阅读说明：本技术 一种利用微藻直接生产乙醇的方法 (Method for directly producing ethanol by using microalgae ) 是由 贺诗欣 曲文颖 于 2019-12-23 设计创作，主要内容包括：一种利用微藻直接生产乙醇的方法,属于发酵工程技术领域。为了解决目前利用微藻生物合成乙醇的成本高,效率低的问题,本发明提供了一种利用微藻生产乙醇的方法,以表达淀粉酶和纤维素酶的酿酒酵母为发酵菌种,接种到含有微藻的发酵培养基中发酵培养制备乙醇；所述微藻为凯氏拟小球藻Parachlorella kessleri QWY28、栅藻Desmodesmus sp.QWY36或衣藻Chlamydomonas sp.QWY37。本发明克服了淀粉和纤维素水解的反应试剂毒性风险,降低了乙醇生产的成本,为真实养猪污水培养的富含碳水化合物的微藻直接生产高浓度乙醇工艺提供了新的视角。(A method for directly producing ethanol by using microalgae, belonging to the technical field of fermentation engineering. In order to solve the problems of high cost and low efficiency of ethanol biosynthesis by using microalgae at present, the invention provides a method for producing ethanol by using microalgae, wherein saccharomyces cerevisiae for expressing amylase and cellulase is taken as a fermentation strain and is inoculated into a fermentation medium containing the microalgae for fermentation culture to prepare the ethanol; the microalgae is Chlorella Kessleri QWY28, Scenedesmus sp.QWY36 or Chlamydomonas sp.QWY37. The invention overcomes the toxicity risk of reaction reagents for hydrolyzing starch and cellulose, reduces the cost for producing ethanol, and provides a new visual angle for the process for directly producing high-concentration ethanol by microalgae which is cultured by real pig-raising sewage and is rich in carbohydrate.)

一种利用微藻直接生产乙醇的方法

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种利用微藻直接生产乙醇的方法。

背景技术

光合生物是利用光能固定CO₂的生物体的总称，藻类是指在良好的培养条件下具有高光合效率的光合生物。藻类的工业化培养已经进行了半个多世纪，人们对藻类作为工业原料、燃料、饲料、精细化学品的原料和保健品的需求越来越大，认为藻类在未来工业中占有重要地位。由于CO₂固定过程中产生了各种有用的碳组分，因此在藻类的培养过程中，藻类生产的各种碳成分成为研究热点。

由于担心矿物燃料枯竭，人们更加需要及早寻找替代燃料，而且由于健康方面的消费者增多，人们对更适合维持和改善健康的功能性化学品的需求也增加了，然而，淡水的短缺使得实际的微藻生物乙醇生产成本过高，因此，有必要开发一种低成本、高碳水化合物产量的培养体系，以更好地满足实际需求。

发明内容

为了解决目前利用微藻生物合成乙醇的成本高，效率低的问题，本发明提供了一种利用微藻生产乙醇的方法，一种利用微藻生产乙醇的方法，以表达淀粉酶和纤维素酶的酿酒酵母为发酵菌种，接种到含有微藻的发酵培养基中发酵培养制备乙醇；所述微藻为凯氏拟小球藻Parachlorella kessleri QWY28、栅藻Desmodesmus sp.QWY36或衣藻Chlamydomonas sp.QWY37，所述微藻经养猪污水培养富集得到，以发酵培养基体积计，所述微藻在发酵培养基中接种量为150-300g/L。

进一步地限定，所述酿酒酵母为EG-D-CBHI-D-CBHII-D和BY-AASS/GASS/GASS组成的混合菌。

进一步地限定，所述发酵培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖培养基。

进一步地限定，所述利用微藻生产乙醇的方法如下：

1)菌种活化：将表达淀粉酶和纤维素酶的酿酒酵母菌株接种至酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中培养，温度为20-30℃，搅拌速度为100-200rpm/min，培养48-72h后，离心后得到的菌体用无菌水漂洗后，称重；

2)发酵培养：然后，将表达淀粉酶和纤维素酶的酿酒酵母接种到含有微藻的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中，接种量为50-100g/L，37℃，搅拌速度为400rpm/min进行乙醇发酵，以酵母浸出粉胨葡萄糖培养基体积计，所述微藻在发酵培养基中接种量为300g/L。

进一步地限定，步骤1)所述离心在4℃下以5200rpm/min离心细胞10min。

进一步地限定，步骤2)所述酿酒酵母菌株为EG-D-CBHI-D-CBHII-D和BY-AASS/GASS/GASS按照1:1组成的混合菌，以酵母浸出粉胨葡萄糖培养基体积计，EG-D-CBHI-D-CBHII-D接种量为50g/L，BY-AASS/GASS/GASS接种量为50g/L。

进一步地限定，步骤2)发酵后乙醇的收集方法为：取已发酵的发酵液加至蒸馏装置的圆底烧瓶中，在水浴锅中85-95℃下蒸馏，收集流出的乙醇。

有益效果

以往利用未经基因改造的酵母菌发酵微藻前，需将微藻水解，以去除微藻中影响发酵的纤维素等结构，而本发明利用来自养猪污水筛选并培养得到的微藻，可直接生产高浓度乙醇，在酿酒酵母的发酵下，在72h时间内，发酵生产乙醇，产量可达61g/L，克服了淀粉和纤维素水解的反应试剂毒性风险，降低了乙醇生产的成本，是一种新颖且经济的技术，为真实养猪污水培养的富含碳水化合物的微藻直接生产高浓度乙醇工艺提供了新的视角。

附图说明

图1表达淀粉酶和纤维素酶的酿酒酵母的发酵原理、淀粉利用和直接生产乙醇的时间过程。

具体实施方式

本发明所使用的酿酒酵母：EG-D-CBHI-D-CBHII-D和BY-AASS/GASS/GASS记载在Huang,X.,Bai,S.,Liu,Z.,Hasunuma,T.,Kondo,A.,&Ho,S.H.(2019).Fermentation ofpigment-extracted microalgal residue using yeast cell-surface display:Directhigh-density ethanol production with competitive life cycle impacts.GreenChemistry.https://doi.org/10.1039/C9GC02634G。该菌株供种可通过哈尔滨工业大学获得。

为了便于更好的理解本发明所述的利用重组酵母菌在含有微藻的培养基上，以微藻为底物生产乙醇的原理，本发明提供相应酵母菌的基因组成以及代谢路线，参见图1所示，附图中所述的各基因以及文中提及的相关质粒也均记载在该文章正文及补充材料中，在此不再赘述。

本发明所述的微藻：凯氏拟小球藻Parachlorella kessleri QWY28、栅藻Desmodesmus sp.QWY36或衣藻Chlamydomonas sp.QWY37是从中国哈尔滨市养猪场附近的河流中分离出细胞，细胞在30℃、200μmol/m²·s的光照条件下培养24h，使用BG-11固体培养基，藻株每2周进行一次传代培养，经形态观察和18S rDNA序列对比等鉴定，确定为凯氏拟小球藻Parachlorella kessleri QWY28、栅藻Desmodesmus sp.QWY36或衣藻Chlamydomonas sp.QWY37(如图1所示)，藻株QWY28、QWY36和QWY37的18SrDNA序列已提交至美国国立生物技术信息中心，序列号分别为MK367466、MK367467和MK367468。以衣藻为例，可见细胞为椭圆形，其大小约为10μm。该细胞具有2个鞭毛，其大小与细胞的长度大致相同。细胞具有运动性。通过二***进行生长。生理或生化特征：①污水：可以在真实养猪污水中生长。②光合作用性能：利用光合作用可以进行光合自养生长。③所含色素：叶绿素a、叶绿素b和其他类胡萝卜素。④同化储存物质：淀粉。⑤生长温度范围：15-35℃(最佳温度为30℃)。⑥生长pH范围：pH6.0-10.0(最佳pH值为7.0)，为衣藻属绿藻。

上述菌藻均记载在：Qu,W.,Zhang,C.,Zhang,Y.,Ho,S.,2019.Optimizing realswine wastewater treatment with maximum carbohydrate production by a newlyisolated indigenous microalga Parachlorella kessleri QWY28.BIORESOURCETECHNOLOGY,289.公众可通过哈尔滨工业大学获得。

BG-11培养基配方如表1所示：

表1 BG-11培养基配方

实施例1.利用微藻生产乙醇的方法。

本实施例中所用的酿酒酵母为酿酒酵母菌株EG-D-CBHI-D-CBHII-D和BY-AASS/GASS/GASS按照1:1组成的混合菌。

所用微藻为衣藻Chlamydomonas sp.QWY37，经测定，其在含有COD、

和

的养猪污水中具有944mg/L·d的碳水化合物生产力，淀粉占干细胞重量的58％，下面具体描述生产乙醇的方法。

1)菌种活化：将上述酿酒酵母菌株接种至酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中培养，温度为30℃，搅拌速度为150rpm/min，培养72h后，离心后得到的菌体用无菌水漂洗2次，称重；

2)发酵培养：将酿酒酵母接种到含有微藻的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中，以酵母浸出粉胨葡萄糖培养基体积计，接种量EG-D-CBHI-D-CBHII-D和BY-AASS/GASS/GASS各为50g/L，37℃，搅拌速度为400rpm/min进行乙醇发酵，以酵母浸出粉胨葡萄糖培养基体积计，所述微藻在发酵培养基中接种量为300g/L。用气相色谱仪(GC-2010，岛津，东京，日本)根据文献(Yamada et al.,2013)测定乙醇浓度，经发酵72h测定，QWY37的产乙醇量为61g/L，如图1所示。