-20℃保存备用，具体操作步骤参照试剂盒说明书。

步骤2：金鱼HIF-1α基因中间片段序列的获得

从NCBI获取鲤鱼的HIF-1α基因的mRNA序列(GenBank:EU144225.1)和蛋白序列(GenBank:ABV59209.1)。将鲤鱼HIF-1α基因的mRNA序列和蛋白序列与金鱼转录组数据(SEQID NO.3)进行比对，调取金鱼HIF-1α基因的mRNA序列。调取的金鱼mRNA序列先进行序列验证，分三段进行验证，验证引物(B3151，B3152，B3153)见表1。所用引物采用Primer Premier5.0软件进设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，三段序列的PCR扩增结果见图1。纯化后的产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序得到的三段序列进行拼接，得到HIF-1α基因的中间片段序列。

步骤3：HIF-1α基因5’端序列的获取

利用中间片段序列结果，采用Primer Premier 5.0软件设5’RACE引物(GSP1,GSP2,GSP3)，见表1。采用Invitrogen公司的5’RACE System for Rapid Amplification ofcDNA Ends,Version 2.0试剂盒进行。扩增结果显示5’端非编码区产物序列长261bp，扩增结果见图2。

步骤4：HIF-1α基因3’端序列的获取

利用中间片段序列结果，采用Primer Premier 5.0软件设计3’RACE引物(C238-1,C238-2)，见表1。采用SMARTer^TMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒进行。扩增结果显示3’端非编码区产物序列长为1263bp，扩增结果见图3。

表1验证引物名称及序列

步骤5：基因序列全长拼接

利用软件对获得的HIF-1α基因中间段序列、5’RACE序列和3’RACE序列进行分析并拼接，得到的HIF-1α基因编码区序列全长2343bp，如下(SEQ ID NO.1)所示：

ATGGATACTGGAGTTGTCACTGAAAAGAAAAGGGTGAGCTCGGAGCGCAGGAAGGAGAAGTCCAGGGATGCAGCGCGATCTCGCAGGGGAAAGGAGTCTGAGGTGTTCTACGAGTTAGCACACCAGCTCCCCCTGCCACACAATGTCACCTCCCACCTGGACAAAGCCTCCATCATGAGGCTGACCATCAGCTATCTGCGCATGAGGAAGCTGCTCAGCTCTGATGAATCTGAGAAGGAGAATGAGGAGGAGAGTCAGCTGAACAGCTTTTATCTGAAGGCTCTGGAGGGTTTCCTCATGGTCCTGTCTGAAGATGGAGACATGGTTTATCTCTCTGAGAATGTCAGCAAGAGCATGGGCCTCTCACAGTTTGATCTGACTGGTCACAGCATCTTTGAATTTTCACACCCATGTGACCATGAGGAGCTGAGAGAGATGCTGGTCTACAGGACAGGATCCAAAAAGACCAAGGAACAAAACACAGAGCGCAGCTTCTTCCTGCGCATGAAGTGCACACTCACTAGCAGAGGGCGCACTGTCAATATCAAGTCTGCCACGTGGAAGGTTCTTCACTGCACTGGTCATGTGCGTGTGCAGGAGTGCGACGAGGGTTCGGGAGACTCTGGCTTTAAAGAGCCTCCTCTGACCTACCTTGTGCTCATCTGTGAGCCCATTCCTCATCCCTCGAACATCGAGGTGCCTCTGGACAGCAAGACCTTCCTTAGCCGCCACACTCTGGACATGAAGTTTTCCTACTGTGATGAAAGAATCACAGAGCTGATGGGATATGAGCCAGATGATCTGCTGAACAAGTCTGTGTATGAATACTATCATGCCCTGGATTCAGATCACCTTACCAAGACACATCACAACTTGTTCGCAAAGGTTCAACTTTGTTCGCAGGGCCAGGCCACCACAGGCCAGTACCGCATGCTGGCTAAGAAAGGTGGTTTTGTGTGGGTGGAGACTCAGGCCACTGTTATCTACAATCCCAAGAATTCTCAGCCACAGTGCATTGTGTGCGTCAACTACGTTCTCAGTGGCATTGTGGAGGGGGATGTTGTCCTGTCCTTGCAGCAGACCATGACCGAACCCGAGGCTGAGGAGAAAGAGAACCAGGAGATGGAAGAGGAGGCCTCTGAGGTGGACATACTCAAACTCTTCAAGCCAGAAAGCCTCAAGTGTCCCGTGAAGAGCTCTGAACTTTATGAGAAGCTGAAAGAGGAGCCTGAGGCTCTCAATGTCTTGGCACCTTCTGCAGGAGACACCATCATCTCTCTGGACTTCAACAATTCAGACTCTGATATGCAGCTGCTGAAGGAGGTGCCCCTCTACAATGACGTCATGCTGCCCTCCAGCAGCGAGAAGCTGCCCATCAGTCTGTCTCCTCTGACGCCCATTGACTCCACCCCTGTTCTGACCAAACTAGACACCGGAGCGGAGGACTTCCCTTTCTGCTCTGCCTCTGATCGTGGTCCAGACTCTGCAAACTCATCTTCCACATCTGGACTGGGCTCCCCGGGGCCCAACAGCCCCATGGATTACTGTTTCCAAGTAGACTCCGACATCAATTCTGAATTCAAACTGGACCTGGTTGAGAAACTGTTTGCTATTGATACTGAGGCAAAGACCCCTTTTAGCTCCCAGGCCATGGAGGATCTCGACCTAGAGATGCTGGCTCCATACATCCCAATGGATGATGACTTCCAGCTGCGTATTCCCTCTCCGCTGGATCCGCTCCCCTCTGGCCCTCACTCTGTGTCCACCATGAGCTCCCTGTTCCAACCCTTGCCCTCCCCTGTGTCTCCAGCCTCTTCCTCCAGCAGCACAGTGAAACAGGAGCCGTCATCTCAGGCCCCTTCACCCCTGCACCTGCTGCAGGAGGTGTGCAATGCTCCTGTCTCACCCTTCAGTGGCAGTCGGGACGTTTCCCCTGCTCGGTCTCCCACCCCACAGAACAGCAATCAGCTCAACAACAGAGAGCTGTCTCCAAAGATGATAGCTGTCCAGAACGCTCAGCGTAAGAGGAAGCTGGAGGAAGTGACATCACTTTCTGAGGCTGTTGGATTGAGTGCTTTGCTTCAGAGTGTGGACAGTGCTATAGAGCCTGGAAAGAGGGCAAAGGTTTTAGAGCTTAAAGGATCAAGTGTGCTTGGAGGAAACAAAACCATTCTCATACTGCCCTCTGATGTGGCCAGTCGTCTGTTGTGCAGTTCTTTAGAGAGCAGCCATGGGCTGCCTCAGCTAACACGTTACGACTGCGAAGTCAACGCTCCTGTGCAGGACCGCCATCATCTGCTGCAGGGAGAGGAGCTCCTGCGTGCTCTGGACCAAGTCAACTGA

步骤6：编码区预测

利用FGENESH软件

(http://linux1.softberry.com/berry.phtml？group＝programs&subgroup＝gfind&topic＝fgenesh)和ORF finder软件(http://www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html)对得到的HIF-1α编码区核苷酸序列急性预测，得到该基因的氨基酸序列，如下(SEQ ID NO.2)所示：

MDTGVVTEKKRVSSERRKEKSRDAARSRRGKESEVFYELAHQLPLPHNVTSHLDKASIMRLTISYLRMRKLLSSDESEKENEEESQLNSFYLKALEGFLMVLSEDGDMVYLSENVSKSMGLSQFDLTGHSIFEFSHPCDHEELREMLVYRTGSKKTKEQNTERSFFLRMKCTLTSRGRTVNIKSATWKVLHCTGHVRVQECDEGSGDSGFKEPPLTYLVLICEPIPHPSNIEVPLDSKTFLSRHTLDMKFSYCDERITELMGYEPDDLLNKSVYEYYHALDSDHLTKTHHNLFAKVQLCSQGQATTGQYRMLAKKGGFVWVETQATVIYNPKNSQPQCIVCVNYVLSGIVEGDVVLSLQQTMTEPEAEEKENQEMEEEASEVDILKLFKPESLKCPVKSSELYEKLKEEPEALNVLAPSAGDTIISLDFNNSDSDMQLLKEVPLYNDVMLPSSSEKLPISLSPLTPIDSTPVLTKLDTGAEDFPFCSASDRGPDSANSSSTSGLGSPGPNSPMDYCFQVDSDINSEFKLDLVEKLFAIDTEAKTPFSSQAMEDLDLEMLAPYIPMDDDFQLRIPSPLDPLPSGPHSVSTMSSLFQPLPSPVSPASSSSSTVKQEPSSQAPSPLHLLQEVCNAPVSPFSGSRDVSPARSPTPQNSNQLNNRELSPKMIAVQNAQRKRKLEEVTSLSEAVGLSALLQSVDSAIEPGKRAKVLELKGSSVLGGNKTILILPSDVASRLLCSSLESSHGLPQLTRYDCEVNAPVQDRHHLLQGEELLRALDQVN*

二、低氧胁迫下的金鱼缺氧诱导因子HIF-1α在不同组织中的表达

步骤1：金鱼低氧胁迫试验

所用试验鱼取自花鸟鱼虫市场，体质量53±2g，全长14±2cm。试验鱼运回后置于实验室循环水养殖系统暂养。循环系统内水温为18±0.5℃，溶氧8.01mg/L。适应1d后开始投喂饲料，每日上午9：00和下午16：00分别投喂颗粒型饵料，在此条件下驯养7d。从暂养鱼中挑选活力好、健壮的个体进行试验。

试验分为对照组(C)、低氧组(H)和恢复组(R)，每组设置3个平行，每个平行放10尾鲫。对照组正常充氧，溶氧保持在8.01mg/L左右，低氧组利用充氮气降低溶氧水平，使溶氧水平保持在为1.04mg/L左右。低氧胁迫12h后取样。恢复组在低氧胁迫12h后打开密闭装置，正常充气，使溶氧恢复至7.85mg/L左右，恢复充气12h后取样。每组取5尾，取肝脏、鳃、脑、心脏组织，于RNAlater保存，4℃过夜，之后转入-80℃冷冻保存。

步骤2：RNA提取和cDNA的合成步骤同步骤一。

步骤3：实时荧光定量qPCR检测HIF-1α基因表达量

利用Primer 5.0软件设计并合成定量引物，并以鲤鱼β-actin基因为内参，检测HIF-1α基因在肝脏、鳃、心脏和脑组织中的表达。本部分所用内参引物(Carp-Actin)和目的基因(HIF-1α)荧光定量引物见表2。

采用的反应体系为15μL，其中上下游引物各0.2umol/L，模板50ng，1×SYBRPremix ExTaq(TaKaRa)。扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，40个循环；72℃延伸5min。使用仪器为BIO-RAD CFX Connect^TM荧光定量PCR检测系统。

步骤4：数据分析

所有实验设置3个重复，结果利用

进行数据处理及分析，用软件SPSS 21.0进行差异显著性检验。结果表明(见图4)，HIF-1α基因在四种组织中均有表达，但是在不同组织中的表达水平有明显的组织差异性。正常充气条件下，肝脏的表达量最高，其次为脑，心脏位居第三，鳃的表达量最低。另外，不同组织中的HIF-1α基因对不同氧气条件的应答模式不同。低氧胁迫12h后，肝脏和脑中表达量显著降低(P<0.05)，恢复正常充气12h后，仍显著低于对照组水平(P<0.05)。低氧胁迫12h后，心脏中的HIF-1α的表达量升高，但与对照组无显著差异，恢复正常充氧12h后，HIF-1α基因表达量显著高于对照组和低氧胁迫组(P<0.05)。低氧胁迫后(A组)，鳃中HIF-1α的相对表达量显著高于对照组(P<0.05)，恢复正常充气12h后，HIF-1α基因相对表达量显著降低，但仍高于对照组水平(P<0.05)。鲫鱼HIF-1α基因不同的组织表达模式显示它可能具有不同的生理功能。

表2 qPCR实验使用的引物

序列表：

SEQUENCE LISTING

SEQ ID NO 1：

SEQ ID NO 2：

SEQ ID NO 3：

ATGGATACTGGAGTTGTCACTGAAAAGAAAAGGGTGAGCTCGGAGCGCAGGAAGGAGAAGTCCAGGGATGCAGCGCGATCTCGCAGGGGAAAGGAGTCTGAGGTGTTCTACGAGTTAGCACACCAGCTCCCCCTGCCACACAATGTCAACTCCCACCTGGACAAAGCCTCCATCATGAGGCTGACCATCAGCTATCTGCGCATGAGGAAGCTGCTCAGCTCTGATACTCCTGTAGTCATATATGAATCTGAGAAGGAGAATGAGGAGGAGAGTCAGCTGAACAGCTTTTATCTGAAGGCCCTGGAGGGTTTCCTCATGGTCCTGTCTGAAGATGGAGACATGGTTTATCTCTCTGAGAATGTCAGCAAGAGCATGGGCCTCTCACAGTTTGATCTGACTGGTCACAGCATCTTTGAATTTTCACACCCATGTGACCATGAGGAGCTGAGAGAGATGCTGGTCTACAGGACAGGATCCAAAAAGACCAAGGAACAAAACACAGACGCGCAGCTCTTCCTGCGCATGAAGTGCACACTCACTAGCAGAGGTCGCACTGTCAATATAAAGTCTGCTACGTGGAAGGTTCTTCACTGCACTGGTCATGTGCGTGTGCAGGAGTGCGACGAGGGTTCGGGAGACTCTGGCTTTAAAGAGCCTCCTCTGACCTACCTTGTGCTCATCTGTGAGCCCATTCCTCATCCCTCGAACATCGAGGTGCCTCTGGACAGCAAGACCTTCCTTAGCCGCCACACTCTGGACATGACCCCCAGGATAAGTTCAGTTGAAAGGATTTGTTGTGGAAATGATTGTAAATGGATCACAGAGCTGATGGGATATGAGCCAGATGATCTGCTGAACAGGTCTGTGTACGAATACTATCATGCCCTGGATTCAGATCACCTTACCAAGACACATCACAACTTGTTTGCAAAGGGCCAGGCCACCACAGGCCAGTACCGCATGCTGGCTAAGAAAGGTGGTTTTGTGTGGGTGGAGACTCAGGCCACTGTTATCTACAACCCCAAGAATTCTCAGCCACAGTGCATTGTGTGCGTCAACTACGTTCTCAGGGCTGCAACTAACGATTATTTTGATAATCGATTAATCGTTTTGCCCATTTTTTCCCCAACAACGAATCGATTACTAAATTATGGCATTGTGGAGGGGGATGTTGTCCTGTCCTTGCAGCAGACCATGACTGAGCCCAAGGCTGAGGAGAAAGAGAACCAGAAGATGGAAGATGAGGCCTCTGAGGTGGACATACTCAAACTCTTCAAGCCAGAAAGCCTCAAGTGTCCCATGAAGAGCCCTGACCTGTATGAGAAGCTGAAAGAGGAGCCCGAGGCTCTCAATGTGTTGGCACCTTCTGCAGGAGACACCATCATCTCTCTGGACTTCAACAACTCAGATTCTGACATGCAGCTGCTGAAGGAGGTGCCCCTCTACAATGATGTCATGCTGCCCTCCAGCAGCGAGAAGCTGCCCATCAGTCTGTCTCCTCTGACGCCCACCGACTCCACCCCTGTTCTGACGGGGTCTGATCGTGGTCCAGACTCCACAAACACACCTTCCACATCTGGACTGGGCTCCTCGGGGCCTAACAGTCCCATGGATTACTGTTTCCAAGTAGACTCAGACATCAATTCTGAATTCAAACTGGACCTGGTTGAGAAACTGTTTGCTATCGATACCGAGGCAAAGACCCCTTTTAGCTCCCAGGACATGGAGGATCTTGACCTAGAGATGCTGGCTCCATACATCCCAATGGATGACGACTTCCAGCTGCGCATCCCCTCTCCGCTGGATCCGCTCCCCTCTGGCCCTCACTCTGTCCTCTTCCTCCAGCAGCACAGTGAACAGGAGCCGTCATCTCAGGGCCCTTCGCCCTTGCACCTGCTGCAGGAGGTGTGCAATGCCCCTGTCTCACCCTTCAGTGGCAGTCGGGACGTTTCCCCTGCTCGGTCCCCCACCCCACAGAGCAGCAATCAGCTCAACAAGAGAGAGCTGTCTCCAAAGATGTTGGCTATCCAGAACGCCCAACGCAAGAGGAAGCTGGAGGAAGTGACATCACTTTCTGAGGCTGTTGGACTGAGTGTGGACAGTGCTATAGAGCCTGGAAAGAGGGCAAAGGTTTTAGAGCTTAAAGGATCAAGTGTGCTTGGAGGAAACAAAACCATTCTCATACTGCCCTCTGATGTGGCCAGTCGTCTGTTGTGCAGTTCTTTAGAGAGCTGCAGTGGGCTGCCTCAGCTAACACGTTACGACTGCGAAGTCAACGCTCCCGTGCAGGACCGCCATCATCTGCTGCAGGGAGAGGAGCTCCTGCGTGCTCTGGACCAAGTCAAC

SEQ ID NO 4(B3151-F)：ATGGATACTGGAGTTGTC

SEQ ID NO 5(B3151-R)：ACAATGCACTGTGGCTGA

SEQ ID NO 6(B3152-F)：TGGATTCAGATCACCTTACC

SEQ ID NO 7(B3152-R)：GGTCTTTGCCTCGGTATC

SEQ ID NO 8(B3153-F)：CCTCCAGCAGCGAGAAGC

SEQ ID NO 9(B3153-R)：GTTGACTTGGTCCAGAGC

SEQ ID NO 10(GSP1)：CTGGTGTGCTAACTCG

SEQ ID NO 11(GSP2)：ACCTCAGACTCCTTTCCC

SEQ ID NO 12(GSP3)：GCTGCATCCCTGGACTTC

SEQ ID NO 13(C238-1)：GCCCTCTGATGTGGCCAGTCGTCT

SEQ ID NO 14(C238-2)：AGCTAACACGTTACGACTGCGAAG

SEQ ID NO 15(HIF-1αF)：CTCACTAGCAGAGGTCGCAC

SEQ ID NO 16(HIF-1αR)：GGGATGAGGAATGGGCTCAC

SEQ ID NO 17(Carp-Actin F)：TGCAAAGCCGGATTCGCTGG

SEQ ID NO 18(Carp-Actin R)：AGTTGGTGACAATACCGTGC

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

序列表

<110> 天津市水产研究所

<120> 一种金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因、克隆方法及应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2343

<212> DNA/RNA

<213> 金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因的核苷酸序列(Unknown)

<400> 1

atggatactg gagttgtcac tgaaaagaaa agggtgagct cggagcgcag gaaggagaag 60

tccagggatg cagcgcgatc tcgcagggga aaggagtctg aggtgttcta cgagttagca 120

caccagctcc ccctgccaca caatgtcacc tcccacctgg acaaagcctc catcatgagg 180

ctgaccatca gctatctgcg catgaggaag ctgctcagct ctgatgaatc tgagaaggag 240

aatgaggagg agagtcagct gaacagcttt tatctgaagg ctctggaggg tttcctcatg 300

gtcctgtctg aagatggaga catggtttat ctctctgaga atgtcagcaa gagcatgggc 360

ctctcacagt ttgatctgac tggtcacagc atctttgaat tttcacaccc atgtgaccat 420

gaggagctga gagagatgct ggtctacagg acaggatcca aaaagaccaa ggaacaaaac 480

acagagcgca gcttcttcct gcgcatgaag tgcacactca ctagcagagg gcgcactgtc 540

aatatcaagt ctgccacgtg gaaggttctt cactgcactg gtcatgtgcg tgtgcaggag 600

tgcgacgagg gttcgggaga ctctggcttt aaagagcctc ctctgaccta ccttgtgctc 660

atctgtgagc ccattcctca tccctcgaac atcgaggtgc ctctggacag caagaccttc 720

cttagccgcc acactctgga catgaagttt tcctactgtg atgaaagaat cacagagctg 780

atgggatatg agccagatga tctgctgaac aagtctgtgt atgaatacta tcatgccctg 840

gattcagatc accttaccaa gacacatcac aacttgttcg caaaggttca actttgttcg 900

cagggccagg ccaccacagg ccagtaccgc atgctggcta agaaaggtgg ttttgtgtgg 960

gtggagactc aggccactgt tatctacaat cccaagaatt ctcagccaca gtgcattgtg 1020

tgcgtcaact acgttctcag tggcattgtg gagggggatg ttgtcctgtc cttgcagcag 1080

accatgaccg aacccgaggc tgaggagaaa gagaaccagg agatggaaga ggaggcctct 1140

gaggtggaca tactcaaact cttcaagcca gaaagcctca agtgtcccgt gaagagctct 1200

gaactttatg agaagctgaa agaggagcct gaggctctca atgtcttggc accttctgca 1260

ggagacacca tcatctctct ggacttcaac aattcagact ctgatatgca gctgctgaag 1320

gaggtgcccc tctacaatga cgtcatgctg ccctccagca gcgagaagct gcccatcagt 1380

ctgtctcctc tgacgcccat tgactccacc cctgttctga ccaaactaga caccggagcg 1440

gaggacttcc ctttctgctc tgcctctgat cgtggtccag actctgcaaa ctcatcttcc 1500

acatctggac tgggctcccc ggggcccaac agccccatgg attactgttt ccaagtagac 1560

tccgacatca attctgaatt caaactggac ctggttgaga aactgtttgc tattgatact 1620

gaggcaaaga ccccttttag ctcccaggcc atggaggatc tcgacctaga gatgctggct 1680

ccatacatcc caatggatga tgacttccag ctgcgtattc cctctccgct ggatccgctc 1740

ccctctggcc ctcactctgt gtccaccatg agctccctgt tccaaccctt gccctcccct 1800

gtgtctccag cctcttcctc cagcagcaca gtgaaacagg agccgtcatc tcaggcccct 1860

tcacccctgc acctgctgca ggaggtgtgc aatgctcctg tctcaccctt cagtggcagt 1920

cgggacgttt cccctgctcg gtctcccacc ccacagaaca gcaatcagct caacaacaga 1980

gagctgtctc caaagatgat agctgtccag aacgctcagc gtaagaggaa gctggaggaa 2040

gtgacatcac tttctgaggc tgttggattg agtgctttgc ttcagagtgt ggacagtgct 2100

atagagcctg gaaagagggc aaaggtttta gagcttaaag gatcaagtgt gcttggagga 2160

aacaaaacca ttctcatact gccctctgat gtggccagtc gtctgttgtg cagttcttta 2220

gagagcagcc atgggctgcc tcagctaaca cgttacgact gcgaagtcaa cgctcctgtg 2280

caggaccgcc atcatctgct gcagggagag gagctcctgc gtgctctgga ccaagtcaac 2340

tga 2343

<210> 2

<211> 780

<212> PRT

<213> 氨基酸的序列(Unknown)

<400> 2

Met Asp Thr Gly Val Val Thr Glu Lys Lys Arg Val Ser Ser Glu Arg

1 5 10 15

Arg Lys Glu Lys Ser Arg Asp Ala Ala Arg Ser Arg Arg Gly Lys Glu

20 25 30

Ser Glu Val Phe Tyr Glu Leu Ala His Gln Leu Pro Leu Pro His Asn

35 40 45

Val Thr Ser His Leu Asp Lys Ala Ser Ile Met Arg Leu Thr Ile Ser

50 55 60

Tyr Leu Arg Met Arg Lys Leu Leu Ser Ser Asp Glu Ser Glu Lys Glu

65 70 75 80

Asn Glu Glu Glu Ser Gln Leu Asn Ser Phe Tyr Leu Lys Ala Leu Glu

85 90 95

Gly Phe Leu Met Val Leu Ser Glu Asp Gly Asp Met Val Tyr Leu Ser

100 105 110

Glu Asn Val Ser Lys Ser Met Gly Leu Ser Gln Phe Asp Leu Thr Gly

115 120 125

His Ser Ile Phe Glu Phe Ser His Pro Cys Asp His Glu Glu Leu Arg

130 135 140

Glu Met Leu Val Tyr Arg Thr Gly Ser Lys Lys Thr Lys Glu Gln Asn

145 150 155 160

Thr Glu Arg Ser Phe Phe Leu Arg Met Lys Cys Thr Leu Thr Ser Arg

165 170 175

Gly Arg Thr Val Asn Ile Lys Ser Ala Thr Trp Lys Val Leu His Cys

180 185 190

Thr Gly His Val Arg Val Gln Glu Cys Asp Glu Gly Ser Gly Asp Ser

195 200 205

Gly Phe Lys Glu Pro Pro Leu Thr Tyr Leu Val Leu Ile Cys Glu Pro

210 215 220

Ile Pro His Pro Ser Asn Ile Glu Val Pro Leu Asp Ser Lys Thr Phe

225 230 235 240

Leu Ser Arg His Thr Leu Asp Met Lys Phe Ser Tyr Cys Asp Glu Arg

245 250 255

Ile Thr Glu Leu Met Gly Tyr Glu Pro Asp Asp Leu Leu Asn Lys Ser

260 265 270

Val Tyr Glu Tyr Tyr His Ala Leu Asp Ser Asp His Leu Thr Lys Thr

275 280 285

His His Asn Leu Phe Ala Lys Val Gln Leu Cys Ser Gln Gly Gln Ala

290 295 300

Thr Thr Gly Gln Tyr Arg Met Leu Ala Lys Lys Gly Gly Phe Val Trp

305 310 315 320

Val Glu Thr Gln Ala Thr Val Ile Tyr Asn Pro Lys Asn Ser Gln Pro

325 330 335

Gln Cys Ile Val Cys Val Asn Tyr Val Leu Ser Gly Ile Val Glu Gly

340 345 350

Asp Val Val Leu Ser Leu Gln Gln Thr Met Thr Glu Pro Glu Ala Glu

355 360 365

Glu Lys Glu Asn Gln Glu Met Glu Glu Glu Ala Ser Glu Val Asp Ile

370 375 380

Leu Lys Leu Phe Lys Pro Glu Ser Leu Lys Cys Pro Val Lys Ser Ser

385 390 395 400

Glu Leu Tyr Glu Lys Leu Lys Glu Glu Pro Glu Ala Leu Asn Val Leu

405 410 415

Ala Pro Ser Ala Gly Asp Thr Ile Ile Ser Leu Asp Phe Asn Asn Ser

420 425 430

Asp Ser Asp Met Gln Leu Leu Lys Glu Val Pro Leu Tyr Asn Asp Val

435 440 445

Met Leu Pro Ser Ser Ser Glu Lys Leu Pro Ile Ser Leu Ser Pro Leu

450 455 460

Thr Pro Ile Asp Ser Thr Pro Val Leu Thr Lys Leu Asp Thr Gly Ala

465 470 475 480

Glu Asp Phe Pro Phe Cys Ser Ala Ser Asp Arg Gly Pro Asp Ser Ala

485 490 495

Asn Ser Ser Ser Thr Ser Gly Leu Gly Ser Pro Gly Pro Asn Ser Pro

500 505 510

Met Asp Tyr Cys Phe Gln Val Asp Ser Asp Ile Asn Ser Glu Phe Lys

515 520 525

Leu Asp Leu Val Glu Lys Leu Phe Ala Ile Asp Thr Glu Ala Lys Thr

530 535 540

Pro Phe Ser Ser Gln Ala Met Glu Asp Leu Asp Leu Glu Met Leu Ala

545 550 555 560

Pro Tyr Ile Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ile Pro Ser Pro

565 570 575

Leu Asp Pro Leu Pro Ser Gly Pro His Ser Val Ser Thr Met Ser Ser

580 585 590

Leu Phe Gln Pro Leu Pro Ser Pro Val Ser Pro Ala Ser Ser Ser Ser

595 600 605

Ser Thr Val Lys Gln Glu Pro Ser Ser Gln Ala Pro Ser Pro Leu His

610 615 620

Leu Leu Gln Glu Val Cys Asn Ala Pro Val Ser Pro Phe Ser Gly Ser

625 630 635 640

Arg Asp Val Ser Pro Ala Arg Ser Pro Thr Pro Gln Asn Ser Asn Gln

645 650 655

Leu Asn Asn Arg Glu Leu Ser Pro Lys Met Ile Ala Val Gln Asn Ala

660 665 670

Gln Arg Lys Arg Lys Leu Glu Glu Val Thr Ser Leu Ser Glu Ala Val

675 680 685

Gly Leu Ser Ala Leu Leu Gln Ser Val Asp Ser Ala Ile Glu Pro Gly

690 695 700

Lys Arg Ala Lys Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Ser Val Leu Gly Gly

705 710 715 720

Asn Lys Thr Ile Leu Ile Leu Pro Ser Asp Val Ala Ser Arg Leu Leu

725 730 735

Cys Ser Ser Leu Glu Ser Ser His Gly Leu Pro Gln Leu Thr Arg Tyr

740 745 750

Asp Cys Glu Val Asn Ala Pro Val Gln Asp Arg His His Leu Leu Gln

755 760 765

Gly Glu Glu Leu Leu Arg Ala Leu Asp Gln Val Asn

770 775 780

<210> 3

<211> 2346

<212> DNA/RNA

<213> 金鱼转录组序列的序列(Unknown)

<400> 3

atggatactg gagttgtcac tgaaaagaaa agggtgagct cggagcgcag gaaggagaag 60

tccagggatg cagcgcgatc tcgcagggga aaggagtctg aggtgttcta cgagttagca 120

caccagctcc ccctgccaca caatgtcaac tcccacctgg acaaagcctc catcatgagg 180

ctgaccatca gctatctgcg catgaggaag ctgctcagct ctgatactcc tgtagtcata 240

tatgaatctg agaaggagaa tgaggaggag agtcagctga acagctttta tctgaaggcc 300

ctggagggtt tcctcatggt cctgtctgaa gatggagaca tggtttatct ctctgagaat 360

gtcagcaaga gcatgggcct ctcacagttt gatctgactg gtcacagcat ctttgaattt 420

tcacacccat gtgaccatga ggagctgaga gagatgctgg tctacaggac aggatccaaa 480

aagaccaagg aacaaaacac agacgcgcag ctcttcctgc gcatgaagtg cacactcact 540

agcagaggtc gcactgtcaa tataaagtct gctacgtgga aggttcttca ctgcactggt 600

catgtgcgtg tgcaggagtg cgacgagggt tcgggagact ctggctttaa agagcctcct 660

ctgacctacc ttgtgctcat ctgtgagccc attcctcatc cctcgaacat cgaggtgcct 720

ctggacagca agaccttcct tagccgccac actctggaca tgacccccag gataagttca 780

gttgaaagga tttgttgtgg aaatgattgt aaatggatca cagagctgat gggatatgag 840

ccagatgatc tgctgaacag gtctgtgtac gaatactatc atgccctgga ttcagatcac 900

cttaccaaga cacatcacaa cttgtttgca aagggccagg ccaccacagg ccagtaccgc 960

atgctggcta agaaaggtgg ttttgtgtgg gtggagactc aggccactgt tatctacaac 1020

cccaagaatt ctcagccaca gtgcattgtg tgcgtcaact acgttctcag ggctgcaact 1080

aacgattatt ttgataatcg attaatcgtt ttgcccattt tttccccaac aacgaatcga 1140

ttactaaatt atggcattgt ggagggggat gttgtcctgt ccttgcagca gaccatgact 1200

gagcccaagg ctgaggagaa agagaaccag aagatggaag atgaggcctc tgaggtggac 1260

atactcaaac tcttcaagcc agaaagcctc aagtgtccca tgaagagccc tgacctgtat 1320

gagaagctga aagaggagcc cgaggctctc aatgtgttgg caccttctgc aggagacacc 1380

atcatctctc tggacttcaa caactcagat tctgacatgc agctgctgaa ggaggtgccc 1440

ctctacaatg atgtcatgct gccctccagc agcgagaagc tgcccatcag tctgtctcct 1500

ctgacgccca ccgactccac ccctgttctg acggggtctg atcgtggtcc agactccaca 1560

aacacacctt ccacatctgg actgggctcc tcggggccta acagtcccat ggattactgt 1620

ttccaagtag actcagacat caattctgaa ttcaaactgg acctggttga gaaactgttt 1680

gctatcgata ccgaggcaaa gacccctttt agctcccagg acatggagga tcttgaccta 1740

gagatgctgg ctccatacat cccaatggat gacgacttcc agctgcgcat cccctctccg 1800

ctggatccgc tcccctctgg ccctcactct gtcctcttcc tccagcagca cagtgaacag 1860

gagccgtcat ctcagggccc ttcgcccttg cacctgctgc aggaggtgtg caatgcccct 1920

gtctcaccct tcagtggcag tcgggacgtt tcccctgctc ggtcccccac cccacagagc 1980

agcaatcagc tcaacaagag agagctgtct ccaaagatgt tggctatcca gaacgcccaa 2040

cgcaagagga agctggagga agtgacatca ctttctgagg ctgttggact gagtgtggac 2100

agtgctatag agcctggaaa gagggcaaag gttttagagc ttaaaggatc aagtgtgctt 2160

ggaggaaaca aaaccattct catactgccc tctgatgtgg ccagtcgtct gttgtgcagt 2220

tctttagaga gctgcagtgg gctgcctcag ctaacacgtt acgactgcga agtcaacgct 2280

cccgtgcagg accgccatca tctgctgcag ggagaggagc tcctgcgtgc tctggaccaa 2340

gtcaac 2346

<210> 4

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> B3151- F(Unknown)

<400> 4

atggatactg gagttgtc 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> B3151- R(Unknown)

<400> 5

acaatgcact gtggctga 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> B3152- F(Unknown)

<400> 6

tggattcaga tcaccttacc 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> B3152- R(Unknown)

<400> 7

ggtctttgcc tcggtatc 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> B3153 -F(Unknown)

<400> 8

cctccagcag cgagaagc 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> B3153 -R(Unknown)

<400> 9

gttgacttgg tccagagc 18

<210> 10

<211> 16

<212> DNA/RNA

<213> GSP1(Unknown)

<400> 10

ctggtgtgct aactcg 16

<210> 11

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> GSP2(Unknown)

<400> 11

acctcagact cctttccc 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> GSP3(Unknown)

<400> 12

gctgcatccc tggacttc 18

<210> 13

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> C238-1 (Unknown)

<400> 13

gccctctgat gtggccagtc gtct 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> C238-2(Unknown)

<400> 14

agctaacacg ttacgactgc gaag 24

<210> 15

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> HIF-1αF(Unknown)

<400> 15

ctcactagca gaggtcgcac 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> HIF-1αR(Unknown)

<400> 16

gggatgagga atgggctcac 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> Carp-Actin F(Unknown)

<400> 17

tgcaaagccg gattcgctgg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> Carp-Actin R(Unknown)

<400> 18

agttggtgac aataccgtgc 20

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一种金鱼缺氧诱导因子HIF-1α基因、克隆方法及应用

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