阅读说明：本技术 一种藿香组织培养快速繁殖及育苗方法 (Tissue culture rapid propagation and seedling raising method for agastache rugosus ) 是由 张桂琴 谢佳秀 陆忠诚 林玉宁 黄森梅 于 2019-12-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种霍香组织培养快速繁殖及育苗方法,选取霍香树枝条芽尖或叶片作繁殖的外植体,用分化培养基培养,培育成原球细胞团并形成小植株,将诱导出的小植株切割后接入新的分化培养基中,采用分化培养基多次继代,再将无菌分化获得的小植株接种到特制的壮苗培养基上进行壮苗培养,最后进行袋装苗移栽。本发明采用独创的培养基成分,定向聚丙烯薄膜袋作为培养皿器。脱除多种植物病毒,避免病毒引起的品种退化和减产造成的损失,使原优良种性得到保持,种苗品质好,栽种成活率高。操作性强,应用价值高,独创性,为霍香种苗繁殖开辟了一条新的快速繁殖,投产快的途径。(The invention discloses a tissue culture rapid propagation and seedling raising method for ageratum, which comprises the steps of selecting ageratum branch bud tips or leaves as explants for propagation, culturing the explants by using a differentiation culture medium to culture protosphere cell clusters and form plantlets, cutting the induced plantlets, inoculating the cut plantlets into a new differentiation culture medium, carrying out multiple subcultures by using the differentiation culture medium, inoculating the plantlets obtained by aseptic differentiation into a special seedling strengthening culture medium for strong seedling culture, and finally carrying out bagged seedling transplantation. The invention adopts original culture medium components and adopts an oriented polypropylene film bag as a culture dish device. The method removes various plant viruses, avoids the loss caused by variety degradation and yield reduction caused by the viruses, keeps the original excellent properties, and has good seedling quality and high planting survival rate. Strong operability, high application value and originality, and opens up a new way for breeding seedlings of ageratum with fast breeding and high production speed.)

一种藿香组织培养快速繁殖及育苗方法

技术领域

本发明涉及一种药材种苗繁育方法，具体地说，涉及一种藿香的快速繁殖及育苗方法。

背景技术

藿香（学名：Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) O. Ktze. ）多年生草本。茎直立，高0.5-1.5米，四棱形，粗达7-8毫米，上部极短的细毛，下部无毛，在上部具能育的分枝。叶心状卵形至长圆状披针形，长4.5-11厘米，宽3-6.5厘米，向上渐小，先端尾状长渐尖，基部心形，稀截形，边缘具粗齿，纸质，上面橄榄绿色，近无毛，下面略淡，被微柔毛及点状腺体；叶柄长1.5-3.5厘米。轮伞花序多花，在主茎或侧枝上组成顶生密集的圆筒形穗状花序，穗状花序长2.5-12厘米，直径1.8-2.5厘米；花序基部的苞叶长不超过5毫米，宽约1-2毫米，披针状线形，长渐尖，苞片形状与之相似，较小，长约2-3毫米；轮伞花序具短梗，总梗长约3毫米，被腺微柔毛。花萼管状倒圆锥形，长约6毫米，宽约2毫米，被腺微柔毛及黄色小腺体，多少染成浅紫色或***，喉部微斜，萼齿三角状披针形，后3齿长约2.2毫米，前2齿稍短。花冠淡紫蓝色，长约8毫米，外被微柔毛，冠筒基部宽约1.2毫米，微超出于萼，向上渐宽，至喉部宽约3毫米，冠檐二唇形，上唇直伸，先端微缺，下唇3裂，中裂片较宽大，长约2毫米，宽约3.5毫米，平展，边缘波状，基部宽，侧裂片半圆形。雄蕊伸出花冠，花丝细，扁平，无毛。花柱与雄蕊近等长，丝状，先端相等的2裂。花盘厚环状。子房裂片顶部具绒毛。成熟小坚果卵状长圆形，长约1.8毫米，宽约1.1毫米，腹面具棱，先端具短硬毛，褐色。花期6-9月，果期9-11月。地理分布：中国各地广泛分布，主产于四川、江苏、浙江、湖南、广东等地，俄罗斯、朝鲜、日本及北美洲有分布。对比文件1，申请号：CN201410039484，发明名称：一种广藿香快速生根育苗的方法，该方法包括采穗母株的选择、采穗、催根处理、扦插基质的配制、扦插和扦插后管理六个关键环节。本发明可使广藿香扦插苗提早生根，快速生根，扦插成活率高达99%以上，成苗仅需15天，且一年四季均可扦插育苗。对比文件1与本发明不相同。

藿香功能主治：芳香化湿，和胃止呕，祛暑解表。主湿阻中焦之脘腹痞闵，食欲不振，呕吐，泄泻，外感暑湿之寒热头痛，湿温初起的发热身困，胸闵恶心，鼻渊，手足癣。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过组织培养技术可以脱除多种植物病毒，避

免病毒引起的品种退化和减产造成的损失，使原来的优良种性得到保持；繁殖快且量大、成苗快、种苗品质好、移栽成活率高的藿香种苗繁殖方法。

本发明人通过选定的藿香芽苞和叶片作为外植体，经消毒去掉杂质，将芽尖组织和叶片放在分化培养基上进行无菌培育成小植株，将诱导出的小植株切割后接入新的分化培养基中，多次继代采用分化培养，结果丛生芽数量多，生长快。再转移到壮苗培养基上培养，形成袋装苗，经过自然光照下炼苗后出袋栽培，移栽到营养杯中育中苗，成活率达到98%以上。经三年摸索筛选，实现了利用培养基上培养出壮苗，找到适合细胞分化，壮苗的培养基作为发明点，从而实现了本发明。

本发明的实施方式是这样的：一种藿香组织培养快速繁殖的方法，其特征在于采用藿香芽苞和叶片作为外植体，消毒，配制分化培养基，壮苗培养基，接种，培养，其技术工艺步骤如下：

步骤（1），采外植体：选定藿香的嫩枝条剪下，连芽和叶片保湿保鲜釆集，选取芽苞和嫩叶放清水冲洗，然后用饱和洗衣粉水清洗，再用流动的清水漂洗2～5分钟；

步骤（2），无菌分化：把漂洗干净的藿香芽苞或嫩叶片作为外植体，在无菌接种室工作台上用72%～75%的酒精消毒10～15秒后，用无菌水冲洗2～5次后置于0.1%～0.2%的升汞中消毒3～15分钟，再用无菌水漂洗4～6次，去掉外表杂物。把所消毒的芽苞、叶片放到150倍以上的电子显微镜下，用解剖刀切割外表的杂物，清理外表杂物后取下最顶的芽尖0.2～0.25mm组织，用接种针接种到分化培养基上培养15～20天得到小植株，所述的分化培养基每升含硝酸钾15～35mg,硫酸镁1～6mg，磷酸二氢铵1～5mg，氯化钙0.5～3mg，硫酸锰10～15mg，硫酸锌0.1～2mg，铳酸铜0.05～0.5mg，氯化钴0.001～0.2mg，维生素B₁0.1～5mg，盐酸吡哆醇0.1～1mg，烟酸0.5～5mg，肌醇10～100mg，蔗糖15～45g，卡拉胶6～10g，生长素0.09～0.25mg，***素6BA0.1～0.3mg；

步骤（3），快速增殖：培养15～20天后，将诱导出的小植株切割成0.3～0.5mm后接入新的分化培养基中，多次继代采用分化培养基，在每次转袋过程中，不断淘汰白化苗和污染袋苗，剪除枯黄叶片，经3～5次转袋培养后，得到的小植株再进行壮苗培养；

步骤（4），壮苗培养：将无菌分化增殖获得的小植株接种到壮苗培养基上培养40～60天得到小苗，所述的壮苗培养基每升含蔗糖10～35g，卡拉胶6～10g，a-萘乙酸0.2～5.0mg，吲哚丁酸0.1～3mg，其余为步骤（2）培养基中的成分。

步骤（2）分化培养基每升含蔗糖25～30g，卡拉胶8g，生长素0.09～0.25mg，其余为步骤（2）培养基中的成分。

步骤（4）壮苗培养基每升含蔗糖30g，卡拉胶8g，a-萘乙酸0.8mg，其余为步骤（2）培养基中的成分。

步骤（2）～步骤（4）中所用的培养基pH为5～6，培养温度20～28℃，每天光照8～12小时，光照度800～2500Lx，芽尖为芽苞生长点0.1～0.5mm组织，叶片为顶尖叶片1/2处0.1～0.8mm组织，小植株的高度最好为1～3cm，小苗最好为苗高3～8cm，每株苗有2～8条根，无变异白化苗。

步骤（2）～步骤（4）中所用的培养基均分装入薄膜袋中，每袋30ml，分装好后密封、高温消毒15～25分钟，取出放在无菌室降温贮存，在无菌室的超净工作台上接上对应的外植体或小植株后，用封口机把接好种的培养基袋封口，再放到培养室培养，培养基分装的薄膜袋，均为OPP薄膜袋。

当小苗形成的植株长至3～8cm时，将培养袋苗转移到自然光下炼苗7～14天，然后将其从袋中取出，洗净根部的培养基，轻基质营养杯栽培，经1～2个月生长得到中苗，成为生产栽培的种苗。

中苗为苗高15cm以上，每株苗有分叉2～5条，有3～8条根以上，须根多，叶片厚浓绿，无病虫，无变异苗白化苗。

本发明与现有技术相比具有的优点是：国内外没有关于利用组培技术生产霍香种苗的专利和相关报道，只有实生苗和扦插育苗繁殖的应用。本发明采用独创的培养基，使用定向聚丙烯薄膜袋作培养器皿，降低成本，可以脱除多种植物病毒，避免病毒引起的品种退化和减产造成的损失，使原来的优良种性得到保持；繁殖快且量大、成苗快、种苗品质好、移栽成活率高，品种遗传物质变异小。本发明具有操作性强，应用价值高，环保，对环境无任何不良影响，具有独创性等特点。

具体实施方式

本发明的最佳实施例是这样的，以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1

步骤（1），采外植体：选用霍香的嫩枝条剪下，连芽和叶片保湿保鲜釆回，选取芽苞放清水冲洗，然后用洗衣粉水清洗，再用流动的清水漂洗。

步骤（2），无菌分化：把漂洗干净的霍香芽苞作为外植体，在无菌接种室工作台上用72%～75%的酒精消毒10～15秒后，用无菌水冲洗2～5次后置于0.1%～0.2%的升汞中消毒3～15分钟，再用无菌水漂洗4～6次，去掉外表杂物。把所消毒的芽苞放到150倍以上的电子显微镜下，用解剖刀切割外表的杂物，清理外表杂物后用接种针将芽尖0.2～0.25mm组织接种到分化培养基上培养得到小植株。所述的分化培养基每升含蔗糖25～30g、卡拉胶8g、生长素0.09～0.25mg、***素6BA0.1mg，其余为SH培养基中的成分。

步骤（3），壮苗培养：将无菌分化获得的小植株接种到壮苗培养基上培养得到小苗。所述的壮苗培养基每升含蔗糖20～25g、卡拉胶8g、a-萘乙酸0.5～3.0mg、吲哚丁酸0.3mg、生长素0.09～0.25mg，其余为SH培养基中的成分。

步骤（4），袋装苗移栽：当小苗形成的植株长至3～6厘米时，将培养袋苗转移到自然光下炼苗7～14天，然后将其从袋中取出，洗净根部的培养基，移至装有营养土的营养杯栽培，得到中苗，成为生产栽培的种苗。

在上述步骤（2）～步骤（3）各步骤中所用的培养基均为pH5.4～5.8，培养温度24～28℃，每天光照10～12小时，光照度1500～2000Lx。

步骤（1）所述的采外植体为当年霍香树嫩枝条的芽苞。

步骤（2）所述的芽尖为芽苞生长点。

步骤（2）所述的小植株的高度为1～2cm。

步骤（3）所述的小苗苗高为3～6cm，每株苗有3～5条根。

实施例2

步骤（1），采外植体：选用霍香的嫩枝条剪下，连芽和叶片保湿保鲜釆回，选取嫩叶放清水冲洗，然后用洗衣粉水清洗，再用流动的清水漂洗。

步骤（2），无菌分化：把漂洗干净的霍香嫩叶片作为外植体，在无菌接种室工作台上用72%～75%的酒精消毒10秒，用无菌水冲洗2～5次后，置于0.1%的升汞中消毒5～15分钟，再用无菌水漂洗4～6次。把所消毒的叶片放到150倍以上的电子显微镜下，用解剖刀切割嫩叶叶尖下1/2处0.3～0.5mm组织，接种到分化培养基上培养得到小植株。所述的分化培养基每升含椰子汁15ml、蔗糖22～30g、卡拉胶7～8g、肌醇100mg、甘氨酸2mg、烟酸0.5mg、吡哆辛盐酸0.4～1.5mg、生长素0.09～0.25mg、***素6BA0.2mg、其余为SH培养基中的1/2大量元素和微量元素成分。

步骤（3），壮苗培养：将无菌分化获得的小植株接种到壮苗培养基上培养得到小苗。所述的壮苗培养基每升含蔗糖20～25g、卡拉胶8g、a-萘乙酸0.5～3.0mg、肌醇40～100mg、盐酸硫胺4.5～12mg、甘氨酸1.5～4.0mg、烟酸1.0～2.5mg、吲哚丁酸0.2mg、吡哆辛盐酸0.4～1.5mg、生长素0.09～0.25mg，其余为SH培养基中的大量元素和1/2微量元素成分。

步骤（4），袋装苗移栽：当小苗形成的植株长至3～6厘米时，将培养袋苗转移到自然光下炼苗7～14天，然后将其从袋中取出，洗净根部的培养基，移至装有营养土的营养杯栽培，得到中苗，成为生产栽培的种苗。

在上述步骤（2）～步骤（3）各步骤中所用的培养基均为pH5.4～6.1，培养温度24～30℃，每天光照10小时，光照度1500～2000Lx。

步骤（1）所述的采外植体为当年霍香嫩枝条的叶片。

步骤（2）所述的叶片为顶尖叶片1/2处0.3～0.5mm组织。

步骤（2）所述的小植株的高度为1～2cm。

步骤（3）所述的小苗苗高为3～6cm，每株苗有3～5条根。

实施例3

步骤（1），采外植体：选用本地种植的霍香嫩枝条剪下，连芽和叶片保湿保鲜釆回，选取芽苞放清水冲洗，然后用洗衣粉水清洗，再用流动的清水漂洗。

步骤（2），无菌分化：把漂洗干净的霍香芽苞作为外植体，在无菌接种室工作台上用71%～76%的酒精消毒15秒后，用无菌水冲洗2～5次后置于0.2%的升汞中消毒7～15分钟，再用无菌水漂洗4～6次，去掉外表杂物。把所消毒的芽苞放到150倍以上的电子显微镜下，用解剖刀切割外表的杂物，清理外表杂物后用接种针将芽尖0.3mm组织接种到分化培养基上培养得到小植株。所述的分化培养基每升含椰子汁10ml、蔗糖25～30g、卡拉胶8g、生长素0.09～0.25mg、***素6BA0.1mg，其余为SH培养基中成分。

步骤（3），壮苗培养：将无菌分化获得的小植株接种到壮苗培养基上培养得到小苗。所述的壮苗培养基每升含蔗糖20～25g、卡拉胶8g、a-萘乙酸0.5～3.0mg、吲哚丁酸0.6mg、生长素0.09～0.25mg，其余为SH培养基中成分。

步骤（4），袋装苗移栽：当小苗形成的植株长至3～6厘米时，将培养袋苗转移到自然光下炼苗7～14天，然后将其从袋中取出，洗净根部的培养基，移至装有营养土的营养杯栽培，得到中苗，成为生产栽培的种苗。

在上述步骤（2）～步骤（3）各步骤中所用的培养基均为pH5.4～6.0，培养温度23～29℃，每天光照12小时，光照度1500～2000Lx。

步骤（1）所述的采外植体为当年霍香嫩枝条的芽苞。

步骤（2）所述的芽尖为芽苞生长点。

步骤（2）所述的小植株的高度为1～3cm。

步骤（3）所述的小苗苗高为3～6cm，每株苗有3～5条根。

实施例4

步骤（1），采外植体：选用广西玉林市陆川县种植的霍香嫩枝条剪下，连芽和叶片保湿保鲜釆回，选取芽苞放清水冲洗，然后用洗衣粉水清洗，再用流动的清水漂洗。

步骤（2），无菌分化：把漂洗干净的霍香芽苞作为外植体，在无菌接种室工作台上用72%～75%的酒精消毒10～15秒后，用无菌水冲洗2～5次后置于0.1%～0.2%的升汞中消毒3～15分钟，再用无菌水漂洗4～6次，去掉外表杂物。把所用消毒的芽苞、叶片放到150倍以上的电子显微镜下，用解剖刀切割外表的杂物，清理外表杂物后用接种针将芽尖0.2～0.25mm组织接种到分化培养基上培养得到小植株。所述的分化培养基每升含蔗糖25～30g、卡拉胶8g、生长素0.09～0.25mg、***素6BA0.1mg，其余为SH培养基中成分。

步骤（3），壮苗培养：将无菌分化获得的小植株接种到壮苗培养基上培养得到小苗。所述的壮苗培养基每升含蔗糖20～25g、卡拉胶8g、a-萘乙酸0.5～3.0mg、吲哚丁酸0.55mg、生长素0.1～0.35mg、苹果汁35g，其余为SH培养基中成分。

步骤（4），袋装苗移栽：当小苗形成的植株长至3～6厘米时，将培养袋苗转移到自然光下炼苗7～14天，然后将其从袋中取出，洗净根部的培养基，移至装有营养土的营养杯栽培，得到中苗，成为生产栽培的种苗。

在上述步骤（2）～步骤（3）各步骤中所用的培养基均为pH5.5～6.0，培养温度24～30℃，每天光照12小时，光照度1500～2200Lx。

步骤（1）所述的采外植体为当年霍香嫩枝条的芽苞。

步骤（2）所述的芽尖为芽苞生长点。

步骤（2）所述的小植株的高度为1～2cm。

步骤（3）所述的小苗苗高为3～6cm，每株苗有3-5条根。

实施例5

步骤（1），采外植体：选用霍香嫩枝条剪下，连芽和叶片保湿保鲜釆回，选取芽苞放清水冲洗，然后用洗衣粉水清洗，再用流动的清水漂洗。

步骤（2），无菌分化：把漂洗干净的油茶树芽苞作为外植体，在无菌接种室工作台上用72%～75%的酒精消毒10～15秒后，用无菌水冲洗2～5次后置于0.1%～0.2%的升汞中消毒3～15分钟，再用无菌水漂洗4～6次，去掉外表杂物。把所用消毒的芽苞、叶片放到150倍以上的电子显微镜下，用解剖刀切割外表的杂物，清理外表杂物后用接种针将芽尖0.2～0.25mm组织接种到分化培养基上培养得到小植株。所述的分化培养基每升含蔗糖25～30g、卡拉胶8g、生长素0.09～0.25mg、***素6BA0.1mg，其余为SH培养基成分。

步骤（3），快速增殖：培养15～20天后，将诱导出的小植株切割后接入新的分化培养基中，结果丛生芽数量多，生长快。多次继代采用分化培养基。在每次转袋过程中，应切除顶端优势，且丛生芽块不能切得太小，以免影响增殖速度。同时，应不断淘汰白化苗和污染袋苗，剪除枯黄叶片，经3次以上转袋后，增殖速度可达2.5～3倍。

步骤（4），壮苗培养：将培养增殖获得的小植株接种到壮苗培养基上培养得到小苗。所述的壮苗培养基每升含蔗糖20～25g、卡拉胶8g、a-萘乙酸0.5～3.0mg、吲哚丁酸0.3mg、生长素0.09～0.25mg、苹果汁10～15g，其余为SH培养基成分。

步骤（5），袋装苗移栽：当小苗形成的植株长至3～6厘米时，将培养袋苗转移到自然光下炼苗7～14天，然后将其从袋中取出，洗净根部的培养基，移至装有营养土的营养杯栽培，经2～4个月得到中苗，成为生产栽培的种苗。

在上述步骤（2）～步骤（3）各步骤中所用的培养基均pH5.4～5.8，培养温度24～28℃，每天光照10～12小时，光照度1500～2000Lx。

步骤（1）所述的采外植体为当年霍香嫩枝条的芽苞。

步骤（2）所述的芽尖为芽苞生长点。

步骤（2）所述的小植株的高度为1～2cm。

步骤（3）～步骤（4）所述的小苗苗高为3～6cm，每株苗有3～5条根。

步骤（5）所述的中苗苗高为15cm以上，每株苗有3-5条根以上，须根多。