一种穿心莲的组织培养方法

文档序号：1436638 发布日期：2020-03-24 浏览：5次 >En<

阅读说明：本技术 一种穿心莲的组织培养方法 (Tissue culture method of andrographis paniculata ) 是由李东兴吴杰于 2019-11-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种穿心莲的组织培养方法,包括以下步骤：S1外植体处理：采集穿心莲完整腋芽作为外植体,消毒杀菌备用；S2愈伤组织培养：将腋芽放入愈伤组织培养基中,首先暗培养,随后光培养；S3诱芽培养：光培养7-10天即可；4增殖培养：将获得的幼芽转入继代增殖培养基中继续光培养；S5生根培养：转到生根培养基上光培养3-5天；S6炼苗：将生根后的幼苗放在营养液内,光培养15-20天；其中：所述生根培养基配方为：1/3MS：+0.1-0.12 mg/L的NAA、+0.08-0.12 mg/L的BR<Sub>1</Sub>、+0.06-0.08 mg/L的青霉素、+20 g/L的蔗糖和+6.5g/L的琼脂,pH5.8-6.0。本发明的培养方法具有使得穿心莲植物组织培养的发芽率、生根率以及成活率高的优点。(The invention discloses a tissue culture method of andrographis paniculata, which comprises the following steps: s1 explant treatment: collecting complete axillary buds of Andrographis paniculata Nees as explants, and sterilizing for later use; s2 callus culture: putting axillary buds into a callus culture medium, and performing dark culture and then light culture; s3 induced bud culture: culturing in light for 7-10 days; 4, propagation culture: transferring the obtained plumule into subculture multiplication culture medium for continuous light culture; s5 rooting culture: transferring to rooting culture medium, and culturing for 3-5 days; s6 seedling hardening: placing the rooted seedlings in a nutrient solution, and performing light culture for 15-20 days; wherein: the rooting medium comprises the following components in parts by weight: 1/3 MS: +0.1-0.12mg/L NAA, +0.08-0.12mg/L BR 1 +0.06-0.08mg/L penicillin, +20g/L sucrose and +6.5g/L agar, pH 5.8-6.0. The culture method of the invention has the advantages of high germination rate, rooting rate and survival rate of the tissue culture of the andrographis paniculata plant.)

一种穿心莲的组织培养方法

技术领域

本发明涉及中草药培养的技术领域，更具体地说，它涉及一种穿心莲的组织培养方法。

背景技术

穿心莲(Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees)，是一年生草本植物，属于药用植物，有清热解毒、消炎、消肿止痛作用。穿心莲喜高温湿润气候，喜阳光充足、喜肥。种子发芽和幼苗生长期适温为25-30℃，气温下降到15-20℃时生长缓慢，气温降至8℃左右，生长停滞；遇0℃左右低温或霜冻，植株全部枯萎。以肥沃、疏松、排水良好的酸性和中性砂壤土栽培为宜，pH8.0的碱性土仍能正常生长。传统穿心莲要长5-6月，育苗时间长，生长周期长。

穿心莲传统的育种方法是以种子播种繁殖，由于种子皮硬，因此发芽所需时间较长，且出苗参差不齐。利用植物组织培养技术进行繁殖，可以克服传统的繁殖缺点。目前对于植物组织培养中，常以MS培养基为基础培养基并添加相应的植物激素来进行种子萌发诱导、愈伤组织培养、诱芽培养以及生根培养等，使得获得更高的发芽率、生根率以及存活率。

对于植物激素的选择，目前用于穿心莲组织培养最多的是6-苯甲基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)、萘乙酸(1-naphthylacetic acid，NAA)、吲哚丁酸(IBA)、激动素(KT)、2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)。但是在将上述的植物激素用于穿心莲的植物组织培养时，最终诱导发芽率为60-85％，移栽后成活率仅为45-86％，相对较低。

因此开展高发芽率、生根率、成活率以及短周期的培育方法研究是十分必要的，也是市场的迫切需求。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种穿心莲的组织培养方法，其具有使得穿心莲植物组织培养的发芽率、生根率以及成活率高的优点。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种穿心莲的组织培养方法，包括以下步骤：

S1外植体处理：采集无菌的穿心莲完整腋芽作为外植体，消毒杀菌之后用无菌水冲洗，随后自然风干，备用；

S2愈伤组织培养：在无菌环境下，将腋芽放入愈伤组织培养基中培养，首先暗培养，随后光培养，获得愈伤组织；

S3诱芽培养：无菌环境下，在愈伤组织培养基中以23-25℃的温度、3200-3400lux的光照强度培养7-10天；

S4增殖培养：将S3中诱芽培养中获得的幼芽转入到继代增殖培养基中继续培养，培养环境为：温度23-25℃，光照强度3200-3500lux，光照时间为10-12h/天，培养时间为10-15天，待无根苗的叶片颜色开始变化时结束；

S5生根培养：转到生根培养基上进行生根培养，培养条件：温度21-25℃，光照强度4500-6000lux，培养3-5天，待98-100％的幼苗根长>2mm时结束；

S6炼苗：将生根后的幼苗连同纸环一起放在种植绵上，将种植棉放在育苗盘里，同时育苗盘里放上5-10mm的营养液，定期补水，在温度25℃下暗培养3-5天，随后在22-25℃的温度、8000-15000lux的光强下光培养15-20天；

其中：所述生根培养基配方为：1/3MS：+0.1-0.12mg/L的NAA、+0.08-0.12mg/L的BR₁、+0.06-0.08mg/L的青霉素、+20g/L的蔗糖和+6.5g/L的琼脂，pH5.8-6.0。

通过采用上述技术方案，通过对穿心莲植物组织培养过程中外植体处理、愈伤组织培养、诱芽培养、增殖培养以及生根培养等过程的条件参数的逐步优化，在采用的培养方式进行逐步确认，并对相应的培养基的配方进行优化确认，在生根培养基中以青霉素和生长素之间的配合使用，共同促进穿心莲的生根，使得其后期能够获得更高的存活率。

进一步地，所述愈伤组织培养基的配方为：MS：+0.12-0.16mg/L的BR₅、+1.8-2.0mg/L的IBA、+0.08-0.10mg/L的青霉素、+16g/L的蔗糖、+6g/L的琼脂，pH5.8-6.0。

通过采用上述技术方案，上述愈伤组织的培养基中加入IBA、BR₅和青霉素，使得三者以一定剂量加入到培养基中，再配合以愈伤组织培养的外部条件，使得愈伤组织的成型率更高；同时，上述的愈伤组织培养基配合以诱芽条件，使得植株的发芽率更高，进而更有利于后期的增殖和生根过程。

进一步地，所述的继代增殖培养基配方为：MS：+0.12-0.16mg/L的BR₅、+0.1-0.14mg/L的NAA、+0.08-0.10mg/L的青霉素、+16g/L的蔗糖和+6g/L的琼脂，pH5.8-6.0。

通过采用上述技术方案，在上述继代增殖培养基中加入NAA、BR₅和青霉素，使得三者以一定剂量加入到培养基中，再配合以继代增殖培养的外部条件，使得增殖后植株的性能稳定，进而更有利于后期的生根过程，使得穿心莲最终的成活率更高。

进一步地，炼苗时营养液的配方为：硝酸钙200-250mg/L、硝酸钾250-300mg/L、黄腐酸钾200-250mg/L、硫酸镁160-200mg/L、硫酸锌30-60mg/L、硫酸锰20-30mg/L、磷酸二氢钾80-90mg/L、硫酸铜1-3mg/L、NaFeEDTA 3-5mg/L。

通过采用上述技术方案，有利于穿心莲幼苗的生长，使之成活率更高。

进一步地，所述步骤S2的具体操作为：在无菌环境下，将腋芽放入愈伤组织培养基中，在25±1℃的温度下暗培养3-5天，随后在22-25℃的温度、800-1200lux的光强下光培养7-10天。

通过采用上述技术方案，由于采用上述的暗培养和光培养方式相结合的方式进行培养，使得穿心莲的芽胚进行愈伤组织培养的过程中，穿心莲愈伤组织的愈伤组织分化率更高。

进一步地，所述诱芽培养和增殖培养的过程中保证培养环境中的湿度为65-85％。

通过采用上述技术方案，避免在培养过程中植株的根部较为湿润，进而保证植株更好的生长。

进一步地，所述步骤S1中的消毒杀菌的步骤为：将采集得到的外植体，用75％的酒精消毒30s，随后用30ppm的次氯酸浸泡8min，然后用无菌水冲洗3次即可。

通过采用上述技术方案，有效避免外植体被细菌污染，进而保证后期步骤的正常进行，不影响后期的愈伤组织培养、增殖培养以及生根培养等。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

第一、由于本发明采用植物组织培养的方式进行穿心莲幼苗的培育，并对培育过程中的生根培养基的成分进行优化，添加青霉素和植物生长调节素，使得获得的植株生根率高，而较高的生根率使得穿心莲对培养基中、种植棉中以及移植之后的土壤中的营养物质的吸收更加高效，物质交换更高效，进而促使最终的植株幼苗在移植之后成活率高。

第二、本发明中优选采用在愈伤组织培养基和继代增殖培养基中添加青霉素，优化确认青霉素和植物生长调节素之间的用量，使得愈伤组织培养基适合愈伤组织的成型，继代增殖培养基利于植株的增殖。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。

其中，NAA(1-naphthylacetic acid)为萘乙酸，IBA为吲哚丁酸，BR₁为油菜素内酯(brassinolide，BL)，BR₅为6-脱氧油菜素甾醇(6-deoxocastasterone)，BR₈为茶甾酮(teasterone，TE)。

实施例

实施例1

一种穿心莲的组织培养方法，包括以下步骤：

S1外植体处理：采集无菌的穿心莲完整腋芽作为外植体，用75％的酒精消毒15s，随后用30ppm的次氯酸浸泡5min，然后用无菌水冲洗2次，自然风干后备用；

S2愈伤组织培养：在无菌环境下，将腋芽放入愈伤组织培养基中培养，在25±1℃的温度下暗培养3天，随后在22℃的温度、800lux的光强下光培养7天，获得愈伤组织；

S3诱芽培养：无菌环境下，在愈伤组织培养基中以23℃的温度、3200lux的光照强度培养7天，期间保证室内的湿度为65％；

S4增殖培养：将S3中诱芽培养中获得的幼芽转入到继代增殖培养基中继续培养，培养环境为：温度23℃，光照强度3200lux，光照时间为10h/天，培养时间为10天，期间保证室内的湿度为65％，待无根苗的叶片颜色开始变化时结束；

S5生根培养：转到生根培养基上进行生根培养，培养条件：温度23±2℃，光照强度4500lux；培养3天，待98-100％的幼苗根长>2mm时结束；

S6炼苗：将生根后的幼苗连同纸环一起放在种植绵上，将种植棉放在育苗盘里，同时育苗盘里放上5mm的营养液，定期补水，在温度25±1℃下暗培养3-5天，随后在22℃的温度、8000lux的光强下光培养15天；

其中：

愈伤组织培养基的配方为：MS：+0.12mg/L的BR₅、+1.8mg/L的IBA、+0.08mg/L的青霉素、+16g/L的蔗糖、+6g/L的琼脂，pH5.8-6.0。按上述的配方将BR₅、IBA、青霉素、以及蔗糖分别加入去离子水中，随后加入琼脂后搅拌均匀，灭菌后冷却即可。

继代增殖培养基配方为：MS：+0.12mg/L的BR₅、+0.1mg/L的NAA、+0.08mg/L的青霉素、+16g/L的蔗糖和+6g/L的琼脂，pH5.8-6.0。按上述的配方将BR₅、NAA、青霉素、以及蔗糖分别加入去离子水中，随后加入琼脂后搅拌均匀，灭菌后冷却即可。

生根培养基配方为：1/3MS：+0.1mg/L的NAA、+0.08mg/L的BR₁、+0.06mg/L的青霉素、+20g/L的蔗糖和+6.5g/L的琼脂，pH5.8-6.0。按上述的配方将BR₁、NAA、青霉素、以及蔗糖分别加入去离子水中，随后加入琼脂后搅拌均匀，灭菌后冷却即可。

炼苗时营养液的配方为：硝酸钙200mg/L、硝酸钾250mg/L、黄腐酸钾200mg/L、硫酸镁160mg/L、硫酸锌30mg/L、硫酸锰20mg/L、磷酸二氢钾80mg/L、硫酸铜1mg/L、NaFeEDTA3mg/L。

上述的试剂均为市售，其中，黄腐酸钾购自金伯升，型号为01；青霉素的CAS号为61-33-6，购自上海诺泰化工有限公司；MS培养基购自北京酷来搏科技有限公司，型号为PM1013-1KG；1/3MS培养基购自北京酷来搏科技有限公司，型号为PM1181-500G；NAA(萘乙酸)的CAS号为86-87-3，均购自湖北远成赛创科技有限公司；IBA(吲哚丁酸)的CAS号为133-32-4，BR₁(油菜素内酯)的CAS号为72962-43-7，均购自上海源叶生物科技有限公司；24-表油素内酯(Epibrassinolide)的CAS号为78821-43-9，购自中科瑞泰；BR₅(6-脱氧油菜素甾酮)的CAS号为690627-49-7；高香蒲甾醇的(28-Homoteasterone)的CAS号为90524-90-6；BR₈为茶甾酮(teasterone，TE)的CAS号为92751-21-8。

实施例2

一种穿心莲的组织培养方法，包括以下步骤：

S1外植体处理：采集无菌的穿心莲完整腋芽作为外植体，用75％的酒精消毒45s，随后用30ppm的次氯酸浸泡10min，然后用无菌水冲洗3次，自然风干后备用；

S2愈伤组织培养：在无菌环境下，将腋芽放入愈伤组织培养基中培养，在25±1℃的温度下暗培养5天，随后在25℃的温度、1200lux的光强下光培养10天，获得愈伤组织；

S3诱芽培养：无菌环境下，在愈伤组织培养基中以25℃的温度、3400lux的光照强度培养10天，期间保证培养环境中的湿度为85％；

S4增殖培养：将S3中诱芽培养中获得的幼芽转入到继代增殖培养基中继续培养，培养环境为：温度25℃，光照强度3500lux，光照时间为12h/天，培养时间为15天，保证这期间的外环境湿度为85％，待无根苗的叶片颜色开始变化时结束；

S5生根培养：转到生根培养基上进行生根培养，培养条件：温度23±2℃，光照强度6000lux；培养5天，待98-100％的幼苗根长>2mm时结束；

S6炼苗：将生根后的幼苗连同纸环一起放在种植绵上，将种植棉放在育苗盘里，同时育苗盘里放上10mm的营养液，定期补水，在温度25±1℃下暗培养5天，随后在25℃的温度、15000lux的光强下光培养20天；

其中：

愈伤组织培养基的配方为：MS：+0.16mg/L的BR5、+2.0mg/L的IBA、+0.10mg/L的青霉素、+16g/L的蔗糖、+6g/L的琼脂，pH5.8-6.0。

继代增殖培养基配方为：MS：+0.16mg/L的BR5、+0.14mg/L的NAA、+0.10mg/L的青霉素、+16g/L的蔗糖和+6g/L的琼脂，pH5.8-6.0。

生根培养基配方为：1/3MS：+0.12mg/L的NAA、+0.12mg/L的BR₁、+0.08mg/L的青霉素、+20g/L的蔗糖和+6.5g/L的琼脂，pH5.8-6.0。

炼苗时营养液的配方为：硝酸钙250mg/L、硝酸钾300mg/L、黄腐酸钾250mg/L、硫酸镁200mg/L、硫酸锌60mg/L、硫酸锰30mg/L、磷酸二氢钾90mg/L、硫酸铜3mg/L、NaFeEDTA5mg/L。

实施例3

一种穿心莲的组织培养方法，包括以下步骤：

S1外植体处理：采集无菌的穿心莲完整腋芽作为外植体，用75％的酒精消毒30s，随后用30ppm的次氯酸浸泡8min，然后用无菌水冲洗3次，自然风干后备用；

S2愈伤组织培养：在无菌环境下，将腋芽放入愈伤组织培养基中培养，在25±1℃的温度下暗培养4天，随后在23℃的温度、1000lux的光强下光培养9天，获得愈伤组织；

S3诱芽培养：无菌环境下，在愈伤组织培养基中以24℃的温度、3300lux的光照强度培养9天，保证外环境的湿度为75％，生成较多腋芽并开始长出幼嫩叶片时结束；

S4增殖培养：将S3中诱芽培养中获得的幼芽转入到继代增殖培养基中继续培养，培养环境为：温度24℃，光照强度3300lux，光照时间为11h/天，培养时间为12天，这期间保证外环境的湿度为75％，待无根苗的叶片颜色开始变化时结束；

S5生根培养：转到生根培养基上进行生根培养，培养条件：温度23±2℃，光照强度5200lux；培养4天，待98-100％的幼苗根长>2mm时结束；

S6炼苗：将生根后的幼苗连同纸环一起放在种植绵上，将种植棉放在育苗盘里，同时育苗盘里放上8mm的营养液，定期补水，在温度25±1℃下暗培养3-5天，随后在24℃的温度、12000lux的光强下光培养18天；

其中：

愈伤组织培养基的配方为：MS：+0.14mg/L的BR₅、+1.9mg/L的IBA、+0.09mg/L的青霉素、+16g/L的蔗糖、+6g/L的琼脂，pH5.8-6.0。

继代增殖培养基配方为：MS：+0.14mg/L的BR₅、+0.12mg/L的NAA、+0.09mg/L的青霉素、+16g/L的蔗糖和+6g/L的琼脂，pH5.8-6.0。

生根培养基配方为：1/3MS：+0.11mg/L的NAA、+0.10mg/L的BR₁、+0.07mg/L的青霉素、+20g/L的蔗糖和+6.5g/L的琼脂，pH5.8-6.0。

炼苗时营养液的配方为：硝酸钙230mg/L、硝酸钾230mg/L、黄腐酸钾230mg/L、硫酸镁180mg/L、硫酸锌45mg/L、硫酸锰25mg/L、磷酸二氢钾85mg/L、硫酸铜2mg/L、NaFeEDTA4mg/L。

实施例4-6

实施例4-6与实施例3的区别在于愈伤组织培养的光培养时间不同，其它同实施例3，具体见表1。

实施例7-8

实施例7-8与实施例5的区别在于愈伤组织培养的光培养强度不同，其它同实施例5，具体见表1。

实施例9-12

实施例9-12与实施例5的区别在于诱芽培养的光强度或培养时间不同，其它同实施例5，具体见表1。

实施例13-14

实施例13-14与实施例11的区别在于生根培养的培养时间不同，其它同实施例11，具体见表1。

实施例15-19

实施例15-19与实施例11的区别在于炼苗培养的培养时间或光强不同，其它同实施例11，具体见表1。

实施例20-23

实施例20-23与实施例16的区别在于愈伤组织培养基的青霉素或BR₅的用量不同，其它同实施例16，具体见表1。

实施例24-27

实施例24-27与实施例18的区别在于继代增殖培养基的青霉素或BR₅的用量不同，其它同实施例16，具体见表1。

实施例28-31

实施例28-31与实施例16的区别在于生根培养基的青霉素或BR₁的用量不同，其它同实施例16，具体见表1。

表1不同实施例的不同实施条件表

对比例

对比例1

对比例1与实施例16的区别在于：

愈伤组织的培养过程为：在无菌环境下，将腋芽放入愈伤组织培养基中培养，在23℃的温度、1000lux的光强下光培养13天，获得愈伤组织，其它同实施例18。

对比例2-5

对比例2-5与实施例16的区别在于愈伤组织培养的光培养时间或强度不同，其它同实施例18，具体见表2。

对比例6-9

对比例6-9与实施例16的区别在于诱芽培养的培养时间或光强度不同，其它同实施例18，具体见表2。

对比例10-11

对比例10-11与实施例16的区别在于生根培养的培养时间不同，其它同实施例18，具体见表2。

对比例12-15

对比例12-15与实施例16的区别在于炼苗培养的培养时间或光强不同，其它同实施例18，具体见表2。

对比例16

对比例16与实施例16的区别在于愈伤组织培养基中以等量的链霉素替代青霉素，其它同实施例18。

对比例17

对比例17与实施例16的区别在于愈伤组织培养基中不添加青霉素，其它同实施例18。

对比例18

对比例18与实施例16的区别在于愈伤组织培养基中以0.11mg/L的NAA替代1.9mg/L的IBA，其它同实施例18。

对比例19

对比例19与实施例16的区别在于愈伤组织培养基中不添加BR₅，其它同实施例18。

对比例20

对比例20与实施例16的区别在于愈伤组织培养基中以等量的BR₁替代BR₅，其它同实施例18。

对比例21

对比例21与实施例16的区别在于继代增殖培养基中以等量的链霉素替代青霉素，其它同实施例18。

对比例22

对比例22与实施例16的区别在于继代增殖培养基中不添加青霉素，其它同实施例18。

对比例23

对比例23与实施例16的区别在于继代增殖培养基中不添加BR₅，其它同实施例18。

对比例24

对比例24与实施例16的区别在于继代增殖培养基中以等量的BR₁替代BR₅，其它同实施例18。

对比例25

对比例25与实施例16的区别在于继代增殖培养基中以等量的24-表油素内酯替代BR₅，其它同实施例18。

对比例26

对比例26与实施例16的区别在于继代增殖培养基中以等量的高香蒲甾醇替代BR₅，其它同实施例18。

对比例27

对比例27与实施例16的区别在于继代增殖培养基中以等量的BR₈替代BR₅，其它同实施例18。

对比例28

对比例28与实施例16的区别在于生根培养基中以等量的链霉素替代青霉素，其它同实施例18。

对比例29

对比例29与实施例16的区别在于生根培养基中不添加青霉素，其它同实施例18。

对比例30

对比例30与实施例16的区别在于生根培养基中不添加BR₁，其它同实施例18。

对比例31

对比例31与实施例16的区别在于生根培养基中以等量的BR₅替代BR₁，其它同实施例18。

对比例32

对比例32与实施例16的区别在于生根培养基中以等量的24-表油素内酯替代BR₁，其它同实施例18。

对比例33

对比例33与实施例16的区别在于生根培养基中以等量的高香蒲甾醇替代BR₁，其它同实施例18。

对比例34

对比例34与实施例16的区别在于生根培养基中以等量的BR₈替代BR₁，其它同实施例18。

表2不同对比例的不同实施条件表

性能检测试验

(一)愈伤组织形成率

对实施例1-8、实施例20-23、对比例1-5以及对比例16-20的愈伤组织的成型率进行检测计算，具体结果见表3。

愈伤组织成型率(％)＝形成愈伤组织的腋芽数/初始腋芽数×100％。

表3不同实施例和对比例的愈伤组织成型率的统计结果表

通过对比表3中实施例1-8以及对比例2-5的结果，表明穿心莲愈伤组织培养的外界条件：光培养时间以及光强度对愈伤组织的形成具有一定的影响，愈伤组织的较优培养条件是光培养时间为8天，光强为1000lux。通过对比对比例1和实施例5，说明穿心莲愈伤组织的培养按照首先暗培养，随后光培养的培养模式有利于穿心莲愈伤组织的形成。

对比实施例20-23以及对比例16-20结果，愈伤组织培养基中青霉素的添加有利于穿心莲植物组织培养，但是以其它的物质：链霉素替代或者不添加青霉素，穿心莲愈伤组织的形成率均会降低，且对于穿心莲愈伤组织培养中，愈伤组织培养基的配方是比较重要的；在上述进行的所有实施方式中，当在MS培养基中添加+0.14mg/L的BR₅、+1.9mg/L的IBA、+0.09mg/L的青霉素时，穿心莲愈伤组织成型率最佳。

(二)诱导发芽率

对实施例5、实施例9-12、实施例20-23、对比例1-9以及对比例16-20的诱导发芽率进行检测计算，具体结果见表4。

诱导发芽率(％)＝发芽的腋芽数/形成愈伤组织的腋芽数×100％。

表4不同实施例和对比例的诱导发芽率的统计结果表

通过对比表3中实施例5、实施例9-12以及对比例6-9的结果，表明穿心莲诱芽培养受到光培养时间以及光强度的影响，诱芽培养的较优培养条件是光培养时间为9天，光强为3300lux。

对比实施例20-23以及对比例16-20的结果，诱芽培养基中青霉素的添加有利于穿心莲植物组织培养中愈伤组织的生成腋芽和长出幼嫩叶片，但是以其它的物质：链霉素替代或者不添加青霉素，穿心莲愈伤组织的出芽率均会降低，且对于穿心莲诱芽培养中，愈伤组织培养基的配方是比较重要的；在上述进行的所有实施方式中，当在MS培养基中添加+0.14mg/L的BR₅、+1.9mg/L的IBA、+0.09mg/L的青霉素时，穿心莲出芽率较佳。

(三)诱导生根率

对实施例11、实施例13-14、实施例24-31、对比例10-11以及对比例21-34的诱导生根率进行检测计算，具体结果见表5。

诱导生根率(％)＝生根苗数量/初始无根苗数量×100％。

表5不同实施例和对比例的诱导生根率的统计结果表