抗il-27抗体及其用途
阅读说明：本技术 抗il-27抗体及其用途 (anti-IL-27 antibodies and uses thereof ) 是由 J·希尔 S·查佩尔 M·格莱斯顿 B·普林茨 A·莱克 C·米勒 K·怀特 华晶 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本公开涉及抗IL-27抗体及其抗原结合部分。本公开还涉及通过施用所述抗体或其抗原结合部分来治疗或缓解诸如癌症的疾病的一种或多种症状的方法。本公开还涉及用于检测例如受试者或样品中的IL-27的方法。(The present disclosure relates to anti-IL-27 antibodies and antigen-binding portions thereof. The disclosure also relates to methods of treating or ameliorating one or more symptoms of a disease, such as cancer, by administering the antibodies or antigen-binding portions thereof. The disclosure also relates to methods for detecting IL-27, e.g., in a subject or sample.)
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年12月13日提交的美国临时申请号62/779,341的权益，所述临时申请的全部内容以引用的方式并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及用于调节IL-27信号传导的组合物和方法。更具体地，本公开涉及结合至IL-27并调节IL-27信号传导的免疫原性组合物(例如，抗体、抗体片段等)。
背景技术
近年来，越来越多的证据表明，免疫系统是肿瘤形成和发展的重要障碍。在癌症患者中存在具有抗肿瘤潜力或活性的天然存在的T细胞的原理使肿瘤学中免疫治疗方法的发展合理化。免疫细胞，如T细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞可表现出抗肿瘤活性并且有效地控制恶性肿瘤的发生和生长。肿瘤特异性或肿瘤相关抗原能够诱导免疫细胞识别并消除恶性肿瘤(Chen和Mellman,(2013)Immunity 39(1):1-10)。尽管存在肿瘤特异性免疫响应，但恶性肿瘤通常通过各种免疫调节机制逃避或避免免疫攻击，从而导致无法控制肿瘤发生和发展(Motz和Coukos,(2013)Immunity 39(1):61-730)。实际上，癌症的新兴特征是这些免疫调节机制的利用和抗肿瘤免疫响应的失能，从而导致肿瘤逃避和免疫杀伤逃脱(Hanahan和Weinberg(2011)Cell 144(5):646-674)。
IL-27是由两个亚基(EBI3和IL-27p28)组成的异二聚体细胞因子。IL-27在结构上与IL-12和IL-6细胞因子家族两者有关。IL-27结合至由IL-27Rα(WSX1)和gp130链组成的异二聚体受体并通过所述异二聚体受体介导信号传导，其主要通过STAT1和STAT3介导信号传导。初始报告将IL-27表征为免疫增强细胞因子，其支持CD4+T细胞增殖、T辅助(Th)1细胞分化和IFN-γ产生，通常与IL-12协同作用。随后的研究表明，IL-27展示复杂免疫调节功能，取决于所使用的生物学环境和实验模型而导致促炎性或抗炎作用。IL-27可驱动人癌细胞中不同免疫调控分子的表达，这可能支持体内免疫响应的局部紊乱(Fabbi等人,(2017)Mediators Inflamm 3958069.2017年2月1日在线公开doi:10.1155/2017/3958069，以及其中包含的参考文献)。
尽管在癌症治疗和管理方面取得了重大进展，但是仍然持续需要用于治疗和管理癌症的新的且有效的疗法。
发明内容
本文公开了抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分以高亲和力和特异性结合至并拮抗人IL-27(白细胞介素27)。还提供了编码抗体分子的核酸分子、用于制备抗体分子的表达载体、宿主细胞和方法。还提供了包含所述抗体分子的药物组合物。本文公开的抗IL-27抗体或其抗原结合部分可用于(单独或与其它治疗剂或程序组合)治疗、预防和/或诊断病症(包括免疫病症和癌症)。因此，本文公开了使用抗IL-27抗体分子治疗和/或诊断各种病症(包括癌症和免疫病症)的组合物和方法。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含选自由以下组成的组的重链CDR和轻链CDR：
(i)分别示于SEQ ID NO:706、707和708中的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别示于SEQ ID NO:714、715和716中的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(ii)分别示于SEQ ID NO:728、729和730中的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别示于SEQ ID NO:736、737和738中的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(iii)分别示于SEQ ID NO:750、751和752中的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别示于SEQ ID NO:758、759和760中的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；以及
(iv)分别示于SEQ ID NO:772、773和774中的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别示于SEQ ID NO:780、781和782中的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含选自由以下组成的组的重链CDR和轻链CDR：
(i)分别示于SEQ ID NO:709、710和711中的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别示于SEQ ID NO:717、718和719中的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(ii)分别示于SEQ ID NO:731、732和733中的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别示于SEQ ID NO:739、740和741中的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(iii)分别示于SEQ ID NO:753、754和755中的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别示于SEQ ID NO:761、762和763中的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；以及
(iv)分别示于SEQ ID NO:775、776和777中的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别示于SEQ ID NO:783、784和785中的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链CDR和轻链CDR，其中所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列分别示于SEQ ID NO:706、707和708中，并且所述轻链CDR1、CDR2和CDR3序列分别示于SEQ IDNO:714、715和716中。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链CDR和轻链CDR，其中所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列分别示于SEQ ID NO:728、729和730中，并且所述轻链CDR1、CDR2和CDR3序列分别示于SEQ IDNO:736、737和738中。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链CDR和轻链CDR，其中所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列分别示于SEQ ID NO:750、751和752中，并且所述轻链CDR1、CDR2和CDR3序列分别示于SEQ IDNO:758、759和760中。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链CDR和轻链CDR，其中所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列分别示于SEQ ID NO:772、773和774中，并且所述轻链CDR1、CDR2和CDR3序列分别示于SEQ IDNO:780、781和782中。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含选自由SEQ ID NO:712、734、756和778组成的组的氨基酸序列；并且其中所述轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:720、742、764和786组成的组的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
(i)分别SEQ ID NO:712和720；
(ii)分别SEQ ID NO:734和742；
(iii)分别SEQ ID NO:756和764；以及
(iv)分别SEQ ID NO:71775和786。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含与选自由SEQ ID NO:712、734、756和778组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列；并且其中所述轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:720、742、764和786组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列：
(i)分别SEQ ID NO:712和720；
(ii)分别SEQ ID NO:734和742；
(iii)分别SEQ ID NO:756和764；以及
(iv)分别SEQ ID NO:778和786。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别包含示于SEQ ID NO:712和720中的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别包含与示于SEQ ID NO:712和720中的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别包含示于SEQ ID NO:734和742中的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别包含与示于SEQ ID NO:734和742中的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别包含示于SEQ ID NO:756和764中的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别包含与示于SEQ ID NO:756和764中的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别包含示于SEQ ID NO:778和786中的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别包含与示于SEQ ID NO:778和786中的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，其中所述重链包含选自由SEQ ID NO:722、744、766和788组成的组的氨基酸序列；并且其中所述轻链包含选自由SEQ ID NO:724、746、768和790组成的组的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，其中所述重链包含与选自由SEQ ID NO:722、744、766和788组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列；并且其中所述轻链包含与选自由SEQ ID NO:724、746、768和790组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，其中所述重链包含选自由SEQ ID NO:726、748、770和792组成的组的氨基酸序列；并且其中所述轻链包含选自由SEQ ID NO:724、746、768和790组成的组的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，其中所述重链包含与选自由SEQ ID NO:726、748、770和792组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列；并且其中所述轻链包含与选自由SEQ ID NO:724、746、768和790组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
(i)分别SEQ ID NO:722和724；
(ii)分别SEQ ID NO:744和746；
(iii)分别SEQ ID NO:766和768；以及
(iv)分别SEQ ID NO:788和790。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列：
(i)分别SEQ ID NO:722和724；
(ii)分别SEQ ID NO:744和746；
(iii)分别SEQ ID NO:766和768；以及
(iv)分别SEQ ID NO:788和790。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
(i)分别SEQ ID NO:726和724；
(ii)分别SEQ ID NO:748和746；
(iii)分别SEQ ID NO:770和768；以及
(iv)分别SEQ ID NO:792和790。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列：
(i)分别SEQ ID NO:726和724；
(ii)分别SEQ ID NO:748和746；
(iii)分别SEQ ID NO:770和768；以及
(iv)分别SEQ ID NO:792和790。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含示于SEQ ID NO:722和724中的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含与示于SEQ ID NO:722和724中的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含示于SEQ ID NO:744和746中的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含与示于SEQ ID NO:744和746中的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含示于SEQ ID NO:766和768中的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含与示于SEQ ID NO:766和768中的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含示于SEQ ID NO:788和790中的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含与示于SEQ ID NO:788和790中的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含示于SEQ ID NO:726和724中的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含与示于SEQ ID NO:726和724中的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含示于SEQ ID NO:748和746中的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含与示于SEQ ID NO:748和746中的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含示于SEQ ID NO:770和768中的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含与示于SEQ ID NO:770和768中的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含示于SEQ ID NO:792和790中的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含与示于SEQ ID NO:792和790中的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述方面的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，本公开提供了一种核酸，所述核酸包含编码上述方面的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链、重链或轻链和重链两者的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供了一种表达载体，所述表达载体包含上述核酸。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用上述表达载体转化的细胞。
在一些实施方案中，本公开提供了上述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段可特异性地结合至人IL-27和/或特异性地拮抗人IL-27。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于产生特异性地结合人IL-27的单克隆抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括在允许所述单克隆抗体或其抗原结合部分表达的条件下维持上述细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括获得所述单克隆抗体或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，本公开提供了一种抑制或减少细胞中的STAT1和/或STAT3磷酸化的方法，所述方法包括使所述细胞与上述分离的单克隆抗体或抗原结合片段中的任一者接触，其中所述抗体或其抗原结合部分抑制或减少细胞中的STAT1和/或STAT3磷酸化。
在一些实施方案中，本公开提供了一种抑制或减轻对细胞中CD161表达的抑制的方法，所述方法包括使所述细胞与上述分离的单克隆抗体或抗原结合片段中的任一者接触，其中所述抗体或其抗原结合部分抑制或减轻对细胞中CD161表达的抑制。
在一些实施方案中，本公开提供了一种抑制或减少细胞中的PD-L1和/或TIM-3表达的方法，所述方法包括使所述细胞与上述分离的单克隆抗体或抗原结合片段中的任一者接触，其中所述抗体或其抗原结合部分抑制或细胞中的PD-L1和/或TIM-3表达。
在一些实施方案中，本公开提供了一种诱导或增强一种或多种细胞因子从细胞的分泌的方法，所述方法包括使所述细胞与上述分离的单克隆抗体或抗原结合片段中的任一者接触，其中所述抗体或其抗原结合部分诱导或增强PD-1介导的一种或多种细胞因子从细胞的分泌。
在一些实施方案中，本公开提供了一种刺激受试者的免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的上述分离的单克隆抗体或抗原结合片段或上述药物组合物中的任一者。
在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的上述分离的单克隆抗体或抗原结合片段或上述药物组合物中的任一者。
在一些实施方案中，本公开提供了一种刺激受试者的免疫响应或治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的上述分离的单克隆抗体或抗原结合片段或上述药物组合物中的任一者，其中所述抗体或其抗原结合部分或药物组合物抑制或减少细胞中的STAT1和/或STAT3磷酸化，从而刺激所述免疫响应或治疗所述癌症。
在一些实施方案中，本公开提供了一种刺激受试者的免疫响应或治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的上述分离的单克隆抗体或抗原结合片段或上述药物组合物中的任一者，其中所述抗体或其抗原结合部分或药物组合物抑制或减轻对细胞中CD161表达的抑制，从而刺激所述免疫响应或治疗所述癌症。
在一些实施方案中，本公开提供了一种刺激受试者的免疫响应或治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的上述分离的单克隆抗体或抗原结合片段或上述药物组合物中的任一者，其中所述抗体或其抗原结合部分或药物组合物抑制或减少细胞上的PD-L1和/或TIM-3表达，从而刺激所述免疫响应或治疗所述癌症。
在一些实施方案中，本公开提供了一种刺激受试者的免疫响应或治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的上述分离的单克隆抗体或抗原结合片段或上述药物组合物中的任一者，其中所述抗体或其抗原结合部分或药物组合物诱导或增强PD-1介导的一种或多种细胞因子从细胞的分泌，从而刺激所述免疫响应或治疗所述癌症。
在一些实施方案中，所述癌症选自肺癌(例如，非小细胞肺癌)、肉瘤、睾丸癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、黑素瘤、头颈癌(例如，鳞状头颈癌)、结肠直肠癌、膀胱癌、子宫内膜癌、前列腺癌、甲状腺癌、肝细胞癌、胃癌、脑癌、淋巴瘤(例如，DL-BCL)、白血病(例如，AML)或肾癌(例如，肾细胞癌，例如，肾透明细胞癌)。
在一些实施方案中，本公开提供了一种增强抗PD-1抗体的一种或多种活性(例如，增强PD-1介导的细胞因子分泌；增强抗PD-1介导的TNFα分泌；增强抗PD-1介导的来自暴露于抗PD-1抗体的细胞的IL-6分泌)的方法，所述方法包括使细胞暴露于上述抗体或其抗原结合部分中的任一者，同时或依序暴露于抗PD-1抗体，从而增强抗PD1抗体的一种或多种活性。
在一些实施方案中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含抗PD-1抗体和上述抗体或其抗原结合部分中的任一者以及药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，本公开提供了一种药盒，所述药盒包含用于同时或依序施用的抗PD-1抗体和上述抗体或其抗原结合部分中的任一者，以及其使用说明书。
在一些实施方案中，本公开提供，将上述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分中的任一者与一种或多种另外的治疗剂或程序组合施用，其中所述第二治疗剂或程序选自由以下组成的组：化学疗法、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、手术程序、放射程序、共刺激分子的活化剂、抑制性分子的抑制剂、疫苗或细胞免疫疗法或其组合。
在一些实施方案中，本公开提供，一种或多种另外的治疗剂是PD-1拮抗剂、PD-L1抑制剂、TIM-3抑制剂、LAG-3抑制剂、TIGIT抑制剂、CD112R抑制剂、TAM抑制剂、STING激动剂、4-1BB激动剂、CTLA-4抑制剂、CD73抑制剂、CD39抑制剂、A2AR抑制剂、IDO抑制剂、peg-IL-2、peg IL-10、CD40激动剂或其组合。
在一些实施方案中，本公开提供，一种或多种另外的治疗剂是PD-1拮抗剂。
在一些实施方案中，本公开提供，PD-1拮抗剂选自由以下组成的组：PDR001、纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗、MEDI0680、REGN2810、TSR-042、PF-06801591、AMP-224、AB122和JTX-4014。
在一些实施方案中，本公开提供，PD-L1抑制剂选自由以下组成的组：FAZ053、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗和BMS-936559。
在一些实施方案中，本公开提供，一种或多种另外的治疗剂选自由以下组成的组：舒尼替尼卡博替尼阿西替尼乐伐替尼依维莫司贝伐单抗依多司他、NKTR-214(CD-122偏向性激动剂)、替伏扎尼艾贝司他、伊匹单抗曲美木单抗、帕唑帕尼索拉非尼西罗莫司雷莫芦单抗尼拉帕尼、沃利替尼(savolitinib)、沃洛拉尼(X-82)、瑞格非尼多纳非尼(多激酶抑制剂)、卡瑞利珠单抗(SHR-1210)、迪-培萨替莫近(pexastimogene devacirepvec)(JX-594)、雷莫芦单抗阿帕替尼(YN968D1)、包封的阿霉素替万替尼(ARQ197)、ADI-PEG 20、比美替尼、甲磺酸阿帕替尼、尼达尼布、利瑞鲁单抗、纳武单抗派姆单抗阿特珠单抗阿维单抗德瓦鲁单抗西米普利单抗-rwlc替雷利珠单抗和斯巴达珠单抗。
在一些实施方案中，本公开提供，一种或多种另外的治疗剂是TIM-3抑制剂，任选地其中所述TIM-3抑制剂是MGB453或TSR-022。
在一些实施方案中，本公开提供，一种或多种另外的治疗剂是LAG-3抑制剂，任选地其中所述LAG-3抑制剂选自由以下组成的组：LAG525、BMS-986016和TSR-033。
在一些实施方案中，本公开提供，一种或多种另外的治疗剂是TIGIT抑制剂。
在一些实施方案中，本公开提供，一种或多种另外的治疗剂是CD112R抑制剂。
在一些实施方案中，本公开提供，一种或多种另外的治疗剂是TAM(Axl、Mer、Tyro)抑制剂。
在一些实施方案中，本公开提供，一种或多种另外的治疗剂是4-1BB激动剂。
在一些实施方案中，本公开提供，一种或多种另外的治疗剂是酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。
在一个方面，本公开提供一种分离的SRF388单克隆抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，本公开提供，所述分离的SRF388单克隆抗体或其抗原结合部分与一种或多种另外的治疗剂或程序进一步组合施用，所述另外的治疗剂或程序选自由以下组成的组：化学疗法、靶向抗癌治疗、溶瘤药物、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、手术程序、放射程序、共刺激分子的活化剂、抑制分子的抑制剂、疫苗或细胞免疫疗法或其组合。在一些实施方案中，本公开提供，一种或多种另外的治疗剂是PD-1拮抗剂、PD-L1抑制剂、TIM-3抑制剂、LAG-3抑制剂、TIGIT抑制剂、CD112R抑制剂、TAM抑制剂、STING激动剂、4-1BB激动剂、CTLA-4抑制剂、CD73抑制剂、CD39抑制剂、A2AR抑制剂、IDO抑制剂、NEKTAR、peg-IL-2、pegIL-10、CD40激动剂或其组合。在一些实施方案中，本公开提供，PD-1拮抗剂选自由以下组成的组：PDR001、纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗、MEDI0680、REGN2810、TSR-042、PF-06801591、AMP-224、AB122和JTX-4014。
在一个方面，本公开提供了一种检测来自受试者的样品中的IL-27或EBI3或p28的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使来自所述受试者的样品与检测抗体在允许所述检测抗体在所述样品中存在IL-27或EBI3或p28的情况下形成检测抗体-EBI3复合物或检测抗体-p28复合物的条件下接触，其中所述检测抗体是上述抗体或其抗原结合片段中的任一者或表12中所描述的任何抗体；以及(b)检测在步骤(a)中产生的复合物(如果有的话)的存在。
在一个方面，本公开提供了一种检测受试者的IL-27相关癌症的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使来自疑似患有IL-27相关癌症的受试者的样品与检测抗体在允许所述检测抗体在所述样品中存在IL-27或EBI3或p28的情况下形成检测抗体-EBI3复合物或检测抗体-p28复合物的条件下接触，其中所述检测抗体是上述抗体或其抗原结合部分中的任一者或表12中所描述的任何抗体；以及(b)检测在步骤(a)中产生的复合物(如果有的话)的存在。
在一些实施方案中，所述检测抗体与可检测标记偶联。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述样品与捕获抗体接触以在所述样品中存在IL-27或EBI3的情况下产生包含IL-27或EBI3和所述捕获抗体的复合物，其中所述捕获抗体是以上抗体或其抗原结合部分中的任一者。
在一些实施方案中，所述捕获抗体具有Ab7的一个或多个CDR，任选地是Ab7。
在一些实施方案中，所述捕获抗体被固定在固体支持物上。
在一些实施方案中，使所述样品在所述检测抗体之前与所述捕获抗体接触。
在一些实施方案中，所述样品是体液样品。
在一些实施方案中，所述体液样品是血液、血清、血浆、细胞裂解物或组织裂解物。
在一些实施方案中，所述癌症选自肾细胞癌(RCC)、肝细胞癌(HCC)、肺癌、胃食管癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑素瘤、白血病和淋巴瘤。
在一些实施方案中，所述癌症是肾细胞癌(RCC)，或者所述癌症是肝细胞癌(HCC)。
在一些实施方案中，所述癌症选自白血病和淋巴瘤，或者所述癌症是卵巢癌。
在一些实施方案中，本公开提供了上述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或上述药物组合物中的任一者用于刺激受试者的免疫响应或用于治疗受试者的癌症、任选地用于与一种或多种另外的治疗剂或程序组合使用的用途。
在一些实施方案中，本公开提供了一种药盒，所述药盒包含上述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或上述药物组合物中的任一者以及刺激受试者的免疫响应或治疗受试者的癌症的使用说明书，任选地具有与一种或多种另外的治疗剂或程序组合的使用说明书。
在一些实施方案中，本公开提供了一种药盒，所述药盒包含上述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分中的任一者，以及检测来自受试者的样品中的IL-27的使用说明书，任选地具有检测受试者的IL-27相关癌症的使用说明书。
在一些实施方案中，本公开提供，上述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包括拮抗IL-27的抗体或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，本公开提供，上述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包括抑制或减少细胞中的STAT1和/或STAT3磷酸化的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，本公开提供，上述细胞是免疫细胞，或者所述细胞是癌细胞。
在一些实施方案中，本公开提供，上述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分中的任一者包括抑制或减轻对细胞中CD161表达的抑制的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，本公开提供，细胞是免疫细胞。
在一些实施方案中，本公开提供，上述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包括抑制或减少细胞中的PD-L1和/或TIM-3表达的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，本公开提供，细胞是免疫细胞或癌细胞。在一些实施方案中，当细胞是癌细胞时，所述抗体或其抗原结合部分抑制或减少癌细胞中PD-L1的表达。
在一些实施方案中，本公开提供，上述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包括诱导或增强PD-1介导的一种或多种细胞因子从细胞的分泌的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子是IFNg、TNFα或IL-6。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子是IFNg、IL-17、TNFα或IL-6。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子是TNFα。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。
在一些实施方案中，本公开提供，上述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包括选自由以下组成的组的抗体：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD以及IgE抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG1抗体或IgG4抗体。在一些实施方案中，抗体包含野生型IgG1重链恒定区。在一些实施方案中，抗体包含野生型IgG4重链恒定区。
在一些实施方案中，本公开提供，上述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包括包含至少一种突变的Fc结构域。在一些实施方案中，抗体包含突变型IgG1重链恒定区。在一些实施方案中，抗体包含突变型IgG4重链恒定区。在一些实施方案中，根据EU编号，突变型IgG4重链恒定区包含取代S228P、L235E、L235A中的任一者或其组合。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分与上述抗体或其抗原结合部分中的任一者结合至基本上相同的表位。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分结合至上述抗体或其抗原结合部分中的任一者所结合的至少一个氨基酸残基。
在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分所结合的表位的突变抑制、减少或阻断与所述抗体或其抗原结合部分的结合，以及与根据上述抗体或其抗原结合片段中的任一者的抗体或其抗原结合部分的结合。
在一个方面，本公开提供了一种结合至IL-27上的表位的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述表位与表12中描述的抗体分子所结合的表位相同或相似。
在一个方面，本公开提供了一种特异性地结合至并拮抗人WSX-1的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含选自由以下组成的组的重链CDR和轻链CDR：分别示于SEQ ID NO:802、803和804中的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别示于SEQ ID NO:805、806和807中的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一个方面，本公开提供了一种特异性地结合人WSX-1的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别包含选自由SEQ ID NO:794和796组成的组的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种特异性地结合人WSX-1的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含轻链恒定区，其中所述轻链恒定区包含示于SEQ ID NO:798中的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种特异性地结合人WSX-1的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含与由分别示于SEQ ID NO:802、803和804中的重链CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组至少90％同一以及与由分别示于SEQ ID NO:805、806和807中的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组至少90％同一的重链CDR和轻链CDR。
在一个方面，本公开提供了一种特异性地结合人WSX-1的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含与分别由SEQ ID NO:794和796组成的组至少90％同一的重链可变区和轻链可变区。
在一个方面，本公开提供了一种特异性地结合人WSX-1的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含轻链恒定区，其中所述轻链恒定区与示于SEQ ID NO:798中的氨基酸序列至少90％同一。
在一些实施方案中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述WSX-1结合抗体中任一者的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，本公开提供了一种核酸，所述核酸包含编码上述WSX-1结合抗体中的任一者的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链、重链或轻链和重链两者的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开提供了一种表达载体，所述表达载体包含前述核酸。在一些实施方案中，本公开提供了一种用前述表达载体转化的细胞。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于产生特异性地结合人WSX-1的单克隆抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括在允许所述单克隆抗体或其抗原结合部分表达的条件下维持前述细胞。在一些实施方案中，本公开提供了一种检测来自受试者的样品中的WSX-1的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使来自所述受试者的样品与检测抗体在允许所述检测抗体在所述样品中存在WSX-1的情况下形成检测抗体-WSX-1复合物的条件下接触，其中所述检测抗体是根据上述WSX-1结合抗体中的任一者的抗体或其抗原结合片段；以及(b)检测在步骤(a)中产生的复合物(如果有的话)的存在。
在一些实施方案中，本公开提供了一种检测受试者的WSX-1相关癌症的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使来自疑似患有WSX-1相关癌症的受试者的样品与检测抗体在允许所述检测抗体在所述样品中存在WSX-1的情况下形成检测抗体-WSX-1复合物的条件下接触，其中所述检测抗体是根据上述WSX-1结合抗体中的任一者的抗体或其抗原结合部分；以及(b)检测在步骤(a)中产生的复合物(如果有的话)的存在。
在一些实施方案中，本公开提供了上述WSX-1结合抗体中的任一者的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或上述药物组合物用于刺激受试者的免疫响应或用于治疗受试者的癌症、任选地用于与一种或多种另外的治疗剂或程序组合使用的用途。
在一些实施方案中，本公开提供了一种药盒，所述药盒包含上述WSX-1结合抗体中的任一者的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或上述药物组合物以及刺激受试者的免疫响应或治疗受试者的癌症的使用说明书，任选地具有与一种或多种另外的治疗剂或程序组合的使用说明书。
定义
除非另有说明，否则如下所示定义权利要求书和说明书中使用的术语。
必须注意的是，除非上下文另有明确规定，否则如说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述(the)”包括复数指代物。
如本文中所用，“约”将被普通技术人员理解，并且将根据其中使用其的上下文在一定程度上变化。如果所述术语的使用对于普通技术人员来说不清楚，给出其中使用其的上下文，“约”将表示达到特定值的正负10％。
如本文所用，术语“激动剂”是指部分或完全促进、诱导、增加和/或活化本文公开的天然多肽的生物活性的任何分子。合适的激动剂分子具体地包括激动剂抗体或抗体片段、天然多肽的片段或氨基酸序列变体、肽或蛋白质等。在一些实施方案中，以剂量依赖性方式观察到在激动剂存在下的活化。在一些实施方案中，测量的信号(例如，生物活性)比在可比较的条件下利用阴性对照测量的信号高至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％。本文还公开了鉴定适用于本公开方法的激动剂的方法。例如，这些方法包括但不限于结合测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)、Forte系统和放射免疫测定(RIA)。这些测定确定激动剂结合目标多肽(例如受体或配体)的能力，并且因此指示激动剂促进、增加或活化多肽活性的能力。激动剂的功效也可使用功能测定来确定，如激动剂活化或促进多肽功能的能力。例如，功能测定可包括将多肽与候选激动剂分子接触，并测量通常与多肽相关的一种或多种生物活性的可检测变化。激动剂的效力通常由其EC50值(活化50％激动剂响应所需的浓度)来定义。EC50值越低，激动剂的效力越大，并且活化最大生物响应所需的浓度越低。
如本文中所用，术语“丙氨酸扫描”是指用于确定特定野生型残基对给定蛋白质或多肽的稳定性或一种或多种功能(例如，结合亲和力)的贡献的技术。所述技术包括用丙氨酸残基取代多肽中的野生型残基，然后评估丙氨酸取代的衍生物或突变多肽的稳定性或一种或多种功能(例如，结合亲和力)，并与野生型多肽进行比较。用丙氨酸取代多肽中的野生型残基的技术是本领域已知的。
术语“改善”是指治疗疾病状态(例如，癌症)中的任何治疗上有益的结果，包括其预防、严重度或进展的减轻、缓解或治愈。
如本文中所用，术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码的氨基酸，以及那些后来被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，所述基本化学结构是结合到氢的碳、羧基、氨基和R基团，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。所述类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指其结构不同于氨基酸的一般化学结构，但其功能与天然存在的氨基酸相似的化合物。
氨基酸在本文中可通过它们通常已知的三个字母符号或由IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的一个字母符号来指代。同样，核苷酸也可用它们普遍接受的单字母代码来指代。
如本文中所用，“氨基酸置换”是指用第二不同的“替换”氨基酸残基替换预定氨基酸序列(起始多肽的氨基酸序列)中的至少一个现存氨基酸残基。“氨基酸插入”是指将至少一个另外的氨基酸掺入预定的氨基酸序列中。虽然插入通常由一个或两个氨基酸残基的插入组成，但也可进行更大的“肽插入”，例如插入约3至约5个或甚至高达约10、15或20个氨基酸残基。如上所公开的，一个或多个插入的残基可以是天然存在的或非天然存在的。“氨基酸缺失”是指从预定的氨基酸序列中去除至少一个氨基酸残基。
如本文中所用，术语“量”或“水平”在最广泛的意义上使用，并且是指物质(例如，代谢物、小分子、蛋白质、mRNA、标志物)的量、浓度或丰度。当提到代谢物或小分子(例如药物)时，术语“量”、“水平”和“浓度”通常可互换使用，并且通常指生物样品中的可检测量。“升高的水平”或“提高的水平”是指样品中物质的数量、浓度或丰度相对于对照样品(诸如来自未患有疾病或病症(例如，癌症)的一个或多个个体)或内部对照的增加。在一些实施方案中，样品中物质(例如，药物)的升高的水平是指相对于对照样品中物质的量，物质的量增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，如通过本领域已知的技术(例如，HPLC)所测定的。“降低的水平”是指个体中物质(例如，药物)的数量、浓度或丰度相对于对照(诸如来自未患有疾病或病症(例如，癌症)的一个或多个个体)或内部对照的降低。在一些实施方案中，降低的水平很少或为不可检测的量、浓度或丰度。在一些实施方案中，样品中物质(例如，药物)的降低的水平是指相对于对照样品中物质的量，物质的量减少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，如通过本领域已知的技术(例如，HPLC)所测定的。
当提及蛋白质、mRNA或标志物(诸如本文所述的那些)时，术语“表达的水平”或“表达水平”通常可互换使用，并且通常指生物样品中蛋白质、mRNA或标记物的可检测量。在一些方面，蛋白质、mRNA或标志物的可检测量或可检测水平与对剂(诸如本文所述的那些)的响应可能性相关。“表达”通常是指籍以将基因中包含的信息转化为细胞中存在并起作用的结构(例如，蛋白质标志物，诸如PD-L1)的过程。因此，如本文中所用，“表达”可指转录成多核苷酸、翻译成多肽，或者甚至多核苷酸和/或多肽修饰(例如，多肽的翻译后修饰)。转录的多核苷酸、翻译的多肽、或多核苷酸和/或多肽修饰(例如，多肽的翻译后修饰)的片段也应被认为是表达的，无论它们来源于由选择性剪接或降解的转录物产生的转录物，还是来源于多肽的翻译后加工(例如通过蛋白水解)。“表达的基因”包括转录成多核苷酸(作为mRNA)的基因，然后翻译成多肽的那些基因，也包括转录成核糖核酸但不翻译成多肽(例如，转运RNA和核糖体RNA)的那些基因。“升高的表达”、“升高的表达水平”或“升高的水平”是指样品中的物质相对于对照样品(诸如未患疾病或病症(例如，癌症)的一个或多个个体)或内部对照的表达增加或水平升高。在一些实施方案中，样品中物质(例如，蛋白质标志物，诸如PD-L1)的升高的表达是指相对于对照样品中物质的量，物质的量增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，如通过本领域已知的技术(例如，FACS)测定的。“减少的表达”、“降低的表达水平”或“降低的水平”是指个体中的物质(例如，蛋白质标志物)相对于对照(诸如未患疾病或病症(例如，癌症)的一个或多个个体)或内部对照的减少的表达或降低的水平。在一些实施方案中，减少的表达是很少或没有表达。在一些实施方案中，样品中物质(例如，蛋白质标志物)的减少的表达是指相对于对照样品中物质的量，物质的量减少了约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，如通过本领域已知的技术(例如，FACS)所测定的。
如本文所用，术语“血管生成”或“新血管形成”是指新血管从先前存在的血管发育的过程(Varner等人,(1999)Angiogen.3:53-60；Mou sa等人,(2000)Angiogen.Stim.Inhib.35:42-44；Kim等人,(2000)Amer.J.Path.156:1345-1362；Kim等人,(2000)J.Biol.Chem.275:33920-33928；Kumar等人(2000)Angiogenesis:From Molecularto Integrative Pharm.169-180)。来自先前存在的血管或循环内皮干细胞的内皮细胞(Takahashi等人,(1995)Nat.Med.5:434-438；Isner等人,(1999)J.Clin.Invest.103:1231-1236)响应于生长因子或激素信号或缺氧或缺血性疾患变得活化以迁移、增殖并分化成具有腔的结构，从而形成新血管。在局部缺血期间，如在癌症中发生的，增加氧合和营养递送的需求显然引起受影响组织分泌血管生成因子；这些因子刺激新血管形成。其他几个术语与血管生成有关。
如本文所用，术语“拮抗剂”是指部分或完全阻断、抑制或中和本文所公开的天然多肽的生物活性的任何分子。合适的拮抗剂分子具体包括拮抗剂抗体或抗体片段、天然多肽的片段或氨基酸序列变体、肽或蛋白质等。在一些实施方案中，以剂量依赖性方式观察到在拮抗剂存在下的抑制。在一些实施方案中，测量的信号(例如，生物活性)比在可比较的条件下利用阴性对照测量的信号低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％。本文还公开了鉴定适用于本公开方法的拮抗剂的方法。例如，这些方法包括但不限于结合测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)、Forte系统、放射免疫测定(RIA)、Meso Scale Discovery测定(例如Meso Scale Discovery电化学发光(MSD-ECL)和基于珠粒的测定。这些测定确定拮抗剂结合目标多肽(例如受体或配体)的能力，并且因此指示拮抗剂抑制、中和或阻断多肽活性的能力。拮抗剂抗体的功效还可使用功能测定(诸如拮抗剂抑制多肽或激动剂功能的能力)来测定。例如，功能测定可包括将多肽与候选拮抗剂分子接触，并测量通常与多肽相关的一种或多种生物活性的可检测变化。拮抗剂的效力通常由其IC50值(抑制50％激动剂响应所需的浓度)来定义。IC50值越低，拮抗剂的效力越大，并且抑制最大生物响应所需的浓度越低。
如本文所用，短语“拮抗人IL-27的抗体或其抗原结合部分”是指拮抗人IL-27的至少一种本领域公认的活性(例如，IL-27生物活性和/或通过IL-27信号传导介导的一种或多种下游途径或其他IL-27介导的功能)，例如涉及人IL-27活性减少(或降低)至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。IL-27生物活性和/或通过IL-27信号传导介导的一种或多种下游途径或其他IL-27介导的功能的另外实例在下文和本文其他地方进行了更详细的描述。
如本文所用，术语“抗IL-27拮抗剂抗体”(可互换地称为“抗IL-27抗体”)是指特异性地结合至IL-27并抑制IL-27生物活性和/或通过IL-27信号传导介导的一种或多种下游途径或其他IL-27介导的功能的抗体。抗IL-27拮抗剂抗体包括阻断、拮抗、阻抑、抑制或降低IL-27生物活性(例如，配体结合、酶活性)(包括通过IL-27信号传导或功能介导的下游途径，诸如受体结合和/或引发对IL-27或其代谢物的细胞响应)的抗体。在一些实施方案中，本公开提供的抗IL-27拮抗剂抗体结合至人IL-27并预防、阻断或抑制人IL-27与其同源或正常受体(例如，IL-27受体)或一个或多个受体亚基(例如gp130和/或IL-27Rα(也称为WSX1/TCCR))的结合。在一些实施方案中，抗IL-27拮抗剂抗体预防、阻断或抑制人IL-27与gp130的结合。在一些实施方案中，抗IL-27拮抗剂抗体预防、阻断或抑制人IL-27与IL-27Rα的结合。在一些实施方案中，抗IL-27拮抗剂抗体预防、阻断或抑制IL-27单体的二聚化。在一些实施方案中，抗IL-27抗体特异性地结合至EBI3单体。在一些实施方案中，抗IL-27抗体特异性地结合至IL-27p28单体。在一些实施方案中，抗IL-27抗体特异性地结合至两种IL-27单体。在一些实施方案中，抗IL-27抗体特异性地结合至包含EBI3和P28两者的非连续表位。在一些实施方案中，抗IL-27抗体抑制或减少细胞中的STAT1和/或STAT3磷酸化。在一些实施方案中，抗IL-27抗体抑制或减轻对细胞中CD161表达的抑制(例如，改善或缓解IL-27介导的对细胞中CD161表达的抑制)。在一些实施方案中，抗IL-27抗体抑制或减少细胞中的PD-L1和/或TIM-3表达。在一些实施方案中，抗IL-27诱导或增强PD-1介导的一种或多种细胞因子从细胞的分泌。在一些实施方案中，抗IL-27拮抗剂抗体结合至人IL-27并刺激或增强抗肿瘤响应。在一些实施方案中，抗IL-27拮抗剂抗体以15nM或更小的亲和力结合至人IL-27。在一些实施方案中，抗IL-27拮抗剂抗体结合至人IL-27，并且包含野生型或突变型IgG1重链恒定区或野生型或突变型IgG4重链恒定区。本文提供了抗IL-27拮抗剂抗体的实例。
如本文中所用，术语“抗体”是指包含两个轻链多肽和两个重链多肽的完整抗体。完整抗体包括不同的抗体同种型，包括IgM、IgG、IgA、IgD和IgE抗体。术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合(chimerized)或嵌合(chimeric)抗体、人源化抗体、灵长类化抗体(primatized antibody)、去免疫化抗体和完全人抗体。抗体可在多种物种中的任何一种中制备或源于多种物种中的任一种，所述物种是例如哺乳动物诸如人、非人灵长类动物(例如，猩猩、狒狒或黑猩猩)、马、牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠和小鼠。抗体可以是纯化的或重组的抗体。如本文所用，术语“抗体片段”、“抗原结合片段”或类似术语是指保留与靶抗原(例如，IL-27)结合并抑制所述靶抗原活性的能力的抗体片段。此类片段包括例如单链抗体、单链Fv片段(scFv)、Fd片段、Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段。scFv片段是单个多肽链，其包括scFv所源自的抗体的重链和轻链可变区两者。另外，抗体的定义中还包括胞内抗体、微型抗体、三抗体(triabody)和双抗体(diabody)，所述抗体适用于本文所述的方法。参见，例如，Todorovska等人，(2001)J.Immunol.Methods 248(1):47-66；Hudson和Kortt,(1999)J.Immunol.Methods231(1):177-189；Poljak,(1994)Structure 2(12):1121-1123；Rondon和Marasco,(1997)Annu.Rev.Microbiol.51:257-283，所述文献的每一篇的公开内容通过引用整体并入本文。
如本文中所用，术语“抗体片段”还包括，例如，单结构域抗体，诸如骆驼化单结构域抗体。参见，例如，Muyldermans等人，(2001)Trends Biochem.Sci.26:230-235；Nuttall等人，(2000)Curr.Pharm.Biotech.1:253-263；Reichmann等人，(1999)J.Immunol.Meth.231:25-38；PCT申请公开号WO 94/04678和WO 94/25591以及美国专利第6,005,079号，其全部通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，本公开提供了包含两个具有修饰的VH结构域(使得能形成单结构域抗体)的单结构域抗体。
在一些实施方案中，抗原结合片段包括重链多肽的可变区和轻链多肽的可变区。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合片段包含抗体的轻链和重链多肽的CDR。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是在其表面显示与MHC复合的外来抗原的细胞。T细胞通过T细胞受体(TCR)识别这种复合物。APC细胞的实例包括但不限于：B细胞、树突细胞(DC)、外周血单核细胞(PBMC)、单核细胞(诸如THP-1)、B淋巴母细胞样细胞(诸如C1R.A2,1518B-LCL)和单核细胞来源的树突细胞(DC)。一些APC通过吞噬作用或受体介导的内吞作用将抗原内化。
术语“抗原呈递”是指APC籍以捕获抗原并使其能被T细胞识别(例如，作为MHC-I和/或MHC-II缀合物的组分)的过程。
如本文中所用，术语“细胞凋亡”是指发生在多细胞生物(例如人)中的程序性细胞死亡过程。导致细胞凋亡的受高度调节的生化和分子事件可导致对细胞的可观察到的和特有的形态学变化，包括膜泡化、细胞体积皱缩、染色体DNA凝缩和断裂以及mRNA衰变。鉴定经历细胞凋亡的细胞(包括T细胞)的常用方法是将细胞暴露于缀合有荧光团的蛋白(膜联蛋白V)。膜联蛋白V通常用于通过其与质膜外小叶上的磷脂酰丝氨酸结合的能力来检测凋亡细胞，与质膜外小叶上的磷脂酰丝氨酸结合是细胞正在经历细胞凋亡过程的早期指标。
如本文中所用，术语“B细胞”(或者“B淋巴细胞”)是指淋巴细胞亚型的一种类型的白细胞。B细胞通过分泌抗体在适应性免疫系统的体液免疫成分中发挥作用。B细胞也呈现抗原并分泌细胞因子。B细胞，与另外两类淋巴细胞(T细胞和天然杀伤细胞)不同，在它们的细胞膜上表达B细胞受体(BCR)。BCR允许B细胞结合至特定抗原，其将启动针对所述抗原的抗体响应。
如本文中所用，术语“结合至固定的IL-27”是指本公开的抗体与IL-27(例如，在细胞表面表达的或附着于固体支持物的IL-27)结合的能力。
如本文中所用，术语“双特异性”或“双功能抗体”是指具有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可通过包括杂交瘤的融合或Fab’片段的连接在内的多种方法产生。参见，例如，Songsivilai&Lachmann,(1990)Clin.Exp.Immunol.79:315-321；Kostelny等人，(1992)J.Immunol.148:1547-1553。
传统上，双特异性抗体的重组产生是基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两个重链/轻链对具有不同的特异性(Milstein和Cuello,(1983)Nature 305:537-539)。可将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合性位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。优选将重链可变区与免疫球蛋白重链恒定区(包括铰链区、CH2区和CH3区的至少一部分)融合。关于目前已知的用于产生双特异性抗体的说明性方法的进一步细节，参见例如Suresh等人，(1986)Methods Enzymol.121:210；PCT公开号WO 96/27011；Brennan等人，(1985)Science 229:81；Shalaby等人，J.Exp.Med.(1992)175:217-225；Kostelny等人，(1992)J.Immunol.148(5):1547-1553；Hollinger等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Gruber等人，(1994)J.Immunol.152:5368以及Tutt等人，(1991)J.Immunol.147:60。双特异性抗体还包括交联或异源缀合的抗体。异源缀合的抗体可使用任何方便的交联方法制备。合适的交联剂是本领域公知的，并与许多交联技术一起公开于美国专利第4,676,980号中。
还描述了直接从重组细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，使用亮氨酸拉链已经产生了双特异性抗体。参见，例如，Kostelny等人(1992)J Immunol148(5):1547-1553。可通过基因融合将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab’部分连接。可在铰链区将抗体同二聚体还原形成单体，然后再氧化形成抗体异二聚体。所述方法也可用于生产抗体同二聚体。Hollinger等人(1993)Proc Natl Acad Sci USA90:6444-6448描述的“双抗体”技术为制备双特异性抗体片段提供了替代机制。所述片段包含通过接头与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，所述接头太短而不能使同一链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫与另一个片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还报道了用于通过使用单链Fv(scFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见，例如，Gruber等人(1994)J Immunol 152:5368。或者，抗体可以是如Zapata等人(1995)Protein Eng.8(10):1057-1062中所述的“线性抗体”。简言之，这些抗体包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，它们形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
在例如Tutt等人(1991)J Immunol 147:60中设想和描述具有两个以上效价的抗体(例如，三特异性抗体)。
本公开还包括多特异性抗体的变体形式，诸如Wu等人(2007)Nat Biotechnol 25(11):1290-1297中描述的双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)分子。DVD-Ig分子被设计成使得来自两种不同亲本抗体的两个不同轻链可变结构域(VL)直接串联连接或通过重组DNA技术经由短接头连接，随后是轻链恒定结构域。类似地，重链包含两个串联连接的不同重链可变结构域(VH)，随后是恒定区CH1和Fc区。从两种亲本抗体制备DVD-Ig分子的方法在例如PCT公开号WO08/024188和WO 07/024715中有进一步描述。在一些实施方案中，双特异性抗体是Fab串联免疫球蛋白，其中具有第二特异性的轻链可变区与完整抗体的重链可变区融合。此类抗体描述于例如国际专利申请公开号WO 2015/103072中。
如本文中所用，“癌症抗原”或“肿瘤抗原”是指(i)肿瘤特异性抗原，(ii)肿瘤相关抗原，(iii)表达肿瘤特异性抗原的细胞，(iv)表达肿瘤相关抗原的细胞，(v)肿瘤上的胚胎抗原，(vi)自体肿瘤细胞，(vii)肿瘤特异性膜抗原，(viii)肿瘤相关膜抗原，(ix)生长因子受体，(x)生长因子配体，和(xi)与癌症相关的任何其它类型的抗原或抗原呈递细胞或材料。
如本文中所用，术语“癌症特异性免疫响应”是指由肿瘤、癌细胞或癌症抗原的存在诱导的免疫响应。在某些实施方案中，响应包括癌症抗原特异性淋巴细胞的增殖。在某些实施方案中，响应包括抗体和T细胞受体的表达和上调以及淋巴因子、趋化因子和细胞因子的形成和释放。先天免疫系统和获得性免疫系统相互作用，以启动针对肿瘤、癌细胞或癌症抗原的抗原响应。在某些实施方案中，癌症特异性免疫响应是T细胞响应。
术语“癌”是本领域承认的，指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑素瘤。本文所述的抗IL-27抗体可用于治疗患有、怀疑患有任何类型的癌症(包括肾癌或黑素瘤)或任何病毒性疾病或可能有发生所述癌症或病毒性疾病的高风险的患者。示例性癌包括由子宫颈、肺、前列腺、乳房、头和颈、结肠和卵巢的组织形成的那些癌。该术语还包括癌肉瘤，其包括由癌瘤性组织和肉瘤组织组成的恶性肿瘤。“腺癌”是指来源于腺组织或其中肿瘤细胞形成可识别的腺体结构的癌。
如本文所用，术语“CD112R”是指脊髓灰质炎病毒受体样蛋白的成员，并且是人T细胞的共抑制受体。CD112R在T细胞上优先表达，并抑制T细胞受体介导的信号。在抗原呈递细胞和肿瘤细胞上广泛表达的CD112是CD112R的配体。CD112R与CD226竞争结合至CD112。破坏CD112R-CD112相互作用可增强人T细胞响应。CD112R通过与CD112的相互作用作为人T细胞的新型检查点。如本文所用，术语“CD112R抑制剂”是指破坏、阻断或抑制CD112R的生物功能或活性的剂。
如本文所用，术语“CD137”(或者“4-1BB”)是指肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员。4-1BB是共刺激免疫检查点分子，主要针对活化的T细胞。CD137的交联可增强T细胞增殖、IL-2分泌、存活和溶细胞活性。如本文所用，术语“4-1BB激动剂”是指刺激、诱导或增加4-1BB的一种或多种功能的剂。示例性4-1BB激动剂是乌托鲁单抗(PF-05082566)，它是靶向此4-1BB以刺激T细胞的完全人IgG2单克隆抗体。
如本文所用，术语“CD161”(或者称为杀伤细胞凝集素样受体亚家族B，成员1(KLRB1)；NK1.1或NKR-P1A)是指C型凝集素超家族的成员。CD161是T细胞的标志物，并且对于许多不同的癌症类型，CD161表达一直与T细胞浸润到肿瘤微环境中相关。CD161在Fergusson等人,(2014)Cell Reports 9(3):1075-1088中进一步描述，所述文献以引用的方式整体并入本文。
如本文所用，术语“IL-27”或“白介素27”是指IL-27细胞因子。IL-27与IL-6/IL-12细胞因子家族有关，并且是包含称为爱泼斯坦-巴尔病毒诱导基因3(EBI3；也称为IL-27亚基β和IL-27B)的第一亚基和称为IL-27p28(也称为IL30、IL-27亚基α和IL-27A)的第二亚基的异二聚体细胞因子。IL-27主要由活化的抗原呈递细胞(包括单核细胞、内皮细胞和树突状细胞)合成(Jankowski等人(2010)Arch Immunol.Ther.Exp.58:417-425；Diakowski等人(2013)Adv.Clin.Exp.Med.(2013)22(5):683-691)。尽管IL-27可具有促炎作用，但许多研究表明IL-27作为免疫抑制剂的重要作用(Shimizu等人(2006)J.Immunol.176:7317-7324；Hisada等人(2004)Cancer Res.64:1152-1156；Diakowski(2013)同上)。尽管最初将IL-27描述为促进Th1响应启动的因素，但后来发现IL-27通过限制Th1响应、抑制Th2和Th17细胞分化以及调控Tr1和其他T调控性细胞群体的发育而起主要的T细胞阻抑功能(Dietrich等人(2014)J.Immunol.192:5382-5389)。除了其作为免疫调控剂的作用外，IL-27还调控血管生成、造血作用和破骨细胞生成(同上)。
IL-27通过异二聚体I型细胞因子受体(IL-27受体或IL-27R)发出信号，所述异二聚体I型细胞因子受体包含称为WSX1(也称为IL-27受体亚基α、IL-27RA、T细胞细胞因子受体1型(TCCR)和细胞因子受体样1(CRL1))的第一亚基和称为gp130(也称为白细胞介素-6信号转导子(IL6ST)、白细胞介素-6受体亚基β(IL-6RB)和制瘤素M受体)的第二亚基。gp130还是IL-6家族细胞因子的受体亚基(Liu等人(2008)Scan.J.Immunol.68:22-299,Diakowski(2013)同上)。通过IL-27R进行的IL-27信号传导活化多个信号传导级联，包括JAK-STAT和p38 MAPK途径。
还认为EBI3具有独立于p28或IL-27异二聚体的生物功能。例如，EBI3还与p35相互作用以形成异二聚体细胞因子IL-35(Yoshida等人(2015)Annu.Rev Immunol.33:417-43)，并且已经显示在某些细胞类型中选择性地过表达而没有p28或IL-27表达的相应增加(Larousserie等人(2005)Am.J.Pathol.166(4):1217-28)。
示例性人EBI3蛋白的氨基酸序列提供于SEQ ID NO:698中(NCBI参考序列：NP_005746.2；N-MTPQLLLALVLWASCPPCSGRKGPPAALTLPRVQCRASRYPIAVDCSWTLPPAPNSTSPVSFIATYRLGMAARGHSWPCLQQTPTSTSCTITDVQLFSMAPYVLNVTAVHPWGSSSSFVPFITEHIIKPDPPEGVRLSPLAERQLQVQWEPPGSWPFPEIFSLKYWIRYKRQGAARFHRVGPIEATSFILRAVRPRARYYVQVAAQDLTDYGELSDWSLPATATMSLGK-C)。示例性人p28蛋白的氨基酸序列提供于SEQ ID NO:699中(NCBI参考序列：NP_663634.2；N-MGQTAGDLGWRLSLLLLPLLLVQAGVWGFPRPPGRPQLSLQELRREFTVSLHLARKLLSEVRGQAHRFAESHLPGVNLYLLPLGEQLPDVSLTFQAWRRLSDPERLCFISTTLQPFHALLGGLGTQGRWTNMERMQLWAMRLDLRDLQRHLRFQVLAAGFNLPEEEEEEEEEEEEERKGLLPGALGSALQGPAQVSWPQLLSTYRLLHSLELVLSRAVRELLLLSKAGHSVWPLGFPTLSPQP-C)。示例性人WSX1蛋白的氨基酸序列提供于SEQ IDNO:700中(NCBI参考序列：NP_004834.1；N-MRGGRGAPFWLWPLPKLALLPLLWVLFQRTRPQGSAGPLQCYGVGPLGDLNCSWEPLGDLGAPSELHLQSQKYRSNKTQTVAVAAGRSWVAIPREQLTMSDKLLVWGTKAGQPLWPPVFVNLETQMKPNAPRLGPDVDFSEDDPLEATVHWAPPTWPSHKVLICQFHYRRCQEAAWTLLEPELKTIPLTPVEIQDLELATGYKVYGRCRMEKEEDLWGEWSPILSFQTPPSAPKDVWVSGNLCGTPGGEEPLLLWKAPGPCVQVSYKVWFWVGGRELSPEGITCCCSLIPSGAEWARVSAVNATSWEPLTNLSLVCLDSASAPRSVAVSSIAGSTELLVTWQPGPGEPLEHVVDWARDGDPLEKLNWVRLPPGNLSALLPGNFTVGVPYRITVTAVSASGLASASSVWGFREELAPLVGPTLWRLQDAPPGTPAIAWGEVPRHQLRGHLTHYTLCAQSGTSPSVCMNVSGNTQSVTLPDLPWGPCELWVTASTIAGQGPPGPILRLHLPDNTLRWKVLPGILFLWGLFLLGCGLSLATSGRCYHLRHKVLPRWVWEKVPDPANSSSGQPHMEQVPEAQPLGDLPILEVEEMEPPPVMESSQPAQATAPLDSGYEKHFLPTPEELGLLGPPRPQVLA-C)。示例性人gp130蛋白的氨基酸序列提供于SEQ ID NO:701中(NCBI参考序列：NP_002175.2；N-MLTLQTWLVQALFIFLTTESTGELLDPCGYISPESPVVQLHSNFTAVCVLKEKCMDYFHVNANYIVWKTNHFTIPKEQYTIINRTASSVTFTDIASLNIQLTCNILTFGQLEQNVYGITIISGLPPEKPKNLSCIVNEGKKMRCEWDGGRETHLETNFTLKSEWATHKFADCKAKRDTPTSCTVDYSTVYFVNIEVWVEAENALGKVTSDHINFDPVYKVKPNPPHNLSVINSEELSSILKLTWTNPSIKSVIILKYNIQYRTKDASTWSQIPPEDTASTRSSFTVQDLKPFTEYVFRIRCMKEDGKGYWSDWSEEASGITYEDRPSKAPSFWYKIDPSHTQGYRTVQLVWKTLPPFEANGKILDYEVTLTRWKSHLQNYTVNATKLTVNLTNDRYLATLTVRNLVGKSDAAVLTIPACDFQATHPVMDLKAFPKDNMLWVEWTTPRESVKKYILEWCVLSDKAPCITDWQQEDGTVHRTYLRGNLAESKCYLITVTPVYADGPGSPESIKAYLKQAPPSKGPTVRTKKVGKNEAVLEWDQLPVDVQNGFIRNYTIFYRTIIGNETAVNVDSSHTEYTLSSLTSDTLYMVRMAAYTDEGGKDGPEFTFTTPKFAQGEIEAIVVPVCLAFLLTTLLGVLFCFNKRDLIKKHIWPNVPDPSKSHIAQWSPHTPPRHNFNSKDQMYSDGNFTDVSVVEIEANDKKPFPEDLKSLDLFKKEKINTEGHSSGIGGSSCMSSSRPSISSSDENESSQNTSSTVQYSTVVHSGYRHQVPSVQVFSRSESTQPLLDSEERPEDLQLVDHVDGGDGILPRQQYFKQNCSQHESSPDISHFERSKQVSSVNEEDFVRLKQQISDHISQSCGSGQMKMFQEVSAADAFGPGTEGQVERFETVGMEAATDEGMPKSYLPQTVRQGGYMPQ-C)。
如本文中所用，术语“竞争”，当在竞争对相同表位的结合的抗原结合蛋白(例如，免疫球蛋白、抗体或其抗原结合片段)的上下文中使用时，是指通过测定(例如，竞争性结合测定；交叉阻断测定)确定的抗原结合蛋白之间的相互作用，其中测试抗原结合蛋白(例如，测试抗体)抑制(例如，减少或阻断)参考抗原结合蛋白(例如，参考抗体)与共同抗原(例如，IL-27或其片段)的特异性结合。
“源自”指定多肽或蛋白质的多肽或氨基酸序列是指多肽的来源。优选地，源自特定序列的多肽或氨基酸序列具有与该序列或其部分(其中所述部分由至少10-20个氨基酸，优选至少20-30个氨基酸，更优选至少30-50个氨基酸组成)基本同一，或者另外地可被本领域普通技术人员识别为源自该序列的氨基酸序列。源自另一种肽的多肽相对于起始多肽可具有一个或多个突变，例如，已被另一种氨基酸残基取代或者已具有一个或多个氨基酸残基插入或缺失的一个或多个氨基酸残基。
多肽可包含非天然存在的氨基酸序列。此类变体必须与起始分子具有小于100％的序列同一性或相似性。在某些实施方案中，变体将具有例如在变体分子的长度上与起始多肽的氨基酸序列具有约75％至小于100％，更优选约80％至小于100％，更优选约85％至小于100％，更优选约90％至小于100％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)，最优选约95％至小于100％的氨基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，起始多肽序列与源自其的序列之间具有一个氨基酸差异。相对于该序列的同一性或相似性在本文中被定义为：在比对序列并引入空位(如果需要的话)以实现最大百分比的序列同一性之后，候选序列中与初始序列同一(即，相同残基)的氨基酸残基的百分比。在某些实施方案中，多肽由选自表12中所示的序列的氨基酸序列组成，基本上由所述氨基酸序列组成或包含所述氨基酸序列。在某些实施方案中，多肽包含与选自表12中所示序列的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。在某些实施方案中，多肽包含与选自表12中所示序列的连续氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的连续氨基酸序列。在某些实施方案中，多肽包含具有选自表12中所示序列的氨基酸序列的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400或500(或这些数字内的任何整数)个连续氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开的抗体由核苷酸序列编码。本发明的核苷酸序列可用于多种应用，包括克隆、基因疗法、蛋白质表达和纯化、突变引入、有此需要的宿主的DNA疫苗接种、抗体生成(对于，例如，被动免疫)、PCR、引物和探针生成等。在某些实施方案中，本发明的核苷酸序列包含选自表12中所示序列的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成。在某些实施方案中，核苷酸序列包含与选自表12中所示序列的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，核苷酸序列包含与选自表12中所示序列的连续核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的连续核苷酸序列。在某些实施方案中，核苷酸序列包含具有选自表12中所示序列的核苷酸序列的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400或500(或这些数字内的任何整数)个连续核苷酸的核苷酸序列。
本领域普通技术人员还将理解，适用于本文公开的方法的抗体可以被改变，使得它们在序列上不同于它们所源自的天然存在的或天然的序列，同时保留天然序列的所需活性。例如，可进行导致“非必需”氨基酸残基处的保守取代或改变的核苷酸或氨基酸取代。可通过标准技术(诸如定点诱变和PCR介导的诱变)引入突变。
适用于本文公开的方法的抗体可在一个或多个氨基酸残基处，例如在必需或非必需氨基酸残基处包含保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，结合多肽中的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基替代。在某些实施方案中，一段氨基酸可被结构相似的段替代，所述段在顺序和/或侧链家族成员的组成上不同。或者，在某些实施方案中，可沿着编码序列的全部或部分随机引入突变，例如通过饱和诱变，并且可将所得的突变体掺入本发明的结合多肽中，并筛选它们与所需靶标结合的能力。
如本文中所用，术语抗原“交叉呈递”是指通过APC上的MHC I类和II类分子向T细胞呈递外源蛋白抗原。
如本文中所用，术语“交叉反应”是指本公开的抗体结合至来自不同物种的IL-27的能力。例如，结合人IL-27的本公开的抗体也可结合另一物种的IL-27。如本文所用，通过在结合测定(例如，SPR、ELISA)中检测与纯化的抗原的特异性反应性，或通过检测与生理表达IL-27的细胞的结合或以其它方式与所述细胞的功能性相互作用来测量交叉反应性。用于确定交叉反应性的方法包括本文所述的标准结合测定，例如，通过BiacoreTM表面等离子体共振(SPR)分析，使用BiacoreTM2000SPR仪(Biacore AB,Uppsala,Sweden)或流式细胞技术。
如本文中所用，术语“细胞毒性T淋巴细胞(CTL)响应”是指由细胞毒性T细胞诱导的免疫响应。CTL响应主要由CD8+T细胞介导。
如本文中所用，术语“树突细胞”或“DC”是指为骨髓(BM)源性白细胞，并且为最强效的抗原呈递细胞类型的抗原呈递细胞的类型。DC捕获并处理抗原，将蛋白质转化为肽，呈现在T细胞所识别的主要组织相容性复合体(MHC)分子上。DC是异质性的，例如髓样和浆细胞样DC；尽管所有DC都能够摄取抗原、处理抗原并呈递给初始T细胞，但DC亚型具有不同的标志物，并在定位、迁移途径、详细的免疫功能以及对感染或炎症刺激(针对其生成)的依赖性方面有所不同。在适应性免疫响应的发展过程中，DC的表型和功能在启动耐受性、记忆和极化的T-辅助细胞1(Th1)、Th2和Th17分化中起作用。
如本文中所用，术语“树突细胞活化”是指从未成熟树突细胞向成熟树突细胞的转变；并且活化的树突细胞包括成熟的树突细胞和转变过程中的树突细胞，其中诱导共刺激信号的CD80和CD86的表达被活化刺激升高。成熟的人树突细胞是对CD40、CD80、CD86和HLA-II类(例如，HLA-DR)的表达呈阳性的细胞。例如，基于选自由CD80和CD86组成的组的标志物，可以将未成熟树突细胞与成熟树突细胞区分开来。未成熟树突细胞对这些标志物呈弱阳性，优选为阴性，而成熟树突细胞呈阳性。成熟树突细胞的区别由本领域技术人员常规地进行，并且上述各自的标志物和测量其表达的方法也是本领域技术人员公知的。
如本文中所用，术语“EC50”是指抗体或其抗原结合部分在体外或体内测定中诱导为最大响应的50％(即，在最大响应与基线之间的一半处)的响应的浓度。
如本文中所用，术语“有效剂量(effective dose)”或“有效剂量(effectivedosage)”被定义为足以实现或至少部分实现所需效果的量。术语“治疗有效剂量”被定义为足以治愈或至少部分阻止已经患有疾病的患者的疾病及其并发症的量。对于这种用途的有效的量取决于所治疗病症的严重程度和患者自身免疫系统的一般状态。
如本文中所用，术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体所特异性结合的位点。术语“表位作图”是指鉴定抗体或其抗原结合片段在其靶蛋白抗原上的结合位点或表位的过程或方法。本文提供了表位作图方法和技术。表位既可由连续氨基酸形成，也可由通过蛋白质的三级折叠而紧靠的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常得以保留，然而由三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常丢失。表位通常以独特的空间构象包括至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸。用于确定给定抗体结合哪些表位的方法(即，表位作图)在本领域中是公知的，包括例如免疫印迹和免疫沉淀测定，其中测试IL-27的重叠或连续肽与给定抗IL-27抗体的反应性。确定表位空间构象的方法包括本领域的技术和本文所述的技术，例如，x射线晶体学和二维核磁共振(参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methodsin Molecular Biology,第66卷，G.E.Morris，编辑(1996))。
本公开还包括与IL-27上的表位结合的抗体，所述表位包含本文所述的特定抗体所识别的表位的全部或部分(例如，相同或重叠的区域或所述区域之间或跨越所述区域的区域)。
本公开还包括结合相同表位的抗体和/或与本文所述抗体竞争结合至人IL-27的抗体。识别相同表位或竞争结合的抗体可使用常规技术来进行鉴定。此类技术包括，例如，免疫测定，其显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的能力，即，竞争性结合测定。在其中所测试的免疫球蛋白抑制参考抗体与共同抗原(诸如IL-27)的特异性结合的测定中测定竞争性结合。许多类型的竞争性结合测定是已知的，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见Stahli等人，Methods inEnzymology9:242(1983))；solid phase direct biotin-avidin EIA(see Kirkland等人，J.Immunol.137:3614(1986))；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988))；使用I-125标记物的固相直接标记RIA(参见Morel等人，Mol.Immunol.25(1):7(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人，Virology 176:546(1990))；和直接标记的RIA。(Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32:77(1990))。典型地，这种测定包括使用与固体表面结合的纯化抗原或带有这两者之一的细胞、未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白。通过在测试免疫球蛋白存在的情况下测定与固体表面或细胞结合的标记物的量来测量竞争性抑制。通常测试免疫球蛋白过量存在。通常，当竞争抗体过量存在时，其将抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或更多。
其它技术包括，例如，表位作图方法，诸如，抗原:抗体复合物晶体的x射线分析，其提供表位的原子分辨率，以及与氢/氘(H/D)交换组合的质谱分析，其研究抗原:抗体相互作用的构象和动力学。其它方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变形式的结合，其中由于抗原序列中氨基酸残基的修饰而导致的结合丧失通常被认为是表位组分的指示。另外，还可使用用于表位作图的计算组合方法。这些方法依赖于目标抗体从组合噬菌体展示肽库中亲和分离特定短肽的能力。然后将肽视为对应于用于筛选肽文库的抗体的表位定义的前导。对于表位作图，也已开发了计算算法，所述算法已经被证明能对构象不连续的表位作图。
如本文中所用，术语“Fc介导的效应子功能”或“Fc效应子功能”是指除抗体的主要功能和目的外的抗体的生物活性。例如，治疗性不可知抗体(therapeutic agnosticantibody)的效应子功能是除靶蛋白或途径的激活外的生物活性。抗体效应功能的实例包括C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；表达Fc受体的血小板的活化的缺乏；和B细胞活化。许多效应子功能始于Fc与Fcγ受体的结合。在一些实施方案中，肿瘤抗原靶向抗体具有效应子功能，例如ADCC活性。在一些实施方案中，本文所述的肿瘤抗原靶向抗体包含相对于恒定区的未修饰形式具有增强的效应子功能(例如，增强的介导ADCC的能力)的变体恒定区。
如本文中所用，术语“Fc受体”是指在免疫效应细胞表面上发现的多肽，其被抗体的Fc区结合。在一些实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。Fcγ受体有三个亚类：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FγcRIII(CD16)。所有四种IgG同种型(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)结合并激活Fc受体FcγRI、FcγRIIA和FcγRIIIA。FcγRIIB是抑制性受体，因此与该受体结合的抗体不会激活补体和细胞响应。FcγRI是以单体形式与IgG结合的高亲和力受体，而FcγRIIA和FcγRIIA是仅以多聚体形式结合IgG且亲和力稍低的低亲和力受体。抗体与Fc受体和/或C1q的结合受Fc区内特定残基或结构域的控制。结合还取决于位于铰链区内和抗体的CH2部分内的残基。在一些实施方案中，本文所述抗体的激动和/或治疗活性依赖于Fc区与Fc受体(例如，FcγR)的结合。在一些实施方案中，本文所述抗体的激动和/或治疗活性通过Fc区与Fc受体(例如，FcγR)的结合而提高。
在本公开中采用的某些Fc受体序列的列表如以下表13所示。
如本文所用，术语“糖基化模式”被定义为与蛋白质、更具体地与免疫球蛋白共价连接的碳水化合物单元的模式。当本领域普通技术人员将异源抗体的糖基化模式识别为与转基因的CH基因所来源的物种比，与非人转基因动物物种中的所述糖基化模式更相似时，异源抗体的糖基化模式可被表征为与非人转基因动物物种产生的抗体上天然存在的糖基化模式基本相似。
如本文中所用，术语“人抗体”包括具有人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在的话)的抗体。本公开的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)(参见，例如，Lonberg等人，(1994)Nature 368(6474):856-859)；Lonberg,(1994)Handbook ofExperimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg&Huszar,(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93，和Harding&Lonberg,(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。然而，术语“人抗体”不包括其中来源于另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列已经被移植到人框架序列上的抗体(即人源化抗体)。
如本文中所用，术语“异源抗体”是相对于产生这种抗体的转基因非人生物定义的。该术语是指具有氨基酸序列或编码核酸序列的抗体，所述氨基酸序列或编码核酸序列对应于在不由转基因非人动物组成的生物体中发现的氨基酸序列或编码核酸序列，并且通常来自除转基因非人动物外的物种。
术语“诱导免疫响应”和“提高免疫响应”可互换使用，是指对特定抗原的免疫响应的刺激(即，被动或适应性的)。关于诱导CDC或ADCC所使用的术语“诱导”是指特定直接细胞杀伤机制的刺激。
如本文所用，术语“免疫原性细胞死亡”(或者称为“免疫原性细胞凋亡”)是指与一种或多种信号传导途径的活化相关的细胞死亡方式，所述信号传导途径诱导来自肿瘤细胞的损伤相关分子模式(DAMP)分子(例如，三磷酸腺苷，ATP)的死亡前表达和释放，从而导致肿瘤细胞免疫原性的增强和肿瘤细胞以免疫原性方式(例如，通过吞噬作用)死亡。如本文中所用，术语“免疫原性细胞死亡诱导剂”是指诱导免疫原性细胞死亡过程、途径或方式的化学、生物或药物试剂。
如本文所用，术语“抑制”、“减少”或“阻断”(例如，涉及抑制或减少细胞中人IL-27介导的STAT1和/或STAT3磷酸化)可互换施用并且涵盖部分和完全抑制/阻断。IL-27的抑制/阻断降低或改变在没有抑制或阻断的情况下发生的活性的正常水平或类型。抑制和阻断也旨在包括与不与抗IL-27抗体接触的IL-27相比，当与抗IL-27抗体接触时IL-27的结合亲和力的任何可测量的降低，例如，将IL-27的结合抑制至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
如本文所用，术语“抑制血管生成”、“减少血管生成(diminishes angiogenesis)”和“减少血管生成(reduces angiogenesis)”是指将组织中血管生成的水平降低至相应对照组织中的量的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或低于相应对照组织中的量并且最优选与对照组织中观察到的水平相同的量。
如本文所用，术语“抑制生长”(例如，涉及细胞)旨在包括细胞生长的任何可测量的降低，例如将细胞生长抑制至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。
如本文所用，“需要预防的”、“需要治疗的”或“有需要的”受试者是指根据适当的从业医生(例如，在人的情况下，医生、护士或护理人员；在非人哺乳动物的情况下，兽医)的判断将合理地受益于给定治疗(诸如用包含抗IL-27抗体的组合物治疗)的受试者。
术语“体内”是指发生在活生物体中的过程。
如本文中所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性地结合至人IL-27的分离的抗体基本上不含特异性地结合除IL-27外的抗原的抗体)。然而，特异性地结合至表位的分离的抗体可与来自不同物种的其它IL-27蛋白具有交叉反应性。然而，在如本文所述的特异性结合测定中，抗体继续显示与人IL-27的特异性结合。另外，分离的抗体通常基本上不含其它细胞物质和/或化学物质。在一些实施方案中，将具有不同IL-27特异性的“分离的”抗体的组合组合在明确定义的组合物中。
如本文中所用，术语“分离的核酸分子”是指编码与IL-27结合的抗体或抗体部分(例如，VH、VL、CDR3)的核酸，旨在指其中编码抗体或抗体部分的核苷酸序列不含编码结合除IL-27外的抗原的抗体或抗体部分的其它核苷酸序列的核酸分子，所述其它序列可天然地在人基因组DNA中位于所述核酸的两侧。例如，选自表12中所示的序列的序列对应于包含本文所述的抗IL-27抗体单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区的核苷酸序列。
如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。在一些实施方案中，本公开的人单克隆抗体是IgG1同种型。在一些实施方案中，本公开的人单克隆抗体是IgG2同种型。在一些实施方案中，本公开的人单克隆抗体是IgG3同种型。在一些实施方案中，本公开的人单克隆抗体是IgG4同种型。对本领域技术人员显而易见的是，抗体同种型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE)的鉴定是本领域中常规的，并且通常涉及与已知抗体、公开的Fc变体序列和保守序列的序列比对的组合。
如本文中所用，术语“同种型转换”是指抗体的种类或同种型从一种Ig种类变为另一种Ig种类的现象。
如本文中所用，术语“KD”或“KD”是指抗体与抗原之间的结合反应的平衡解离常数。KD的值是抗体解离速率常数(kd)与抗体结合速率常数(ka)之比的数值表示。KD的值与抗体对抗原的结合亲和力成反比。KD值越小，抗体对其抗原的亲和力越大。亲和力是单个分子与其配体结合的强度，通常通过平衡解离常数(KD)来测量和报告，该常数用于评估和排列双分子相互作用的排序强度。
如本文中所用，术语“kd”或“kd”(或者“koff”或“koff”)旨在指抗体从抗体/抗原复合物中解离的解离速率常数。Kd的值每秒衰变或解离的复合物的分数的数值表示，以秒-1为单位表示。
如本文所用，术语“ka”或“ka”(或者“kon”或“kon”)旨在指抗体与抗原缔合的结合速率常数。ka的值是在1摩尔(1M)抗体和抗原溶液中每秒钟形成的抗体/抗原复合物数量的数值表示，以M-1sec-1为单位表示。
如本文中所用，术语“白细胞(leukocyte)”是指参与保护身体免受感染性生物体和外来物质侵害的一种类型的白血细胞。白细胞在骨髓中产生。白细胞有5种主要类型，分为两大类：多形核白细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)和单核白细胞(单核细胞和淋巴细胞)。
如本文中所用，术语“淋巴细胞”是指参与身体的免疫防御的一种类型的白细胞或白血细胞。淋巴细胞有两种主要类型：B细胞和T细胞。
如本文中所用，术语“连接的”、“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语是指通过任何方式，包括化学缀合或重组方式，将两个或更多个元件或组分或结构域连接在一起。化学缀合的方法(例如，使用异双官能交联剂)是本领域已知的。
如本文中所用，“局部施用”或“局部递送”是指不依赖于组合物或剂通过血管系统转运至其预定的靶组织或部位的递送药。例如，可通过注射或植入组合物或剂或通过注射或植入包含组合物或剂的装置来递送组合物。在靶组织或部位附近局部施用后，组合物或剂或其一种或多种组分可以扩散到预期的靶组织或部位。
如本文中所用，“MHC分子”指两种类型的分子：MHC I类和MHC II类。MHC I类分子向特异性CD8+T细胞呈递抗原，MHC II类分子向特异性CD4+T细胞呈递抗原。外源性递送至APC的抗原主要被加工用于与MHC II类缔合。相反地，内源性递送至APC的抗原主要被加工用于与MHC I类缔合。
如本文中所用，术语“单克隆抗体”是指表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力的抗体。因此，术语“人单克隆抗体”是指表现出单一结合特异性并且具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和任选的恒定区的抗体。在一些实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的获自转基因非人动物(例如，转基因小鼠)的B细胞，所述动物具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
如本文中所用，术语“单核细胞”是指一种类型的白细胞，其可分化为巨噬细胞和树突细胞以实现免疫响应。
如本文中所用，术语“天然杀伤(NK)细胞”是指一种类型的细胞毒性淋巴细胞。这些是大的、通常是颗粒状的非T、非B淋巴细胞，它们杀死某些肿瘤细胞，并在针对病毒和其它细胞内病原体的先天免疫方面以及在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)方面起着重要作用。
如本文中所用，应用于物体的术语“天然存在的”是指物体可以存在于自然界中的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的，所述多肽或多核苷酸序列可以从自然界的来源中分离出来，并且在实验室中未被人有意修饰过。
如本文中所用，术语“非转换的同种型的”是指当没有发生同种型转换时产生的重链的同种型类别；编码非转换的同种型的CH基因通常是紧接在功能重排的VDJ基因下游的第一个CH基因。同型转换分为经典同型转换和非经典同型转换。经典同种型转换通过涉及转基因中至少一个转换序列区的重组事件而发生。非经典同种型转换可通过例如人σμ与人∑μ之间的同源重组(δ-相关缺失)来发生。替代的非经典转换机制，诸如基因间和/或染色体间重组等，可以发生并实现同种型转换。
如本文中所用，术语“核酸”是指以单链或双链形式存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非特别限定，否则该术语包括含有已知天然核苷酸类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合特性，并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另外指出，否则特定的核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子替换)和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子替换可通过产生序列来实现，在所述序列中一个或多个选择的(或所有的)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19:5081,1991；Ohtsuka等人，Biol.Chem.260:2605-2608,1985；以及Cassol等人，1992；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8:91-98,1994)。对于精氨酸和亮氨酸，第二碱基处的修饰也可以是保守的。术语核酸可与基因、cDNA和由基因编码的mRNA互换使用。
本文使用的多核苷酸可以由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成，其可以是未修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸可由单链和双链DNA、为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA以及为单链区和双链区的混合物的RNA、包含可为单链区或更常见地双链区或者单链区和双链区的混合物的DNA和RNA的杂交分子组成。另外，多核苷酸可由包含RNA或DNA或RNA和DNA的三链区组成。多核苷酸还可包含一个或多个经修饰的碱基或为了稳定性或其它原因而修饰的DNA或RNA骨架。“经修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化碱基和稀有碱基，诸如肌苷。可对DNA和RNA进行各种修饰；因此，“多核苷酸”包括化学、酶促或代谢修饰的形式。
当核酸与另一种核酸序列处于功能关系中时，其为“可操作地连接的”。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接。就转录调控序列而言，可操作地连接的意味着被连接的DNA序列是连续的，并且在必要时连接两个蛋白质编码区(所述两个蛋白质编码区是连续的并且在读框中)。对于转换序列，可操作地连接表示该序列能够实现转换重组。
如本文中所用，“肠胃外施用”、“肠胃外施用的”和其它语法上等同的短语是指除肠内和局部施用外的施用方式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、鼻内、眼内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外、大脑内、颅内、颈内动脉内和胸骨内注射和输注。
如本文所用，术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。
如本文中所用，术语“PD-1拮抗剂”是指抑制PD-1信号传导途径或以其它方式抑制细胞(例如免疫细胞)中的PD-1功能的任何化合物或生物分子。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂阻断PD-L1与PD-1和/或PD-L2与PD-1的结合。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂特异性地结合PD-1。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂特异性地结合PD-L1。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一性百分比”是指当就最大一致性进行比较和比对时，具有如使用下述序列比较算法(例如，BLASTP和BLASTN或本领域技术人员可用的其它算法)之一或通过目测测量的特定百分比的相同的核苷酸或氨基酸的两个或更多个序列或子序列。取决于应用，“同一性百分比”可存在于被比较序列的区域上，例如，存在于功能结构域上，或者，存在于待比较的两个序列的全长上。对于序列比较，通常地，一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数，计算一个或多个测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)，或通过目测(通常参见Ausubel等人，在下文中)来进行。
适于测定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，所述算法描述于Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心网站公开获得。
如本文中通常所用的，“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适于与人类和动物的组织、器官和/或体液接触使用而没有过度毒性、刺激、过敏反应或与合理的效益/风险比相称的其它问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文中所用，“药学上可接受的载剂”是指并包括生理上相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。所述组合物可包括药学上可接受的盐，例如酸加成盐或碱加成盐(参见，例如，Berge等人(1977)J Pharm Sci 66:1-19)。
如本文中所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
如本文中所用，术语“预防”，当结合疾患使用时，是指相对于未接受组合物的受试者，降低受试者的疾患的症状的频率或延迟其发作的组合物的施用。
如本文中所用，用于本文所述的任何蛋白质(抗体或片段)的术语“纯化的”或“分离的”是指从天然伴随其的组分(例如，蛋白质或其它天然存在的生物或有机分子)(例如，表达所述蛋白质的原核生物中的其它蛋白质、脂质和核酸)中分离或纯化的多肽。通常，当多肽构成按重量计至少60％(例如，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％或99％)的样品中的总蛋白质时，所述多肽被纯化。
如本文所用，术语“程序性细胞死亡蛋白1”或“PD-1”是指程序性细胞死亡蛋白1多肽(一种属于CD28家族的免疫抑制性受体)，并且由人中的PDCD1基因编码。PD-1的替代名称或同义词包括：PDCD1、PD1、CD279和SLEB2。PD-1主要在体内在先前活化的T细胞、B细胞和髓样细胞上表达，并与两种配体PD-L1和PD-L2结合。如本文中所用，术语“PD-1”包括人PD-1(hPD-1)、hPD-1的变体、同种型和物种同源物，以及与hPD-1具有至少一个共同表位的类似物。完整的hPD-1序列可在GenBank登录号AAC51773下找到。
如本文中所用，术语“程序性死亡配体-1”或“PD-L1”是PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体之一(另一种是PD-L2)，其在与PD-1结合时下调T细胞活化和细胞因子分泌。PD-L1的替代名称和同义词包括：PDCD1L1、PDL1、B7H1、B7-4、CD274和B7-H。如本文所用的术语“PD-L1”包括人PD-L1(hPD-L1)、hPD-L1的变体、同种型和物种同源物，以及与hPD-L1具有至少一个共同表位的类似物。完整的hPD-L1序列可在GenBank登录号Q9NZQ7下找到。
PD-1被称为免疫抑制蛋白，其负向调节TCR信号(Ishida,Y.等人(1992)EMBOJ.11:3887-3895；Blank,C.等人(Epub 2006年12月29日)Immunol.Immunother.56(5):739-745)。PD-1与PD-L1之间的相互作用可充当免疫检查点，其可导致T细胞受体介导的增殖降低(Dong等人(2003)J.Mol.Med.81:281-7；Blank等人(2005)CancerImmunol.Immunother.54:307-314；Konishi等人(2004)Clin.Cancer Res.10:5094-100)。免疫抑制可通过抑制PD-1与PD-L1或PD-L2的局部相互作用来逆转；当PD-1与PD-L2的相互作用也被阻断时，所述效应是累加的(Iwai等人(2002)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 99:12293-7；Brown等人(2003)J.Immunol.170:1257-66)。
对于几种癌症，肿瘤的存活和增殖是由肿瘤介导的免疫检查点调节维持的。这种调节可导致抗癌免疫系统功能的破坏。例如，最近的研究表明，肿瘤细胞表达免疫检查点受体配体，诸如PD-L1或PD-L2，可以特别地通过抑制T细胞来下调肿瘤微环境中的免疫系统活性并促进癌症免疫逃避。PD-L1在多种人癌症中大量表达(Dong等人，(2002)Nat Med 8:787-789)。PD-L1受体PD-1在淋巴细胞(例如，活化的T细胞)上表达，通常参与下调(特别地通过抑制T细胞)免疫系统和促进自身耐受性。然而，当在T细胞上表达的PD-1受体与肿瘤细胞上的同源PD-L1配体结合时，所产生的T细胞抑制导致针对肿瘤的免疫响应受损(例如，肿瘤浸润性淋巴细胞降低或癌细胞建立免疫逃避)。
在例如卵巢癌、肾癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌和黑素瘤的大样本组中，已表明，无论后续治疗如何，PD-L1表达均与预后不良和总生存率降低相关(参见，例如，Dong等人，(2002)Nat Med 8(8):793-800；Yang等人，(2008)Invest Ophthalmol Vis Sci 49(6):2518-2525；Ghebeh等人，(2006)Neoplasia 8:190-198；Hamanishi等人，(2007)Proc NatAcad Sci USA 104:3360-3365；Thompson等人，(2006)Clin Genitourin Cancer 5:206-211；Nomi等人，(2005)Clin Cancer Res 11:2947-2953；Inman等人，(2007)Cancer 109:1499-1505；Shimauchi等人，(2007)Int J Cancer 121:2585-2590；Gao等人，(2009)ClinCancer Res 15:971-979；Nakanishi等人，(2007)Cancer Immunol Immunother 56:1173-1182；Hino等人，(2010)Cancer 116(7):1757-1766)。类似地，发现肿瘤淋巴细胞上的PD-1表达标志着乳腺癌(Kitano等人，(2017)ESMO Open2(2):e000150)和黑素瘤(Kleffel等人，(2015)Cell 162(6):1242-1256)中的功能失调的T细胞。PD-1拮抗剂，诸如影响PD-1/PD-L1/PD-L2信号传导轴的功能和/或破坏PD-1与PD-L1和/或PD-L2之间相互作用的那些拮抗剂，已被开发出来，并且代表了一类新型的抗肿瘤抑制剂，其通过调节免疫细胞-肿瘤细胞相互作用发挥作用。
如本文中所用，术语“重排的”是指重链或轻链免疫球蛋白基因座的构型，在所述构型中V区段以分别编码基本上完整的VH或VL结构域的构象紧邻D-J或J区段。通过与种系DNA比较，可以鉴定重排的免疫球蛋白基因座；重排的基因座将具有至少一个重组的七聚体/九聚体同源元件。
如本文中所用，术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)旨在指已向其中引入了重组表达载体的细胞。应当理解，此类术语不仅指特定的受试细胞，还指这种细胞的后代。因为由于突变或环境影响，某些修饰可以在后续世代中发生，所以这样的后代实际上可能与亲代细胞不完全相同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
如本文中所用，术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如(a)从动物(例如，小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体，所述动物对于人免疫球蛋白基因而言是转基因的或跨染色体的，(b)从经转化以表达所述抗体的宿主细胞，例如从转染瘤中分离的抗体，(c)从重组组合人抗体文库中分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的任何其它手段制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体包含利用特定人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区，所述可变区和恒定区序列由种系基因编码，但包括随后例如在抗体成熟过程中发生的重排和突变。如本领域所知的(参见，例如，Lonberg(2005)Nature Biotech.23(9):1117-1125)，可变区包含抗原结合结构域，其由各种基因编码，所述基因重排形成对外来抗原特异的抗体。除了重排以外，可变区还可通过多个单个氨基酸变化(称为体细胞突变或超突变)被进一步修饰，以增加抗体对外来抗原的亲和力。恒定区将随着对抗原的进一步相应而改变(即，同种型转换)。因此，响应于抗原而重排和体细胞突变的编码轻链和重链免疫球蛋白多肽的核酸分子可能与原始核酸分子不具有完全同一性的序列，而是具有基本上同一或相似(即，具有至少80％的同一性)。
如本文中所用，术语“参考抗体”(可与“参考mAb”互换使用)或“参考抗原结合蛋白”是与IL-27上的特定表位结合并用于建立其自身与一种或多种不同抗体之间的关系的抗体或其抗原结合片段，其中所述关系是参考抗体和一种或多种不同抗体与IL-27上相同表位的结合。如本文中所用，所述术语意指抗IL-27抗体，其可用于测试或测定，诸如本文所述的那些测试或分析(例如，竞争性结合测定)，用作竞争者，其中所述测定可用于发现、鉴定或开发一种或多种与相同表位结合的不同抗体。
如本文中所用，术语“特异性结合(specific binding)”、“选择性结合(selectivebinding)”、“选择性结合(selectively binds)”和“特异性结合(specifically binds)”是指抗体与预定抗原上的表位的结合。通常，当使用重组人IL-27作为分析物并且抗体作为配体在BIACORE 2000仪器中通过表面等离子体共振(SPR)技术测定时，抗体以约小于10-6M，诸如大约小于10-7、10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的平衡解离常数(KD)结合，并且其与预定抗原结合的亲和力为其与除所述预定抗原或密切相关的抗原外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)结合的亲和力的至少两倍。在某些实施方案中，当使用重组人IL-27作为分析物并且抗体作为配体在BIACORE 2000仪器中通过表面等离子体共振(SPR)技术测定时，特异性地结合至IL-27的抗体以大约小于100nM(10-7M)、任选地大约小于50nM(5x10-8M)、任选地大约小于15nM(1.5x10-8M)、任选地大约小于10nM(10-8M)、任选地大约小于5nM(5x10-9M)、任选地大约小于1nM(10-9M)、任选选地大约小于0.1nM(10-10M)、任选地大约小于0.01nM(10-11M)或甚至更低的平衡解离常数(KD)结合，其中结合至预定抗原以比所述抗体对结合至除预定抗原或紧密相关的抗原以外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)的亲和力大至少两倍的亲和力发生。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中与术语“特异性地结合至抗原的抗体”互换使用。
如本文所用，术语“STAT1磷酸化”是指信号转导子和转录活化因子1(STAT1)多肽(其是人中由STAT1基因编码的转录因子)的磷酸化。STAT分子通过受体相关激酶磷酸化，所述激酶通过形成同或异二聚体而引起活化和二聚化，所述同或异二聚体易位至细胞核以起转录因子的作用。STAT1可响应于经由包括IL-27的几种配体的信号传导而被活化(即磷酸化)。通过IL-27R的IL-27信号传导导致STAT1(pSTAT1)磷酸化。STAT1在涉及细胞的存活、活力或病原体响应的基因表达中起关键作用。确定由于IL-27信号转导引起的STAT1磷酸化的方法包括但不限于用特异性地识别磷酸化STAT1的抗体标记的细胞的流式细胞术分析(参见例如，Tochizawa等人,(2006)J Immunol Methods 313(1-2):29-37)。
如本文所用，术语“STAT3磷酸化”是指信号转导子和转录活化因子3(STAT3)多肽(其是人中由STAT3基因编码的转录因子)的磷酸化。STAT3响应于细胞刺激介导多种基因的表达，并且因此在许多细胞过程(如细胞生长和凋亡)中起着关键作用。确定由于IL-27信号转导引起的STAT3磷酸化的方法包括但不限于对用特异性地识别磷酸化STAT3的抗体标记的细胞或细胞提取物的分析(参见例如，Fursov等人,(2011)Assay Drug Dev Technol 9(4):420-429)。
如本文中所用，术语“转换序列”是指负责转换重组的那些DNA序列。μ“转换供体”序列，通常为转换区，将为在转换重组过程中被删除的构建体区域的5’(即，上游)。“转换受体”区域将位于待缺失的构建体区域与替换恒定区(例如，γ、ε等)之间。由于不存在总是发生重组的特定位点，因此最终的基因序列通常不能从构建体中预测。
如本文中所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。例如，本发明的方法和组合物可用于治疗患有免疫病症的受试者。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
对于核酸，术语“实质同源性”表示两个核酸或其指定的序列，当被最佳比对和比较时，在具有适当的核苷酸插入或缺失的情况下，在至少约80％的核苷酸中，通常至少约90％至95％，更优选至少约98％至99.5％的核苷酸中是同一的。或者，当区段在选择性杂交条件下与链的互补序列杂交时，存在实质同源性。
两个序列之间的同一性百分比是序列所共享的相同位置的数量的函数(即，同源性％＝相同位置的数量/位置总数×100)，其中考虑了需要被引入以进行两个序列的最佳比对的空位的数量和每个空位的长度。序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定可使用如以下非限制性实例中所述的数学算法来完成。
两个核苷酸序列之间的同一性百分比可使用GCG软件包(可在http://www.gcg.com上获得)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及为40、50、60、70或80的空位权重和为1、2、3、4、5或6的长度权重来确定。两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比也可使用已并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller(CABIOS,4:11-17(1989))的算法，使用PAM120权重残基表、为12的空位长度罚分、为4的空位罚分来确定。另外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可使用已并入GCG软件包(可在http://www.gcg.com上获得)中的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵、为16、14、12、10、8、6或4的空位权重、为1、2、3、4、5或6的长度权重来确定。
可将本公开的核酸和蛋白质序列进一步用作“查询序列”，以针对公共数据库执行搜索，以例如鉴定相关序列。此类搜索可使用Altschul,等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)来进行。可用NBLAST程序、得分＝100、字长＝12来进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。可用XBLAST程序、得分＝50、字长＝3来进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可利用如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中描述的空位BLAST程序。当利用BLAST和空位BLAST程序时，可使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
核酸可以以完整细胞、细胞裂解物或部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过标准技术(包括碱性/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其它技术)从其它细胞组分或其它污染物(例如，其它细胞核酸或蛋白质)中纯化出来时，核酸被“分离”或“基本上纯化”。参见，F.Ausubel,等人,编Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。
可根据提供基因序列的标准技术，对来自cDNA、基因组或其混合物的本公开的核酸组合物(尽管通常是天然序列(除经修饰的限制性位点等外))进行突变。对于编码序列，这些突变可以根据需要影响氨基酸序列。特别地，设想了与天然V序列、D序列、J序列、恒定序列、转换序列和本文所述的其它此类序列基本上同源或源自所述序列的DNA序列(其中“源自”表示序列与另一个序列相同或从另一个序列修饰而来)。
如本文所用，术语“STING”(或者TMEM173)是指干扰素基因刺激因子，其是一种充当直接细胞溶质DNA传感器和衔接蛋白。在人中，STING由TMEM173基因编码。STING在先天免疫中起重要作用。当细胞感染细胞内病原体(如病毒、分枝杆菌和细胞内寄生虫)时，STING诱导I型干扰素产生。由STING介导的I型干扰素通过结合至分泌它的同一细胞和附近细胞而保护受感染的细胞和附近细胞免受局部感染。STING的示例性氨基酸序列由NCBIGenbank数据库以登录号NP_001288667提供。
术语“T细胞”是指一种类型的白血细胞，其通过在细胞表面上存在T细胞受体而与其它白血细胞相区别。存在T细胞的多个亚群，包括但不限于T辅助细胞(又称TH细胞或CD4+T细胞)和亚型，包括TH1、TH2、TH3、TH17、TH9和TFH细胞；细胞毒性T细胞(又称TC细胞、CD8+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、T杀伤细胞、杀伤性T细胞)；记忆T细胞和亚型，包括中心记忆T细胞(TCM细胞)、效应记忆T细胞(TEM和TEMRA细胞)和驻留记忆T细胞(TRM细胞)；调控性T细胞(又称Treg细胞或抑制性T细胞)和亚型，包括CD4+FOXP3+Treg细胞、CD4+FOXP3-Treg细胞、Tr1细胞、Th3细胞和Treg17细胞；自然杀伤T细胞(又称NKT细胞)；粘膜相关非变异T细胞(MAIT)和γδT细胞(γδT细胞)，包括Vγ9/Vδ2T细胞。任何一种或多种前述或未提及的T细胞可以是用于本发明的使用方法的靶细胞类型。
如本文中所用，术语“T细胞介导的响应”是指由T细胞(包括但不限于效应T细胞(例如，CD8+细胞)和辅助T细胞(例如，CD4+细胞))介导的任何响应。T细胞介导的响应包括，例如，T细胞的细胞毒性和增殖。
如本文中所用，术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”或本文所用的类似术语旨在表示将引发所需生物或医学响应(例如，癌症的一个或多个症状的改善)的剂(例如，抗IL-27抗体或其抗原结合片段)的量。
如本文所用，术语“TAM受体”是指TAM受体蛋白酪氨酸激酶(TYRO3、AXL和MER)。TAM受体参与免疫系统稳态的调控。在癌症环境中，TAM受体具有双重调控作用，从而控制肿瘤发展的起始和进展，并且同时控制各种免疫细胞的相关抗肿瘤响应。TAM受体的进一步描述在Paolino和Penninger(2016)Cancers 8(97):doi:10.3390/cancers8100097)中找到。如本文所用，术语“TAM受体抑制剂”或“TAM抑制剂”是指抑制、阻断或降低TAM受体的功能或活性的剂。
如本文所用，除非另有指示，否则术语“TIGIT”或“具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体”是指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物，如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然TIGIT。TIGIT在本领域中也称为DKFZp667A205、FLJ39873、含V组和免疫球蛋白结构域的蛋白9、含V组和免疫球蛋白结构域的蛋白3、VSIG9、VSTM3和WUCAM。所述术语还涵盖TIGIT的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人TIGIT的氨基酸序列可在UniProt登录号Q495A1下找到。
如本文所用的术语“治疗”是指本文中描述的治疗或预防措施。“治疗”的方法采用向需要这种治疗的受试者(例如，需要针对特定抗原的增强的免疫响应的受试者或最终可能获得这种病症的受试者)施用本公开的人抗体，以预防、治愈、延迟、降低所述病症或复发病症的严重程度或改善其一种或多种症状，或者延长受试者的存活期，使其超过没有这种治疗时所预期的存活期。
如本文中所用，术语“肿瘤微环境”(或者“癌症微环境”；缩写为TME)是指肿瘤或赘生物存在于其中的细胞环境或背景，包括周围血管以及非癌细胞，包括但不限于免疫细胞、成纤维细胞、骨髓来源的炎症细胞和淋巴细胞。信号分子和细胞外基质也构成了TME。肿瘤和周围的微环境密切相关，并不断相互作用。肿瘤可通过释放细胞外信号、促进肿瘤血管生成和诱导外周免疫耐受来影响微环境，而微环境中的免疫细胞可影响肿瘤细胞的生长和进化。
如本文中所用，术语“未重排的”或“种系构型”是指V区段的构型，在所述构型中V片段不重组从而与D或J区段紧密相邻。
如本文中所用，术语“载体”旨在指能够转运与其相连的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中可将另外的DNA片区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入至其中的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入到宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，重组DNA技术中有用的表达载体通常以质粒的形式存在。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括表达载体的此类其它形式，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其具有等同的功能。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。下面描述了优选方法和材料，尽管与本文所述的方法和材料相似或等效的方法和材料也可用于目前公开的方法和组合物的实践或测试。本文提及的所有公布、专利申请、专利以及其他参考文献以引用的方式整体并入。
附图说明
图1是提供如所指示的抗IL-27抗体的亲和力数据的表。亲和力测量使用ForteBio和Meso Scale Discovery方法进行。
图2是描绘如通过ELISA测量的如所指示的抗IL-27抗体与板结合的重组IL-27的结合的图。
图3A-3E分别是条形图、两个图、条形图和图。图3A是描绘如通过流式细胞术测量的如所指示的抗IL-27抗体对人全血中IL-27介导的STAT1磷酸化的抑制的图。图3B是描绘如通过流式细胞术测量的如所指示的抗IL-27抗体对人PBMC中IL-27介导的STAT1磷酸化的抑制的图。图3C是描述如通过流式细胞术测量的如所指示的抗IL-27抗体对U937细胞中IL-27介导的STAT1磷酸化的抑制的图。图3D是描绘如通过流式细胞术测量的如所指示的抗IL-27抗体对HUT-78细胞中IL-27介导的STAT1磷酸化的抑制的图。图3E是显示SRF388抑制人全血T细胞中IL-27介导的pSTAT1的图。
图4是描绘通过如所指示的一系列浓度的抗IL-27抗体逆转T细胞中IL-27介导的对CD161表达的抑制的图。使用流式细胞术测定CD161表达。
图5A是描绘如通过ELISA测量的抗IL-27抗体增强人PBMC中PD-1介导的TNFα分泌的程度的图。图5B是描绘如通过ELISA测量的抗IL-27抗体增强人PBMC中PD-1介导的IL-6分泌的程度的图。图5C是点图，其示出SRF388与PD-1阻断的组合导致来自健康供体和RCC患者的PBMC中的细胞因子产生增加(缩写：CBA＝细胞计数珠阵列，IFNγ＝干扰素γ，MSD＝MesoScale Discovery，PBMC＝外周血单核细胞，PD-1＝程序性死亡受体-1，RCC＝肾细胞癌，TNFα＝肿瘤坏死因子α)。图5D示出IL-27抑制PD-1阻断后的细胞因子产生，并与SRF388组合恢复(缩写：Ctrl＝对照，ns＝不显着，PBMC＝外周血单核细胞，rhIL-27＝重组人IL-27)。图5E总结当PBMC培养物中的各种指示类型的细胞与SRF388抗体、αPD-1抗体或SRF388与αPD-1抗体的组合接触时，针对此类细胞观察到的细胞因子诱导(特别是TNFα、IFNγ、IL-6和IL-17A)。图5F示出不同浓度的如所指示的单独抗体(SRF405、SRF410、SRF411、SRF414、SRF416、SRF536、SRF543、SRF529、SRF381、SRF388和Ab7)对U937(淋巴瘤)细胞中pSTAT1信号的影响。图5G示出不同浓度的这些单独抗体对PBMC(外周血单核细胞)中pSTAT1信号的影响。图5H示出不同浓度的这些单独抗体对PBMC(外周血单核细胞)中CD161信号的影响。图5I示出不同浓度的这些单独抗体(不包括SRF414)对CD4 T淋巴细胞(CD4细胞)中PD-L1信号的影响。图5J示出不同浓度的这些单独抗体(不包括SRF529)对单核细胞中PD-L1信号的影响。图5K示出不同浓度的这些单独抗体(不包括SRF529)对单核细胞中TIM-3信号的影响。
图6A是描绘如通过流式细胞术确定的用抗IL-27抗体处理人单核细胞对IL-27介导的PD-L1表达的抑制的图。图6B是描绘如通过流式细胞术确定的通过用一系列浓度的特异性地结合至EBI3单体的抗IL-27抗体处理人单核细胞对IL-27介导的PD-L1表达的剂量依赖性抑制的图。图6C是描绘如通过流式细胞术确定的通过用抗IL-27抗体处理人单核细胞对IL-27介导的TIM3表达的抑制的图。图6D是描绘如通过流式细胞术确定的通过用抗IL-27抗体处理静息人T细胞对IL-27介导的PD-L1表达的抑制的图。
图7A是点图，其描绘如通过从小鼠分离的肺中的结节的目测计数所确定的，来自用如所指示的抗IL27抗体(SRF388)、同种型对照抗体、αWSX-1抗体或组合的αPD-1和αCTLA-4抗体处理的B16F10荷瘤小鼠的表面肺B16F10转移性结节(肺结节)的数量。图7B提供描绘如通过生物发光成像分析确定的在用抗IL-27抗体(SRF388)或同种型对照抗体处理的小鼠中的生物发光B16-Luc肿瘤的生长动力学的图。图7C示出从用如所指示的抗IL27抗体(SRF388)、同种型对照抗体、αWSX-1抗体或组合的αPD-1和αCTLA-4抗体处理的B16F10荷瘤小鼠分离的、用苏木精和曙红染色的固定、切片的肺组织的一系列图像。图7D是点图，其描绘如通过图像分析软件确定的，作为从用如所指示的抗IL27抗体(SRF388)、同种型对照抗体、αWSX-1抗体或组合的αPD-1和αCTLA-4抗体处理的B16F10荷瘤小鼠分离的、用苏木精和曙红染色的固定、切片的肺组织B16F10肿瘤组织的总组织面积的百分比的总肿瘤面积。用IL-27RA(WSX-1)介导的抗体阻断和用抗PD-1+抗CTLA-4组合疗法观察到表面肺转移数量和总肿瘤面积的相似减少。
图8A提供散点图，其描绘用IL-27微环处理后从过表达IL-27的小鼠分离的脾细胞中表达变化>1.0log2倍变化(黑点)的基因的微阵列数据。图8B提供描绘如图8A中的脾细胞中，如所指示的选择的免疫调节基因的表达水平的图。图8C示出人IL-27的异位表达在体内诱导鼠T细胞上的抑制性受体表达，并且SRF388在IL-27微环处理后降低体内T细胞上的抑制性受体表达。向六周龄的雌性Balb/c小鼠注射空载体(对照)或hIL-27微环。转染后5天收集(左上图和右上图)PBMC和(左下图和右下图)总脾细胞，并将细胞染色且通过流式细胞术进行分析。在CD4+T细胞(左上图和左下图)和CD8+T细胞(右上图和右下图)上分析了所指示标志物的表达。使用FlowJo软件进行分析。图8D示出SRF388抑制鼠血浆中微环来源的人IL-27的检测。
图9提供选择的单克隆抗体性质的列表总结。
图10A呈现抗体序列图表，其中序列划分反映NT编号。图10B呈现抗体序列图表(对应于图10A的序列图表)，其中序列划分反映ImMunoGeneTics(IMGT)编号。在图10A和图10B中，CDR序列中突出显示的氨基酸显示来自种系编码序列的突变。对于本领域技术人员显而易见的是，可以多种本领域公认的方式来进行抗体编号，包括确定CDR序列、框架序列等，包括通过图10A和图10B中呈现以及本文其他地方使用的NT和IMGT编号系统。
图11A是示出在患有癌症的患者或健康对照中EBI3或IL-27的血清水平的点图。使用实施例15中描述的抗体对测试血清样品的EBI3(A)或IL-27(B)水平。值是使用重组人IL-27从标准曲线外推。健康供体(正常对照)的平均值+2SD被用作血清样品被视为阳性的任意截断值。阳性样品的总数在相应的癌症分类上指示。图11B是散点图，其示出几种卵巢癌样品在血清中显示可检测水平的IL-27，使用与图11A所述相同的参数，在来自3名B细胞淋巴瘤患者和1名子宫内膜癌患者的血清中也观察到可检测水平的IL-27。
图12A是示出抗p28捕获抗体SRF381与抗EBI3抗体Ab7配对以通过MSD免疫测定以IL-27浓度依赖性方式检测重组人IL-27的图。图12B是示出抗EBI3捕获抗体SRF557与抗EBI3抗体Ab7配对以通过过MSD免疫测定以IL-27浓度依赖性方式检测重组人IL-27的图。图12C-12D是示出如通过Meso Scale Discovery(MSD)测定所确定的，来自癌性(肾细胞癌(RCC)、卵巢癌、肝细胞癌(HCC)、急性骨髓性白血病(AML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、肉瘤、黑素瘤、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、霍奇金淋巴瘤、胃癌、子宫内膜癌和健康(正常)患者的174份血清样品中的EBI3(图12C)和IL-27(图12D)浓度的图。图12E是示出抗IL-27抗体可与SRF381配对以通过MSD免疫测定检测重组人IL-27的条形图。图12F是示出抗IL-27抗体可与Ab7配对以通过ELISA检测重组人IL-27的条形图。
具体实施方式
本公开至少部分提供了以高亲和力和特异性结合人IL-27的抗体分子。在一个实施方案中，本文公开了结合至IL-27的人抗体。如本文所用的术语“IL-27”和“IL27”可互换地指异二聚体细胞因子IL-27，其由两个不同的亚基组成，由两种不同的基因编码：爱泼斯坦-巴尔病毒诱导基因3(EBI3)和IL-27p28。IL-27具有促炎性质和抗炎性质，对造血和非造血细胞具有不同作用。
因此，在一个方面，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分表现出以下性质中的至少一种或多种：
(i)以15nM或更小的平衡解离常数(KD)结合至人IL-27；
(ii)阻断IL-27与IL-27受体的结合；
(iii)抑制或减少细胞中的STAT1和/或STAT3磷酸化；
(iv)抑制或减轻IL-27介导的对细胞中CD161表达的抑制；
(v)抑制或减少细胞中IL-27介导的PD-L1和/或TIM-3表达；
(vi)诱导或增强PD-1介导的一种或多种细胞因子从细胞的分泌；以及
(vii)(i)-(vi)的组合。
在其他方面，本公开提供了特异性地结合人IL-27并抑制或降低IL-27生物活性或IL-27信号传导的单克隆抗体或其抗原结合部分。
本发明的其他方面包括编码抗体分子的核酸分子、表达载体、宿主细胞以及用于制备抗体分子的方法。还提供了免疫缀合物、多或双特异性分子以及包含抗体分子的药物组合物。本文公开的抗IL-27抗体分子可用于治疗、预防和/或诊断癌性或恶性病症，例如实体瘤和液体瘤(例如白血病，例如淋巴瘤，例如AML)、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、胰腺癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、黑素瘤、睾丸癌、肉瘤、头颈癌(例如，鳞状头颈癌)、肝癌(例如，肝细胞癌(HCC))、结肠直肠癌、卵巢癌、脑癌(例如，多多形性成胶质细胞瘤)或肾癌(例如，肾细胞癌，例如肾透明细胞癌)。
抗IL-27抗体及其抗原结合片段
本公开提供了特异性地结合至并拮抗IL-27(特别是人IL-27)的抗体及其抗原结合部分。本文提供了特异性地结合至人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含如表12中所示的重链CDR和轻链CDR以及可变序列。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分表现出至少一种或多种以下性质：(i)以15nM或更小的平衡解离常数(KD)结合至人IL-27；(ii)阻断IL-27与IL-27受体的结合；(iii)抑制或减少细胞中的STAT1和/或STAT3磷酸化；(iv)抑制或减轻对细胞中CD161表达的抑制；(v)抑制或减少细胞中的PD-L1和/或TIM-3表达；(vi)诱导或增强PD-1介导的一种或多种细胞因子从细胞的分泌；以及(vii)(i)-(vi)的组合。
在一些实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分以15nM或更小的平衡解离常数(KD)结合至人IL-27。
在一些实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分结合至重组人IL-27或鼠IL-27。
在一些实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分抑制或减少细胞中的STAT1和/或STAT3磷酸化。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，细胞是癌细胞。
在一些实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分抑制或减轻对细胞中CD161表达的抑制(例如改善或缓解对细胞中CD161表达的抑制)。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。
在一些实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分抑制或减少细胞中的PD-L1和/或TIM-3表达。在一些实施方案中，PD-L1表达被抑制或降低。在一些实施方案中，TIM-3表达被抑制或降低。在一些实施方案中，PD-L1表达和TIM-3表达两者均降低。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分诱导或增强PD-1介导的一种或多种细胞因子从细胞的分泌。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子是TNFα。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子是IL-6。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子是TNFα和IL-6。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。
在一些实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分选自由以下组成的组：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG1抗体或IgG4抗体。在一些实施方案中，抗体包含野生型IgG1重链恒定区。在一些实施方案中，抗体包含野生型IgG4重链恒定区。在一些实施方案中，抗体包含含有至少一种突变的Fc结构域。在一些实施方案中，抗体包含突变型IgG1重链恒定区。在一些实施方案中，抗体包含突变型IgG4重链恒定区。在一些实施方案中，根据EU编号，突变型IgG4重链恒定区包含取代S228P、L235E、L235A中的任一者或其组合。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述单克隆抗体或其抗原结合部分与根据前述实施方案中任一项所述的抗体或其抗原结合部分结合至IL-27上的基本上相同的表位。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述单克隆抗体或其抗原结合部分结合至由根据前述实施方案中任一项所述的抗体或其抗原结合部分所结合的包含IL-27的氨基酸残基中的至少一个。
在一些实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中由所述抗体或其抗原结合部分所结合的IL-27上的表位的突变抑制、减少或阻断与所述抗体或其抗原结合部分和与根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合部分两者的结合。
在一些实施方案中，本公开提供了一种结合至IL-27上的表位的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述表位与表12中描述的抗体分子所结合的表位相同或相似。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含选自由以下组成的组的重链CDR和轻链CDR：
(i)分别示于SEQ ID NO:706、707和708中的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别示于SEQ ID NO:714、715和716中的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(ii)分别示于SEQ ID NO:728、729和730中的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别示于SEQ ID NO:736、737和738中的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(iii)分别示于SEQ ID NO:750、751和752中的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别示于SEQ ID NO:758、759和760中的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；以及
(iv)分别示于SEQ ID NO:750、751和752中的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别示于SEQ ID NO:758、759和760中的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；以及。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链CDR和轻链CDR，其中所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列分别示于SEQ ID NO:161、162和163中，并且所述轻链CDR1、CDR2和CDR3序列分别示于SEQ ID NO:169、170和171中。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含选自由以下组成的组的重链CDR和轻链CDR：
(i)分别示于SEQ ID NO:709、710和711中的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别示于SEQ ID NO:717、718和719中的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(ii)分别示于SEQ ID NO:731、732和733中的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别示于SEQ ID NO:739、740和741中的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(iii)分别示于SEQ ID NO:753、754和755中的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别示于SEQ ID NO:761、762和763中的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；以及
(iv)分别示于SEQ ID NO:775、776和777中的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别示于SEQ ID NO:783、784和785中的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链CDR和轻链CDR，其中所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列分别示于SEQ ID NO:164、165和166中，并且所述轻链CDR1、CDR2和CDR3序列分别示于SEQ ID NO:172、173和174中。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链CDR和轻链CDR，其中重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别是SYSMS(SEQ ID NO:23)、YISYDGGSAYYPDTVKG(SEQ ID NO:24)和HGDYDDDDAMDY(SEQ ID NO:25)，并且其中轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别是RASENIYSYLA(SEQ ID NO:26)、NAETLTE(SEQ ID NO:27)和QHHYGTPLT(SEQ IDNO:28)。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含选自由SEQ ID NO:712、734、756和778组成的组的氨基酸序列；并且其中所述轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:720、742、764和786组成的组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
(i)分别SEQ ID NO:712和720；
(ii)分别SEQ ID NO:734和742；
(iii)分别SEQ ID NO:756和764；以及
(iv)分别SEQ ID NO:778和786。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含与选自由SEQ ID NO:712、734、756和778组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列；并且其中所述轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:720、742、764和786组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列：
(i)分别SEQ ID NO:712和720；
(ii)分别SEQ ID NO:734和742；
(iii)分别SEQ ID NO:756和764；以及
(iv)分别SEQ ID NO:778和786。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别包含示于SEQ ID NO:167和175中的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别包含与示于SEQ ID NO:167和175中的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，其中所述重链包含选自由SEQ ID NO:722、744、766和788组成的组的氨基酸序列；并且其中所述轻链包含选自由SEQ ID NO:724、746、768和790组成的组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，其中所述重链包含与选自由SEQ ID NO:722、744、766和788组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列；并且其中所述轻链包含与选自由SEQ ID NO:724、746、768和790组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，其中所述重链包含选自由SEQ ID NO:726、748、770和792组成的组的氨基酸序列；并且其中所述轻链包含选自由SEQ ID NO:724、746、768和790组成的组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，其中所述重链包含与选自由SEQ ID NO:726、748、770和792组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列；并且其中所述轻链包含与选自由SEQ ID NO:724、746、768和790组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
(i)分别SEQ ID NO:722和724；
(ii)分别SEQ ID NO:744和746；
(iii)分别SEQ ID NO:766和768；以及
(iv)分别SEQ ID NO:788和790。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列：
(i)分别SEQ ID NO:722和724；
(ii)分别SEQ ID NO:744和746；
(iii)分别SEQ ID NO:766和768；以及
(iv)分别SEQ ID NO:788和790。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
(i)分别SEQ ID NO:726和724；
(ii)分别SEQ ID NO:748和746；
(iii)分别SEQ ID NO:770和768；以及
(iv)分别SEQ ID NO:792和790。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列：
(i)分别SEQ ID NO:726和724；
(ii)分别SEQ ID NO:748和746；
(iii)分别SEQ ID NO:770和768；以及
(iv)分别SEQ ID NO:792和790。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含示于SEQ ID NO:177和179中的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含与示于SEQ ID NO:177和179中的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含示于SEQ ID NO:181和179中的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含与示于SEQ ID NO:181和179中的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
抗IL-27受体(WSX-1)抗体及其抗原结合片段
WSX-1是序列和结构均与IL-12R的β2链同源的I类细胞因子受体。静息/初始CD4+T细胞和CD8+T细胞高度表达这种受体。最近的研究已将由亚基EBI3和IL-27p28组成的异二聚体细胞因子IL-27鉴定为WSX-1的配体。EBI3(I类细胞因子受体家族的成员)与IL-12p40具有显著结构同源性，并且IL-27p28与IL-12p35密切相关。除了IL-12/IL-12R与IL-27/WSX-1配体/受体对之间的结构相似性外，还有报告显示功能相似性。尽管IL-12R在Th1型响应的发生中起关键作用，但据报告，WSX-1缺陷型细胞在Th1早期分化过程中损害IFN-γ产生。此外，与IL-12一样，重组IL-27能够增强高度纯化的初始辅助T细胞中的Th1分化。作为这些研究的结果，早期的共识是，与IL-12/IL-12R相互作用一样，IL-27/WSX-1是Th1响应的初始分化中的重要因素。
因此，在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人WSX-1的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链CDR和轻链CDR，其中重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列分别是SNNAAWN(SEQ ID NO:802)、RTYYRSKWYNDYALSVKS(SEQ ID NO:803)和GLPMVPFDS(SEQ ID NO:804)，并且轻链CDR1、CDR2和CDR3序列分别是RASQSISSWLA(SEQ ID NO:805)、KASSLES(SEQ ID NO:806)和QQYDSFSMYT(SEQ ID NO:807)。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合至并拮抗人WSX-1的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含示于SEQ ID NO:794中的氨基酸序列；并且其中所述轻链可变区包含示于SEQ ID NO:796中的氨基酸序列。
在一些实施方案中，特异性地结合至并拮抗人WSX-1的抗体或其抗原结合部分包含轻链恒定区，其中所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:中798所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，特异性地结合至并拮抗人WSX-1的抗体或其抗原结合部分包含重链恒定区，其中所述重链恒定区包含SEQ ID NO:中799所示的氨基酸序列。
用于产生抗IL-27抗体及其抗原结合片段的方法
本公开的特征还在于用于产生本文所述的任何抗IL-27抗体或其抗原结合片段的方法。在一些实施方案中，制备本文所述抗体的方法可包括用合适的免疫原免疫受试者(例如，非人哺乳动物)。本文阐述了用于产生本文所述的任何抗体的合适免疫原。例如，为了产生结合至IL-27的抗体，技术人员可用IL-27免疫合适的受试者(例如，非人哺乳动物，诸如大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、狗、猫、猪、山羊、马或非人灵长类动物)。在一些实施方案中，将包含示于SEQ ID NO:97中的氨基酸序列的全长人IL-27EBI3单体多肽用作免疫原。在一些实施方案中，将包含示于SEQ ID NO:98中的氨基酸序列的全长人IL-27p28单体多肽用作免疫原。
可用合适的抗原对合适的受试者(例如，非人哺乳动物)进行免疫，同时随后进行足以引发哺乳动物产生抗体的多次加强免疫。可将免疫原与佐剂一起向受试者(例如，非人哺乳动物)施用。用于在受试者中产生抗体的佐剂包括但不限于蛋白质佐剂；细菌佐剂，例如完整细菌(BCG、厌氧短棒杆菌(Corynebacterium parvum)或明尼苏达沙门菌(Salmonella minnesota))和细菌组分，包括细胞壁骨架、海藻糖二霉菌酸酯、单磷酰基脂质A、结核杆菌(tubercle bacillus)的甲醇可提取残留物(MER)、完全或不完全弗氏佐剂；病毒佐剂；化学佐剂，例如氢氧化铝以及碘乙酸盐和胆固醇半琥珀酸酯。可用于诱导免疫响应的方法中的其它佐剂包括，例如，霍乱毒素和副痘病毒蛋白。还参见Bieg等人(1999)Autoimmunity 31(1):15-24。还参见例如，Lodmell等人(2000)Vaccine 18:1059-1066；Johnson等人(1999)J Med Chem 42:4640-4649；Baldridge等人(1999)Methods 19:103-107；以及Gupta等人(1995)Vaccine 13(14):1263-1276。
在一些实施方案中，所述方法包括制备分泌与免疫原结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。例如，用如上所述的IL-27多肽免疫合适的哺乳动物诸如实验室小鼠。可在免疫原的至少一次强化免疫后2至4天分离免疫哺乳动物的抗体产生细胞(例如，脾脏的B细胞)，然后将其在与合适的骨髓瘤细胞系的细胞融合之前在培养中短暂生长。可将细胞在融合启动子(诸如痘苗病毒或聚乙二醇)存在下融合。克隆在融合中获得的杂交细胞，并选择分泌所需抗体的细胞克隆。例如，可将用合适的免疫原免疫的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系PAI或骨髓瘤细胞系Sp2/0-Ag 14的细胞融合。融合后，将细胞在合适的培养基中扩增，以规则的间隔为所述培养基补充选择培养基，例如HAT培养基，以防止正常骨髓瘤细胞生长超过所需的杂交瘤细胞。然后筛选获得的杂交细胞的所需抗体(例如与人IL-27结合的抗体)的分泌，并且在一些实施方案中，技术人员可从美国专利号6,300,064(属于Knappik等人；Morphosys AG)和Schoonbroodt等人(2005)Nucleic Acids Res 33(9):e81中描述的非免疫偏向的文库中鉴定抗IL-27抗体。
在一些实施方案中，本文所述的方法可涉及例如噬菌体展示技术、细菌展示、酵母表面展示、真核生物病毒展示、哺乳动物细胞展示和无细胞(例如，核糖体展示)抗体筛选技术或与所述技术结合使用(参见例如，Etz等人(2001)J Bacteriol 183:6924-6935；Cornelis(2000)Curr Opin Biotechnol 11:450-454；Klemm等人(2000)Microbiology146:3025-3032；Kieke等人(1997)Protein Eng 10:1303-1310；Yeung等人(2002)BiotechnolProg 18:212-220；Boder等人(2000)Methods Enzymology 328:430-444；Grabherr等人(2001)Comb Chem High Throughput Screen 4:185-192；Michael等人(1995)Gene Ther2:660-668；Pereboev等人(2001)J Virol 75:7107-7113；Schaffitzel等人(1999)J ImmunolMethods 231:119-135；以及Hanes等人(2000)Nat Biotechnol 18:1287-1292)。
使用各种噬菌体展示方法鉴定抗体的方法是本领域已知的。在噬菌体展示方法中，将功能性抗体结构域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。这种噬菌体可用于展示抗体的抗原结合结构域，例如Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体片段，其从文库或组合抗体文库(例如，人或鼠)中表达。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，诸如fd和M13。抗原结合结构域表达为与噬菌体外壳蛋白pIII、pVIII或pIX中的任一种重组融合的蛋白质。参见例如，Shi等人(2010)JMB 397:385-396。本文所述的可用于制备免疫球蛋白或其片段的噬菌体展示方法的实例包括以下文献中公开的那些：Brinkman等人(1995)J Immunol Methods 182:41-50；Ames等人(1995)J Immunol Methods 184:177-186；Kettleborough等人(1994)Eur J Immunol 24:952-958；Persic等人(1997)Gene 187:9-18；Burton等人(1994)Advances in Immunology 57:191-280；以及PCT公布号WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982和WO 95/20401。合适的方法也描述在例如美国专利第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号和第5,969,108号中。
在一些实施方案中，噬菌体展示抗体库可使用从免疫哺乳动物的B细胞收集的mRNA来产生。例如，可从用如上所述的IL-27多肽免疫的小鼠中分离包含B细胞的脾细胞样品。可从细胞中分离出mRNA，并使用标准分子生物学技术将其转化为cDNA。参见例如，Sambrook等人(1989)“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,”Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Harlow和Lane(1988),同上；BennyK.C.Lo(2004),同上；以及Borrebaek(1995),同上。将编码免疫球蛋白重链和轻链多肽的可变区的cDNA用于构建噬菌体展示文库。用于产生这种文库的方法描述于，例如，Merz等人(1995)J Neurosci Methods 62(1-2):213-9；Di Niro等人(2005)Biochem J 388(Pt 3):889-894；以及Engberg等人(1995)Methods Mol Biol 51:355-376中。
在一些实施方案中，选择和筛选的组合可用于从例如杂交瘤产生的抗体群体或噬菌体展示抗体文库中鉴定目标抗体。合适的方法在本领域中是已知的，并且描述于例如Hoogenboom(1997)Trends in Biotechnology 15:62-70；Brinkman等人(1995),同上；Ames等人(1995),同上；Kettleborough等人(1994),同上；Persic等人(1997),同上；以及Burton等人(1994),同上中。例如，使用标准分子生物学技术产生多种噬菌粒载体(每种噬菌粒载体编码噬菌体外壳蛋白(例如，M13噬菌体的pIII、pVIII或pIX)与不同抗原结合区的融合蛋白)，然后将其引入细菌群体(例如，大肠杆菌)中。在一些实施方案中，细菌中噬菌体的表达可能需要使用辅助噬菌体。在一些实施方案中，不需要辅助噬菌体(参见，例如，Chasteen等人,(2006)Nucleic Acids Res34(21):e145)。回收从细菌产生的噬菌体，然后将其与例如与固体支持物结合的(固定的)靶抗原接触。还可将噬菌体与溶液中的抗原接触，随后使复合物结合到固体支持物上。
可使用本领域已知的任何基于免疫学或生物化学的方法来表征使用上述方法筛选的抗体亚群的对特定抗原(例如，人IL-27)的特异性和结合亲和力。例如，抗体与IL-27的特异性结合可以例如使用基于免疫学或生物化学的方法来确定，所述方法是诸如但不限于，如上所述的ELISA测定法、SPR测定、免疫沉淀测定、亲和色谱和平衡透析。可用于分析抗体的免疫特异性结合和交叉反应性的免疫测定包括但不限于竞争性和非竞争性测定系统，其使用诸如蛋白质印迹、RIA、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫分析、免疫沉淀测定、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定等技术。此类测定是常规的并且在本领域中是公知的。
应当理解，上述方法也可用于确定，例如，抗IL-27抗体是否不与全长人IL-27和/或IL-27蛋白结合。
在其中选择的CDR氨基酸序列是短序列(例如，长度少于10-15个氨基酸)的实施方案中，可如例如Shiraishi等人(2007)Nucleic Acids Symposium Series 51(1):129-130和美国专利号6,995,259中所述，化学合成编码CDR的核酸。对于编码受者抗体的给定核酸序列，编码CDR的核酸序列的区域可使用标准分子生物学技术，利用化学合成的核酸来替换。可以合成化学合成的核酸的5’和3’末端以包含粘性末端限制性酶切位点，用于将核酸克隆到编码供体抗体的可变区的核酸中。
在一些实施方案中，本文所述的抗IL-27抗体包含改变的重链恒定区，所述改变的重链恒定区相对于其相应的未改变的恒定区具有降低的(或无)效应子功能。涉及抗IL-27抗体的恒定区的效应子功能可通过改变恒定区或Fc区的特性来调整。改变的效应子功能包括，例如，以下活性中的一种或多种的调节：抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、细胞凋亡、与一种或多种Fc受体的结合以及促炎响应。调节是指与恒定区的未改变形式的活性相比，包含改变的恒定区的受试抗体所表现出的效应子功能活性的增强、降低或消除。在特定实施方案中，调节包括其中活性被消除或完全不存在的情况。
在一个实施方案中，本文所述的抗IL-27抗体包含IgG4重链恒定区。在一个实施方案中，IgG4重链恒定区是野生型IgG4重链恒定区。在另一个实施方案中，例如，根据EU编号(Kabat,E.A.等人，同上)，IgG4恒定区包含突变，例如，S228P和L235E或L235A之一或两者。用于本公开的抗体的野生型和突变型IgG4恒定区的代表性序列示于表12中。在一个实施方案中，本文所述的抗IL-27抗体包含IgG1恒定区。在一个实施方案中，IgG1重链恒定区是野生型IgG1重链恒定区。在另一个实施方案中，IgG1重链恒定区包含突变。用于本公开的抗体的野生型和突变型IgG4恒定区的代表性序列示于表12中。
具有改变的FcR结合亲和力和/或ADCC活性和/或改变的CDC活性的改变的恒定区是这样的多肽，所述多肽与恒定区的未改变形式相比具有提高或降低的FcR结合活性和/或ADCC活性和/或CDC活性。显示与FcR结合增强的改变的恒定区以比未改变的多肽更大的亲和力结合至少一种FcR。显示与FcR结合降低的改变的恒定区以比恒定区的未改变形式更低的亲和力结合至少一种FcR。此类显示出与FcR的结合降低的变体可具有很少或不明显的与FcR的结合，例如，与天然序列免疫球蛋白恒定区或Fc区与FcR的结合水平相比，0至50％(例如，小于50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)的与FcR的结合。类似地，与未改变的恒定区相比，显示经调整的ADCC和/或CDC活性的改变的恒定区可显示出增强的或降低的ADCC和/或CDC活性。例如，在一些实施方案中，包含改变的恒定区的抗IL-27抗体可表现出约0至50％(例如，小于50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)的恒定区的未改变形式的ADCC和/或CDC活性。表现出降低的ADCC和/或CDC的包含改变的恒定区的本文所述的抗IL-27抗体可表现出降低的ADCC和/或CDC活性或无ADCC和/或CDC活性。
在一些实施方案中，本文所述的抗IL-27抗体表现出降低的效应子功能或无效应子功能。在一些实施方案中，抗IL-27抗体包含杂交恒定区或其部分，诸如G2/G4杂交恒定区(参见，例如，Burton等人(1992)Adv Immun 51:1-18；Canfield等人(1991)J Exp Med173:1483-1491；以及Mueller等人(1997)Mol Immunol 34(6):441-452)。参见上文。
在一些实施方案中，抗IL-27抗体可包含表现出增强或降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)的改变的恒定区。可通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代、插入或缺失来调整CDC活性。参见，例如美国专利第6,194,551号。可选地或另外地，可在Fc区中引入一个或多个半胱氨酸残基，从而允许在该区域中形成链间二硫键。如此产生的同二聚体抗体可能具有提高或降低的内化能力和/或增强或降低的补体介导的细胞杀伤。参见例如，Caron等人(1992)J Exp Med176:1191-1195和Shopes(1992)Immunol 148:2918-2922；PCT公布号WO 99/51642和WO 94/29351；Duncan和Winter(1988)Nature322:738-40；以及美国专利号5,648,260和5,624,821。
重组抗体的表达和纯化
本文所述的抗体或其抗原结合片段可使用分子生物学和蛋白质化学领域中已知的多种技术来生产。例如，可将编码抗体的重链和轻链多肽中的一种或两种的核酸插入包含转录和翻译调控序列的表达载体中，所述调控序列包括例如启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、转录终止子信号、多腺苷酸化信号和增强子或激活子序列。调控序列包括启动子以及转录起始和终止序列。另外，表达载体可包括一个以上的复制系统，使得其可在两种不同的生物体中得以保持，例如在哺乳动物或昆虫细胞中进行表达，以及在原核宿主中进行克隆和扩增。
几种可能的载体系统可用于在哺乳动物细胞中表达从核酸克隆的重链和轻链多肽。一类载体依赖于将所需基因序列整合到宿主细胞基因组中。具有稳定整合的DNA的细胞可通过同时引入药物抗性基因诸如大肠杆菌gpt(Mulligan和Berg(1981)Proc Natl AcadSci USA78:2072)或Tn5 neo(Southern和Berg(1982)Mol Appl Genet 1:327)来选择。可将选择标记基因与待表达的DNA序列连接，或者可通过共转染将可选择标记基因引入同一细胞(Wigler等人(1979)Cell 16:77)。第二类载体利用赋予染色体外质粒自主复制能力的DNA元件。这些载体可来源于动物病毒，诸如牛乳头瘤病毒(Sarver等人(1982)Proc NatlAcad Sci USA,79:7147)、巨细胞病毒、多瘤病毒(Deans等人(1984)Proc Natl Acad SciUSA 81:1292)或SV40病毒(Lusky和Botchan(1981)Nature 293:79)。
可将表达载体以适合核酸后续表达的方式引入细胞。如下所论述的，引入方法主要由靶细胞类型决定。示例性方法包括CaPO4沉淀、脂质体融合、阳离子脂质体、电穿孔、病毒感染、葡聚糖介导的转染、凝聚胺介导的转染、原生质体融合和直接显微注射。
用于表达抗体或其抗原结合片段的合适宿主细胞包括酵母、细菌、昆虫、植物和哺乳动物细胞。特别感兴趣的是细菌诸如大肠杆菌、真菌诸如酿酒酵母和毕赤酵母、昆虫细胞诸如SF9、哺乳动物细胞系(例如，人细胞系)以及原代细胞系。
在一些实施方案中，抗体或其片段可以在转基因动物(例如，转基因哺乳动物)中表达并从其纯化。例如，如在例如Houdebine(2002)Curr Opin Biotechnol 13(6):625-629；van Kuik-Romeijn等人(2000)Transgenic Res 9(2):155-159；和Pollock等人(1999)J Immunol Methods231(1-2):147-157中所述，可在转基因非人哺乳动物(例如，啮齿动物)中产生抗体，并从乳汁中分离所述抗体。
抗体及其片段可通过在足以允许蛋白质表达的条件下培养用含有编码抗体或片段的核酸的表达载体转化的宿主细胞，持续一定量的时间而从细胞中产生。用于蛋白质表达的此类条件将随表达载体和宿主细胞的选择而变化，并且将由本领域技术人员通过常规实验来容易地确定。例如，可将在大肠杆菌中表达的抗体从包涵体中重新折叠(参见例如，Hou等人(1998)Cytokine 10:319-30)。细菌表达系统及其使用方法在本领域中是公知的(参见Current Protocols in Molecular Biology,Wiley&Sons,and MolecularCloning--A Laboratory Manual--第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork(2001))。密码子、合适的表达载体和合适的宿主细胞的选择将根据许多因素而变化，并且可以根据需要容易地进行优化。本文所述的抗体(或其片段)可在哺乳动物细胞或其它表达系统(包括但不限于酵母、杆状病毒)和体外表达系统(参见例如，Kaszubska等人(2000)Protein Expression and Purification 18:213-220)中表达。
表达后，可以分离抗体及其片段。抗体或其片段可用本领域技术人员已知的多种方法分离或纯化，这取决于样品中存在的其它组分。标准纯化方法包括电泳技术、分子技术、免疫学技术和色谱技术，包括离子交换色谱、疏水色谱、亲和色谱和反相HPLC色谱。例如，可使用标准抗-抗体柱(例如，蛋白-A或蛋白-G柱)纯化抗体。与蛋白质浓缩结合的超滤和渗滤技术也是有用的。参见例如，Scopes(1994)“Protein Purification，第3版，”Springer-Verlag,New York City,New York。必需的纯化程度将根据所需的用途而变化。在一些情况下，所表达的抗体或其片段的纯化不是必需的。
测定纯化抗体或其片段的产率或纯度的方法在本领域中是已知的，包括例如Bradford测定、紫外光谱学、双缩脲蛋白测定、Lowry蛋白测定、氨基黑蛋白测定、高压液相色谱(HPLC)、质谱(MS)和凝胶电泳方法(例如，使用蛋白染色剂诸如考马斯蓝或胶体银染色)。
抗体或其抗原结合片段的修饰
可在表达和纯化后修饰抗体或其抗原结合片段。修饰可以是共价或非共价修饰。此类修饰可通过例如多肽的靶向氨基酸残基与能够与选定的侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应而引入抗体或片段中。可使用多个标准(包括例如抗体或片段的结构分析或氨基酸序列分析)中的任一个选择合适的修饰位点。
在一些实施方案中，可将抗体或其抗原结合片段与异源部分缀合。异源部分可以是例如异源多肽、治疗剂(例如，毒素或药物)或可检测的标记物，诸如但不限于放射性标记物、酶促标记物、荧光标记物、重金属标记物、发光标记物或亲和标签诸如生物素或链霉抗生物素蛋白。合适的异源多肽包括，例如，抗原标签(FLAG(DYKDDDDK(SEQ ID NO:405))、聚组氨酸(6-His；HHHHHH(SEQ ID NO:406)、血凝素(HA；YPYDVPDYA(SEQ ID NO:407))、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或麦芽糖结合蛋白(MBP))，用于纯化抗体或片段。异源多肽还包括用作诊断或可检测标志物的多肽(例如酶)，例如萤光素酶、荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白(GFP))或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。合适的放射性标记包括例如32P、33P、14C、125I、131I、35S和3H。合适的荧光标记包括但不限于荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、绿色荧光蛋白(GFP)、DyLightTM488、藻红蛋白(PE)、碘化丙啶(PI)、PerCP、PE-Alexa700、Cy5、别藻蓝蛋白和Cy7。发光标记物包括，例如，多种发光镧系元素(例如，铕或铽)螯合物中的任一种。例如，合适的铕螯合物包括二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)的铕螯合物。酶促标记物包括例如碱性磷酸酶、CAT、萤光素酶和辣根过氧化物酶。
两种蛋白质(例如，抗体和异源部分)可使用许多已知的化学交联剂中的任一种进行交联。此类交联剂的实例是通过包含“受阻的”二硫键的键联连接两个氨基酸残基的那些交联剂。在这些键联中，交联单元内的二硫键被保护(通过阻碍二硫键两侧上的基团)免受通过例如还原型谷胱甘肽或二硫化物还原酶的作用进行的还原。一种合适的试剂4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α(2-吡啶基二硫代)甲苯(SMPT)利用一种蛋白质上的末端赖氨酸和另一种蛋白质上的末端半胱氨酸在两个蛋白质之间形成这种键联。还可使用通过每个蛋白质上不同的偶联部分交联的异双功能试剂。其它有用的交联剂包括但不限于连接两个氨基(例如，N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰基氧基琥珀酰亚胺)、两个巯基(例如，1,4-双-马来酰亚胺基丁烷)、氨基和巯基(例如，间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、氨基和羧基(例如，4-[对-叠氮基水杨酰胺基]丁胺)以及氨基和存在于精氨酸的侧链中的胍基(例如，对-叠氮基苯基乙二醛一水合物)的试剂。
在一些实施方案中，可将放射性标记物直接与抗体的氨基酸骨架直接缀合。或者，可将放射性标记物作为更大分子的一部分(例如，间-[125I]碘代苯基-N-羟基琥珀酰亚胺([125I]mIPNHS)中的125I)包含，其与游离氨基结合以形成相关蛋白质的间碘代苯基(mIP)衍生物(参见例如，Rogers等人(1997)J Nucl Med 38:1221-1229)或螯合物(例如，与DOTA或DTPA的螯合物)，然后又将其与蛋白质骨架结合。将放射性标记物或含有它们的更大的分子/螯合物与本文所述的抗体或抗原结合片段缀合的方法是本领域已知的。此类方法涉及在有利于放射性标记物或螯合剂与蛋白质结合的条件(例如，pH、盐浓度和/或温度)下将蛋白质与放射性标记物一起孵育(例如，参见美国专利第6,001,329号)。
将荧光标记物(有时称为“荧光团”)与蛋白质(例如，抗体)缀合的方法在蛋白质化学领域中是已知的。例如，可使用连接到荧光团的琥珀酰亚胺(NHS)酯或四氟苯基(TFP)酯部分，将荧光团与蛋白质的游离氨基(例如，赖氨酸的)或巯基(例如，半胱氨酸的)缀合。在一些实施方案中，可将荧光团与异双官能交联剂部分(诸如磺基-SMCC)缀合。合适的缀合方法涉及在促进荧光团与蛋白质结合的条件下，将抗体蛋白质或其片段与荧光团一起孵育。参见，例如，Welch和Redvanly(2003)“Handbook of Radiopharmaceuticals:Radiochemistry and Applications,”John Wiley和Sons(ISBN 0471495603)。
在一些实施方案中，可以例如用改善抗体在循环中(例如，在血液、血清或其它组织中)的稳定性和/或保留的部分修饰抗体或片段。例如，可如例如Lee等人(1999)Bioconjug Chem 10(6):973-8；Kinstler等人(2002)Advanced Drug Deliveries Reviews54:477-485；和Roberts等人(2002)Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476中所述对抗体或片段进行聚乙二醇化，或者可对所述对抗体或片段进行羟乙基化(HESylated)(Fresenius Kabi,Germany；参见例如等人(2010)Int J Pharm 387(1-2):110-119)。稳定化部分可将抗体(或片段)的稳定性或保留性提高至少1.5倍(例如，至少2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍或50倍或更多倍)。
在一些实施方案中，可以糖基化本文所述的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，可将本文所述的抗体或其抗原结合片段进行酶促或化学处理，或者从细胞中产生所述抗体或其抗原结合片段，使得所述抗体或片段具有减少的糖基化或不存在糖基化。用于产生糖基化减少的抗体的方法是本领域已知的，并且描述于例如美国专利号6,933,368；Wright等人(1991)EMBO J 10(10):2717-2723；和Co等人(1993)Mol Immunol 30:1361。
药物组合物和制剂
在某些实施方案中，本发明提供了包含抗IL-27抗体和药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的药物组合物。
在某些实施方案中，可接受的制剂材料优选在所采用的剂量和浓度下对受者无毒。在某些实施方案中，一种或多种制剂材料用于皮下和/或静脉内施用。在某些实施方案中，药物组合物可包含用于改变、维持或保存例如组合物的pH、重量摩尔渗透压浓度、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶出或释放速率、吸附或渗透的制剂材料。在某些实施方案中，合适的制剂材料包括但不限于氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(诸如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(诸如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)；填充剂(诸如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(诸如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟基丙基-β-环糊精)；填充物；单糖；二糖；和其它碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(诸如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(诸如钠)；防腐剂(诸如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(诸如甘露醇或山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或湿润剂(诸如普流尼克、PEG、脱水山梨醇酯、聚山梨醇酯诸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、triton、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊)；稳定性增强剂(诸如蔗糖或山梨醇)；张力增强剂(诸如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾，甘露醇山梨醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。(Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A.R.Gennaro，编辑，Mack Publishing Company(1995)。在某些实施方案中，制剂包含PBS；20mM NaOAC(pH 5.2)、50mM NaCl；和/或10mM NAOAC(pH 5.2)、9％的蔗糖。在某些实施方案中，最佳药物组合物将由本领域技术人员根据例如预期的施用途径、递送形式和所需剂量来确定。参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，同上。在某些实施方案中，此类组合物可影响抗IL-27抗体的物理状态、稳定性、体内释放速率和/或体内清除速率。
在某些实施方案中，药物组合物中的主要媒介物或载体本质上可以是水性或非水性的。例如，在某些实施方案中，合适的媒介物或载剂可以是注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，其可能补充有用于肠胃外施用的组合物中常用的其它材料。在某些实施例中，盐水包含等渗磷酸盐缓冲盐水。在某些实施方案中，中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是进一步的示例性媒介物。在某些实施方案中，药物组合物包含pH为约7.0-8.5的Tris缓冲液，或pH为约4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，其还可包含山梨醇或其合适的替代物。在某些实施方案中，可通过将所选的具有所需纯度的组合物与任选的配制剂(Remington'sPharmaceutical Sciences，同上)以冻干饼或水溶液的形式混合来制备包含抗IL-27抗体的组合物以用于储存。另外，在某些实施方案中，可使用合适的赋形剂诸如蔗糖将包含抗IL-27抗体的组合物配制成冻干物。
在某些实施方案中，可选择药物组合物用于肠胃外递送。在某些实施方案中，可选择组合物用于吸入或通过消化道(诸如口服)递送。此类药学上可接受的组合物的制备在本领域技术人员的能力范围内。
在某些实施方案中，制剂组分以施用部位可接受的浓度存在。在某些实施方案中，缓冲液用于将组合物保持在生理pH或稍低的pH下，通常在约5至约8的pH范围内。
在某些实施方案中，当设想肠胃外施用时，治疗性组合物可以以无热原、肠胃外可接受的水溶液的形式存在于药学上可接受的媒介物中，所述水溶液包含抗IL-27抗体。在某些实施方案中，用于肠胃外注射的媒介物是无菌蒸馏水，其中抗IL-27抗体被配制成无菌等渗溶液，并被适当保存。在某些实施方案中，所述制备可涉及将所需分子与剂(诸如可注射微球、生物可侵蚀颗粒、聚合化合物(诸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体)一起配制，所述剂可提供产品的受控或持续释放，所述产品然后可通过储库注射进行递送。在某些实施方案中，还可使用透明质酸，所述透明质酸可具有促进循环中的持续时间的作用。在某些实施方案中，可植入药物递送装置可用于引入所需的分子。
在某些实施方案中，药物组合物可以被配制用于吸入。在某些实施方案中，抗IL-27抗体可被配制成干粉用于吸入。在某些实施方案中，可用用于气雾剂递送的推进剂配制包含抗IL-27抗体的吸入溶液。在某些实施方案中，可将溶液雾化。在PCT申请号PCT/US94/001875(其描述了经化学修饰的蛋白质的肺部递送)中进一步描述了肺部施用。
在某些实施方案中，设想了可以口服施用制剂。在某些实施方案中，可以用或可以不用通常用于配制固体剂型诸如片剂和胶囊剂的那些载体来配制以这种方式施用的抗IL-27抗体。在某些实施方案中，胶囊剂可被设计成在胃肠道中在生物利用度被最大化且体系前降解被最小化时的点释放制剂的活性部分。在某些实施方案中，可包括至少一种另外的剂以促进抗IL-27抗体的吸收。在某些实施方案中，还可使用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。
在某些实施方案中，药物组合物可包含有效量的抗IL-27抗体与适合于片剂生产的无毒赋形剂的混合物。在某些实施方案中，通过将片剂溶解在无菌水或另一种合适的媒介物中，可以单位剂量形式制备溶液。在某些实施方案中，合适的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，诸如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
其它药物组合物对本领域技术人员来说是显而易见的，包括在持续或受控释放制剂中包含抗IL-27抗体的制剂。在某些实施方案中，用于配制多种其它持续或受控递送部件(诸如脂质体载体、可生物消蚀的微粒或多孔珠粒和储库注射剂)的技术对于本领域技术人员来说也是已知的。参见例如描述用于递送药物组合物的多孔聚合物微粒的受控释放的PCT申请号PCT/US93/00829。在某些实施方案中，持续释放制剂可包括成型制品形式(例如薄膜或微胶囊)的半透性聚合物基质。持续释放基质可包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯(美国专利第3,773,919和EP 058,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人，Biopolymers,22:547-556(1983))、聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)和Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。在某些实施方案中，持续释放组合物还可包含脂质体，其可通过本领域已知的几种方法中的任一种来制备。参见，例如，Eppstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688-3692(1985)；EP 036,676；EP088,046和EP 143,949。
用于体内施用的药物组合物通常是无菌的。在某些实施方案中，这可以通过无菌过滤膜过滤来实现。在某些实施方案中，当冻干组合物时，使用该方法的灭菌可以在冻干和复原之前或之后进行。在某些实施方案中，用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或溶液形式储存。在某些实施方案中，通常将肠胃外组合物置于具有无菌入口的容器中，例如，具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内注射溶液袋或小瓶。
在某些实施方案中，一旦配制了药物组合物，就可将其以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体的形式或作为脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。在某些实施方案中，可将此类制剂以即用型或施用复原的形式(例如，冻干的)储存。
在某些实施方案中，提供了用于产生单剂量施用单位的药盒。在某些实施方案中，药盒可包含含有干燥蛋白质的第一容器和含有水性制剂的第二容器。在某些实施方案中，包括了包含单室和多室预填充注射器(例如，液体注射器和冻干注射器)的药盒。
在某些实施方案中，待治疗性使用的包含抗IL-27抗体的药物组合物的有效量将取决于例如治疗背景和目标。本领域技术人员将理解，根据某些实施方案，用于治疗的合适剂量水平将因此部分取决于所递送的分子、对其使用抗IL-27抗体的适应症、施用途径和患者的尺寸(体重、身体表面积或器官尺寸)和/或状况(年龄和一般健康状况)而变化。在某些实施方案中，临床医生可滴定剂量并修改施用途径以获得最佳治疗效果。
在某些实施方案中，给药频率将考虑所用制剂中抗IL-27抗体的药代动力学参数。在某些实施方案中，临床医生将施用该组合物，直至达实现期望效果的剂量。在某些实施方案中，所述组合物因此可以随时间以单剂量或两个或更多个剂量(其可以包含或可以不包含相同量的所需分子)施用，或者作为经由植入装置或导管的连续输注施用。适当剂量的进一步细化由本领域普通技术人员常规进行，并且在他们常规执行的任务的范围内。在某些实施例中，可通过使用适当的剂量-响应数据来确定适当的剂量。
在某些实施方案中，药物组合物的施用途径依照已知的方法，例如口服，通过经由静脉内、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌内、皮下、眼内、动脉内、门静脉内或病变内途径的注射；通过持续释放系统或植入装置。在某些实施方案中，组合物可通过推注注射施用或通过输注连续施用，或通过植入装置施用。在某些实施方案中，组合疗法的单个成分可以通过不同的途径施用。
在某些实施方案中，可通过植入其上已吸附或包封了所需分子的膜、海绵或另一种合适的材料来局部施用所述组合物。在某些实施方案中，在使用植入装置的情况下，可将所述装置植入任何合适的组织或器官中，并且所需分子的递送可通过扩散、定时释放推注或连续施用来进行。在某些实施方案中，可希望以离体方式使用包含抗IL-27抗体的药物组合物。在此类情况下，将从患者取出的细胞、组织和/或器官暴露于包含抗IL-27抗体的药物组合物中，之后将所述细胞、组织和/或器官植入回患者体内。
在某些实施方案中，可通过使用方法(诸如本文所述的那些方法)植入某些已被遗传工程化的细胞以表达和分泌多肽来递送抗IL-27抗体。在某些实施方案中，此类细胞可以是动物或人细胞，并且可以是自体的、异源的或异种的。在某些实施方案中，可使细胞永生化。在某些实施方案中，为了减少免疫响应的机会，可包封细胞以避免对周围组织的浸润。在某些实施方案中，包封材料通常是生物相容的、半透性的聚合物外壳或膜，其允许一种或多种蛋白质产物的释放，但防止细胞被患者的免疫系统或来自周围组织的其它有害因素破坏。
应用
本文所述的组合物可用于多种诊断和治疗应用。例如，可检测标记的抗原结合分子可用于检测靶抗原在样品(例如，生物样品)中的存在或量的测定。所述组合物可用于研究靶抗原功能的抑制的体外测定。在例如其中所述组合物与补体蛋白结合并抑制补体蛋白的一些实施方案中，所述组合物可在测定中用作阳性对照，所述测定被设计成鉴定抑制补体活性或以其它方式用于治疗补体相关病症的其它新型化合物。例如，IL-27抑制组合物可在测定中用作阳性对照，以鉴定减少或消除IL-27产生的其它化合物(例如，小分子、适体或抗体)。所述组合物也可用于下文详述的治疗方法。
在一些实施方案中，本公开提供了检测生物样品或受试者中IL-27的方法，包括(i)在允许抗体分子和IL-27发生相互作用的条件下，使样品或受试者(和任选的参考样品或受试者)与本文所述的任何抗体接触，以及(ii)检测抗体分子与样品或受试者(和任选的参考样品或受试者)之间复合物的形成。
药盒
药盒可包括如本文公开的抗IL-27抗体和使用说明书。药盒可在适当的容器中包含抗IL-27抗体、一种或多种对照和各种缓冲液、试剂、酶以及本领域公知的其它标准成分。在一些方面，本公开提供了药盒，其包括本文公开的抗IL-27抗体或抗原结合部分，以及刺激受试者中的免疫响应或治疗受试者的癌症的使用说明书，任选地具有与本文所述的一种或多种另外的治疗剂或程序组合的使用说明书。
容器可包括至少一个可将抗IL-27抗体放入其中以及在一些情况下适当地将抗IL-27抗体在其中等分的小瓶、孔、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器装置。如果提供了另外的部件，药盒可含有可将这种部件放入其中的另外的容器。所述药盒还可包括以密封方式容纳抗IL-27抗体和任何其它试剂容器的装置以用于商业销售。此类容器可包括将所需小瓶保持在其中的注塑成型或吹塑成型塑料容器。容器和/或药盒可包括带有使用说明书和/或警告的标签。
使用方法
本发明的组合物具有许多体外和体内用途，包括IL-27和/或对IL-27功能的拮抗的检测和/或定量。
在一些实施方案中，本公开提供了抑制或减少细胞中的STAT1和/或STAT3磷酸化的方法，所述方法包括使所述细胞与本公开所提供的分离的单克隆抗体或抗原结合片段接触，其中所述抗体或其抗原结合部分抑制或减少细胞中的STAT1和/或STAT3磷酸化。
在一些实施方案中，本公开提供了抑制或减轻对细胞中CD161表达的抑制的方法，所述方法包括使所述细胞与本公开所提供的分离的单克隆抗体或抗原结合片段接触，其中所述抗体或其抗原结合部分抑制或减轻对细胞中CD161表达的抑制。
在一些实施方案中，本公开提供了抑制或减少细胞中的PD-L1和/或TIM-3表达的方法，所述方法包括使所述细胞与本公开所提供的分离的单克隆抗体或抗原结合片段接触，其中所述抗体或其抗原结合部分抑制或细胞中的PD-L1和/或TIM-3表达。
在一些实施方案中，本公开提供了诱导或增强一种或多种细胞因子从细胞的分泌的方法，所述方法包括使所述细胞与本公开所提供的分离的单克隆抗体或抗原结合片段接触，其中所述抗体或其抗原结合部分诱导或增强PD-1介导的一种或多种细胞因子从细胞的分泌。
在一些实施方案中，本公开提供了刺激受试者的免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开所提供的特异性地结合至并拮抗人IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，或包含所述抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体的药物组合物。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开所提供的特异性地结合至并拮抗IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，或包含所述抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体的药物组合物。
在一些实施方案中，本公开提供了刺激受试者的免疫响应或治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开所提供的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，或包含所述抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合部分或药物组合物抑制或减少细胞中的STAT1和/或STAT3磷酸化，从而刺激免疫响应或治疗癌症。
在一些实施方案中，本公开提供了刺激受试者的免疫响应或治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开所提供的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，或包含所述抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合部分或药物组合物抑制或减轻对细胞中CD161表达的抑制，从而刺激免疫响应或治疗癌症。
在一些实施方案中，本公开提供了刺激受试者的免疫响应或治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开所提供的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，或包含所述抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合部分或药物组合物抑制或减少细胞中的PD-L1和/或TIM-3表达，从而刺激免疫响应或治疗癌症。
在一些实施方案中，本公开提供了刺激受试者的免疫响应或治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开所提供的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，或包含所述抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合部分或药物组合物诱导或增强PD-1介导的一种或多种细胞因子从细胞的分泌，从而刺激免疫响应或治疗癌症。
在一些实施方案中，所述癌症选自肺癌(例如，非小细胞肺癌)、肉瘤、睾丸癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、黑素瘤、头颈癌(例如，鳞状头颈癌)、结肠直肠癌、膀胱癌、子宫内膜癌、前列腺癌、甲状腺癌、肝细胞癌、胃癌、脑癌、淋巴瘤(例如，DL-BCL)、白血病(例如，AML)或肾癌(例如，肾细胞癌，例如，肾透明细胞癌)。
上述组合物尤其可用于治疗或预防受试者的多种癌症的方法。可使用多种部分取决于施用途径的方法向受试者(例如人受试者)施用组合物。所述途径可以是例如静脉内注射或输注(IV)、皮下注射(SC)、腹膜内(IP)注射、肌内注射(IM)或鞘内注射(IT)。注射可以是推注或连续输注。
施用可通过例如局部输注、注射或通过植入来实现。植入物可以是多孔的、无孔的或凝胶状的材料，包括膜，诸如唾液弹性膜或纤维。植入物可被配置用于向受试者持续或定期释放组合物。参见，例如美国专利申请公开号20080241223；美国专利第5,501,856号、第4,863,457号和第3,710,795号；EP488401；以及EP 430539，所述专利申请和专利中的每一项通过引用整体并入本文。可通过基于例如扩散系统、可侵蚀系统或对流系统的可植入装置(例如，渗透泵、生物可降解的植入物、电扩散系统、电渗系统、蒸汽压泵、电解泵、起泡泵、压电泵、基于侵蚀的系统或机电系统)向受试者递送组合物。
在一些实施方案中，通过局部施用将抗IL-27抗体或其抗原结合片段治疗性地递送给受试者。
本文所述的抗体或其片段的合适剂量(所述剂量能够治疗或预防受试者的癌症)可取决于多种因素，包括例如待治疗的受试者的年龄、性别和体重以及所用的特定抑制剂化合物。例如，与治疗同一受试者所需的IL-27结合Fab’抗体片段的剂量相比，治疗患有癌症的受试者可能需要不同剂量的完整抗IL-27抗体。影响向受试者施用的剂量的其它因素包括，例如，癌症的类型或严重程度。例如，与患有胶质母细胞瘤的受试者相比，患有转移性黑素瘤的受试者可能需要施用不同剂量的抗IL-27抗体。其它因素可包括，例如，同时或之前影响受试者的其它医学病症、受试者的一般健康状况、受试者的遗传倾向、饮食、施用时间、排泄速率、药物组合以及向受试者施用的任何其它另外的治疗剂。还应当理解，任何特定对象的具体剂量和治疗方案也将取决于从业医生(例如，医生或护士)的判断。本文描述了合适的剂量。
药物组合物可包含治疗有效量的本文所述的抗IL-27抗体或其抗原结合片段。如果使用一种以上的剂，本领域普通技术人员可以部分地基于所施用的抗体的效果或者抗体与一种或多种另外的活性剂的组合效果，来容易地确定这样的有效量。本文所述的抗体或其片段的治疗有效量也可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体(和一种或多种另外的活性剂)在个体中引发期望的响应(例如，肿瘤生长减少)的能力等因素而变化。例如，治疗有效量的抗IL-27抗体可以抑制(减轻其严重程度或消除其发生)和/或预防特定病症和/或本领域已知或本文所述的特定病症的任一种症状。治疗有效量也是其中组合物的任何毒性或有害作用被治疗有益效果所超过的量。
可在例如I期剂量升级研究中进一步评估本文所述的任何抗体或其片段的合适的人剂量。参见例如，van Gurp等人(2008)Am J Transplantation 8(8):1711-1718；Hanouska等人(2007)Clin Cancer Res13(2,part 1):523-531；以及Hetherington等人(2006)Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50(10):3499-3500。
在一些实施方案中，组合物包含本文所述的任何抗体或其抗原结合片段以及一种或多种(例如，两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、10种或11种或更多种)另外的治疗剂，使得组合物整体上是治疗有效的。例如，组合物可包含本文所述的抗IL-27抗体和烷化剂，其中抗体和剂各自的浓度在组合时对治疗或预防受试者的癌症(例如，黑素瘤)是治疗上有效的。
此类组合物的毒性和治疗效果可通过细胞培养物或实验动物(例如，本文所述的任何癌症的动物模型)中的已知制药程序来确定。这些程序可用于，例如，确定LD50(50％群体的致死剂量)和ED50(50％群体的治疗有效剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数，并且可以表达为比率LD50/ED50。表现出高治疗指数的抗体或其抗原结合片段是优选的。虽然可使用显示出毒副作用的组合物，但应当注意设计将此类化合物靶向到受累组织部位并使对正常细胞的潜在损伤降至最低，从而减小副作用的递送系统。
从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于配制在人中使用的一系列剂量。此类抗体或其抗原结合片段的剂量通常在包括ED50的抗体或片段的循环浓度范围内，且毒性很小或没有毒性。剂量可在这个范围内变化，这取决于所用的剂型和所用的施用途径。对于本文所述的抗IL-27抗体，治疗有效剂量可以最初从细胞培养测定中估计。可在动物模型中配制剂量，以达到包括如在细胞培养物中确定的IC50(即，达到症状的半最大抑制的抗体浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可用于更准确地确定人体内的有用剂量。血浆中的水平可以例如通过高效液相色谱来测量。在一些实施方案中，例如，在需要局部施用(例如，至眼睛或关节)的情况下，可将细胞培养或动物建模用于确定在局部部位内达到治疗有效浓度所需的剂量。
在一些实施方案中，可将所述方法与癌症的其它治疗剂结合进行。例如，可将组合物在进行放射、手术、靶向或细胞毒性化学疗法、化学放射疗法、激素疗法、免疫疗法、基因疗法、细胞移植疗法、精准医学、基因组编辑疗法或其它药物疗法的同时、之前或之后向受试者施用。
如上所述，本文所述的组合物(例如，抗IL-27组合物)可用于治疗多种癌症，诸如但不限于：卡波西氏肉瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、成髓细胞早幼粒细胞髓单核细胞红白血病(myeloblasts promyelocyte myelomonocytic monocyticerythroleukemia)、慢性白血病、慢性髓细胞性(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和边缘区B细胞淋巴瘤、真性红细胞增多性淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金病、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链疾病、实体瘤、肉瘤和癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠肉瘤、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌(HCC)、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、鼻咽癌、食道癌、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和中枢神经系统(CNS)癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈癌、胃癌、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌(小细胞、大细胞)、黑素瘤、神经母细胞瘤；口腔癌(例如唇、舌、口和咽)、卵巢癌、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌；呼吸系统癌症、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌和泌尿系统癌。
组合疗法
在一些实施方案中，可将由本公开提供的抗IL-27抗体或其抗原结合部分与一种或多种另外的治疗剂或治疗(例如癌症的另一种治疗剂或治疗)组合。例如，可将抗IL-27抗体或其抗原结合部分与一种或多种另外的治疗剂组合向受试者(例如，人患者)施用，其中所述组合为患有癌症或有患癌风险的受试者提供治疗益处。
在一些实施方案中，在同一时间(例如，同时地)施用抗IL-27抗体或其抗原结合部分和一种或多种另外的治疗剂。在其它实施方案中，在第一时间施用抗IL-27抗体或其抗原结合部分，在第二时间(例如，顺次地)施用一种或多种另外的治疗剂。在一些实施方案中，在第一时间施用一种或多种另外的治疗剂，在第二时间施用抗IL-27抗体。
本文所述的抗IL-27抗体或其抗原结合片段可替代或增强先前或当前施用的疗法。例如，在用抗IL-27抗体或其抗原结合片段治疗后，可停止或减少一种或多种另外的治疗剂的施用，例如，以较低的水平施用一种或多种另外的治疗剂。在一些实施方案中，可以维持先前疗法的施用。在一些实施方案中，将维持先前的疗法，直至抗IL-27抗体的水平达到足以提供治疗效果的水平。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的与一种或多种另外的治疗剂或程序组合的由本公开提供的特异性地结合至并拮抗IL-27的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中第二治疗剂或程序选自由以下组成的组：化学疗法、靶向抗癌治疗、溶瘤药物、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、手术程序、放射程序、共刺激分子的活化剂、抑制分子的抑制剂、疫苗或细胞免疫疗法或其组合。
在一些实施方案中，一种或多种另外的治疗剂是PD-1拮抗剂、TIM-3抑制剂、LAG-3抑制剂、TIGIT抑制剂、CD112R抑制剂、TAM抑制剂、STING激动剂、4-1BB激动剂或其组合。
在一些实施方案中，一种或多种另外的治疗剂是PD-1拮抗剂。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂选自由以下组成的组：PDR001、纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗、MEDI0680、REGN2810、TSR-042、PF-06801591、AMP-224、AB122和JTX-4014。在某些实施方案中，一种或多种另外的治疗剂是PD-L1抑制剂。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂选自由以下组成的组：FAZ053、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗和BMS-936559。在一些实施方案中，本公开提供了增强抗PD-1抗体的一种或多种活性(例如，增强PD-1介导的细胞因子分泌；增强抗PD-1介导的TNFα分泌；增强抗PD-1介导的来自暴露于抗PD-1抗体的细胞的IL-6分泌)的方法，所述方法包括使细胞暴露于本公开所提供的抗体或其抗原结合部分，同时或依序暴露于抗PD-1抗体，从而增强抗PD1抗体的一种或多种活性。
在一些实施方案中，一种或多种另外的治疗剂是舒尼替尼卡博替尼阿西替尼乐伐替尼依维莫司贝伐单抗依多司他、NKTR-214(CD-122偏向性激动剂)、替伏扎尼艾贝司他、伊匹单抗曲美木单抗、帕唑帕尼索拉非尼西罗莫司雷莫芦单抗尼拉帕尼、沃利替尼、沃洛拉尼(X-82)、瑞格非尼多纳非尼(多激酶抑制剂)、卡瑞利珠单抗(SHR-1210)、迪-培萨替莫近(JX-594)、雷莫芦单抗阿帕替尼(YN968D1)、包封的阿霉素替万替尼(ARQ197)、ADI-PEG 20、比美替尼、甲磺酸阿帕替尼、尼达尼布、利瑞鲁单抗、纳武单抗派姆单抗阿特珠单抗阿维单抗德瓦鲁单抗西米普利单抗-rwlc替雷利珠单抗和/或斯巴达珠单抗。
在一些实施方案中，一种或多种另外的治疗剂是TIM-3抑制剂，任选地其中所述TIM-3抑制剂是MGB453或TSR-022。
在一些实施方案中，一种或多种另外的治疗剂是LAG-3抑制剂，任选地其中所述LAG-3抑制剂选自由以下组成的组：LAG525、BMS-986016和TSR-033。
在一些实施方案中，一种或多种另外的治疗剂是TIGIT抑制剂。在一些实施方案中，一种或多种另外的治疗剂是CD112R抑制剂。在一些实施方案中，一种或多种另外的治疗剂是TAM(Axl、Mer、Tyro)抑制剂。在一些实施方案中，一种或多种另外的治疗剂是STING激动剂。在一些实施方案中，一种或多种另外的治疗剂是4-1BB激动剂。
与化学治疗剂的组合
适用于与本发明的组合物组合和/或共施用的化学治疗剂包括，例如：紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮(dihydroxyanthrancindione)、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。其它剂包括，例如，抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化剂(例如，氮芥、噻替派、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链佐霉素、丝裂霉素C、顺式-二氯二胺铂(II)(DDP)、丙卡巴肼(procarbazine)、六甲蜜胺、顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、赛特铂或三铂四硝酸酯)、蒽环类药物(例如柔红霉素(原称道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(原称放线菌素)、博莱霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)和替莫唑胺。
与PD-1/PD-L1拮抗剂的组合
在一些实施方案中，由本公开提供的抗IL-27抗体或其抗原结合部分与一种或多种PD-1拮抗剂组合(例如，组合施用)，所述PD-1拮抗剂特异性地结合至人PD-1或PD-L1并抑制PD-1/PD-L1生物活性和/或通过人PD-1/PD-L1信号传导介导的一种或多种下游途径和/或细胞加工或其它人PD-1/PD-L1介导的功能。
因此，本文提供了PD-1拮抗剂，所述PD-1拮抗剂直接或变构阻断、拮抗、阻抑、抑制或降低PD-1/PD-L1生物活性，包括通过PD-1/PD-L1信号传导介导的下游途径和/或细胞过程，诸如受体结合和/或引发对PD-1/PD-L1的细胞响应。本文还提供了减少细胞或受试者产生的人PD-1或PD-L1的数量或量的PD-1拮抗剂。
在一些实施方案中，本公开提供了结合人PD-1并防止、抑制或减少PD-L1与PD-1的结合的PD-1拮抗剂。在一些方面，PD-1拮抗剂与编码PD-1或PD-L1的mRNA结合并阻止翻译。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂与编码PD-1或PD-L1的mRNA结合，并导致降解和/或周转。
在一些实施方案中，PD-1拮抗剂抑制PD-1信号传导或功能。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂阻断PD-1与PD-L1、PD-L2或PD-L1和PD-L2的结合。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂阻断PD-1与PD-L1的结合。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂阻断PD-1与PD-L2的结合。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂阻断PD-1与PD-L1和PD-L2的结合。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂特异性地结合PD-1。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂特异性地结合PD-L1。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂特异性地结合PD-L2。
在一些实施方案中，PD-1拮抗剂抑制PD-1与其同源配体的结合。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂抑制PD-1与PD-L1、PD-1与PD-L2或PD-1与PD-L1和PD-L2的结合。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂不抑制PD-1与其同源配体的结合。
在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是特异性地结合至PD-1或PD-L1的分离的单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是特异性地结合至人PD-1的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是特异性地结合至人PD-L1的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是与人PD-L1结合并抑制PD-L1与PD-1结合的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是与人PD-1结合并抑制PD-L1与PD-1结合的抗体或抗原结合片段。
几种抑制或破坏PD-1与其配体PD-L1和PD-L2之一或两者之间的相互作用的免疫检查点拮抗剂正在临床开发中，或目前可由临床医生用来治疗癌症。
可在由本公开提供的组合物、方法和用途中的任一项中包含PD-1拮抗剂的抗人PD-1单克隆抗体或其抗原结合片段的实例包括但不限于：(派姆单抗、MK-3475、h409A11；参见US8952136、US8354509、US8900587和EP2170959，其全部通过引用整体并入本文；Merck),(纳武单抗、BMS-936558,MDX-1106,ONO-4538；参见US7595048、US8728474、US9073994、US9067999、EP1537878、US8008449、US8779105和EP2161336，其全部以引用的方式整体并入本文；Bristol Myers Squibb)、MEDI0680(AMP-514)、BGB-A317和BGB-108(BeiGene)、244C8和388D4(参见WO2016106159，其以引用的方式整体并入本文；Enumeral Biomedical)、PDR001(Novartis)和REGN2810(Regeneron)。因此，在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是派姆单抗。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是纳武单抗。
可在由本公开提供的组合物、方法和用途中的任一项中包含PD-1拮抗剂的抗人PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段的实例包括但不限于：(阿维鲁单抗、MSB0010718C，参见WO2013/79174，其通过引用整体并入本文；Merck/Pfizer)、(德瓦鲁单抗、MEDI4736)、(阿特珠单抗、MPDL3280A、RG7446；参见WO2010/077634，其以引用的方式整体并入本文；Roche)、MDX-1105(BMS-936559、12A4；参见US7943743和WO2013/173223，这两者以引用的方式整体并入本文；Medarex/BMS)和FAZ053(Novartis)。因此，在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是阿维鲁单抗。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是德瓦鲁单抗。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是阿特珠单抗。
在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是特异性地结合至人PD-1或人PD-L1的免疫粘附素，例如，包含与免疫球蛋白分子的恒定区(诸如Fc区)融合的PD-L1或PD-L2的胞外部分或PD-1结合部分的融合蛋白。特异性地结合至PD-1的免疫粘附素的实例描述于WO2010/027827和WO2011/066342中，这两者以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是AMP-224(也称为B7-DCIg)，其是特异性地结合至人PD-1的PD-L2-FC融合蛋白。
本领域普通技术人员将理解，任何与PD-1或PD-L1结合并破坏PD-1/PD-L1信号传导途径的PD-1拮抗剂都适用于本文公开的组合物、方法和用途。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1拮抗剂是小分子、核酸、肽、肽模拟物、蛋白质、碳水化合物、碳水化合物衍生物或糖聚合物。示例性小分子PD-1抑制剂描述于Zhan等人，(2016)Drug Discov Today21(6):1027-1036中。
与TIM-3抑制剂的组合
在一些实施方案中，将由本公开提供的抗IL-27抗体或其抗原结合部分与TIM-3抑制剂组合(例如，组合施用)。TIM-3抑制剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。在一些实施方案中，TIM-3抑制剂选自MGB453(Novartis)、TSR-022(Tesaro)或LY3321367(Eli Lilly)。在一些实施方案中，将抗IL-27抗体或其抗原结合部分与MGB453组合施用。在一些实施方案中，将抗IL-27抗体或其抗原结合部分与TSR-022组合施用。
与LAG-3抑制剂的组合
在一些实施方案中，将由本公开提供的抗IL-27抗体或其抗原结合部分与LAG-3抑制剂组合(例如，组合施用)。LAG-3抑制剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。在一些实施方案中，LAG-3抑制剂选自LAG525(Novartis)、BMS-986016(Bristol-Myers Squibb)、TSR-033(Tesaro)、MK-4280(Merck&Co)或REGN3767(Regeneron)。
其他组合
在一些实施方案中，将本公开所述提供的抗IL-27抗体或其抗原结合部分与TIGIT抑制剂、激酶抑制剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂(TKI))、CD112R抑制剂、TAM受体抑制剂、STING激动剂和/或4-1BB激动剂、CTLA-4抑制剂、CD73抑制剂、CD39抑制剂、A2AR抑制剂、IDO抑制剂、NEKTAR、peg-IL-2、peg IL-10、CD40激动剂或其组合组合(例如组合施用)。
检测方法
在一些实施方案中，本文所述的抗IL-27抗体或其抗原结合片段可用于检测和/或定量生物样品中人IL-27的方法。因此，本文所述的抗IL-27抗体或其抗原结合片段可用于诊断、预后患者的疾病(例如，癌症)和/或确定所述疾病的进展。
如本文所定义的，监测受试者(例如，人患者)的癌症改善意味着评估受试者的疾病参数的变化，例如肿瘤生长的减少。在一些实施方案中，在施用后至少一(1)小时，例如至少2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时或48小时，或至少1天、2天、4天、10天、13天、20天或更长时间，或至少1周、2周、4周、10周、13周、20周或更长时间，进行评估。可在以下时期中的一个或多个时期评估受试者：治疗开始前；治疗期间；或者在已经施用了一种或多种治疗成分之后。评估可包括评估对进一步治疗的需要，例如，评估是否应该改变剂量、施用频率或治疗持续时间。其还可包括评估对添加或撤消所选治疗方式的需要，例如添加或撤消本文所述的任何癌症治疗。
在一些实施方案中，本公开提供了一种检测来自受试者的样品中的IL-27的方法，所述方法包括：(a)使来自所述受试者的样品与检测抗体在允许所述检测抗体在所述样品中存在IL-27的情况下形成检测抗体-IL-27复合物的条件下接触，其中所述检测抗体是本公开所提供的抗体或其抗原结合片段；以及(b)检测在步骤(a)中产生的复合物(如果有的话)的存在。
在一些实施方案中，本公开提供了一种检测受试者的IL-27相关癌症的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使来自疑似患有IL-27相关癌症的受试者的样品与检测抗体在允许所述检测抗体在所述样品中存在IL-27的情况下形成检测抗体-IL-27复合物的条件下接触，其中所述检测抗体是本公开所提供的抗体或其抗原结合部分；以及(b)检测在步骤(a)中产生的复合物(如果有的话)的存在。在一些实施方案中，所述检测抗体与可检测标记偶联。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述样品与捕获抗体接触以在所述样品中存在IL-27的情况下产生包含IL-27和所述捕获抗体的复合物，其中所述捕获抗体是本公开所提供的抗体或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，所述捕获抗体被固定在固体支持物上。在一些实施方案中，使所述样品在所述检测抗体之前与所述捕获抗体接触。在一些实施方案中，所述样品是体液样品。在一些实施方案中，所述体液样品是血液、血清、血浆、细胞裂解物或组织裂解物。
在一些实施方案中，所述癌症选自肾细胞癌(RCC)、肝细胞癌、肺癌、胃食管癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑素瘤、白血病和淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症是肾细胞癌(RCC)。在其他实施方案中，癌症是肝细胞癌(HCC)。在一些实施方案中，癌症选自白血病和淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症是急性骨髓性白血病(AML)。
实施例
虽然已经参照本公开的具体实施方案描述了本公开，但本领域技术人员应该理解，在不脱离本公开的真实精神和范围的情况下，可进行各种改变，并且可以替换等同物。另外，可进行许多修改以使特定情况、材料、物质组成、过程、过程步骤适应本公开的目标、精神和范围。所有此类修改都旨在本公开的范围内。
实施例1：特异性地结合IL-27EBI3单体的抗IL-27抗体的产生和表征
此实施例描述特异性地结合至人IL-27的EBI3亚基的抗IL-27抗体的产生。简言之，用人EBI3免疫载体(Aldevron)对BALB/c小鼠进行免疫，并将其用于表达抗EBI3单克隆抗体的杂交瘤的产生和分离。分离的杂交瘤包括表达抗IL-27抗体分子(在本文中称为Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7和Ab8)的杂交瘤。通过流式细胞术在表达表面靶向的人EBI3的哺乳动物细胞上分析杂交瘤上清液。所测试的所有杂交瘤克隆上清液均与表达EBI3的细胞结合(数据未示出)。
对示例性的分离的抗EBI3抗体Ab7(以下称为“Ab7”，包含下文称为“Ab7-VH0”的免疫球蛋白重链可变区和下文称为“Ab7-VL0”的免疫球蛋白轻链可变区)进行测序并在下文进一步表征(未示出氨基末端信号肽序列)。
分离的Ab7抗体的重链可变区(Ab7-VH0)具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLFCAASGFTFTSYSMSWVRQTPEKRLEWVAYISYDGGSAYYPDTVKGRFSISRDNAKKTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHGDYDDDDAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:1)。
编码重链可变区Ab7-VH0的核酸序列具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)：
GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAAACTCTTCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGAGCTGGGTCCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTTATGATGGTGGTAGCGCCTACTACCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCTCCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAAAACCCTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGAAGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACGACGACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ IDNO:2)。
分离的Ab7抗体的轻链可变区(Ab7-VL0)具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAETLTEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGNYYCQHHYGTPLTFGAGTKLDLK(SEQ ID NO:3)。
分离的Ab7抗体的重链(Ab7-VH0-mIgG2a)具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLFCAASGFTFTSYSMSWVRQTPEKRLEWVAYISYDGGSAYYPDTVKGRFSISRDNAKKTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHGDYDDDDAMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ ID NO:183)。
编码轻链可变区Ab7-VL0的核酸序列具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)：
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGAAACTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAACATTTACAGCTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGGAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCAGAAACCTTGACAGAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAATTCTCTCTCAAGATCAACAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGGGAATTACTACTGTCAACATCATTACGGTACCCCGCTCACATTCGGCGCTGGGACCAAGCTGGATCTGAAA(SEQ ID NO:4)。
分离的Ab7抗体的轻链(Ab7-VL0-mκ)具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAETLTEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGNYYCQHHYGTPLTFGAGTKLDLKADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ IDNO:184)。
使用本领域已知的方法设计人源化Ab7抗体。简言之，使用编码小鼠单克隆Ab7抗体的V区基因序列来构建一系列完全人源化的抗体。将可变区基因克隆到编码人IgG1重链恒定结构域和人κ轻链恒定结构域的载体中。嵌合抗体和人源化抗体在哺乳动物细胞中瞬时表达。分离的Ab7重链可变区的人源化产生5种人源化重链可变区变体(以下称为“Ab7-VH1”、“Ab7-VH2”、“Ab7-VH3”、“Ab7-VH4”和“Ab7-VH5”)。分离的Ab7轻链可变区的人源化产生4种人源化轻链可变区变体(以下称为“Ab7-VL1”、“Ab7-VL2”、“Ab7-VL3”和“Ab7-VL4”)。
下文概述了定义人源化Ab7变体可变区的蛋白质序列和编码人源化Ab7变体可变区的核苷酸序列(未示出氨基末端信号肽序列)。
重链可变区Ab7-VH1具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)：
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMSWVRQAPGKGLEWVAYISYDGGSAYYPDTVKGRFTISRDNSKKTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHGDYDDDDAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:5)。
编码重链可变区Ab7-VH1的核酸序列具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)：
GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTTATGATGGTGGTAGCGCCTACTACCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAAAACCCTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGAAGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACGACGACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ IDNO:6)。
重链可变区Ab7-VH2具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMSWVRQAPGKGLEWVAYISYDGGSAYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHGDYDDDDAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:7)。
编码重链可变区Ab7-VH2的核酸序列具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTTATGATGGTGGTAGCGCCTACTACCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGAAGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACGACGACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ IDNO:8)。
重链可变区Ab7-VH3具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)：
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMSWVRQAPGKGLEWVAYISYDGGSAYYPDTVKGRFTISRDNSKKTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGDYDDDDAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)。
编码重链可变区Ab7-VH3的核酸序列具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)：
GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTTATGATGGTGGTAGCGCCTACTATCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAAAACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACGACGACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ IDNO:10)。
重链可变区Ab7-VH4具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMSWVRQAPGKGLEWVAYISYDGGSAYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGDYDDDDAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:11)。
编码重链可变区Ab7-VH4的核酸序列具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTTATGATGGTGGTAGCGCCTACTATCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACGACGACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ IDNO:12)。
重链可变区Ab7-VH5具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMSWVRQAPGKGLEWVSYISYDGGSAYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGDYDDDDAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:13)。
编码重链可变区Ab7-VH5的核酸序列具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGTCTTACATTAGTTATGATGGTGGTAGCGCCTACTATCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACGACGACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ IDNO:14)。
轻链可变区Ab7-VL1具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKAPKLLVYNAETLTEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFANYYCQHHYGTPLTFGQGTKLDIK(SEQ ID NO:15)。
编码轻链可变区Ab7-VL1的核酸序列具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)：
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAACATTTACAGCTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGGTCTATAATGCAGAAACCTTGACAGAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAAATTACTACTGTCAACATCATTACGGTACCCCGCTCACATTCGGCCAAGGGACCAAGCTGGATATCAAA(SEQ ID NO:16)。
轻链可变区Ab7-VL2具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLVYNAETLTEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFANYYCQHHYGTPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:17)。
编码轻链可变区Ab7-VL2的核酸序列具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)：
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAACATTTACAGCTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGGTCTATAATGCAGAAACCTTGACAGAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAAATTACTACTGTCAACATCATTACGGTACCCCGCTCACATTCGGCCAAGGGACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:18)。
轻链可变区Ab7-VL3具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLVYNAETLTEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:19)。
编码轻链可变区Ab7-VL3的核酸序列具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)：
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAACATTTACAGCTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGGTCTATAATGCAGAAACCTTGACAGAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACATCATTACGGTACCCCGCTCACATTCGGCCAAGGGACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:20)。
轻链可变区Ab7-VL4具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLNWYQQKPGKAPKLLVYNAETLTEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:21)。
编码轻链可变区Ab7-VL4的核酸序列具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)：
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAACATTTACAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGGTCTATAATGCAGAAACCTTGACAGAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACATCATTACGGTACCCCGCTCACATTCGGCCAAGGGACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:22)。
表1中示出分离的亲本Ab7抗体的重链CDR和轻链CDR氨基酸序列(Kabat定义)。
表1
为了产生完整的嵌合和人源化重链或轻链抗体序列，将上述每个重链可变区与人IgG1恒定区组合，并将上述每个轻链可变区与人κ恒定区组合。
下文概述了定义嵌合和人源化Ab7变体的完整重链和轻链的蛋白质序列(未示出氨基末端信号肽序列)。
重链Ab7-VH0-IgG1具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLFCAASGFTFTSYSMSWVRQTPEKRLEWVAYISYDGGSAYYPDTVKGRFSISRDNAKKTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHGDYDDDDAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:29)。
编码重链Ab7-VH0-IgG1的核酸序列具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAAACTCTTCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGAGCTGGGTCCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTTATGATGGTGGTAGCGCCTACTACCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCTCCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAAAACCCTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGAAGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACGACGACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAAGGCCCCAGCGTCTTCCCCCTCGCGCCGTCCTCCAAGTCCACCTCGGGTGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCGGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCGGGCGCGCTCACGAGCGGCGTACACACCTTCCCGGCGGTGCTCCAGTCCTCCGGGCTGTACTCGCTCTCGTCGGTCGTCACGGTGCCGTCCTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCGTCCAACACCAAGGTGGATAAGAAGGTCGAGCCCAAGTCGTGCGACAAGACGCACACGTGCCCGCCGTGCCCGGCCCCGGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCGGTCTTCCTGTTCCCCCCGAAGCCCAAGGATACGCTGATGATCTCCCGCACCCCGGAGGTCACCTGCGTGGTGGTGGACGTCTCCCACGAGGACCCGGAGGTGAAATTCAACTGGTACGTCGACGGAGTGGAGGTCCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTACAACTCCACGTACCGCGTCGTCTCCGTCCTGACCGTCCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTCTCCAACAAGGCGCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCAAAGGGTCAGCCGCGGGAGCCGCAGGTCTATACCCTCCCCCCGTCCCGCGACGAGCTGACGAAAAACCAGGTCTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGTTTCTACCCCTCCGACATCGCGGTCGAGTGGGAGTCGAACGGCCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTCGACAGTGACGGCTCGTTCTTCCTGTACTCGAAGCTGACCGTCGACAAGTCGCGCTGGCAGCAGGGCAACGTCTTCTCGTGCTCCGTTATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGTCTTTCGCTGTCCCCGGGGAAGTGA(SEQID NO:30)。
重链Ab7-VH1-IgG1具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMSWVRQAPGKGLEWVAYISYDGGSAYYPDTVKGRFTISRDNSKKTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHGDYDDDDAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:31)。
编码重链Ab7-VH1-IgG1的核酸序列具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTTATGATGGTGGTAGCGCCTACTACCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAAAACCCTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGAAGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACGACGACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAAGGCCCCAGCGTCTTCCCCCTCGCGCCGTCCTCCAAGTCCACCTCGGGTGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCGGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCGGGCGCGCTCACGAGCGGCGTACACACCTTCCCGGCGGTGCTCCAGTCCTCCGGGCTGTACTCGCTCTCGTCGGTCGTCACGGTGCCGTCCTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCGTCCAACACCAAGGTGGATAAGAAGGTCGAGCCCAAGTCGTGCGACAAGACGCACACGTGCCCGCCGTGCCCGGCCCCGGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCGGTCTTCCTGTTCCCCCCGAAGCCCAAGGATACGCTGATGATCTCCCGCACCCCGGAGGTCACCTGCGTGGTGGTGGACGTCTCCCACGAGGACCCGGAGGTGAAATTCAACTGGTACGTCGACGGAGTGGAGGTCCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTACAACTCCACGTACCGCGTCGTCTCCGTCCTGACCGTCCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTCTCCAACAAGGCGCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCAAAGGGTCAGCCGCGGGAGCCGCAGGTCTATACCCTCCCCCCGTCCCGCGACGAGCTGACGAAAAACCAGGTCTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGTTTCTACCCCTCCGACATCGCGGTCGAGTGGGAGTCGAACGGCCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTCGACAGTGACGGCTCGTTCTTCCTGTACTCGAAGCTGACCGTCGACAAGTCGCGCTGGCAGCAGGGCAACGTCTTCTCGTGCTCCGTTATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGTCTTTCGCTGTCCCCGGGGAAGTGA(SEQID NO:32)。
重链Ab7-VH2-IgG1具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMSWVRQAPGKGLEWVAYISYDGGSAYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHGDYDDDDAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:33)。
编码重链Ab7-VH2-IgG1的核酸序列具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTTATGATGGTGGTAGCGCCTACTACCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGAAGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACGACGACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAAGGCCCCAGCGTCTTCCCCCTCGCGCCGTCCTCCAAGTCCACCTCGGGTGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCGGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCGGGCGCGCTCACGAGCGGCGTACACACCTTCCCGGCGGTGCTCCAGTCCTCCGGGCTGTACTCGCTCTCGTCGGTCGTCACGGTGCCGTCCTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCGTCCAACACCAAGGTGGATAAGAAGGTCGAGCCCAAGTCGTGCGACAAGACGCACACGTGCCCGCCGTGCCCGGCCCCGGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCGGTCTTCCTGTTCCCCCCGAAGCCCAAGGATACGCTGATGATCTCCCGCACCCCGGAGGTCACCTGCGTGGTGGTGGACGTCTCCCACGAGGACCCGGAGGTGAAATTCAACTGGTACGTCGACGGAGTGGAGGTCCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTACAACTCCACGTACCGCGTCGTCTCCGTCCTGACCGTCCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTCTCCAACAAGGCGCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCAAAGGGTCAGCCGCGGGAGCCGCAGGTCTATACCCTCCCCCCGTCCCGCGACGAGCTGACGAAAAACCAGGTCTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGTTTCTACCCCTCCGACATCGCGGTCGAGTGGGAGTCGAACGGCCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTCGACAGTGACGGCTCGTTCTTCCTGTACTCGAAGCTGACCGTCGACAAGTCGCGCTGGCAGCAGGGCAACGTCTTCTCGTGCTCCGTTATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGTCTTTCGCTGTCCCCGGGGAAGTGA(SEQID NO:34)。
重链Ab7-VH3-IgG1具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMSWVRQAPGKGLEWVAYISYDGGSAYYPDTVKGRFTISRDNSKKTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGDYDDDDAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:35)。
编码重链Ab7-VH3-IgG1的核酸序列具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTTATGATGGTGGTAGCGCCTACTATCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAAAACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACGACGACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAAGGCCCCAGCGTCTTCCCCCTCGCGCCGTCCTCCAAGTCCACCTCGGGTGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCGGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCGGGCGCGCTCACGAGCGGCGTACACACCTTCCCGGCGGTGCTCCAGTCCTCCGGGCTGTACTCGCTCTCGTCGGTCGTCACGGTGCCGTCCTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCGTCCAACACCAAGGTGGATAAGAAGGTCGAGCCCAAGTCGTGCGACAAGACGCACACGTGCCCGCCGTGCCCGGCCCCGGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCGGTCTTCCTGTTCCCCCCGAAGCCCAAGGATACGCTGATGATCTCCCGCACCCCGGAGGTCACCTGCGTGGTGGTGGACGTCTCCCACGAGGACCCGGAGGTGAAATTCAACTGGTACGTCGACGGAGTGGAGGTCCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTACAACTCCACGTACCGCGTCGTCTCCGTCCTGACCGTCCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTCTCCAACAAGGCGCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCAAAGGGTCAGCCGCGGGAGCCGCAGGTCTATACCCTCCCCCCGTCCCGCGACGAGCTGACGAAAAACCAGGTCTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGTTTCTACCCCTCCGACATCGCGGTCGAGTGGGAGTCGAACGGCCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTCGACAGTGACGGCTCGTTCTTCCTGTACTCGAAGCTGACCGTCGACAAGTCGCGCTGGCAGCAGGGCAACGTCTTCTCGTGCTCCGTTATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGTCTTTCGCTGTCCCCGGGGAAGTGA(SEQID NO:36)。
重链Ab7-VH4-IgG1具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMSWVRQAPGKGLEWVAYISYDGGSAYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGDYDDDDAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:37)。
编码重链Ab7-VH4-IgG1的核酸序列具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTTATGATGGTGGTAGCGCCTACTATCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACGACGACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAAGGCCCCAGCGTCTTCCCCCTCGCGCCGTCCTCCAAGTCCACCTCGGGTGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCGGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCGGGCGCGCTCACGAGCGGCGTACACACCTTCCCGGCGGTGCTCCAGTCCTCCGGGCTGTACTCGCTCTCGTCGGTCGTCACGGTGCCGTCCTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCGTCCAACACCAAGGTGGATAAGAAGGTCGAGCCCAAGTCGTGCGACAAGACGCACACGTGCCCGCCGTGCCCGGCCCCGGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCGGTCTTCCTGTTCCCCCCGAAGCCCAAGGATACGCTGATGATCTCCCGCACCCCGGAGGTCACCTGCGTGGTGGTGGACGTCTCCCACGAGGACCCGGAGGTGAAATTCAACTGGTACGTCGACGGAGTGGAGGTCCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTACAACTCCACGTACCGCGTCGTCTCCGTCCTGACCGTCCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTCTCCAACAAGGCGCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCAAAGGGTCAGCCGCGGGAGCCGCAGGTCTATACCCTCCCCCCGTCCCGCGACGAGCTGACGAAAAACCAGGTCTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGTTTCTACCCCTCCGACATCGCGGTCGAGTGGGAGTCGAACGGCCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTCGACAGTGACGGCTCGTTCTTCCTGTACTCGAAGCTGACCGTCGACAAGTCGCGCTGGCAGCAGGGCAACGTCTTCTCGTGCTCCGTTATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGTCTTTCGCTGTCCCCGGGGAAGTGA(SEQID NO:38)。
重链Ab7-VH5-IgG1具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMSWVRQAPGKGLEWVSYISYDGGSAYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGDYDDDDAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:39)。
编码重链Ab7-VH5-IgG1的核酸序列具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGTCTTACATTAGTTATGATGGTGGTAGCGCCTACTATCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACGACGACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAAGGCCCCAGCGTCTTCCCCCTCGCGCCGTCCTCCAAGTCCACCTCGGGTGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCGGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCGGGCGCGCTCACGAGCGGCGTACACACCTTCCCGGCGGTGCTCCAGTCCTCCGGGCTGTACTCGCTCTCGTCGGTCGTCACGGTGCCGTCCTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCGTCCAACACCAAGGTGGATAAGAAGGTCGAGCCCAAGTCGTGCGACAAGACGCACACGTGCCCGCCGTGCCCGGCCCCGGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCGGTCTTCCTGTTCCCCCCGAAGCCCAAGGATACGCTGATGATCTCCCGCACCCCGGAGGTCACCTGCGTGGTGGTGGACGTCTCCCACGAGGACCCGGAGGTGAAATTCAACTGGTACGTCGACGGAGTGGAGGTCCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTACAACTCCACGTACCGCGTCGTCTCCGTCCTGACCGTCCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTCTCCAACAAGGCGCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCAAAGGGTCAGCCGCGGGAGCCGCAGGTCTATACCCTCCCCCCGTCCCGCGACGAGCTGACGAAAAACCAGGTCTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGTTTCTACCCCTCCGACATCGCGGTCGAGTGGGAGTCGAACGGCCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTCGACAGTGACGGCTCGTTCTTCCTGTACTCGAAGCTGACCGTCGACAAGTCGCGCTGGCAGCAGGGCAACGTCTTCTCGTGCTCCGTTATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGTCTTTCGCTGTCCCCGGGGAAGTGA(SEQID NO:40)。
轻链Ab7-VL0-κ具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAETLTEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGNYYCQHHYGTPLTFGAGTKLDLKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:41)。
编码轻链Ab7-VL0-κ的核酸序列具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGAAACTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAACATTTACAGCTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGGAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCAGAAACCTTGACAGAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAATTCTCTCTCAAGATCAACAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGGGAATTACTACTGTCAACATCATTACGGTACCCCGCTCACATTCGGCGCTGGGACCAAGCTGGATCTGAAACGAACGGTGGCCGCGCCGAGCGTCTTCATCTTCCCGCCTTCCGACGAGCAGCTCAAGTCCGGGACCGCCTCCGTAGTATGCCTCCTCAATAACTTCTACCCCCGGGAGGCGAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAACGCCCTCCAATCGGGCAACTCCCAGGAGTCGGTGACCGAGCAGGATTCCAAGGACTCGACCTACAGTCTAAGCTCCACCCTCACACTGTCGAAGGCGGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTCACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCGGTCACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA(SEQ ID NO:42)。
轻链Ab7-VL1-κ具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKAPKLLVYNAETLTEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFANYYCQHHYGTPLTFGQGTKLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:43)。
编码轻链Ab7-VL1-κ的核酸序列具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAACATTTACAGCTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGGTCTATAATGCAGAAACCTTGACAGAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAAATTACTACTGTCAACATCATTACGGTACCCCGCTCACATTCGGCCAAGGGACCAAGCTGGATATCAAACGAACGGTGGCCGCGCCGAGCGTCTTCATCTTCCCGCCTTCCGACGAGCAGCTCAAGTCCGGGACCGCCTCCGTAGTATGCCTCCTCAATAACTTCTACCCCCGGGAGGCGAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAACGCCCTCCAATCGGGCAACTCCCAGGAGTCGGTGACCGAGCAGGATTCCAAGGACTCGACCTACAGTCTAAGCTCCACCCTCACACTGTCGAAGGCGGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTCACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCGGTCACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA(SEQ ID NO:44)。
轻链Ab7-VL2-κ具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLVYNAETLTEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFANYYCQHHYGTPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:45)。
编码轻链Ab7-VL2-κ的核酸序列具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAACATTTACAGCTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGGTCTATAATGCAGAAACCTTGACAGAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAAATTACTACTGTCAACATCATTACGGTACCCCGCTCACATTCGGCCAAGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGAACGGTGGCCGCGCCGAGCGTCTTCATCTTCCCGCCTTCCGACGAGCAGCTCAAGTCCGGGACCGCCTCCGTAGTATGCCTCCTCAATAACTTCTACCCCCGGGAGGCGAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAACGCCCTCCAATCGGGCAACTCCCAGGAGTCGGTGACCGAGCAGGATTCCAAGGACTCGACCTACAGTCTAAGCTCCACCCTCACACTGTCGAAGGCGGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTCACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCGGTCACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA(SEQ ID NO:46)。
轻链Ab7-VL3-κ具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLVYNAETLTEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:47)。
编码轻链Ab7-VL3-κ的核酸序列具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAACATTTACAGCTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGGTCTATAATGCAGAAACCTTGACAGAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACATCATTACGGTACCCCGCTCACATTCGGCCAAGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGAACGGTGGCCGCGCCGAGCGTCTTCATCTTCCCGCCTTCCGACGAGCAGCTCAAGTCCGGGACCGCCTCCGTAGTATGCCTCCTCAATAACTTCTACCCCCGGGAGGCGAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAACGCCCTCCAATCGGGCAACTCCCAGGAGTCGGTGACCGAGCAGGATTCCAAGGACTCGACCTACAGTCTAAGCTCCACCCTCACACTGTCGAAGGCGGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTCACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCGGTCACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA(SEQ ID NO:48)。
轻链Ab7-VL4-κ具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLNWYQQKPGKAPKLLVYNAETLTEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:49)。
编码轻链Ab7-VL4-κ的核酸序列具有以下序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-恒定区)：
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAACATTTACAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGGTCTATAATGCAGAAACCTTGACAGAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACATCATTACGGTACCCCGCTCACATTCGGCCAAGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGAACGGTGGCCGCGCCGAGCGTCTTCATCTTCCCGCCTTCCGACGAGCAGCTCAAGTCCGGGACCGCCTCCGTAGTATGCCTCCTCAATAACTTCTACCCCCGGGAGGCGAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAACGCCCTCCAATCGGGCAACTCCCAGGAGTCGGTGACCGAGCAGGATTCCAAGGACTCGACCTACAGTCTAAGCTCCACCCTCACACTGTCGAAGGCGGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTCACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCGGTCACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA(SEQ ID NO:50)。
还考虑到，所述可变区序列可融合至其他抗体恒定区序列以产生全长免疫球蛋白重链和轻链。例如，可将Ab7-VH0、Ab7-VH1、Ab7-VH2、Ab7-VH3、Ab7-VH4或Ab7-VH5重链可变区与人IgG2、IgG3、IgG4或在恒定区中包含一个或多个氨基酸取代的IgG4(例如，IgG4mt或IgG4mt2)组合。类似地，可将Ab7-VL0、Ab7-VL1、Ab7-VL2、Ab7-VL3或Ab7-VL4轻链可变区与人λ恒定区组合。
使用侧翼限制性酶位点合成编码上述Ab7和人源化Ab7变体的重链和轻链可变区的DNA片段，以克隆到IgG1重链和κ轻链的pANT表达载体(Antitope)系统中。通过测序确认所有构建体。使用PEI转染方法将表2中所示的重链和轻链组合瞬时转染到HEK293 EBNA粘附细胞(LGC Standards,Teddington,UK)中，并在转染后孵育7天。
表2
从蛋白A缀合的琼脂糖凝胶柱(GE Healthcare,Little Chalfont,UK)上的细胞培养上清液纯化抗体，缓冲液交换到1x DPBS pH 7.2中，并基于预测的氨基酸序列使用消光系数(Ec(0.1％))通过OD280nm进行定量。通过SDS-PAGE分析1μg的每种抗体，并观察到对应于典型抗体谱的条带(数据未示出)。
抗EBI3抗体的体外表征
将如表2所述产生的Ab7抗体和Ab7抗体变体在一系列体外测定中进行测试，以确定它们的生物特性和活性。
为了评估人源化Ab7抗体变体相对于嵌合Ab7.1抗体的结合，建立了结合竞争ELISA。将测定板用在1x DPBS pH 7.2中稀释的1μg/mL的人IL-27(hIL-27)(R&D Systems,Abingdon,UK)包被，并在4℃下孵育过夜。将所有抗体在2％BSA/DPBS中稀释至25μg/mL，并在板上连续三倍稀释以产生八点结合曲线。将抗体稀释液与生物素化的Ab7.1抗体预混合，最终恒定浓度为0.08μg/mL。然后将抗体混合物转移到包被的测定板上，并在室温下孵育1小时。用链霉亲和素-过氧化物酶缀合物(Sigma-Aldrich,Gillingham,UK)和TMB底物(ThermoFisher,Loughborough,UK)检测生物素化的Ab7.1抗体的结合。用1M HCl终止反应，并在Dynex Technologies MRX TC II板读数器上在450nm处读取吸光度。
使用四参数对数曲线确定所测试抗体的绝对IC50值。相对于每个板上的嵌合抗体的IC50归一化的IC50总结在表3中。结果表明，除含有Ab7-VL4轻链的变体外，所有产生的人源化Ab7变体均与嵌合Ab7.1抗体具有相似的结合谱，大多数变体在嵌合Ab7.1抗体的两倍内竞争。
表3
通过表面等离子体共振(SPR)进一步表征抗体。动力学实验在Biacore T200(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)上进行。所有实验均使用hIL-27(R&D Systems,Abingdon,UK)在HBS-P+运行缓冲液(pH 7.4)(GE Healthcare,Little Chalfont,UK)在25℃下进行。在CM5芯片上将人IL-27(hIL-27)抗原捕获至约16RU。固定在10mM乙酸盐缓冲液(pH 5.0)中在1μg/mL的蛋白质浓度下进行。使用在HBS-P+缓冲液中稀释的抗体3.3nM至30nM的三点三倍稀释范围，每种浓度之间没有再生。每次监测增加浓度的抗体的三次注射的缔合期持续75秒，并且最后一次抗体注射后测量单个解离期250秒。使用单次注射2M MgCl2持续120秒来进行hIL-27表面的再生。在整个测定过程中进行嵌合抗体的多次重复(n＝4)，以检查表面和分析物在动力学循环中的稳定性。
由于抗体具有二价性质，因此使用1:1结合模型和二价分析物模型来分析数据。来自1:1结合模型分析的结果总结于表4中，并且来自二价分析物模型的结果总结于表5中。
表4
表5
使用1:1模型(表4)的单循环动力学表明，Ab7-VL4人源化变体不结合至hIL-27，并且其余变体在嵌合抗体的两倍内结合，与来自二价分析物模型(表5)和竞争ELISA的结果一致。
总之，如通过单循环动力学和使用1:1结合模型测定的Ab7.1嵌合抗体的结合亲和力是1nM。所有人源化变体具有1.5nM或更低的KD，但含有Ab7-VL4的变体除外(其中结合被消除)。这些结果证明，Ab7抗体和Ab7抗体变体以高亲和力结合至IL-27的EBI3亚基。
实施例2：在酵母中产生特异性地结合至人IL-27的EBI3和/或P28亚基的抗IL-27抗体
使用下文描述的方法，从八个初始人合成酵母文库中选择了代表多个表位分组(epitope bin)的另外抗IL-27单克隆抗体。
材料和方法
如前所述繁殖各自约109多样性的八个初始人合成酵母文库(参见例如，Xu等人,(2013)Protein Eng Des Sel 26(10):663-670；WO2009036379；WO2010105256；和WO2012009568，所述文献全部以引用的方式整体并入本文)。对于前两轮选择，如前所述，进行利用Miltenyi MACS系统的磁珠分选技术(参见例如，Siegel等人(2004)J ImmunolMethods 286(1-2):141-153，所述文献以引用的方式整体并入本文)。
简言之，在30℃将酵母细胞(约1010个细胞/文库)与3ml的100nM生物素化抗原(重组人IL-27；R&D Systems)于洗涤缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(PBS)/0.1％牛血清白蛋白(BSA))中一起孵育30分钟。用40ml冰冷的洗涤缓冲液洗涤一次后，将细胞沉淀重悬于20mL洗涤缓冲液中，并将链霉抗生物素蛋白微珠(500μl)加入酵母中，并在4℃孵育15分钟。接下来，将酵母细胞沉淀，重悬于20mL洗涤缓冲液中，并装载到Miltenyi LS柱上。负载20mL后，用3ml洗涤缓冲液洗涤柱3次。然后将柱从磁场中移走，用5mL生长培养基洗脱酵母细胞，然后生长过夜。使用流式细胞术进行以下轮选择。将大约2×107个酵母细胞沉淀，用洗涤缓冲液洗涤三次，并在30℃下于平衡条件下与浓度递减的生物素化抗原(100至1nM)、30nM不同物种的生物素化抗原一起孵育，以获得物种交叉反应性，或者与多特异性耗减试剂(PSR)一起孵育，以从选择中去除非特异性抗体。对于PSR耗减，将文库与生物素化PSR试剂的1:10稀释液一起孵育。
然后用洗涤缓冲液洗涤酵母细胞两次，用LC-FITC(1:100稀释的)和SA-633(1:500稀释的)或EAPE(1:50稀释的)次级试剂在4℃下染色15分钟。用洗涤缓冲液洗涤两次后，将细胞沉淀重悬于0.3mL洗涤缓冲液中，并转移到带滤网的分选管中。使用FACS ARIA分选仪(BD Biosciences)进行分选，并确定分选门以选择具有所需特征的抗体。重复选择轮次，直到获得具有所有所需特征的群体。在最后一轮分选后，将酵母细胞涂铺并挑选单个集落进行表征。
轻链多样化
在初步发现阶段使用轻链多样化方案，以进一步发现和改进抗体。
轻链批量多样化方案：通过粉碎和抓取从酵母中提取来自初始选择输出(selection output)的重链质粒，将所述重链质粒在大肠杆菌中繁殖并随后从大肠杆菌纯化，然后转化到具有5x106种多样性的轻链文库中。采用与初始发现中的相同条件，利用一轮MACS和四轮FACS进行选择。
抗体优化
如下所述，通过将多样性引入重链和轻链可变区中来进行抗体的优化。
CDRH1和CDRH2选择：将单个抗体的CDRH3重组到多样性为1x108的具有CDRH1和CDRH2变体的预制文库中，并且如初始发现中所述，用一轮MACS和四轮FACS进行选择。在不同的FACS轮次中，通过滴定或亲本Fab预复合观察文库的PSR结合、物种交叉反应性和亲和压力，并进行分选以获得具有所需特征的群体。
抗体的产生和纯化
将酵母克隆生长至饱和，然后在30℃下振荡诱导48小时。诱导后，将酵母细胞沉淀，收集上清液以进行纯化。使用蛋白A柱纯化IgG，并用乙酸(pH 2.0)洗脱。通过木瓜蛋白酶消化产生Fab片段，然后通过KappaSelect(GE Healthcare LifeSciences)纯化所述Fab片段。
ForteBio KD测量
如前所述，通常对Octet RED384进行ForteBio亲和力测量(参见，例如，Estep等人，High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinityand epitope binning.Mabs 5(2),270-278(2013)，所述文献以引用的方式整体并入本文)。简言之，通过将IgG在线装载到AHQ传感器上来进行ForteBio亲和力测量。将传感器在测定缓冲液中离线平衡30分钟，然后在线监测60秒以建立基线。将装载有IgG的传感器暴露于100nM抗原3分钟，然后转移到测定缓冲液中3分钟，以测量解离速率。使用1:1结合模型分析所有动力学。重组人IL-27蛋白(R&D Systems目录号：2526-IL)用作抗原。抗IL-27抗体的亲和力测量值示于图1中。
ForteBio表位分组(Epitope Binning)/配体阻断
使用标准夹心式交叉阻断测定进行表位分组/配体阻断。将对照抗靶IgG装载到AHQ传感器上，用不相关的人IgG1抗体阻断传感器上未被占据的Fc-结合位点。然后将传感器暴露于100nM靶抗原，接着暴露于第二抗靶抗体或配体。抗原缔合后第二抗体或配体的额外结合表示未被占据的表位(非竞争者)，而没有结合表示表位阻断(竞争者或配体阻断)。
MSD-SET动力学测定
如前所述进行平衡亲和力测量(Estep等人，2013年)。在PBS+0.1％不含IgG的BSA(PBSF)中进行溶液平衡滴定(SET)，其中将抗原保持恒定在10-100pM并与始于5-100nM的抗体的3-5倍系列稀释液一起孵育(实验条件取决于样品)。将抗体(于PBS中的20nM)涂布在标准结合MSD-ECL板上，在4℃下过夜或在室温下持续30分钟。然后在以700rpm摇动的条件下将板封闭30分钟，接着用洗涤缓冲液(PBSF+0.05％Tween 20)洗涤三次。施加SET样品，在以700rpm摇动的条件下于板上孵育150s，然后进行一次洗涤。通过在板上孵育3分钟，用在PBSF中的250ng/mL磺基标签标记的链霉抗生物素蛋白检测捕获在板上的抗原。用洗涤缓冲液将板洗涤三次，然后在MSD Sector Imager 2400仪上使用含表面活性剂的1x读取缓冲液T(Read Buffer T)进行读取。在Prism中将游离抗原百分比绘制为滴定的抗体的函数，并将其与二次方程拟合以推断出KD。为了提高通量，在整个MSD-SET实验(包括SET样品制备)中使用了液体处理机器人。
实施例3：抗IL-27抗体与重组人IL-27的结合
通过ELISA评估实施例2中描述的抗IL-27抗体结合至重组人IL-27的能力。简言之，将Nunc MaxiSorp ELISA板(Affymetrix#44-2404-21)用100μL/孔重组人IL-27(R&DSystems#2526-IL/CF)(于PBS中稀释的0.5μg/mL)包被，密封并在4℃孵育过夜。将板用100μL/孔的洗涤缓冲液(PBS+0.01％Tween)洗涤3次。然后在室温(RT)振荡下，用200μL/孔的封闭缓冲液(PBS+0.1％BSA+0.01％Tween)封闭板1小时。倾析封闭缓冲液，并如所示每孔添加100μL稀释的对照抗体和抗IL-27抗体。通过从最高浓度1μg/mL开始1:10稀释抗体，针对每种抗体创建10点系列稀释液。将板在室温下振荡孵育1-2小时。用100μL/孔的洗涤缓冲液洗涤板3次。添加100μL/孔的抗人IgG第二抗体(SouthernBiotech；目录号2014-05)(在封闭缓冲液中1:5000稀释)。然后将板在室温下振荡孵育1小时。在孵育1小时后，将板用100μL/孔的洗涤缓冲液洗涤3次。为了使板显影，添加了100μL/孔的TMB缓冲液(Life Technologies#00-2023)。观察到标准曲线孔中的蓝色显影，并且一旦稀释的对照抗体的最高浓度达到深蓝色(5-10分钟)，就添加50μL/孔终止溶液(Thermo Fisher#SS04)(颜色将变为黄色)。在终止反应的30分钟内，在450nm(对于波长校正为负570nm)处读取显影的板。
如图2所示，抗IL-27抗体结合至重组人IL-27。IgG同种型对照抗体(IgG对照)用作比较物。
例如，生物化学亲和力和特异性研究表明抗IL-27抗体SRF388结合至异二聚体细胞因子IL-27的p28亚基(但不结合至EBI3亚基)。SRF388结合只人、非人灵长类动物和啮齿类动物重组IL-27，并且结合的程度在物种之间有所不同。SRF388对IL-27的结合特异性通过对一组约4500个细胞表面和可溶性分子进行测试来证实，并且未观察到脱靶结合。还证实了IL-27对其受体IL-27RA(WSX-1)的结合特异性；没有其他细胞表面受体结合的人IL-27。通过表面等离子体共振证实了SRF388阻断人IL-27与IL-27RA(WSX-1)之间的相互作用的能力。
在多种模型系统中评估了本文公开的抗体的结合。由于人IL-27在小鼠细胞上具有生物活性，因此利用使用DNA微环递送在小鼠中进行人IL-27的系统性过表达，以通过全基因组微阵列分析、流式细胞术和血清细胞因子分析来分析体内IL-27介导的效应。在体内通过IL-27调节的许多标志物与基于人细胞的测定中的发现一致。还在播散性B16肿瘤模型中评价了SRF381。在那种情况下，用SRF381进行处理显示与在缺乏IL-27配体(IL-27p28，EBI3)或受体(IL-27RA)的各种组分的小鼠中观察到的表型一致的结果。
总体而言，这些研究证明，SRF388(及其同胞SRF381)可表型复制小鼠中的IL 27缺乏，特异性地且以高亲和力结合至IL-27，并且能够单独或与PD-L1阻断剂组合来抑制其免疫抑制作用。
实施例4：抗IL27抗体在体外抑制STAT1的磷酸化
通过IL-27受体(IL-27R)的IL-27信号传导导致信号转导子和转录活化因子1(STAT1)多肽(pSTAT1)的磷酸化。通过流式细胞术测试了实施例2中描述的抗IL-27抗体抑制人全血、人PBMC、U937骨髓细胞(组织细胞淋巴瘤细胞系)和HUT-78T细胞淋巴瘤中IL-27介导的STAT1磷酸化的能力。
测试了抗IL-27抗体抑制人全血中IL-27介导的STAT1磷酸化的能力。简言之，将EDTA抗凝全人血液储存在室温下，用于此测定中。将45μL血液分配到深孔圆底板(Phenix#850356)的每个孔中，并在加热板(EchoTherm IC20)上在37℃下或在37℃的孵育箱中加热30分钟。在聚丙烯V底板(Corning#3363)中的无内毒素的PBS(Teknova#P0300)中将抗IL-27抗体稀释至10倍最高浓度。根据需要在无内毒素的PBS中连续稀释抗IL-27抗体。仅将PBS添加至未刺激的对照和刺激的对照的孔中。将5μL的每种稀释液添加至45μL血液的孔中，并在板振荡器上以1000RPM(Eppendorf Mix Mate)振荡15秒进行混合。将板在加热板上在37℃下或在37℃的孵育箱中孵育60分钟。
通过添加100μL PBS+0.1％BSA(由10％BSA Sigma#A1595制成)，将10μg小瓶的重组人IL-27(R&D Systems#2526-IL)重构至100μg/mL。通过在无内毒素的PBS中稀释至200ng/mL来制备重组hIL-27(rhIL-27)的工作储备液。孵育60分钟后，将5μL的200ng/mLrhIL-27添加至经刺激血液的每个孔中。将5μL PBS添加至未刺激的对照孔。将板在板振荡器上以1000RPM振荡15秒。将板在37℃下孵育30分钟。
孵育30分钟后，将细胞固定。将裂解/固定试剂(BD#558049)在无菌水(Hyclone#SH3052902)中1:5稀释，并在水浴中加热至37℃。将500μL的裂解/固定试剂添加至深孔板的每个孔中，并将板在板振荡器上以1000RPM混合15秒。将板在37℃下孵育15分钟。
孵育15分钟后，将板在室温下以1500RPM离心5分钟(Eppendorf离心机5810R)，并通过轻弹丢弃上清液。每孔添加1mL无内毒素的PBS，并将板在板振荡器上以1000RPM振荡15秒。将板在室温下以1500RPM离心5分钟(Eppendorf离心机5810R)，并通过轻弹丢弃上清液。细胞沉淀保留在板中。
将细胞沉淀重悬于FACS缓冲液(PBS，Gibco#14190-144/2％FBS，Sigma#F8317/1mMEDTA，Fisher#BP2482)中的50μL 1:200CD14-Pacific Blue(Biolegend#325616)中并转移至U-底96孔板(Costar#3799)。将板用板密封件(VWR#89134-432)密封，并在黑暗中在室温下孵育30分钟。
孵育30分钟后，将150μL FACS缓冲液添加至每个孔中，并将板在室温下以1500RPM离心5分钟。然后通过移液将细胞沉淀重悬于100μL Perm III(储存在-20℃)(BD#558050)中，并用板密封件和盖将板密封。将板在-20℃下孵育过夜或在4℃下孵育15分钟。
在孵育后，添加150μL PBS，并将板在室温下以1500RPM离心5分钟。通过轻弹从板中丢弃上清液，并将板重悬于50μL染色混合物中，所述混合物如以下表6中所述而制备：
表6
BD目录号
抗体
颜色
稀释度
561807
CD3
FITC
1:10
562069
pSTAT1 Y701
PE
1:100
562071
pSTAT3 Y705
APC
1:20
将所述板在黑暗中在室温下孵育1小时。孵育1小时后，添加100μL的FACS缓冲液，并将板在室温下以1500RPM离心5分钟。通过轻弹将上清液从板中丢弃，并将板重悬于100μLFACS缓冲液中，用于通过流式细胞术进行分析。
如图3A所示，抗IL-27抗体抑制人全血中STAT1的磷酸化。抗IL-27抗体Ab14抑制人全血中STAT1的磷酸化，IC50为24.7ng/mL。
通过流式细胞术进一步测试了实施例2中所述的抗IL-27抗体抑制合并的人PBMC中IL-27介导的STAT1磷酸化的能力。简言之，将从血沉棕黄层获得的人PBMC(外周血单核细胞)的冷冻冷冻小瓶从液氮储存中取出，并在37℃水浴中迅速解冻。用P1000移液管取出每个冷冻小瓶的内容物，并转移至15mL锥形falcon管中。将2-3mL完全RPMI-1640(Gibco，61870-036)缓慢添加至解冻的细胞中，将细胞轻轻涡旋或轻弹以使其悬浮。用完全RPMI-1640将锥形管装满至10mL，然后倒转以进行混合。将锥形管在室温下以1400RPM离心8分钟。
将PBMC细胞以每mL 400万个细胞的密度重悬于温热的无血清RPMI-1640中，并以每孔200,000个细胞(50μ)的密度涂铺在圆底96孔板(Costar，3799)中。将抗IL-27抗体在96孔聚丙烯板第一行中的无血清RPMI-1640中稀释至最高浓度40μg/ml(最终将为10μg/ml)。在板的前10行的其余部分中进行所需的系列稀释(1:2、1:3等)。将五十微升(μL)的抗体储备液(4x)添加至圆底板中PBMC细胞板的前10行中。在第11和12行中，添加了50μL的无血清RPMI-1640细胞培养基。然后在37℃下将平板孵育2小时。
在孵育2小时后，将100μ在无血清RPMI-1640细胞培养基中稀释的50ng/ml重组人IL-27(R&D Systems,2526-IL)天爱至每个孔中(对照孔除外，所述对照孔包括单独的无血清培养基或单独的抗体)，最终浓度为25ng/ml。将100μL无血清RPMI-1640细胞培养基添加至对照孔或仅含抗体的孔。将板在37℃下孵育20分钟。
在孵育20分钟后，将50μL的去离子水中的4％PFA(Pierce,28906)直接添加至每个孔中，并将板在37℃下孵育5分钟以固定细胞。将板以2000RPM离心5分钟。通过轻弹丢弃培养基，并用150μL DPBS洗涤板。将洗涤步骤再重复两次。使用12通道移液管将稀释于H2O中的50μ冰冷90％甲醇(MeOH)(Sigma，439193)快速添加至每个孔中。当添加MeOH时，要特别小心地混合每个孔。将板在20℃下孵育至少15分钟。将100μL的DPBS添加至90％甲醇上方的每个孔中，并将板以2000RPM离心5分钟。通过轻弹丢弃板内容物，并且如前所述将板洗涤3次。最后一次洗涤后，细胞沉淀保留在板的孔中。
将沉淀的PBMC在室温下在黑暗中用FACS缓冲液(2％FBS，2mM EDTA于DPBS中)缓冲液中的pSTAT1 PE(BD Phosflow，526069)1:100染色45分钟。在添加着色剂时要格外小心将每个孔与12通道移液管混合。孵育45分钟后，将100μL FACS缓冲液添加至每个孔中，并将板以2000RPM离心5分钟。通过轻弹丢弃上清液，并如前所述将板洗涤2次。将细胞重悬于100μLFACS缓冲液中，并通过流式细胞术进行分析。
如图3B所示，抗IL-27抗体抑制人合并的PBMC中STAT1的磷酸化。抗IL-27抗体SRF381抑制合并的人PBMC中STAT1的磷酸化，平均IC50为140.5ng/ml(n＝2)。抗IL-27抗体SRF388抑制合并的人PBMC中STAT1的磷酸化，平均IC50为58.3ng/ml(n＝3)。
基本上如针对图3B所述，通过流式细胞术进一步测试了抗IL-27抗体抑制U937细胞(已知表达Fc受体的细胞系)中IL-27介导的STAT1磷酸化的能力。如图3C所示，抗IL-27抗体抑制U-937细胞中STAT1的磷酸化，如所指示。抗体SRF381抑制U937细胞中STAT1的磷酸化，平均IC50为81ng/ml(n＝2)。抗体SRF388抑制U937细胞中STAT1的磷酸化，平均IC50为96ng/ml(n＝2)。
基本上如针对图3B所述，通过流式细胞术测试了抗IL-27抗体抑制皮肤T细胞淋巴瘤细胞系HUT-78中IL-27介导的STAT1磷酸化的能力，所述皮肤T细胞淋巴瘤细胞系不表达细胞表面Fc受体。如图3D所示，抗IL-27抗体抑制HUT-78细胞中STAT1的磷酸化。抗体SRF381抑制HUT-78细胞中STAT1的磷酸化，平均IC50为80ng/ml(n＝1)。抗体SRF388抑制HUT-78细胞中STAT1的磷酸化，平均IC50为95ng/ml(n＝1)。
本公开还评估了全血测定中跨物种的SRF388对IL-27的抑制。为了表征跨物种的SRF388活性，测试了来自人、食蟹猴、大鼠和小鼠的重组IL-27刺激从这些物种获得的全血样品的T淋巴细胞中的pSTAT1信号传导(数据未示出)。
简言之，将全血温至37℃，然后与SRF388一起预孵育60分钟，并且添加20ng/mL的人IL-27。将样品孵育另外30分钟。将白细胞固定，并使红细胞裂解。洗涤后，将固定的细胞透化并用抗CD3和抗磷酸STAT1(Y701)染色。孵育1小时后，将样品洗涤并重悬以进行流式细胞术。使用刺激和未刺激的对照孔计算抑制百分比，并使用GraphPad Prism计算IC50值。
人T细胞中SRF388信号传导抑制的代表性数据显示在图3E中。与关于SRF388对不同物种的亲和力的观察结果一致，SRF388对IL-27信号传导抑制的效力在人中最强，其次是食蟹猴、大鼠和小鼠(参见例如，表7)。
表7：来自不同物种的外周血T细胞中的SRF388 IC50值
物种
评价IC<sub>50</sub>，ng/mL
标准偏差
数量
人
78.4
35
7
食蟹猴
118.1
36.4
4
大鼠
273.2
133.5
8
小鼠
1721
N/A
1(10个的池)
缩写：IC50＝最大抑制浓度的一半，N/A＝不适用
实施例5：通过抗IL-27抗体减轻IL-27介导的对CD161的抑制
C型凝集素CD161是T细胞的标志物，其表达受IL-27阻抑。通过流式细胞术测试了实施例2中描述的抗IL-27抗体逆转IL-27介导的对合并的人PBMC细胞中CD161的抑制的能力。简言之，将从血沉棕黄层获得的合并的人PBMC(外周血单核细胞)的冷冻冷冻小瓶从液氮储存中取出，并在37℃水浴中迅速解冻。用P1000移液管取出每个冷冻小瓶的内容物，并转移至15mL锥形falcon管中。将2-3mL完全RPMI-1640(Gibco，61870-036)缓慢添加至解冻的细胞中，将细胞轻轻涡旋或轻弹以使其悬浮。用完全RPMI-1640将锥形管装满至10mL，然后倒转以进行混合。将锥形管在室温下以1400RPM离心8分钟。
避免使用外壁，以使5天测定过程中的蒸发效应最小化。外孔应填充200μL/孔的DPBS(Gibco，14190-144)。将PBMC细胞以200万个细胞/mL的密度重悬于温热的完全RPMI-1640中。以0.5μg/mL的浓度(这是2倍最终浓度)添加纯化的人抗CD3抗体(Biolegend，UCTH1，#300402)。将100μL/孔的这种细胞混合物(每孔200,000个细胞)涂铺在在圆底96孔板(Costar，3799)中。
将抗IL-27抗体在96孔聚丙烯板第一行中的完全RPMI-1640中稀释至最高浓度40μg/ml(最终将为10ug/ml)。在板的前10行的其余部分中进行所需的系列稀释(1:2、1:3等)。将50μL抗体储备液(4x)添加至圆底板中PBMC细胞板的前10行中。在第11和12行中，添加50μL的完全RPMI-1640。
添加抗IL-27抗体后，将在完全RPMI-1640中稀释的50μl的100ng/ml重组人IL-27(R&D Systems，#2526-IL)添加至每个孔中(对照孔除外，所述对照孔包含无血清培养基或单独抗体)，最终浓度为25ng/ml。将50μL的完全RPMI-1640添加至对照孔中。将板在组织培养箱中在最小干扰在37℃下孵育5天。
在5天孵育后，将板从孵育箱中移除并在板振荡器上以600RPM搅拌30秒。将板以1800RPM离心5分钟。除去培养基并放置用于另外的测定，并将板用150μL DPBS(Gibco，#14190-144)洗涤。洗涤步骤再重复2次。如以下表8所述，将细胞沉淀用50μL/孔染色混合物染色：
表8
将板在板振荡器上以600RPM搅拌30秒，并将板在黑暗中在室温下孵育30分钟。
孵育30分钟后，将板离心，并通过轻弹丢弃上清液。如前所述，将板洗涤2次。最后一次洗涤后，通过在室温下添加50μL去离子水中的4％PFA(Pierce，28906)来固定细胞沉淀10分钟。向每个孔中添加100μL FASC缓冲液，并将板以1800RPM离心5分钟。将细胞重悬于100μL FACS缓冲液中，并通过流式细胞术读取。
如图4所示，如所指示的抗IL-27抗体减轻IL-27介导的对CD161的抑制。
实施例6：抗IL-27抗体增强PD-1介导的TNFα、IL-6和其他细胞因子的分泌，包括抗IL-27抗体的额外体外表征
测试了抗IL-27抗体增强来自癌症患者的人PBMC细胞中PD-1介导的TNFα和IL-6分泌的能力。基本上如实施例5中所述培养来自癌症患者的人PBMC细胞，并添加接受如所指示的1μg/mL抗PD-1抗体的孔。使用人CBA Th1/Th2/Th17试剂盒(BD，560484)分析了来自测定的上清液中的TNFα和IL-6。如图5A和5B所示，抗IL-27抗体增强合并的人PBMC细胞中PD-1介导的TNFα和IL-6的分泌。
本文的技术还显示SRF388单一疗法以及与抗PD-1组合在人PBMC中的细胞因子诱导活性。已知IL-27负调控几种炎性细胞因子的表达。为了确定IL-27阻断对细胞因子产生的影响，在存在或不存在SRF388的情况下，将来自健康供体、RCC患者和卵巢癌患者的人PBMC用抗CD3活化几天，并测试分泌的细胞因子(包括IL-17、IFNγ、TNFα和IL-6)的水平。简言之，在不存在或存在SRF388(1μg/mL)、抗PD 1(派姆单抗，1μg/mL)或两种抗体的情况下，通过0.25μg/mL抗CD3抗体活化从来自4名健康供体、5名RCC患者和2名卵巢癌患者的新鲜全血分离的PBMC。5天后，收集上清液并通过MSD或CBA测试TNFα(A)或IFNγ(B)的水平。所示的数据代表与单独抗CD3刺激相比，细胞因子产生的倍数变化。统计数据通过配对t检验(*p<0.005)进行计算。
抗PD-1抗体在这些测定中用作对照，并且如图5C所示还探索了PD-1和IL-27阻断的组合。SRF388处理导致所测试的11份PBMC样品中的6份(包括4名健康供体中的2名，5名RCC患者中的3名和2名卵巢癌患者中的1名)中的TNFα产生增加(由>2倍增加确定)。在一部分供体中进行测试时，这种活性是SRF388剂量依赖性的(数据未示出)。抗PD-1(派姆单抗)处理显示所测试的11个供体中的2个中的TNFα增加(5名RCC中的1名和2名卵巢癌中的1名)，而SRF388与抗PD-1的组合导致11个供体中的10个中的增加。在组合处理条件下观察到的TNFα增加似乎是10名响应者中8名的累加。在SRF388和抗PD-1处理后(11个供体中的10个)，在这些培养物中观察到了IFNγ产生的累加效应；然而，与SRF388(11个供体中的2个)相比，对仅抗PD-1处理的响应更为常见(11个供体中的10个)。总之，这些数据表明，SRF388增加来自健康供体和癌症患者的活化PBMC培养物中的TNFα水平，并且与单独的任一种处理相比，SRF388与抗PD-1处理的组合导致更高的TNFα和IFNγ水平。
为了进一步探索IL-27和PD-1阻断的作用，使用了相同的活化PBMC培养系统来确定IL-27是否能够直接抵消由PD-1阻断引起的细胞因子产生增加的影响。简言之，通过0.25μg/mL的抗CD3抗体活化从人全血中新鲜分离的PBMC。在37℃下将细胞用对照IgG1(1μg/mL)、αPD-1抗体(派姆单抗，1μg/mL)、rhIL-27(25ng/mL)加αPD-1或rhIL-27加αPD-1与SRF388(1μg/mL)处理细胞5天。收集上清液用于CBA检测。来自4个健康供体的示例性细胞因子(IL-17A和IFNγ)显示为相对于对照的倍数变化。描绘了平均值和标准偏差。统计数据通过配对t检验(*p<0.05，**p<0.01)进行计算。在来自患有RCC的患者的PBMC中也观察到了相似的结果。PD-1阻断增加这些培养物中的IL-17和IFNγ，并且IL-27能够完全抑制这种活性，其是在存在SRF388的情况下被逆转的一种响应，如图5D所示。这些数据表明IL-27能够减弱抗PD-1处理对细胞因子产生的影响。
因此，IL-27被证明抑制活化的人PBMC中抗PD-1介导的促炎性细胞因子产生，其是被SRF388阻断的一种性质。此外，将SRF388与PD-1阻断剂组合使来自健康供体和RCC患者的活化PBMC中的细胞因子产生增加。因此，通过阻断IL-27，SRF388通过改变免疫调控受体表达并增加炎性细胞因子产生而增强免疫细胞活化。
在存在抗IL-27抗体(此处为SRF388)、αPD-1抗体或组合的抗IL-27和αPD-1抗体的情况下对单独抗IL-27抗体的额外表征中，进行了细胞因子诱导/分泌(图5E，特别是针对TNFα、IFNγ、IL-6和IL-17A)的进一步表征。还获得了针对SRF405、SRF410、SRF411、SRF414、SRF416、SRF536、SRF543、SRF529、SRF381、SRF388和Ab7抗体的多种IL-27介导的信号传导作用的体外剂量反应曲线(图5F-5K，其中：图5F示出跨递增浓度的抗IL-27抗体对U937(淋巴瘤)细胞中pSTAT1信号的抑制；图5G示出跨递增浓度的抗IL-27抗体对PBMC(外周血单核细胞)中pSTAT1信号的抑制；图5H示出跨递增浓度的抗IL-27抗体对PBMC(外周血单核细胞)中CD161信号的不同影响；图5I示出跨递增浓度的抗IL-27抗体对CD4 T淋巴细胞(CD4细胞)对PD-L1信号的不同影响；图5J示出跨递增浓度的抗IL-27抗体对单核细胞中PD-L1信号的不同影响；并且图5K示出跨递增浓度的抗IL-27抗体对单核细胞中TIM-3信号的不同程度的抑制作用)。
实施例7：抗IL-27抗体对IL-27介导的PD-L1和TIM3表达的抑制
通过流式细胞术测试了实施例1和2中描述的抗IL-27抗体抑制合并的人单核细胞中IL-27介导的PD-L1和TIM-3表达的能力。
使用RosetteSepTM人单核细胞富集混合物(Stemcell#15068)从人血沉棕黄层中分离新鲜单核细胞。
避免使用外壁，以使5天测定过程中的蒸发效应最小化。外孔应填充200μL/孔的DPBS(Gibco，14190-144)。
将单核细胞以200万个细胞/mL的密度重悬于温热的完全RPMI-1640中。将100μL/孔的这种细胞混合物涂铺(每孔200,000个细胞)在圆底96孔板(Costar，3799)中。
将抗IL-27抗体在96孔聚丙烯板第一行中的完全RPMI-1640中稀释至最高浓度40μg/ml(10μg/ml最终浓度)。在板的前10行的其余部分中进行所需的系列稀释(1:2、1:3等)。将50μL抗体储备液(4x)添加至圆底板中PBMC细胞板的前10行中。在第11和12行中，添加1250μL的完全RPMI-1640。
添加抗IL-27抗体后，将在完全RPMI-1640中稀释的50μL的80ng/ml重组人IL-27(R&D Systems，2526-IL)添加至每个孔中(对照孔除外，所述对照孔包含无血清培养基或单独抗体)，最终浓度为20ng/ml。将100μL无血清RPMI-1640添加至对照孔。将板在37℃在最小干扰下孵育3天。
在3天孵育后，将板从孵育箱中移除并在板振荡器上以600RPM搅拌30秒。将板以1800RPM离心5分钟。通过轻弹丢弃培养基，并用150μL DPBS(Gibco，14190-144)洗涤板。洗涤步骤重复两次。如以下表9所述，将细胞沉淀用50μL/孔染色混合物染色：
表9
Biolegend目录号
抗体靶标
颜色
稀释度
345006
TIM3
PE
1:100
301310
CD11b
APC
1:100
329714
PD-L1
BV421
1:100
将板在板振荡器上以600RPM搅拌30秒，并将板在黑暗中在4℃下孵育30分钟。
孵育30分钟后，将板离心，并通过轻弹丢弃上清液。如前所述，将板洗涤2次。最后一次洗涤后，通过在室温下添加50μL去离子(DI)水中的4％PFA(Pierce，28906)来固定细胞沉淀10分钟。向每个孔中添加100μL FACS缓冲液，并将板以1800RPM离心5分钟。将细胞重悬于100μL FACS缓冲液中，并通过流式细胞术进行分析。
如图6A、6B和6C所示，抗IL-27抗体有效地抑制IL-27介导的合并的人单核细胞中PD-L1和TIM3的表达。
基本上如针对图6A、6B和6C所述，进一步测试了抗IL-27抗体抑制静息T细胞(灭活)中IL-27介导的PD-L1表达的能力。使用RosetteSepTM人T细胞富集混合物(Stemcell#15061)从人血沉棕黄层中分离静息T细胞。
在测定结束时，如以下表10所述，将细胞沉淀用50μL/孔染色混合物染色：
表10
将板在板振荡器上以600RPM搅拌30秒，并将板在黑暗中在4℃下孵育30分钟。
孵育30分钟后，将板离心，并通过轻弹丢弃上清液。如前所述，将板洗涤2次。最后一次洗涤后，通过在室温下添加50μL去离子水中的4％PFA(Pierce，28906)来固定细胞沉淀10分钟。向每个孔中添加100μL FACS缓冲液，并将板以1800RPM离心5分钟。将细胞重悬于100μL FACS缓冲液中，并通过流式细胞术读取。如图6D所示，抗IL-27抗体有效地抑制合并的人静息T细胞中IL-27介导的PD-L1表达。
实施例8：抗IL-27抗体在播散性B16F10黑素瘤模型中的体内功效
使用临床候选SRF388，黑素瘤肺转移模型用于评估IL-27阻断剂的抗肿瘤活性。播散性B16F10肺转移的生长已知在缺乏EBI3和Il27ra(Wsx-1)的小鼠中显著降低(Sauer等人,J.Immunology 181:6148-6157)。由于肺结节大小和生长动力学取决于转移的B16F10细胞的数量，并且能够可变且快速地进展，因此研究了抗PD-1与抗CTLA-4的组合作为治疗活性的基准。SRF388预处理产生总体肿瘤负担的显著降低。为了评价抗IL-27抗体的体内抗肿瘤功效，评估了Ab14对B16F10黑素瘤肿瘤模型中肿瘤生长的影响。
简言之，通过尾静脉向六至八周龄的雌性C57BL/6小鼠(n＝10只/组)静脉内(i.v.)接种200μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的2.5x105个B16F10细胞或1x105个B16-Luc细胞。向动物腹膜内(i.p.)注射SRF388(1mg剂量)(Wuxi；批次2108SD170316K01X01I01)或多克隆人IgG同种型对照(1mg剂量)(Bioxcell；BE0092；批次658417D1)。从肿瘤注射前7天开始，每周一次给予抗体，总计四个剂量(第-7天、第0天、第7天和第14天)。为了目测肺转移，在肿瘤细胞注射后18天，通过CO2窒息对B16F10荷瘤小鼠进行安乐死，并将肺通过心脏穿刺用PBS灌注，取出并固定在10％中性缓冲福尔马林中24小时。然后将固定的肺转移至70％乙醇中，并且目测计数表面肺转移。为了进行免疫组织化学分析，将福尔马林固定的肺(n＝5/组)用石蜡包埋，切片并用苏木精和曙红染色，以定量肿瘤总面积作为各切片中总组织面积的百分比。为了对肺转移进行体内肿瘤成像，通过尾静脉向B16-Luc荷瘤动物每周两次静脉内注射3mg的200μl PBS(Promega)中的VivoGlo D-荧光素。荧光素注射后五分钟，将动物麻醉，并使用IVIS Lumina LT Series III成像仪进行生物发光成像。使用Living Image(版本4.5.5)软件分析图像，并表示为以光子/秒为单位的总通量测量值。
如图7A-7D所示，用抗IL-27抗体SRF388处理B16F10荷瘤小鼠产生总体肿瘤负担的显著降低，如通过表面肺转移的总计数(肺结节数量，图7A)和通过免疫组织化学(IHC)分析肺组织切片中的肿瘤面积减小(图7C和图7D)所测量。与同种型对照处理相比，用SRF388阻断p28使得肺B16结节数量减少42％。与同种型对照相比，SRF388处理显著抑制(p＝0.0079)B16F10肺转移的生长(分别为21.6±8.4对比37.6±10.9个肺结节)。如通过IHC所测量，SRF388处理使得总体肺肿瘤转移面积减小83％(同种型对照组中16.43％±1.39％对比SRF388处理组中2.83％±1.45％)。类似地，生物发光成像显示，SRF388处理显著(p＝0.0062)延迟了B16-Luc肺转移的生长(图7B)。用IL-27RA(WSX-1)介导的抗体阻断和用抗PD-1+抗CTLA-4组合疗法观察到表面肺转移数量和总肿瘤面积的相似减少，如图7D所示。这些数据来自2个独立的实验，其中抗PD-1和抗CTLA-4基准组合显示出抗肿瘤活性。将B16F10细胞(2.5x105个)静脉注射到C57BL/6小鼠(n＝10只/组)中。将小鼠用1mg的SRF388、抗IL-27RA(WSX-1)或人IgG同种型对照抗体对小鼠进行腹膜内处理(第-7天、第0天、第7天、第14天)。用抗PD-1和抗CTLA-4对一些动物进行腹膜内处理(第0天、第4天、第7天和第11天)。从如上所述处理的携带B16F10肺转移的动物(n＝5只/组)中收集肺，将其切片并用H&E染色。在来自经处理动物的H&E染色的肺切片中，从正常肺组织描绘出B16F10肿瘤组织(图7A)。将肿瘤面积计算为总肺面积的百分比(图7D)。通过t检验计算统计数据。总体而言，这些数据表明SRF388可在肿瘤模型中表型复制Il27ra(WSX-1)和EBI3缺乏，并且显示出与组合阻断PD-1和CTLA-4相似的活性。
这些数据证明，用抗IL-27抗体(SRF388)治疗产生抗肿瘤作用，从而与用不结合IL-27的同种型对照抗体治疗相比，使肿瘤生长和转移降低至更大程度。
实施例9：来自用人IL-27小环流体动力学转染的小鼠的鼠脾细胞的基因表达谱分析
为了检查IL-27对体内T细胞表型的影响，使用编码IL-27的DNA微环在小鼠中过表达IL-27，并通过RNA-Seq和流式细胞术评估T细胞应答。已知人IL-27具有物种交叉反应性，并且可在体外诱导鼠脾细胞中的pSTAT1信号传导和PD L1。这种物种交叉反应性用于研究小鼠中人IL-27过表达的影响及SRF388对其的抑制。为此，如下文所述，通过流体动力学转染将编码人IL-27的DNA质粒微环(通过甘氨酸丝氨酸接头栓系至EBI3的p28)施用于小鼠，其导致IL-27的高全身性水平。
人IL-27微环的流体动力学转染
在5秒过程中通过尾静脉向六周龄的雌性BALB/c小鼠注射20μg的2mL 0.9％生理盐水中的空载体或连接的人IL-27微环DNA(System Biosciences,Palo Alto,CA)。将注射的动物转移至带有加热垫的空笼中以恢复5分钟。在微环注射后24小时，将全血收集到K2-EDTA管中进行血浆分离，并通过ELISA确认血浆IL-27水平。转染5天后收集PBMC和总脾细胞，并且将细胞染色并通过流式细胞术进行分析。在CD4+T细胞和CD8+T细胞上分析了所指示标志物的表达。使用FlowJo软件进行分析。
基因表达谱分析
通过机械分解整个脾脏、然后红细胞的ACK裂解来制备小鼠脾细胞。用小型试剂盒(Qiagen，目录号：74104)从脾细胞中提取总RNA，并在无核酸酶的水(Qiagen，目录号：19101)中调节至20ng/ul。基因表达谱分析是在Affymetrix GeneChipTM小鼠基因2.0ST阵列(Applied Biosystems，目录号：902118)上进行的。使用波士顿大学微阵列和测序资源(Boston University Microarray and Sequencing Resource)(BUMSR)的标准Affymetrix GeneChipTM方案进行RNA样品的加工，杂交和阵列扫描。所有CEL文件均通过稳健的多阵列平均值(RMA)进行归一化(Irizarry等人,2003)，并通过去除未表达的探针并丢弃了具有较高重复间变异系数的转录物来对基因表达数据进行预处理。随后的分析(平均表达、倍数变化、t检验)在R中进行。
流式细胞术分析
微环注射五天后从小鼠收集全血和脾脏。转染5天后，从表达IL27的小鼠中收集脾细胞，并通过Affymetrix GeneChip小鼠基因2.0ST阵列进行分析。通过在40μm尼龙细胞过滤器上进行机械解离、然后在ACK缓冲液中进行红细胞裂解来制备单细胞脾细胞悬浮液。根据制造商的说明书(BD Biosciences,San Jose,CA)，将全血细胞直接染色，然后将红细胞裂解并固定在BD Phosflow裂解/固定缓冲液中。将FcγRIII/II通过在含有2％FBS和2mMEDTA的PBS中与大鼠抗小鼠CD16/CD32 mAb(每百万细胞1μg；Biolegend，San Diego，CA)一起预孵育来封闭。将细胞用针对鼠CD4(克隆GK1.5)、CD8(53-6.7)、PD-L1(10F.9G2)、TIM3(RMT3-23)、LAG3(C9B7W)和TIGIT(1G9)的APC-、PE-、亮紫510-和亮紫711-缀合的mAb染色(Biolegend)。使用LSRFortessa X-20流式细胞仪(BD Biosciences)测量细胞相关荧光，并使用FlowJo软件(Tree Star，Ashland，OR)进行分析。
统计分析
如所示，使用GraphPad Prism软件通过配对、未配对或比率学生t检验来确定统计显著性。当使用比率t检验时，将0.1添加至零值以使它们为非零。小于0.05的P值被认为是显著的。
IL-27在体内促进T细胞对抑制性受体的表达
如图8A所示，响应于IL-27的施用，超过400种基因改变≥1.0倍。这些基因的一部分显示在表11中。在这些基因中，有编码在免疫响应中起关键作用的免疫抑制性受体的那些基因。如图8B所示，响应于IL-27，Ly6a(编码Sca-1)、Lag3、Tigit和Il10在脾细胞上上调。还存在朝向IL-27介导的Ctla4和Cd274(编码PD-L1)上调对于1倍诱导的趋势(数据未示出)。为了验证表达数据，利用流式细胞术来评估来自这些小鼠的T细胞上PD-L1、LAG-3、TIGIT和TIM-3的蛋白质表达。IL-27微环的施用使得脾脏(脾)和外周血(PBMC)CD4+T细胞中PD-L1、LAG-3和TIGIT上调。在CD8+T细胞中，IL-27微环上调了PD-L1、LAG-3、TIGIT和TIM-3。如图8C所示，施用IL-27微环使得脾和外周血CD4+T细胞中PD-L1、Lag-3和Tigit上调。在CD8+T细胞中，IL-27微环上调了PD-L1、Lag-3、Tigit和Tim-3。这些数据表明IL-27可在体内驱动免疫调控受体表达中发挥关键作用。
为了研究SRF388在体内阻断微环来源的人IL-27的能力，研究了通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行的靶标接合以及脾细胞中的免疫调控受体表达。在IL-27转染并用SRF388(50mg/kg)处理后五天，从小鼠收集血浆以通过Meso Scale Discovery(MSD)分析IL-27异二聚体和EBI3水平。IL-27异二聚体测定利用交叉阻断SRF388的p28捕获抗体和人特异性EBI3检测抗体；因此，如果SRF388结合至IL-27，则其检测将被掩蔽。EBI3测定利用对人EBI3的2个不同表位具有特异性的捕获抗体和检测抗体，并且由于微环来源的IL-27是束缚的异二聚体，因此这一测定法允许检测总IL 27，而与SRF388结合无关。
简言之，向六周龄的雌性Balb/c小鼠注射空载体(对照)或人IL-27。在微环转染前7天和当天(第-7天和第0天)，用1mg的SRF388或抗DNP IgG1同种型对照抗体处理小鼠。收集全血，并通过Meso Scale Discovery分析血浆中的IL-27(图8D)。图8D示出通过MSD，SRF388治疗完全抑制血浆中IL-27的检测。当测试剂量为25mg/kg的SRF388时，可以观察到类似的数据。这些数据表明，剂量为25mg/kg或更高的SRF388可在体内使微环来源的IL-27完全饱和。在pSTAT1功能测定中也证实了这种完全靶标接合。
为了评估SRF388体内阻断IL-27活性的能力，通过流式细胞术分析了鼠PBMC和脾细胞中PD L1、Tim-3、Lag-3和Tigit的表达。SRF388显著阻断IL 27诱导的CD4+PBMC中的PD-L1和Lag 3表达，以及CD8+PBMC中的PD-L1、Tim-3、Lag-3和Tigit表达。SRF388处理还阻断了IL 27诱导的CD4+脾细胞中的PD-L1、Lag-3和Tigit表达以及CD8+脾细胞中的PD-L1和Lag 3表达。这些数据表明，SRF388可在体内参与和阻断人IL-27的活性。
这些结果证明，IL-27在体内的异位表达导致脾细胞中T细胞和其他几种具有免疫调节活性的分子对多种抑制性受体的上调。这些数据表明IL-27拮抗作用(例如，通过用抗IL-27抗体治疗)将减少T细胞上抑制剂受体的表达，从而增加免疫响应。
表11：响应于IL-27施用而上调的基因
表12：序列表
表13：Fc序列(＝CH2+CH3)
实施例10：SRF388结合性质和IL-27受体阻断
确定了浓度范围为0至5.0μg/mL的重组人IL-27与浓度为1μg/mL的SRF388的缔合和解离。最终的结合动力学参数与结合模型拟合参数(R2和χ2)一起显示在表14中，所述参数证明模型良好拟合至数据。
人IL-27对本研究中测试的所有物种的SRF388表现出最强的结合亲和力(3.86pM)。重组大鼠和食蟹猴IL-27也显示出对SRF388的强亲和力，值分别为80.9和37.4pM，尽管比人蛋白弱一些。与人蛋白质相比，重组小鼠IL-27对SRF388的亲和力最弱，值在nM范围内(4.43nM)，如通过其较慢结合速率和较快解离速率所指示。
表14：IL-27结合至SRF388和物种交叉反应性的数据总结
分析物
K<sub>D</sub>(M)
k<sub>a</sub>(1/Ms)
k<sub>d</sub>(1/s)
全χ<sup>2</sup>
全R<sup>2</sup>
人IL-27
3.86E-12
5.10E+05
1.97E-06
0.4055
0.9991
小鼠IL-27
4.43E-09
5.50E+04
2.44E-04
0.6732
0.9963
大鼠IL-27
8.09E-11
2.34E+06
1.89E-04
0.4685
0.9945
食蟹猴IL-27
3.74E-11
3.18E+05
1.19E-05
1.3431
0.9979
缩写：IL-27＝白细胞介素27，ka＝缔合常数，kd＝解离常数，KD＝结合亲和力
注意：R2值>0.95和χ2值<3.0证明模型与数据的良好拟合。
实施例11：CDR序列比对
本公开的抗IL-27抗体的许多亚选择在它们的CDR区域上共有序列同源性，从而提供已被证实为保留功能性的多种变体CDR序列。本文中明确预期，以下共有CDR序列完全由本公开支持，并且因此在本公开的范围内。
对于SRF388、SRF381、SRF382、SRF384、SRF386和SRF529抗体，这些抗IL-27抗体各自的CDR序列的比对揭示广泛同源性，由可变残基打断。特别地，重链CDR1比对揭示以下可变残基：
HCDR1(IMGT)
CLUSTAL O(1.2.4)多重序列比对
1 GFTFRSYG 8(SEQ ID NO:161)
5 GFTFRSYG 8(SEQ ID NO:73)
4 GFTFASYG 8(SEQ ID NO:139)
2 GFTFSRTG 8(SEQ ID NO:95)
3 GFTFSRYG 8(SEQ ID NO:117)
6 GFTFSSYS 8(SEQ ID NO:51)
****
因此这些同源抗体的共有重链CDR1(IMGT)序列是N-GFTF[S/A/R][S/R][T/Y][G/S]-C(SEQ ID NO:412)，并且因此，在本文中作为共有重链CDR1(IMGT)序列更一般地考虑的是N-GFTFXXXX-C(SEQ ID NO:408)，其中X是任何氨基酸残基。
SRF388、SRF381、SRF382、SRF384、SRF386和SRF529抗体重链CDR2(IMGT)序列的比对揭示以下：
HCDR2(IMGT)
CLUSTAL O(1.2.4)多重序列比对
10 ISSSGSYI 8(SEQ ID NO:162)
11 ISSSSSYI 8(SEQ ID NO:140)
7 ISSSSSYI 8(SEQ ID NO:74)
9 ISSSSSYI 8(SEQ ID NO:96)
8 ISSSSAYI 8(SEQ ID NO:118)
12 ISSSSSYI 8(SEQ ID NO:52)
****.:**
因此这些同源抗体的共有重链CDR2(IMGT)序列是N-ISSS[S/G][S/A]YI-C(SEQ IDNO:413)，并且因此，在本文中作为共有重链CDR2(IMGT)序列更一般地考虑的是N-ISSSXXYI-C(SEQ ID NO:409)，其中X是任何氨基酸残基。
人CDR1(NT)与人CDR2(NT)序列的比对还揭示以下：
HCDR1(NT)
CLUSTAL O(1.2.4)多重序列比对
13 FTFRSYGMN 9(SEQ ID NO:76)
16 FTFRSYGMN 9(SEQ ID NO:164)
17 FTFASYGMN 9(SEQ ID NO:142)
14 FTFSRTGMN 9(SEQ ID NO:98)
15 FTFSRYGMN 9(SEQ ID NO:120)
18 FTFSSYSMN 9(SEQ ID NO:54)
******
HCDR2(NT)
CLUSTAL O(1.2.4)多重序列比对
23 GISSSGSYIYYADSVKG 17(SEQ ID NO:165)
19 SISSSSSYIYYADSVKG 17(SEQ ID NO:77)
20 SISSSSSYIYYADSVKG 17(SEQ ID NO:99)
22 SISSSSSYIYYADSVKG 17(SEQ ID NO:143)
21 SISSSSAYILYADSVKG 17(SEQ ID NO:121)
24 SISSSSSYIYYADSVKG 17(SEQ ID NO:55)
.****.:*********
因此这些同源抗体的共有重链CDR1(NT)和CDR2(NT)序列分别是N-FTF[S/A/R][S/R][T/Y][G/S]MN-C(SEQ ID NO:414)和N-[G/S]ISSS[S/G][S/A]YI[L/Y]YADSVKG-C(SEQ IDNO:415)。鉴于这些共有序列，本文更一般考虑的是共有重链CDR1(NT)和CDR2(NT)序列分别是N-FTFXXXXMN-C(SEQ ID NO:410)和N-XISSSXXYIXYADSVKG-C(SEQ ID NO:411)，其中X是任何氨基酸残基。
重链CDR3(IMGT或NT)和轻链CDR CDR1(IMGT或NT)、CDR2(IMGT或NT)和CDR3(IMGT或NT)在SRF388、SRF381、SRF382、SRF384、SRF386和SRF529之间完全保守。
对SRF535和SRF538单克隆抗体进行的类似CDR序列比对揭示了这两种相关抗体的以下共有CDR序列：
观察到的变异(IMGT)：
HCDR1(IMGT)-N-GFTFSSYG-C(SEQ ID NO:361)
HCDR2(IMGT)-N-I[K/W][Q/Y]DGS[E/N]K-C(SEQ ID NO:445)
HCDR3(IMGT)-N-AR[D/G]AP[WDIYDYYM/EYV]DV-C(SEQ ID NO:446)
LCDR1(IMGT)-N-QS[I/V]SSY-C(SEQ ID NO:447)
LCDR2(IMGT)-N-[A/D][A/S]S-C(SEQ ID NO:448)
LCDR3(IMGT)-N-QQ[S/Y][Y/S][V/L][P/Y]P[W/-]T-C(SEQ ID NO:449)
共有序列(IMGT)：
HCDR1(IMGT)-N-GFTFSSYG-C(SEQ ID NO:361)
HCDR2(IMGT)-N-IXXDGSXK-C(SEQ ID NO:436)
HCDR3(IMGT)-N-ARXAP[X]n＝3-8DV-C(SEQ ID NO:437)
LCDR1(IMGT)-N-QSXSSY-C(SEQ ID NO:438)
LCDR2(IMGT)-N-XXS-C(SEQ ID NO:439)
LCDR3(IMGT)-N-QQXXXXP[X]n＝0-1T-C(SEQ ID NO:440)
观察到的变异(NT)：
HCDR1(NT)-N-FTFSSYGM[S/H]-C(SEQ ID NO:450)
HCDR2(NT)-N-[N/V]I[K/W][Q/Y]DGS[E/N]KYY[V/A]DSVKG-C(SEQ ID NO:451)
HCDR3(NT)-N-AR[D/G]AP[WDIYDYYM/EYV]DV-C(SEQ ID NO:446)
LCDR1(NT)-N-RASQS[I/V]SSYL[N/A]-C(SEQ ID NO:452)
LCDR2(NT)-N-[AA/D]SS[LQS/NRAT]-C(SEQ ID NO:453)
LCDR3(NT)-N-QQ[S/Y][Y/S][V/L][P/Y]P[W/-]T-C(SEQ ID NO:449)
共有序列(NT)：
HCDR1(NT)-N-FTFSSYGMX-C(SEQ ID NO:441)
HCDR2(NT)-N-XIXXDGSXKYYXDSVKG-C(SEQ ID NO:442)
HCDR3(NT)-N-ARXAP[X]n＝3-8DV-C(SEQ ID NO:437)
LCDR1(NT)-N-RASQSXSSYLX-C(SEQ ID NO:443)
LCDR2(NT)-N-[X]n＝1-2SS[X]n＝3-4-C(SEQ ID NO:444)
LCDR3(NT)-N-QQXXXXP[X]n＝0-1T-C(SEQ ID NO:440)
在整个SRF388、SRF381、SRF382、SRF384、SRF386、SRF529、SRF535和SRF538抗体之间也进行了CDR序列的比对，所述比对产生了以下观察到的变异和共有序列：
观察到的变异(IMGT)：
HCDR1(IMGT)-N-GFTF[S/A/R][S/R][T/Y][G/S]-C(SEQ ID NO:454)
HCDR2(IMGT)-N-I[S/K/W][S/Q/Y][S/D][S/G][S/A][Y/E/N][I/K]-C(SEQ ID NO:455)
HCDR3(IMGT)-N-AR[DGGRTSYTATAHNWF/DAPWDIYDYYM/GAPEYV]D[P/V]-C(SEQ IDNO:457)
LCDR1(IMGT)-N-QS[VLF/I/V]SS[NNKN/-]Y-C(SEQ ID NO:459)
LCDR2(IMGT)-N-[W/A/D][A/S]S-C(SEQ ID NO:461)
LCDR3(IMGT)-N-QQ[H/S/Y][A/Y/S][S/V/L][A/P/Y]P[P/W/-]T-C(SEQ ID NO:463)
共有序列(IMGT)：
HCDR1(IMGT)-N-GFTFXXXX-C(SEQ ID NO:408)
HCDR2(IMGT)-N-IXXXXXXX-C(SEQ ID NO:456)
HCDR3(IMGT)-N-AR[X]n＝6-15DX-C(SEQ ID NO:458)
LCDR1(IMGT)-N-QS[X]n＝1-3SS[X]n＝0-4Y-C(SEQ ID NO:460)
LCDR2(IMGT)-N-XXS-C(SEQ ID NO:462)
LCDR3(IMGT)-N-QQXXXXP[X]n＝0-1T-C(SEQ ID NO:464)
观察到的变异(NT)：
HCDR1(NT)-N-FTF[S/A/R][S/R][T/Y][G/S]M[N/S/H]-C(SEQ ID NO:465)
HCDR2(NT)-N-[G/S/N/V]I[S/K/W][S/Q/Y][S/D][S/G][S/A][Y/E/N][I/K][L/Y]Y[V/A]DSVKG-C(SEQ ID NO:467)
HCDR3(NT)-N-AR[D/G][GGRTSYTATAHNWF/APWDIYDYYM/APEYV]D[P/V]-C(SEQ IDNO:469)
LCDR1(NT)-N-RASQS[I/V]SSYL[N/A]-C(SEQ ID NO:471)
LCDR2(NT)-N-[WA/AA/D]S[TRES/SLQS/SNRAT]-C(SEQ ID NO:473)
LCDR3(NT)-N-QQ[H/S/Y][A/Y/S][S/V/L][A/P/Y]P[P/W/-]T-C(SEQ ID NO:475)
共有序列(NT)：
HCDR1(NT)-N-FTFXXXXMX-C(SEQ ID NO:466)
HCDR2(NT)-N-XIXXXXXXXXYXDSVKG-C(SEQ ID NO:468)
HCDR3(NT)-N-AR[X]n＝6-15DX-C(SEQ ID NO:470)
LCDR1(NT)-N-RASQSXSSYLX-C(SEQ ID NO:472)
LCDR2(NT)-N-[X]n＝1-2S[X]n＝4-5-C(SEQ ID NO:474)
LCDR3(NT)-N-QQXXXXP[X]n＝0-1T-C(SEQ ID NO:476)
还进行了SRF543和SRF414的比对，并且产生了以下观察到的变异和共有序列：
观察到的变异(IMGT)：
HCDR1(IMGT)-N-GGSFS[R/D]Y[E/Y]-C(SEQ ID NO:426)
HCDR2(IMGT)-N-ID[W/Y]SG[I/S]T-C(SEQ ID NO:427)
HCDR3(IMGT)-N-AR[D/L][P/G][M/V]YY[-/Y]DSS[VSTGSV/DLGF]D[V/I]-C(SEQ IDNO:428)
LCDR1(IMGT)-N-Q[S/D][V/I]S[S/N]Y-C(SEQ ID NO:429)
LCDR2(IMGT)-N-D[S/A]S-C(SEQ ID NO:430)
LCDR3(IMGT)-N-QQ[D/Y][S/D]D[H/L]PIT-C(SEQ ID NO:431)
共有序列(IMGT)：
HCDR1(IMGT)-N-GGSFSXYX-C(SEQ ID NO:416)
HCDR2(IMGT)-N-IDXSGXT-C(SEQ ID NO:417)
HCDR3(IMGT)-N-ARXXXYY[X]n＝0-1DSS[X]n＝4-6DX-C(SEQ ID NO:418)
LCDR1(IMGT)-N-QXXSXY-C(SEQ ID NO:419)
LCDR2(IMGT)-N-DXS-C(SEQ ID NO:420)
LCDR3(IMGT)-N-QQXXDXPIT-C(SEQ ID NO:421)
观察到的变异(NT)：
HCDR1(NT)-N-GSFS[R/D]Y[E/Y]WS-C(SEQ ID NO:432)
HCDR2(NT)-N-SID[W/Y]SG[I/S]T[N/E]YNPSLKS-C(SEQ ID NO:433)
HCDR3(NT)-N-AR[D/L][P/G][M/V]YY[-/Y]DSS[VSTGSV/DLGF]D[V/I]-C(SEQ IDNO:428)
LCDR1(NT)-N-[Q/R]ASQ[S/D][V/I]S[S/N]YL[N/A]-C(SEQ ID NO:434)
LCDR2(NT)-N-D[S/A]SN[R/L][A/E]T-C(SEQ ID NO:435)
LCDR3(NT)-N-QQ[D/Y][S/D]D[H/L]PIT-C(SEQ ID NO:431)
共有序列(NT)：
HCDR1(NT)-N-GSFSXYXWS-C(SEQ ID NO:422)
HCDR2(NT)-N-SIDXSGXTXYNPSLKS-C(SEQ ID NO:423)
HCDR3(NT)-N-ARXXXYY[X]n＝0-1DSS[X]n＝4-6DX-C(SEQ ID NO:418)
LCDR1(NT)-N-XASQXXSXYLX-C(SEQ ID NO:424)
LCDR2(NT)-N-DXSNXXT-C(SEQ ID NO:425)
LCDR3(NT)-N-QQXXDXPIT-C(SEQ ID NO:421)
实施例12：选择的单克隆抗体的性质
评估了本公开的选择的单克隆抗体的各种功能性质。某些这样的评估的结果列在图9中。显著地，鉴定了表现出与人IL-27结合的具有15nM或更小的平衡解离常数(KD)的多种单克隆抗体(如上所述，如通过BIACORE 2000仪器中的表面等离子体共振(SPR)技术所确定)(“性质(i)”)，所述单克隆抗体包括Ab7、SRF557、SRF536、SRF416、SRF543、SRF414、SRF529、SRF381、SRF388、SRF382、SRF384、SRF386、SRF410、SRF411、SRF405、SRF535和SRF538。
出人意料地，鉴定了具有WSX-1竞争性(“性质(ii)”)的单克隆抗体选择，所述单克隆抗体包括Ab7、SRF536、SRF416、SRF543、SRF414、SRF529、SRF381、SRF388、SRF382、SRF384、SRF386、SRF535和SRF538。
出人意料地，鉴定了抑制pSTAT1 U937(“性质(iii)”)的单克隆抗体选择，所述单克隆抗体包括Ab7、SRF536、SRF416、SRF543、SRF414、SRF529、SRF381、SRF388、SRF382、SRF384、SRF386、SRF410、SRF411、SRF405、SRF535和SRF538。
显著地，还鉴定了抑制CD161表达(“性质(iv)”)的单克隆抗体选择，所述单克隆抗体包括Ab7、SRF536、SRF416、SRF543、SRF529、SRF381、SRF388、SRF382、SRF384和SRF386。
还鉴定了显著抑制CD4+T细胞中的PD-L1表达(“性质(v)”)的单克隆抗体选择，所述单克隆抗体包括Ab7、SRF536、SRF416、SRF543、SRF414、SRF529、SRF381、SRF388、SRF382、SRF384、SRF386和SRF535。
尽管仅测试了有限数量的单克隆抗体，但也观察到所测试的那些抗体增强PD-1介导的细胞因子分泌能力的差异(“性质(vi)”)。具体而言，SRF381和SRF388抗体显著鉴定为增强PD-1介导的细胞因子分泌，而SRF536则不能。
因此，本文已经鉴定了具有如上所述的性质(i)-(vi)中的每一种的单克隆抗体。并非所有被检查的抗体都被鉴定为具有性质(i)-(vi)中的每一种，并且因此明确地考虑到可组装具有这些性质的子选择的抗体选择。例如，抗体Ab7、SRF536、SRF416、SRF543、SRF529、SRF381、SRF388、SRF382、SRF384和SRF386被鉴定为具有性质(i)-(v)中的每一种。同时，抗体Ab7、SRF536、SRF416、SRF543、SRF529、SRF381、SRF388、SRF382、SRF384和SRF386被鉴定为具有性质(iii)-(iv)中的每一种。对于本领域技术人员而言显而易见的是，抗体的相似亚选择和相关性质可容易地从图9所呈现的信息组装。
实施例13：来自人患者的血清中EBI3和IL-27的测量
为了探测血清或血浆中EBI3和IL-27的蛋白质水平，开发了在图11至图12中所示的用于ELISA和MSD的新抗体对。使用定制EBI3 ELISA，对来自癌症患者的几种血清/血浆样品进行了测试。筛选群组是从商业供应商获得的，并且通过从重组人IL 27的标准曲线外推计算EBI3的水平。如先前所公布的(Devergne等人Am J Pathol.2001；159(5):1763-76)，将来自孕妇的血清用作EBI3检测的阳性对照。EBI3水平升高被归类为健康对照(正常血清)平均值之上的2个标准差。通过这种分析，EBI3水平升高似乎是RCC患者的共同特征，而在其他测试的癌症类型中偶发地发现了EBI3水平升高。当测试这些相同样品的IL-27异二聚体水平时，基于重组IL-27的检测，没有RCC样品为阳性或高于测定的定量下限(图11A)。几种卵巢癌样品在血清中显示可检测水平的IL-27，在来自3名B细胞淋巴瘤患者和1名子宫内膜癌患者的血清中也观察到可检测水平的IL-27(图11B)。由于EBI3水平高于测定的较低定量水平，因此使用这种ELISA格式进行了另外的实验。在更敏感的MSD平台(如下所述)上进行了针对IL-27抗体对的进一步测定优化。
实施例14：小鼠中人抗WSX-1抗体的产生和表征
此实施例描述特异性地结合至人IL-27受体WSX-1的人抗WSX-1抗体的产生。简言之，用编码人WSX-1的免疫DNA载体(Aldevron)对Harbour H2L2小鼠(Harbour Biomed)进行免疫，并产生了表达抗WSX-1单克隆抗体的杂交瘤。Harbour H2L2转基因小鼠在抗原攻击后产生具有完整人可变区的经典的两个重和两个轻链免疫球蛋白抗体。
在对Harbour H2L2小鼠免疫后，使用标准杂交瘤技术分离了特异性地结合人IL-27受体WSX-1的抗原特异性H2L2单克隆抗体。简言之，在从小鼠血清中确认WSX-1阳性滴度后，除去小鼠脾脏，并使用典型的融合方法创建杂交瘤细胞。使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen，目录号74104)从杂交瘤细胞沉淀物中提取RNA。使用对人信号序列具有特异性的简并引物库以及针对IgG、IgM、Igλ和Igκ中的每一者的大鼠恒定区引物，通过RT-PCR扩增V区。使用一组七个简并引物库(HA至HF)扩增了重链V区(VH)mRNA。使用对κ簇具有特异性的一组三个简并引物库(KA至KC)和对λ簇具有特异性的三个引物库(LA至LC)来扩增轻链V区mRNA。将从成功扩增获得的PCR产物纯化，克隆到‘TA’克隆载体(pGEM-T Easy，Promega，目录号A1360)中，转化到大肠杆菌中，并对单独集落进行测序，从而鉴定和分离抗WSX-1抗体8B11。8B11抗体的可变重链和可变轻链的氨基酸序列分别示于表12中的SEQ ID NO:794和SEQ ID NO:796中。
实施例15：抗IL-27抗体与抗EBI3抗体Ab7配对以检测重组人IL-27
为了提高这些测定的灵敏度和动态范围，在MSD平台上优化了EBI3和IL-27抗体对。这样，较低的定量水平分别从EBI3和IL 27的约2.5ng/mL降低至80pg/mL和630pg/mL。然后使用这种MSD平台来探测从商业供应商获得的另一组血清和血浆样品，以检测IL-27和EBI3。
确定了来自患有多种癌症类型的患者的血清样品和来自健康供体的血清样品中白细胞介素27(IL-27)和爱泼斯坦-巴尔病毒诱导的3(EBI3)的浓度。评估了从BioIVT获得的总计174例血清样品(15例肾细胞癌[RCC]，15例卵巢癌，10例肝细胞癌[HCC]，15例急性骨髓性白血病[AML]，15例弥漫性大B细胞淋巴瘤[DLBCL]，14例肉瘤，15例黑素瘤，15例头颈部鳞状细胞癌[HNSCC]，10例霍奇金淋巴瘤，15例胃癌，1例睾丸癌，15例子宫内膜癌和19例健康供体)。使用Meso Scale Discovery(MSD)测定确定了IL-27和EBI3的血清浓度。简言之，使用由重组人IL-27蛋白构建的标准曲线确定了IL-27和EBI3的浓度在0至723ng/mL范围内。IL-27MSD的捕获和检测抗体对是抗p28抗体SRF381和抗EBI3抗体Ab7。EBI3 MSD的捕获和检测抗体对是抗EBI3抗体SRF557和抗EBI3抗体Ab7。将SULFO-TAG标记的山羊抗小鼠抗体用作检测抗体，并在MESO QUICKPLEX SQ120上读取板。
通过夹心ELISA评估了抗IL-27抗体与抗EBI3抗体Ab7配对以检测重组人IL-27的能力。图12A示出如通过夹心ELISA所测量，通过Ab7检测，抗IL-27抗体SRF381与重组人IL-27的结合。图12B示出如通过MSD夹心免疫测定所测量，通过SRF381检测，抗IL-27抗体与重组人IL-27的结合。
与通过ELISA获得的观察结果一致，一些RCC患者(15名中的9名)通过MSD检测显示EBI3的水平高于健康供体中所观察到的水平(＞平均值+2SD)(图12C-12D)。基于TCGA中EBI3或p28的肿瘤转录水平或已知与病毒感染相关的癌症(一种已知驱动EBI3和p28表达的免疫刺激物)，探索了几种其他癌症类型。在这些组中的29例，EBI3的水平几乎在肝细胞癌中均匀增加，并且接近50％的子宫内膜癌患者(15名中的7名)。
图12E示出通过MSD夹心免疫测定使用SRF381作为捕获和Ab7作为检测对重组人IL-27的检测。图12F示出通过MSD夹心免疫测定使用SRF557作为捕获和Ab7作为检测对重组人IL-27的检测。
随着IL-27MSD测定的灵敏度提高，在所测试的155个样品中的38个中检测到高于较低定量水平的血清水平。4个样品具有>10ng/mL的浓度(各自1例来自RCC、弥漫性大B细胞淋巴瘤、黑素瘤和头颈部鳞状细胞癌[HNSCC])，而若干HCC(10例中的5例)、黑素瘤(15例中的7例)和HNSCC(15例中的5例)样品具有高于定量下限的可检测水平的IL-27。这些数据分别针对IL-27和EBI3的水平总结于以下表5和表6中。因此，MSD格式提供了用于检测血清中的IL-27的灵敏度；然而，所述水平始终低于针对EBI3所能够检测到的水平，从而表明发现了EBI3亚基过量。
表15：来自癌症患者和健康供体的血清中IL-27浓度的分布
缩写：AML＝急性骨髓性白血病，DLBCL＝弥漫性大B细胞淋巴瘤，HCC＝肝细胞癌，HNSCC＝头颈部鳞状细胞癌，Hodgkin＝霍奇金淋巴瘤，IL-27＝白细胞介素27，LLOQ＝定量下限，NA＝不适用，RCC＝肾细胞癌，SD＝标准偏差
a.使用来自每种血清样品类型的所有值(具有高于LLOQ的2个重复值)计算平均IL-27水平。
表16：来自癌症患者和健康供体的血清中EBI3浓度的分布
缩写：AML＝急性骨髓性白血病，DLBCL＝弥漫性大B细胞淋巴瘤，EBI3＝爱泼斯坦-巴尔病毒诱导的基因3，HCC＝肝细胞癌，HD＝健康供体，HNSCC＝头颈部鳞状细胞癌，Hodgkin＝霍奇金淋巴瘤，LLOQ＝定量下限，NA＝不适用，RCC＝肾细胞癌，SD＝标准偏差
a.所有血清样品均具有高于LLOQ的EBI3水平。
b.HD平均值+2SD EBI3浓度＝约13ng/mL。
c.通过未配对的t检验，与HD相比，EBI3浓度具有统计学上显著的增加。RCC对比HD：p＝0.0002；HCC对比HD：p<0.0001；DLBCL对比HD：p＝0.0180；以及子宫内膜对比HD：p＝0.0098。
这些数据共同表明，在RCC和HCC患者中通常发现循环EBI3的水平升高；然而，这种EBI3似乎并非仅与p28在血清/血浆中复合。对于异二聚体细胞因子IL-12或IL-23也显示了类似的发现，其中可发现两个分子共有的p40亚基以单体形式循环，超过并独立于p19或p35异二聚体对。已经推测，异二聚体亚基的局部表达可能在空间上限制异二聚体的生物活性。
夹心测定
将Nunc MaxiSorp ELISA板(Affymetrix#44-2404-21)用100μL/孔重组人IL-27抗体(于PBS中稀释的0.5μg/mL)包被，密封并在4℃孵育过夜。这些捕获抗体包括例如抗p28抗体(例如，SRF381、SRF529、SRF388、SRF382、SRF384、SRF386、SRF605、SRF535、SRF538)或抗EBI3抗体(例如，SRF557、SRF536、SRF416、SRF543、SRF414、SRF541和Ab7)或抗IL-27抗体(例如，SRF583、SRF410、SRF411、SRF405和SRF573)。将板用100μL/孔的洗涤缓冲液(PBS+0.01％Tween)洗涤3次。然后在室温(RT)振荡下，用200μL/孔的封闭缓冲液(PBS+0.1％BSA+0.01％Tween)封闭板1小时。倾析封闭缓冲液，将板用100μL/孔的洗涤缓冲液洗涤3次，并且将100μL的重组人IL-27(R&D Systems 2526-IL/CF)(在封闭缓冲液中稀释的100ng/mL)添加至每个孔。倾析板，用100μL/孔的洗涤缓冲液洗涤3次，并在室温下在振荡下添加100μL/孔的生物素化的检测抗体(在封闭缓冲液中稀释的1μg/mL)1小时。检测抗体包括例如抗p28抗体(例如，SRF381、SRF529、SRF388、SRF382、SRF384、SRF386、SRF605、SRF535、SRF538)或抗EBI3抗体(例如，SRF557、SRF536、SRF416、SRF543、SRF414、SRF541和Ab7)或抗IL-27抗体(例如SRF583、SRF410、SRF411、SRF405和SRF573)，(用于检测IL-27异二聚体、EBI3和p28的抗体的特定组合在以下表17-19中列出。)倾析检测抗体，将板用100μL/孔的洗涤缓冲液洗涤3次，并在室温下在振荡下添加100μL/孔的链霉抗生物素蛋白HRP(Abcam ab7403)(在封闭缓冲液中1:5000稀释)1小时。将板用100μL/孔的洗涤缓冲液洗涤3次，在室温下添加100μL/孔的TMB缓冲液(Life Technologies#00-2023)10分钟，并且添加50μL/孔的终止溶液(ThermoFisher#SS04)。在终止反应的30分钟内在450nm处读取板。
表17：IL-27异二聚体ELISA抗体组合
可用于如实施例15中所述检测IL-27的方法中的抗p28抗体和抗EBI3抗体组合示于表17中。此外，抗IL-27抗体SRF583、SRF410、SRF411、SRF405和SRF573可各自与Ab7、SRF557、SRF536、SRF416、SRF543、SRF414、SRF541、SRF529、SRF381、SRF388、SRF382、SRF384、SRF386、SRF605、SRF535和SRF538中的任一者组合使用。
表18：EBI3 ELISA抗体组合
可用于如实施例15中所述检测EBI3的方法中的EBI3抗体组合示于表18中。
表19：P28 ELISA抗体组合
可用于如实施例15中所述检测p28的方法中的P28抗体组合示于表19中。
通过夹心MSD免疫测定评估了抗IL-27抗体与抗p28抗体SRF381配对以检测重组人IL-27的能力。简言之，将MSD QUICKPLEX 96孔板(Meso Scale Discovery L55XA)用50μL/孔的抗IL-27抗体(在PBS中稀释的0.5μg/mL)包被，密封，并在4℃下孵育过夜。将板用150μL/孔的洗涤缓冲液(PBS+0.01％Tween)洗涤3次。然后在室温(RT)振荡下，用200μL/孔的封闭缓冲液(PBS+1％BSA+0.01％Tween)封闭板1小时。倾析封闭缓冲液，将板用150μL/孔的洗涤缓冲液洗涤3次，并且在室温下振荡下将50μL/孔的重组人IL-27(R&D Systems 2526-IL/CF)(在封闭缓冲液中稀释的500ng/mL)添加至每个孔中持续2小时。将板用150μL/孔的洗涤缓冲液洗涤3次，并且在室温下振荡下将50μL生物素化的SRF381(在封闭缓冲液中稀释0.5μg/mL)添加至每个孔中持续1小时。将板用150μL/孔的洗涤缓冲液洗涤3次，并且在室温下振荡下将50μL/孔的SULFO-TAG标记的链霉抗生物素蛋白(Meso Scale Discovery R92TC-1)(在封闭缓冲液中1:1000稀释)添加至每个孔中持续30分钟。将板用150μL/孔的洗涤缓冲液洗涤3次，并且向每个孔中添加150μL的MSD读取缓冲液(Meso Scale Discovery R92TC-1)(在去离子水中稀释至2倍)，然后在MESO QUICKPLEX SQ120上读取板。
免疫测定
将MSD QUICKPLEX 96孔板(Meso Scale Discovery L55XA)用50μL/孔的SRF381或SRF557(在PBS中稀释的0.5μg/mL)包被，密封并在4℃孵育过夜。将板用150μL/孔的洗涤缓冲液(PBS+0.01％Tween)洗涤3次。然后在室温(RT)振荡下，用200μL/孔的封闭缓冲液(PBS+1％BSA+0.01％Tween)封闭板1小时。倾析封闭缓冲液，将板用150μL/孔的洗涤缓冲液洗涤3次，并且在室温下振荡下将50μL/孔在封闭缓冲液中稀释的重组人IL-27(R&DSystems2526-IL/CF)添加至每个孔中持续2小时。以100ng/mL开始创建8点2倍系列稀释IL-27标准曲线。将板用150μL/孔的洗涤缓冲液洗涤3次，并且在室温下振荡下将50μL Ab7(在封闭缓冲液中稀释0.5μg/mL)添加至每个孔中持续1小时。将板用150μL/孔的洗涤缓冲液洗涤3次，并且在室温下振荡下向每个孔中添加50μL/孔的MSD SULFO-TAG缀合的山羊抗小鼠抗体(Meso Scale Discovery R32AC-5)(在封闭缓冲液中1:1000稀释)持续30分钟。将板用150μL/孔的洗涤缓冲液洗涤3次，并且向每个孔中添加150μL的MSD读取缓冲液(Meso ScaleDiscovery R92TC-1)(在去离子水中稀释至2倍)，然后在MESO QUICKPLEX SQ120上读取板。
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