阅读说明：本技术 一种获得白及单倍体的育种方法 (Breeding method for obtaining rhizoma bletillae haploid ) 是由 林云斌 梁志勇 黄剑雄 于 2019-12-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种获得白及单倍体的培育方法,特别涉及一种采用植物组织培养获得白及单倍体的培育方法,属于白及单倍体的选育领域。本发明选取花药进行花药培养,诱导愈伤组织再分化为单倍体植株,提高了愈伤诱导频率和愈伤组织的分化能力,本发明优化了愈伤组织诱导培养基、不定芽分化培养基以及生根培养基,进行白及花药培养,使愈伤诱导率85％以上,出苗率90％以上,应用于白及育种,为白及的育种、品质改良、遗传研究提供有力的手段。本发明方法培育的白及单倍体植株生长良好、移栽成活率高,是大规模工厂化生产优质白及种质的基础。(The invention relates to a cultivation method for obtaining a bletilla striata haploid, in particular to a cultivation method for obtaining the bletilla striata haploid by adopting plant tissue culture, and belongs to the field of breeding of the bletilla striata haploid. The method selects the anther to culture the anther, induces the callus to be redifferentiated into haploid plants, improves the callus induction frequency and the differentiation capacity of the callus, optimizes a callus induction culture medium, an adventitious bud differentiation culture medium and a rooting culture medium, cultures the bletilla striata anther, ensures that the callus induction rate is more than 85 percent and the emergence rate is more than 90 percent, is applied to bletilla striata breeding, and provides a powerful means for breeding, quality improvement and genetic research of the bletilla striata. The bletilla striata haploid plants cultivated by the method have good growth and high transplanting survival rate, and are the basis for large-scale industrialized production of high-quality bletilla striata germplasm.)

一种获得白及单倍体的育种方法

技术领域

本发明涉及植物育种技术领域，尤其是一种获得白及单倍体的育种方法。

背景技术

白及(Bletilla striata)，又名白芨，为兰科白及属多年生草本植物，属国家二级濒危植物，其干燥根茎入药，具有收敛止血，消肿生肌之功效，用于治疗肺结核咳血、支气管扩张咯血、胃溃疡及尿血、便血、外伤出血等疾病；此外，白及块茎中富含白及胶与白及多糖，被广泛应用于食品工业和日化工业中。经济价值很高。近几年的野外乱采挖导致野生白及资源日益减少，而由于白及自身特殊的生理特点及其生态环境受到严重破坏，资源几近枯竭，人工种植的不合理引种与培育造成白及的种质基源混乱，故野生白及种质资源的优化育种尤显重要。

近年来的单倍体育种技术、基因工程育种等生物技术手段的发展提高了育种效率，开辟了育种的新途径。通过常规的杂交育种获得纯合的品种需要较长的育种周期。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种获得白及单倍体的育种方法。利用花药花粉培养可获得单倍体植株技术，具有快速获得纯合二倍体，缩短育种周期、提高选择效率等优势。

本发明的技术方案为：

一种获得白及单倍体的育种方法，其特征在于，它包括以下步骤：

步骤1、新鲜花药的选取：选取小孢子处于单核靠边期的花药，通过DAPI染色确定花粉发育时期为单核靠边期；

步骤2、花药消毒：花药先用75％酒精消毒1分钟，7％次氯酸钠溶液消毒浸泡15分钟，无菌水冲洗3-5次，无菌滤纸吸干水分；

步骤3、将消毒的花药接种在愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养；在黑暗件下，温度4℃，暗处理2-3d，在转移至37℃处理5-7d，再光照1500～2000lx，光照时间12小时/天，培养温度为25±1℃，获得白及愈伤组织；

步骤4、将愈伤组织接种于不定芽分化培养基上进行不定芽的分化培养，获得白及不定芽；培养温度为25±1℃，光照1500～2000lx，光照时间12小时/天；

步骤5、将不定芽接种于生根培养基上进行培养，获得试管小苗；

步骤6、经过倍性鉴定，获得白及单倍体植株。

为了更好地达到培育效果，将小孢子发育处于单核靠边期的花药取出进行愈伤组织的诱导培养，能有效的提高愈伤组织的诱导培养率；其中，白及小孢子发育时期可以通过染色观察小孢子的发育阶段，这些方法或手段均为本领域技术人员所通晓；本发明通过醋酸洋红染色观察来确定白及小孢子发育时期。

愈伤组织诱导培养基优选是MS改良培养基+萘乙酸(NAA)0.1-2.0mg/L+6-糠氨基嘌呤(KT)0.5-2.0mg/L+蔗糖15-25g/L+琼脂5-15g/L；

不定芽分化培养基优选是MS改良培养基+萘乙酸(NAA)0.2-2.0mg/L+6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.5-1.0mg/L+蔗糖15-25g/L+琼脂5-15g/L；

生根培养基优选是1/2MS改良培养基+吲哚丁酸(IBA)0.2-1.0mg/L+蔗糖15-25g/L+琼脂5-15g/L。

本发明的有益效果为：本发明采用固体培养基将小孢子和花药壁共培养，低温、热激预处理，愈伤诱导和分化培养基成分和培养条件调节，可提高愈伤诱导频率和愈伤组织的分化能力。在单倍体中能简化基因互作，保留有利的优质种质基因，淘汰有害的隐性基因。它可以与目前所采用的杂交育种、人工诱变育种等方法结合形成优质的种质资源。本发明通过选取花药，花药培养，诱导愈伤组织再分化为单倍体植株,提高了愈伤诱导频率和愈伤组织的分化能力。应用此方法进行白及花药培养，愈伤诱导率80％以上，出苗率90％以上，应用于育种实践，可加快育种步伐，为新品种选育提供有力的手段。

具体实施方式

下面结合具体实施方式作进一步说明：

实施例1

步骤1、新鲜花药的选取：选取小孢子处于单核靠边期的花药，通过DAPI染色确定花粉发育时期为单核靠边期；

步骤2、花药消毒：花药先用75％酒精消毒1分钟，7％次氯酸钠溶液消毒浸泡15分钟，无菌水冲洗3-5次，无菌滤纸吸干水分。

步骤3、将消毒的花药接种在愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，愈伤组织诱导培养基优选是MS改良培养基+萘乙酸(NAA)0.2mg/L+6-糠氨基嘌呤(KT)0.52mg/L+蔗糖152g/L+琼脂52g/L；在黑暗件下，培养温度为25±1℃；获得白及愈伤组织；

步骤4、将愈伤组织接种于不定芽分化培养基上进行不定芽的分化培养，获得白及不定芽；不定芽分化培养基优选是MS改良培养基+萘乙酸(NAA)0.5mg/L+6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L；培养温度为25±1℃，光照1500～2000lx，光照时间12小时/天；

步骤5、将不定芽接种于生根培养基上进行培养，获得试管小苗；生根培养基优选是1/2MS改良培养基+吲哚丁酸(IBA)0.2mg/L+蔗糖15g/L+琼脂6g/L。培养温度为25±1℃，光照1500～2000lx，光照时间12小时/天；

步骤6、经过倍性鉴定，获得白及单倍体植株。

实施例2

步骤1、新鲜花药的选取：选取小孢子处于单核靠边期的花药，通过DAPI染色确定花粉发育时期为单核靠边期；

步骤2、花药消毒：花药先用75％酒精消毒1分钟，7％次氯酸钠溶液消毒浸泡15分钟，无菌水冲洗3-5次，无菌滤纸吸干水分。

步骤3、将消毒的花药接种在愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，愈伤组织诱导培养基优选是MS改良培养基+萘乙酸(NAA)0.5mg/L+6-糠氨基嘌呤(KT)1.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂10g/L；在黑暗件下，培养温度为25±1℃；获得白及愈伤组织；

步骤4、将愈伤组织接种于不定芽分化培养基上进行不定芽的分化培养，获得白及不定芽；不定芽分化培养基优选是MS改良培养基+萘乙酸(NAA)0.5mg/L+6-苄基腺嘌呤(6-BA)1.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂10g/L；培养温度为25±1℃，光照1500～2000lx，光照时间12小时/天；

步骤5、将不定芽接种于生根培养基上进行培养，获得试管小苗；生根培养基优选是1/2MS改良培养基+吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂10g/L。培养温度为25±1℃，光照1500～2000lx，光照时间12小时/天；

步骤6、经过倍性鉴定，获得白及单倍体植株。

实施例3

步骤1、新鲜花药的选取：选取小孢子处于单核靠边期的花药，通过DAPI染色确定花粉发育时期为单核靠边期；

步骤2、花药消毒：花药先用75％酒精消毒1分钟，7％次氯酸钠溶液消毒浸泡15分钟，无菌水冲洗3-5次，无菌滤纸吸干水分。

步骤3、将消毒的花药接种在愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，愈伤组织诱导培养基优选是MS改良培养基+萘乙酸(NAA)1.0mg/L+6-糠氨基嘌呤(KT)2.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂10g/L；在黑暗件下，培养温度为25±1℃；获得白及愈伤组织；

步骤4、将愈伤组织接种于不定芽分化培养基上进行不定芽的分化培养，获得白及不定芽；不定芽分化培养基优选是MS改良培养基+萘乙酸(NAA)1.5mg/L+6-苄基腺嘌呤(6-BA)1.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂10g/L；培养温度为25±1℃，光照1500～2000lx，光照时间12小时/天；

步骤5、将不定芽接种于生根培养基上进行培养，获得试管小苗；生根培养基优选是1/2MS改良培养基+吲哚丁酸(IBA)1.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂10g/L。培养温度为25±1℃，光照1500～2000lx，光照时间12小时/天；

步骤6、经过倍性鉴定，获得白及单倍体植株。

MS改良培养基配方如表1所示：

表1培养基的配方

大量元素成分	分子量	使用浓度(mg/L)
			硝酸钾KNO3	101.21	1900
硝酸铵NH4NO3	80.04	1.65
			磷酸二氢钾KH2PO4	136.09	170
硫酸镁MgSO4·7H2O	246.47	370
			氯化钙CaCl2·2H2O	147.02	440
微量元素
			碘化钾KI	166.01	0.83
硼酸H3BO3	61.83	6.2
			硫酸锰MnSO4·4H2O	223.01	22.3
硫酸锌ZnSO4·7H2O	287.54	8.6
			钼酸钠Na2MoO4·2H2O	241.95	0.25
硫酸铜CuSO4·5H2O	249.68	0.125
			氯化钴CoCl2·6H2O	237.93	0.025
铁盐
			乙二胺四乙酸二钠Na2.EDTA	372.25	37.3
硫酸亚铁FeSO24·7H2O	278.03	27.8
			有机成分
肌醇		100
			甘氨酸		2
盐酸硫胺素VB1		10
			盐酸吡哆醇VB6		1.0
烟酸VB5或VPP		1

上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理和最佳实施例，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。