阅读说明：本技术 植物的组织培养方法及其装置以及代谢产物的生产方法 (Plant tissue culture method and device and production method of metabolite ) 是由 饶君凤 吕伟德 凌霄 林紫怡 胡玉林 罗煦钦 边天煜 何国强 于 2019-11-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了植物的组织培养方法及其装置以及代谢产物的生产方法,属于植物组织培养和代谢产物领域。植物的组织培养方法及其装置以及代谢产物的生产方法,通过明确植物的组织培养方法,优化愈伤组织培养流程,加快了愈伤组织的培养过程,并且通过优化生长素起到了对愈伤组织的诱导及生长作用,增长了其生长代谢物产量,由于目前的生态环境造成的破坏和人们对于野生资源的盲目采集,造成许多野生植物趋于濒危,导致众多的生物天然活性物质来源减少,并且化学合成方法由于工艺复杂和费用高,同时易造成新的环境污染,本发明可以有效的增长植物天然活性物质的生产量。(The invention discloses a plant tissue culture method and a device thereof and a production method of a metabolite, belonging to the field of plant tissue culture and metabolites. The invention relates to a plant tissue culture method, a plant tissue culture device and a production method of metabolites, wherein the callus culture process is optimized by defining the plant tissue culture method, the callus culture process is accelerated, the callus is induced and grown by optimizing auxin, the yield of the growing metabolites is increased, a plurality of wild plants tend to be endangered due to the damage caused by the current ecological environment and the blind collection of wild resources by people, so that the sources of a plurality of biological natural active substances are reduced, and the production of the plant natural active substances can be effectively increased due to the complex process and high cost of a chemical synthesis method and the easy new environmental pollution.)

植物的组织培养方法及其装置以及代谢产物的生产方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养和代谢产物领域，尤其涉及植物的组织培养方法及其装置以及代谢产物的生产方法。

背景技术

地球上种类繁多、数量浩瀚的植物是人类赖以生存的宝贵资源，从植物来的有机物包括初生代谢物和次生代谢物两大类。初生代谢物与植物生长、发育、繁殖直接相关，是植物获得能量的代谢，为植物体生存、生长、发育、繁殖提供能量和中间产物。次生代谢物是相对于初生代谢物而言，是以初生代谢的一些中间产物作为原料或前体，进行进一步的代谢过程。植物的这种次生代谢产物是释放能量过程中产生的物质，与植物生长、发育、繁殖无直接关系。但是这些次生代谢物往往具有很强的生物活性和经济利用价值，是人类防治疾病的天然活性物质(即药用有效成分)或有独特经济利用价值的天然产物。次生代谢机理至今仍是朦胧不清且公认研究难度大，但又是极有应用前景的研究领域。

现有的植物的组织培养方法及其装置以及代谢产物的生产方法，代谢产物产量交底，无法满足现有需要。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有的代谢产物产量交底，无法满足现有需要问题，而提出的植物的组织培养方法及其装置以及代谢产物的生产方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

植物的组织培养方法及其装置以及代谢产物的生产方法，包括以下步骤：

S1、采集当年新生幼茎及叶，茎切成3-4cm长的小段，叶切成1cm宽长条，用体积分数为2％的双氧水洗涤，并用自来水反复清洗后，采用流水冲洗1.5h，并用体积分数65％乙醇消毒40s，无菌水冲洗3-4次，再采用1g/L HgCl₂消毒3-7min，之后无菌水冲洗4-5次备用；

S2、选用当年饱满种子，浸泡22h后剥去种皮后用清水反复冲洗，之后采用体积分数为70％的酒精，消毒1min，无菌水冲洗3-4次，1g/L HgCl₂，消毒15min，无菌水冲洗4-5次，接入1/2MS培养基中，保持温度为22-27℃左右下自然光照培养；

S3、将S2中发育完成的幼茎切成0.7cm长段，幼叶切成0.5cm*0.5cm的方块接种在S1中采集的备用材料上，之后放置在愈伤培养基中，进行愈伤组织培养；

S4、将S3中诱导的愈伤组织，在一代培养基上培养一代愈伤组织，培养完毕后，在继代培养基上，进行愈伤组织继代培养；

S5、取S4中的茎继代培养的第三代愈伤组织，在100ml三脚瓶中加入30ml B₅培养基进行愈伤组织提取培养；

S6、将S5中培养的愈伤组织采集后放置于烘箱中80℃烘至恒重，粉碎后放入烧瓶中，加入体积分数为60％的酒精于75℃水浴中冷凝回流提取两次，每次1h，抽滤合并滤液，得到愈伤组织代谢物。

优选地，所述S3中的愈伤培养基中蔗糖35g/L，用琼脂8g/L固化，pH在愈伤培养基高压灭菌前将调至6.3，培养室温度控制在22-27℃左右，暗光培养时将培养瓶放于不照光培养架上并用黑布覆盖，光照培养时，光照12h/d，光照强度1，000-1，500lx。

优选地，所述一代培养基为B₅培养基，并添加0.5mg/LNAA和0.5mg/LBA。

优选地，所述继代培养基中为B₅培养基，并添加0.5mg/L2，4-D和0.5mg/LNAA。

优选地，所述S6中的愈伤组织粉末与体积分数为60％的酒精按照1：16的质量比进行配比。

优选地，所述S3中培养萌发成苗30d后备用。

优选地，所述S5中培养20天后收获。

与现有技术相比，本发明提供了植物的组织培养方法及其装置以及代谢产物的生产方法，具备以下有益效果：

1.本发明通过明确植物的组织培养方法，优化愈伤组织培养流程，加快了愈伤组织的培养过程，并且通过优化生长素起到了对愈伤组织的诱导及生长作用，增长了其生长代谢物产量，由于目前的生态环境造成的破坏和人们对于野生资源的盲目采集，造成许多野生植物趋于濒危，导致众多的生物天然活性物质来源减少，并且化学合成方法由于工艺复杂和费用高，同时易造成新的环境污染，本发明可以有效的增长植物天然活性物质的生产量。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

实施例1：

植物的组织培养方法及其装置以及代谢产物的生产方法，包括以下步骤：

S1、采集当年新生幼茎及叶，茎切成3-4cm长的小段，叶切成1cm宽长条，用体积分数为2％的双氧水洗涤，并用自来水反复清洗后，采用流水冲洗1.5h，并用体积分数65％乙醇消毒40s，无菌水冲洗3-4次，再采用1g/L HgCl₂消毒3-7min，之后无菌水冲洗4-5次备用；

S2、选用当年饱满种子，浸泡22h后剥去种皮后用清水反复冲洗，之后采用体积分数为70％的酒精，消毒1min，无菌水冲洗3-4次，1g/L HgCl₂，消毒15min，无菌水冲洗4-5次，接入1/2MS培养基中，保持温度为22-27℃左右下自然光照培养；

S3、将S2中发育完成的幼茎切成0.7cm长段，幼叶切成0.5cm*0.5cm的方块接种在S1中采集的备用材料上，之后放置在愈伤培养基中，进行愈伤组织培养；

S4、将S3中诱导的愈伤组织，在一代培养基上培养一代愈伤组织，培养完毕后，在继代培养基上，进行愈伤组织继代培养；

S5、取S4中的茎继代培养的第三代愈伤组织，在100ml三脚瓶中加入30ml B₅培养基进行愈伤组织提取培养；

S6、将S5中培养的愈伤组织采集后放置于烘箱中80℃烘至恒重，粉碎后放入烧瓶中，加入体积分数为60％的酒精于75℃水浴中冷凝回流提取两次，每次1h，抽滤合并滤液，得到愈伤组织代谢物。

进一步，优选地，S3中的愈伤培养基中蔗糖35g/L，用琼脂8g/L固化，pH在愈伤培养基高压灭菌前将调至6.3，培养室温度控制在22-27℃左右，暗光培养时将培养瓶放于不照光培养架上并用黑布覆盖，光照培养时，光照12h/d，光照强度1，000-1，500lx。

进一步，优选地，一代培养基为B₅培养基，并添加0.5mg/LNAA和0.5mg/LBA。

进一步，优选地，继代培养基中为B₅培养基，并添加0.5mg/L2，4-D和0.5mg/LNAA。

进一步，优选地，S6中的愈伤组织粉末与体积分数为60％的酒精按照1：16的质量比进行配比。

进一步，优选地，S3中培养萌发成苗30d后备用。

进一步，优选地，S5中培养20天后收获。

实施例2：基于实施例1，但有所不同的是：

表1不同浓度的2，4-D对愈伤组织诱导的影响

表1是愈伤组织分别接种在2,4-D为0.0、0.1、03、0.5、1.0、2.0和4.0的MS培养基上，进行植物生长调节剂对愈伤组织诱导实验。幼茎培养3d后，各处理幼茎两端开始膨大变白，6d时大部分外植体开始从两端长出愈伤组织。对照一直无明显变化，也无愈伤组织产生。在不同浓度的2,4-D中，以0.5mg/L的出愈率最高，为100％,所诱导的愈伤组织生长也最好。过高或过低均不利于愈伤组织的诱导和生长。2,4-D浓度为4.0mg/L时，已完全抑制外植体产生愈伤组织。

实施例3：基于实施例1和2，但有所不同的是：

表2不同浓度的NAA对愈伤组织诱导的影响

NAA浓度在2.0mg/L以下时，出愈率均在90％以上，各处理间没有明显的差异，但出愈时间、愈伤组织颜色、大小和继代后生长状况差异较大NAA在0.1-0.5mg/L时，愈伤组织虽然长势较好，但颜色暗淡，没有光泽，继代后生长缓慢。NAA1.0mg/L时，愈伤组织生长较好，呈奶油色，发亮，有光泽，转接后长势较好。NAA在1.0mg/L以下各浓度诱导出愈伤组织的时间基本一致，为7d；NAA为2.0mg/L时，诱导率和长势均较好，继代后生长一般，但诱导愈伤组织所需要的时间较1.0mg/L以下浓度晚2-3d；NAA为4.0mg/L时，出愈时间又比2.0mg/L晚2d，在仅有少量愈伤组织长出后，逐渐发褐，死亡。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。