阅读说明：本技术 一种低致敏性脱腥南极磷虾肽的制备方法 (Preparation method of low-sensitization fishy smell-removed Antarctic krill peptide ) 是由 于建伟 魏星 邹鹏飞 蒋一博 唐文金 卢伟超 杜可欣 于 2019-11-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种低致敏性脱腥南极磷虾肽的制备方法,按制备顺序依次包括酶解、超滤、闪蒸、膜分级；所述膜分级为使用半透膜装置将闪蒸获得的浓缩酶解液分离成多个分子量不同的组分,分别检测除分子量最小的组分之外的每个组分的过敏原含量,将过敏原含量最高的组分与分子量最小的组分抛弃,并将其他组分合并。本发明通过多层定向透析技术有效脱除南极磷虾肽中的致敏物质,同时采用超滤闪蒸串联的一步浓缩法,获得的南极磷虾肽液,具有低致敏性、无腥味等特点。本发明制造过程效率高,易于产业化,肽活性高,功效明显,同时使提取液可以广泛应用于营养品、护肤品、药品等领域。(The invention relates to a preparation method of low-sensitization fishy smell-removed Antarctic krill peptide, which sequentially comprises enzymolysis, ultrafiltration, flash evaporation and membrane classification according to the preparation sequence; the membrane fractionation is to separate the concentrated enzymatic hydrolysate obtained by flash evaporation into a plurality of components with different molecular weights by using a semi-permeable membrane device, detect the allergen content of each component except the component with the minimum molecular weight, discard the component with the highest allergen content and the component with the minimum molecular weight, and combine the other components. The method effectively removes the sensitizing substances in the Antarctic krill peptide by a multilayer directional dialysis technology, and simultaneously adopts a one-step concentration method of ultrafiltration flash evaporation series connection to obtain the Antarctic krill peptide liquid, which has the characteristics of low sensitization, no fishy smell and the like. The invention has high efficiency of the manufacturing process, easy industrialization, high peptide activity and obvious effect, and simultaneously, the extracting solution can be widely applied to the fields of nourishment, skin care products, medicines and the like.)

一种低致敏性脱腥南极磷虾肽的制备方法

技术领域

本发明具体涉及一种低致敏性脱腥南极磷虾肽的制备方法。

背景技术

南极磷虾(Euphausia superba)属节肢动物门甲壳亚门磷虾目磷虾科，广泛分布于环南极海域，南极磷虾的资源蕴藏量巨大，据估计在6.5～10亿吨之间。由于数量多，营养丰富，生态学家认为是人类潜在的食物来源。南极磷虾蛋白含有8种人体必需的氨基酸，其必需氨基酸的含量和评分高于FAO/WHO推荐的理想蛋白模型。研究表明，南极磷虾肽具有抗氧化、降血压、降胆固醇、抗菌等生物活性，有巨大的应用潜力。

然而，磷虾属于甲壳类动物，甲壳动物在***粮农组织提出的八大类致敏食物中的一类。甲壳动物过敏后临床症状常见的是皮肤反应和消化道反应，严重的过敏可至休克甚至死亡。酶解是蛋白脱敏的常用手段，磷虾蛋白经酶解后可脱除部分过敏原，但仍存在相当量的过敏物质，且残余的过敏物质为多种，体系复杂，难以通过普通纯化方法脱除。此外，海洋肽所特有的腥味也影响其应用。

发明内容

本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种低致敏性脱腥南极磷虾肽的制备与纯化方法，工艺简单易操作，成本低，脱敏效率高。

具体技术方案如下：

一种低致敏性脱腥南极磷虾肽的制备方法，按制备顺序依次包括酶解、超滤、闪蒸、膜分级；

所述膜分级为使用半透膜装置将闪蒸获得的浓缩酶解液分离成多个分子量不同的组分，分别检测除分子量最小的组分之外的每个组分的过敏原含量，将过敏原含量最高的组分与分子量最小的区间组分抛弃，并将其他组分收集。收集得的组分可分别利用，也可合并。

所述将闪蒸获得的浓缩酶解液分离成多个分子量不同的组分，即利用半透膜将酶解液分成多个分子量区间。

发明人意外地发现，过敏物质在酶解产物中存在一定程度的分子量聚集情况；

此外，小分子组分中过敏物质也较多，将此部分剔除，还具备脱盐和脱除游离氨基酸的作用。

磷虾酶解液中的致敏成分即过敏原主要为小分子蛋白、游离氨基酸、小分子极性物质等成分，检测方法为噻唑蓝法，简称MTT法，噻唑蓝可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的甲臜(Formazan)结晶并沉积在细胞中，结晶物能被酸性异丙醇溶解，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，通过MTT细胞活性检测方法即可进行受试物ET50检测。优选的，使用半透膜装置将浓缩酶解液分离成3～5个分子量不同的组分。

组分的数量是综合考虑脱敏效果、得率和工艺成本获得的。

进一步优选，使用4个半透膜装置将浓缩酶解液分离成5个分子量不同的组分，4个半透膜装置的截留分子量分别为800～2500Da,500～1800Da，300～1200Da，100～800Da。

优选的，所述半透膜装置为透析袋。

可选用不同截留分子量的透析袋按照其截留分子量从大到小依次透析。具体为用截留分子量最大的透析袋对酶解液进行透析，保留袋内液体，将透析流出物(即剩余液体)使用次一级截留分子量的透析袋进行透析，依次类推。

进一步优选，所述半透膜装置包括按截留分子量从大到小的多个依次从内到外套接的透析袋。

所述透析袋优选为4个，其截留分子量从内到外依次为800～2500Da,500～1800Da，300～1200Da，100～800Da；透析温度为4～15℃，透析时间为12～48h。

其中，最优选为截留分子量从内到外依次为1000Da，800Da，500Da，200Da。

使用按截留分子量从大到小的多个依次从内到外套接的透析袋，可同时获得多个分子量的组分，达到多层定向透析，简化生产工艺。

本发明还设计了一种多层定向透析装置，包括透析容器和置于容器中的多个按截留分子量从大到小的多个依次从内到外套接的透析袋，所述透析袋的截面直径从内到外依次增大。所述的多层定向透析装置还可包括多个与透析袋形状、尺寸相应的套筒骨架，透析袋粘附于套筒骨架上，以固定透析袋的形状。使用该装置时，将超滤获得的浓缩酶解液倒入最内层的透析袋，容器中倒入适量的水或缓冲液，由于各个透析袋之间的连续截留分子量差值，将浓缩酶解液分隔成多个分子量不同的组分。

优选的，所述的酶解，其具体工作条件为：

将南极磷虾破碎，与水按照质量比1：2～1：8比例混合均匀，调节pH值至2.0～6.0，加入以总反应体系质量计1.0～6.0wt％胃蛋白酶，30℃～50℃温度下酶解0.5～2h，升温至85℃～95℃保持5～20min灭酶；反应体系冷却至室温后离心，离心后收集清液，去除残渣，得粗酶解液。

优选的，所述的超滤，其具体工作条件为：将酶解后获得的粗酶解液通入超滤装置，膜孔径为10～5000nm。

优选使用高通量超滤装置，通量优选为50～100L/h，操作压力差为50～500kPa。

优选的，所述的闪蒸，其具体工作条件为：将超滤获得的酶解液在100～200℃条件下闪蒸10～100s。

超滤装置可与超高温闪蒸装置串联，提高工作效率。采用超滤闪蒸串联的一步浓缩法，提高浓缩效率的同时可实现磷虾酶解液的有效脱腥。

本发明的有益效果如下：

本发明通过多层定向透析技术有效脱除南极磷虾肽中的致敏物质，同时采用超滤闪蒸串联的一步浓缩法，获得的南极磷虾肽液，具有低致敏性、无腥味等特点。本发明制造过程效率高，易于产业化，肽活性高，功效明显，同时使提取液可以广泛应用于营养品、护肤品、药品等领域。

附图说明

图1为本发明中多层定向透析装置的示意图；

图中：1、透析容器；2、透析袋。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本实施例中使用的胃蛋白酶购买自鼓臣生物，酶活为10000u/mg。

实施例1

一种多层定向透析装置，如图1所示，包括向上开口的透析容器1和四个置于容器中的、按截留分子量从大到小的多个依次从内到外套接的透析袋2，所述透析袋2的截面直径从内到外依次增大。

一种低致敏性脱腥南极磷虾肽的制备方法，步骤如下：

(1)酶解：将南极磷虾破碎，与水按照质量比1：5比例混合均匀，调节pH值至4.5，加入以总反应体系质量计2.5wt％胃蛋白酶，42℃下酶解1h，升温至90℃保持10min灭酶；反应体系冷却至30℃以下后离心，离心后收集清液，去除残渣，得粗酶解液。

(2)超滤与闪蒸串联一步浓缩：将超滤装置与超高温闪蒸装置串联，将步骤(1)收集的粗酶解液通入100L/h的大通量超滤装置，膜孔径为50nm，操作压力差为200kPa，，闪蒸温度160℃，闪蒸时间60s，收集闪蒸浓缩液。

(3)膜分级：多层定向透析装置中的透析袋由内至外的截留分子量分别为1000Da，800Da，500Da，200Da；将步骤(2)获得的浓缩液导入所述多层定向透析装置的最内层透析袋，透析容器中可加入适量超纯水；透析温度为10℃，透析时间为36h；透析完成后，将最外层透析袋之外、容器内的组分抛弃，剩余的四个组分分子量范围分别为1000Da以上、800～1000Da、500～800Da、200～500Da。

用MTT法分别检测除分子量最小的组分之外的每个组分的过敏原含量，各组分在570nm处的吸光值A(570nm)按分子量从大到小排列依次为0.44、1.08、1.84、0.81。将吸光值最大的组分即500～800Da的组分抛弃，将其他三个组分合并，得低致敏性脱腥南极磷虾肽。

需要注意的是，如果吸光值最大的组分与相邻组分吸光值接近，说明各个透析袋的截留分子量安排不合理，需要重新设置。

实施例2

一种低致敏性脱腥南极磷虾肽的制备方法，步骤如下：

(1)酶解：将南极磷虾破碎，与水按照质量比1：8比例混合均匀，调节pH值至6.0，加入以总反应体系质量计6.0wt％胃蛋白酶，50℃下酶解0.5h，升温至95℃保持5min灭酶；反应体系冷却至30℃以下后离心，离心后收集清液，去除残渣，得粗酶解液。

(2)超滤与闪蒸串联一步浓缩：将超滤装置与超高温闪蒸装置串联，将步骤(1)收集的粗酶解液通入100L/h的大通量超滤装置，膜孔径为10nm，操作压力差为500kPa，，闪蒸温度100℃，闪蒸时间100s，收集闪蒸浓缩液。

(3)膜分级：使用实施例1中的多层定向透析装置；多层定向透析装置中的透析袋由内至外的截留分子量分别为800Da，500Da，300Da，100Da；将步骤(2)获得的浓缩液导入所述多层定向透析装置的最内层透析袋，透析容器中可加入适量超纯水；透析温度为4℃，透析时间为48h；透析完成后，将最外层透析袋之外、容器内的组分抛弃，剩余的四个组分分子量范围分别为800Da以上、500～800Da、300～500Da、100～300Da。

用MTT法分别检测除分子量最小的组分之外的每个组分的过敏原含量，各组分在570nm处的吸光值A(570nm)按分子量从大到小排列依次为0.53、0.49、0.97、1.38。将吸光值最大的组分即100～300Da的组分抛弃，将其他三个组分合并，得低致敏性脱腥南极磷虾肽。

需要注意的是，如果吸光值最大的组分与相邻组分吸光值接近，说明各个透析袋的截留分子量安排不合理，需要重新设置。

实施例3

一种低致敏性脱腥南极磷虾肽的制备方法，步骤如下：

(1)酶解：将南极磷虾破碎，与水按照质量比1：2比例混合均匀，调节pH值至2.0，加入以总反应体系质量计1.0wt％胃蛋白酶，30℃下酶解2h，升温至85℃保持20min灭酶；反应体系冷却至30℃以下后离心，离心后收集清液，去除残渣，得粗酶解液。

(2)超滤与闪蒸串联一步浓缩：将超滤装置与超高温闪蒸装置串联，将步骤(1)收集的粗酶解液通入50L/h的大通量超滤装置，膜孔径为5000nm，操作压力差为50kPa，闪蒸温度200℃，闪蒸时间10s，收集闪蒸浓缩液。

(3)膜分级：使用实施例1中的多层定向透析装置；多层定向透析装置中的透析袋由内至外的截留分子量分别为2500Da，1800Da，1200Da，800Da；将步骤(2)获得的浓缩液导入所述多层定向透析装置的最内层透析袋，透析容器中可加入适量超纯水；透析温度为15℃，透析时间为12h；透析完成后，将最外层透析袋之外、容器内的组分抛弃，剩余的四个组分分子量范围分别为2500Da以上、1800～2500Da、1200～1800Da、800～1200Da。

用MTT法分别检测除分子量最小的组分之外的每个组分的过敏原含量，各组分在570nm处的吸光值A(570nm)按分子量从大到小排列依次为0.37、1.25、0.64、0.68。将吸光值最大的组分即1800～2500Da的组分抛弃，将其他三个组分合并，得低致敏性脱腥南极磷虾肽。

需要注意的是，如果吸光值最大的组分与相邻组分吸光值接近，说明各个透析袋的截留分子量安排不合理，需要重新设置。

实施例4

一种低致敏性脱腥南极磷虾肽的制备方法，步骤如下：

(1)酶解：将南极磷虾破碎，与水按照质量比1：5比例混合均匀，调节pH值至4.5，加入以总反应体系质量计1.5wt％胃蛋白酶，42℃下酶解1h，升温至90℃保持10min灭酶；反应体系冷却至30℃以下后离心，离心后收集清液，去除残渣，得粗酶解液。

(2)超滤与闪蒸串联一步浓缩：将超滤装置与超高温闪蒸装置串联，将步骤(1)收集的粗酶解液通入100L/h的大通量超滤装置，膜孔径为300nm，操作压力差为200kPa，，闪蒸温度160℃，闪蒸时间60s，收集闪蒸浓缩液。

(3)膜分级：多层定向透析装置中的透析袋由内至外的截留分子量分别为1500Da，1200Da，900Da，600Da；将步骤(2)获得的浓缩液导入所述多层定向透析装置的最内层透析袋，透析容器中可加入适量超纯水；透析温度为10℃，透析时间为36h；透析完成后，将最外层透析袋之外、容器内的组分抛弃，剩余的四个组分分子量范围分别为1500Da以上、1200～1500Da、900～1200Da、600～900Da。

用MTT法分别检测除分子量最小的组分之外的每个组分的过敏原含量，各组分在570nm处的吸光值A(570nm)按分子量从大到小排列依次为0.32、0.85、1.42、0.71。将吸光值最大的组分即500～800Da的组分抛弃，将其他三个组分合并，得低致敏性脱腥南极磷虾肽。

需要注意的是，如果吸光值最大的组分与相邻组分吸光值接近，说明各个透析袋的截留分子量安排不合理，需要重新设置。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。