具体实施方式

本公开内容的方面包括用于表征流动流中的样品的颗粒的方法。根据某些实施例的方法包括检测来自具有流动流中的细胞的样品的光，生成询问区域中的流动流中的对象的图像，以及基于所生成的图像确定流动流中的对象是否是聚集体。还描述了具有处理器的系统，该处理器具有可操作地耦合到该处理器的存储器，该存储器具有存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使该处理器产生流动流中的对象的图像并且确定该对象是否为聚集体。还提供了具有用于实施主题方法的编程的集成电路设备(例如，现场可编程门阵列)。

在更详细地描述本发明之前，应当理解，因为所描述的特定实施例当然可以变化，因此本发明不限于这些实施例。还应理解，因为本发明的范围仅由所附权利要求书限制，因此本文所用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而非旨在限制。

在提供数值范围的情况下，应当理解，在该范围的上限与下限之间的每个中间值(除非上下文另外明确指出，否则为下限单位的十分之一)以及在该所述范围内的任何其他规定的值或中间值都包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包括在本发明内，受到在所述范围内的任何具体排除的限制。当所述范围包括一个或两个限制时，排除那些包括的限制中的一个或两个的范围也包括在本发明中。

本文中提出的某些范围的数值前面有术语“约”，本文中使用的术语“约”是为了提供对前面确切数字的字面支持，以及接近或近似于该术语前面的数字的数字。在确定数字是否接近或近似于具体叙述的数字时，接近或近似未叙述的数字可以是在其被呈现的上下文中提供具体叙述的数字的基本等效物的数字。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料也能够用于本发明的实践或测试，但现在描述的是代表性的示例性方法和材料。

本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，就像每个单独的出版物或专利具体地和单独地指明通过引用并入本文，并且通过引用并入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用是由于其公开早于申请日，不应解释为承认本发明无权以在先发明为由在该出版物之前发表。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要单独地确认。

应注意，除非上下文另外明确指出，否则如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。还应注意，权利要求书可被起草以排除任何可选元素。因此，该陈述旨在用作使用与权利要求要素的叙述有关的诸如“单独地”、“仅”等的排他性术语或使用“否定”限制的先行基础。

本领域技术人员在阅读本公开内容后将明白，本文描述和说明的各实施例具有离散的部件和特征，不脱离本发明的范围或精神的情况下可以容易地与其他几个实施例中的任一个的特征分开或组合。任何列举的方法能够以列举的事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序来执行。

虽然为了语法流畅，已经或将要用功能性解释来描述该装置和方法，但是应该清楚地理解，除非在35 U.S.C.§112中明确地阐述，否则这些权利要求不应被解释为必须以任何方式受限于“装置”或“步骤”的构造，而是应该符合在司法等同原则下由权利要求所提供的定义的含义和等同内容的全部范围，并且在35 U.S.C.§112中明确地阐述的权利要求的情况下，应该符合在35 U.S.C.§112中的全部法定等同内容。

如上所述，本公开内容提供了用于确定流动流中的对象是否是细胞聚集体的系统和方法。

在进一步描述本公开内容的实施例中，首先更详细地描述用于生成流动流中的对象的空间数据并且基于该空间数据确定对象是否是细胞聚集体的方法。接下来，描述用于表征流动流中的对象并实时分离样品中的颗粒的系统。还提供了集成电路设备，例如具有用于产生流动流中的对象的空间数据、将对象分类为细胞聚集体或单细胞并分选细胞聚集体或单细胞的程序的现场可编程门阵列。

·表征样品中颗粒的方法

本公开内容的方面包括用于表征样品的颗粒(例如，生物样品中的细胞)的方法。在实践根据某些实施例的方法的过程中，用光源照射在流动流中具有细胞的样品，并且检测来自样品的光以生成询问区域中的流动流中的对象的空间数据，并且基于该空间数据来确定对象是否是颗粒的聚集体(例如，细胞的聚集体)。在实施例中，方法包括基于对象的空间数据区分单细胞和两个或更多个细胞的聚集体。在本文中，术语“空间数据”用于描述编码流动流的被照射询问区域的空间位置的数据信号。如下面更详细描述的，在一些实施例中，根据来自流动流中的对象的频率编码的荧光数据来计算空间数据，诸如通过执行频率编码的荧光数据的变换(例如，执行傅里叶变换或利用数字锁定放大器计算空间数据以对频率编码的荧光数据进行外差和解复用)。在一些实施例中，样品是生物样品。术语“生物样品”以其常规意义使用，指完整的有机体、植物、真菌或动物组织、细胞或组成部分的子集，其在某些情况下可以在血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、支气管肺泡灌洗液、羊水、羊膜脐带血、尿、阴道液和精液中发现。因此，“生物样品”指天然有机体或其组织的子集，以及从有机体或其组织的子集制备的匀浆、裂解物或提取物，包括但不限于，例如，血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤切片、呼吸道、胃肠道、心血管和泌尿生殖道、泪液、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤、器官。生物样品可以是任何类型的有机的组织，包括健康和患病组织(例如，癌变的、恶性的、坏死的等)。在某些实施例中，生物样品是液体样品，诸如血液或其衍生物，例如血浆、泪液、尿液、精液等，其中在一些情况下，样品是血液样品，包括全血，诸如从静脉穿刺或手指穿刺获得的血液(其中血液在化验之前可以与或可以不与任何试剂，诸如防腐剂、抗凝剂等进行组合)。

在某些实施例中，样品的来源是“哺乳动物”或“哺乳类动物”，其中，这些术语被广泛地用于描述在哺乳动物纲内的有机体，包括食肉动物目(例如狗和猫)、啮齿目(例如小鼠、豚鼠和大鼠)和灵长目(例如人、黑猩猩和猴)。在一些情况下，所述受试者是人。所述方法可应用于从两性和任何发育阶段(即，新生儿、婴儿、少年、青少年、成人)的人类受试者获得的样品，其中，在某些实施例中，人类受试者是少年、青少年或成人。尽管本发明可以应用于来自人类受试者的样品，但是，应当理解，该方法也可以在来自其他动物受试者(即，“非人类受试者”)的样品上进行，例如但不限于鸟、小鼠、大鼠、狗、猫、家畜和马。

在实施本发明方法时，用来自光源的光照射(例如，在流式细胞仪的流动流中)具有细胞的样品。在一些实施例中，光源是宽带光源，其发射具有宽范围波长的光，例如跨50nm或更宽，例如100nm或更宽，例如150nm或更宽，例如200nm或更宽，例如250nm或更宽，例如300nm或更宽，例如350nm或更宽，例如400nm或更宽，并且包括跨500nm或更宽。例如，一种合适的宽带光源发射具有200nm到1500nm的波长的光。合适的宽带光源的另一个示例包括发射具有400nm到1000nm的波长的光的光源。在方法包括用宽带光源照射的情况下，感兴趣的宽带光源协议可以包括但不限于卤素灯、氘弧光灯、氙弧灯、稳定的光纤耦合宽带光源、具有连续光谱的宽带LED、超发光发射二极管、半导体发光二极管、宽谱LED白光源、多LED集成白光源、以及其他宽带光源或其任意组合。

在其他实施例中，方法包括用发射特定波长或窄波长范围的窄带光源照射，例如用发射窄波长范围的光的光源照射，所述窄波长范围如50nm或更窄，例如40nm或更窄，例如30nm或更窄，例如25nm或更窄，例如20nm或更窄，例如15nm或更窄，例如10nm或更窄，例如5nm或更窄，例如2nm或更窄，并且包括发射特定波长的光(即单色光)的光源。在方法包括用窄带光源照射的情况下，感兴趣的窄带光源协议可以包括但不限于窄波长LED、激光二极管或耦合到一个或更多个光学带通滤波器、衍射光栅、单色仪或其任何组合的宽带光源。

在某些实施例中，方法包括用一个或更多个激光器照射流动流。如上所述，激光器的类型和数量将根据样品以及所收集的期望光而变化，并且可以是脉冲激光器或连续波激光器。例如，激光器可以是气体激光器，例如氦-氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、CO2激光器、CO激光器、氩-氟(ArF)受激准分子激光器、氪-氟(KrF)受激准分子激光器、氙-氯(XeCl)受激准分子激光器或氙-氟(XeF)受激准分子激光器或它们的组合；染料激光器，例如芪、香豆素或罗丹明激光器；金属蒸气激光器，例如氦-镉(HeCd)激光器、氦-汞(HeHg)激光器、氦-硒(HeSe)激光器、氦-银(HeAg)激光器、锶激光器、氖-铜(NeCu)激光器、铜激光器或金激光器及它们的组合；固态激光器，例如红宝石激光器，Nd:YAG激光器、NdCrYAG激光器、Er:YAG激光器、Nd:YLF激光器，Nd:YVO₄激光器，Nd:YCa₄O(BO₃)₃激光器，Nd:YCOB激光器、钛蓝宝石激光器、铥YAG激光器、镱YAG激光器、三氧化二镱激光器或铈掺杂激光器及它们的组合；半导体二极管激光器、光泵浦半导体激光器(OPSL)，或者上述激光器中的任何一个的倍频或三倍频实现。

可以用上述光源中的一个或更多个照射流动流中的样品，所述一个或更多个上述光源例如2个或更多个光源，例如3个或更多个光源，例如4个或更多个光源，例如5个或更多个光源，并且包括10个或更多个光源。光源可以包括任何类型的光源的组合。例如，在一些实施方式中，所述方法包括用激光器阵列照射流动流中的样品，所述激光器阵列例如是具有一个或更多个气体激光器、一个或更多个染料激光器和一个或更多个固态激光器的阵列。

可以用范围为200nm至1500nm，例如250nm至1250nm，例如300nm至1000nm，例如350nm至900nm，并且包括400nm至800nm的波长照射样品。例如，在光源是宽带光源的情况下，可以用200nm至900nm的波长照射样品。在其他情况下，在光源包括多个窄带光源的情况下，可以用范围为200nm至900nm的特定波长照射样品。例如，光源可以是多个窄带LED(1nm-25nm)，各自独立地发射波长范围为200nm到900nm的光。在其他实施例中，窄带光源包括一个或更多个激光器(例如激光器阵列)，并且用范围为200nm至700nm的特定波长照射样品，例如用如上所述的具有气体激光器、受激准分子激光器、染料激光器、金属蒸气激光器和固态激光器的激光器的阵列来照射样品。

在采用多于一个光源的情况下，可以用光源同时或顺序或以它们的组合照射样品。例如，可以用光源中的每一个同时照射样品。在其他实施例中，用光源中的每一个顺序地照射流动流。在使用多于一个光源顺序照射样品的情况下，每个光源照射样品的时间可以独立地为0.001微秒或更长，例如0.01微秒或更长，例如0.1微秒或更长，例如1微秒或更长，例如5微秒或更长，例如10微秒或更长，例如30微秒或更长，并且包括60微秒或更长。例如，方法可以包括用光源(例如激光)照射样品持续0.001微秒至100微秒的持续时间，例如0.01微秒至75微秒，例如0.1微秒至50微秒，例如1微秒至25微秒，并且包括5微秒至10微秒。在用两个或更多个光源顺序照射样品的实施例中，由每个光源照射的持续时间样品可以相同或不同。

每个光源照射之间的时间周期也可根据需要变化，独立地被分开0.001微秒或更长的延迟，例如0.01微秒或更长，例如0.1微秒或更长，例如1微秒或更长，例如5微秒或更长，例如10微秒或更长，例如15微秒或更长，例如30微秒或更长，包括60微秒或更长。例如，每个光源照射之间的时间周期的范围可以为0.001微秒至60微秒，例如为0.01微秒至50微秒，例如为0.1微秒至35微秒，例如为1微秒至25微秒，并且包括5微秒至10微秒。在某些实施例中，由每个光源照射之间的时间周期是10微秒。在样品被多于两个(即3个或更多个)光源顺序照射的实施例中，每个光源照射之间的延迟可以相同或不同。

样品可以被连续地或以离散的间隔照射。在一些情况下，方法包括用光源连续照射样品中的样品。在其他情况下，以离散间隔用光源照射样品，离散间隔例如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒且包括每1000毫秒或某一其他间隔。

取决于光源，可以从诸如0.01mm或更远、诸如0.05mm或更远、诸如0.1mm或更远、诸如0.5mm或更远、诸如1mm或更远、诸如2.5mm或更远、诸如5mm或更远、诸如10mm或更远、诸如15mm或更远、诸如25mm或更远并且包括50mm或更远的变化的距离照射样品。此外，角度或照射也可以变化，范围为10°至90°，例如为15°至85°，例如为20°至80°，例如为25°至75°，并且包括30°至60°，例如以90°角。

在实施本发明方法时，例如通过收集来自样品的一定波长范围(例如200nm至1000nm)的光来测量来自被照射样品的光。在实施例中，方法可以包括测量样品的光吸收(例如明场光数据)、测量光散射(例如前向或侧向散射光数据)和测量样品的光发射(例如荧光数据)中的一种或更多种。

可以在一个或更多个波长处，例如在5个或更多个不同波长处，例如在10个或更多个不同波长处，例如在25个或更多个不同波长处，例如在50个或更多个不同波长处，例如在100个或更多个不同波长处，例如在200个或更多个不同波长处，例如在300个或更多个不同波长处测量来自样品的光，并且包括在400个或更多个不同波长处测量收集的光。

可以在200nm至1200nm的波长范围中的一个或更多个上收集光。在一些情况下，方法包括在一定波长范围上测量来自样品的光，波长范围例如为200nm至1200nm，例如为300nm至1100nm，例如为400nm至1000nm，例如为500nm至900nm，并且包括600nm至800nm。在其他情况下，方法包括测量在一个或更多个特定波长处收集的光。例如，可以在450nm、518nm、519nm、561nm、578nm、605nm、607nm、625nm、650nm、660nm、667nm、670nm、668nm、695nm、710nm、723nm、780nm、785nm、647nm、617nm中的一个或更多个及其任意组合下测量所收集的光。在某些实施例中，方法包括测量对应于某些荧光团的荧光峰值波长的光的波长。

可以连续地或以离散的间隔测量所收集的光。在一些情况下，方法包括连续地进行光的测量。在其他情况下，以离散间隔测量光，诸如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒并且包括每1000毫秒或以一些其他间隔测量光。

在本发明方法期间，对收集的光的测量可以进行一次或更多次，例如2次或更多次，例如3次或更多次，例如5次或更多次，包括10次或更多次。在某些实施例中，来自样品的光被测量2次或更多次，在某些情况下数据被平均。

在一些实施例中，方法包括在检测光之前进一步调节来自样品的光。例如，来自样品源的光可以穿过一个或更多个透镜、反射镜、针孔、狭缝、光栅、光折射器、以及它们的任何组合。在一些情况下，所收集的光穿过一个或更多个聚焦透镜，以便减小光的轮廓。在其他情况下，来自样品的发射光穿过一个或更多个准直器以减少光束发散。

在某些实施例中，方法包括用两束或更多束频移光照射样品。如上所述，可以采用具有激光器和用于使激光频移的声光装置的光束生成器元件。在这些实施例中，方法包括用激光照射声光装置。根据在输出激光束中产生的(例如，用于照射流动流中的样品)光的期望波长，激光可以具有200nm至1500nm变化的特定波长，例如250nm至1250nm，例如300nm至1000nm，例如350nm到900nm，并且包括400nm至800nm变化的特定波长。声光装置可以用一个或更多个激光器照射，所述一个或更多个激光器例如2个或更多个激光器，例如3个或更多个激光器，例如4个或更多个激光器，例如5个或更多个激光器，并且包括10个或更多个激光器。激光器可以包括任何类型的激光器的组合。例如，在一些实施例中，所述方法包括用激光器阵列照射声光装置，该激光器阵列例如具有一个或更多个气体激光器、一个或更多个染料激光器及一个或更多个固态激光器的阵列。

在使用多于一个激光器的情况下，声光装置可以用激光器同时或顺序或以它们的组合照射。例如，声光装置可以用激光器中的每个同时照射。在其他实施例中，声光装置用激光器中的每个顺序地照射。在使用多于一个激光器来顺序照射声光装置的情况下，每个激光器照射声光装置的时间可以独立地为0.001微秒或更多，例如0.01微秒或更多，例如0.1微秒或更多，例如1微秒或更多，例如5微秒或更多，例如10微秒或更多，例如30微秒或更多，并且包括60微秒或更多。例如，方法可以包括用激光器来照射声光装置一持续时间，该持续时间的范围为0.001微秒至100微秒，例如为0.01微秒至75微秒，例如为0.1微秒至50微秒，例如为1微秒至25微秒，并且包括5微秒至10微秒。在用两个或更多个激光器顺序照射声光装置的实施例中，声光装置由每个激光器照射的持续时间可以相同或不同。

每个激光器的照射之间的时间段也可根据需要变化，独立地被分开0.001微秒或更长的延迟，例如0.01微秒或更长，例如0.1微秒或更长，例如1微秒或更长，例如5微秒或更长，例如10微秒或更长，例如15微秒或更长，例如30微秒或更长，包括60微秒或更长。例如，每个光源照射之间的时间周期的范围可以为0.001微秒至60微秒，例如为0.01微秒至50微秒，例如为0.1微秒至35微秒，例如为1微秒至25微秒，并且包括为5微秒至10微秒。在某些实施例中，由每个激光器的照射之间的时间周期为10微秒。在声光装置被多于两个(即，3个或更多个)激光器顺序照射的实施例中，每个激光器的照射之间的延迟可以相同或不同。

声光装置可以被连续地或以离散间隔照射。在一些情况下，方法包括用激光器连续地照射声光装置。在其他情况下，以离散间隔用激光器照射声光装置，离散间隔例如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒且包括每1000毫秒，或某一其他间隔。

取决于激光器，可以从例如0.01mm或更远、例如0.05mm或更远、例如0.1mm或更远、例如0.5mm或更远、例如1mm或更远、例如2.5mm或更远、例如5mm或更远、例如10mm或更远、例如15mm或更远、例如25mm或更远且包括50mm或更远的变化的距离照射声光装置。此外，角度或照射也可以变化，范围为10°至90°，例如为15°至85°，例如为20°至80°，例如为25°至75°，并且包括30°至60°，例如为90°角。

在实施例中，方法包括将射频驱动信号施加到声光装置以产生成角度偏转的激光束。可将两个或更多个射频驱动信号施加到声光装置以产生具有期望数量的角偏转激光束的输出激光束，所述两个或更多个射频驱动信号例如3个或更多个射频驱动信号，例如4个或更多个射频驱动信号，例如5个或更多个射频驱动信号，例如6个或更多个射频驱动信号，例如7个或更多个射频驱动信号，例如8个或更多个射频驱动信号，例如9个或更多个射频驱动信号，例如10个或更多个射频驱动信号，例如15个或更多个射频驱动信号，例如25个或更多个射频驱动信号，例如50个或更多个射频驱动信号，并且包括100个或更多个射频驱动信号。

由射频驱动信号产生的角偏转激光束各自具有基于所施加的射频驱动信号的幅度的强度。在一些实施例中，方法包括施加具有足以产生具有期望强度的成角度偏转的激光束的幅度的射频驱动信号。在一些情况下，每个施加的射频驱动信号独立地具有约0.001V至约500V的幅度，例如约0.005V至约400V，例如约0.01V至约300V，例如约0.05V至约200V，例如约0.1V至约100V，例如约0.5V至约75V，例如约1V至50V，例如约2V至40V，例如约3V至约30V，并包括约5V至约25V。在一些实施例中，每个施加的射频驱动信号具有约0.001MHz至约500MHz的频率，例如约0.005MHz至约400MHz，例如约0.01MHz至约300MHz，例如约0.05MHz至约200MHz，例如约0.1MHz至约100MHz，如约0.5MHz至约90MHz，例如约1MHz至约75MHz，例如约2MHz至约70MHz，例如约3MHz至约65MHz，例如约4MHz至约60MHz，并且包括约5MHz至约50MHz。

在这些实施例中，输出激光束中的角度偏转的激光束在空间上被分离。取决于输出激光束的期望的照射分布和所施加的射频驱动信号，角度偏转的激光束可以被分开0.001μm或更多，诸如被分开0.005μm或更多，诸如被分开0.01μm或更多，诸如被分开0.05μm或更多，诸如被分开0.1μm或更多，诸如被分开0.5μm或更多，诸如被分开1μm或更多，诸如被分开5μm或更多，诸如被分开10μm或更多，诸如被分开100μm或更多，诸如被分开500μm或更多，诸如被分开1000μm或更多，并且包括被分开5000μm或更多。在一些实施例中，角度偏转的激光束例如与沿输出激光束的水平轴线的相邻的角度偏转的激光束交叠。相邻的角度偏转的激光束之间的交叠(例如，束斑的交叠)可以是0.001μm或更大的交叠，例如0.005μm或更大的交叠，例如0.01μm或更大的交叠，例如0.05μm或更大的交叠，例如0.1μm或更大的交叠，例如0.5μm或更大的交叠，例如1μm或更大的交叠，例如5μm或更大的交叠，例如10μm或更大的交叠，并且包括100μm或更大的交叠。

在某些情况下，用多个频移光束照射流动流，并且通过使用射频标记发射(FIRE)的荧光成像来对流动流中的细胞成像，以生成频率编码的图像，诸如在Diebold等人的Nature Photonics第7卷(10)；806-810(2013)以及在美国专利第9,423,353号；第9,784,661号和第10,006,852号以及美国专利公开号2017/0133857和2017/0350803中描述的，其公开内容通过引用并入本文。

在实施例中，方法包括根据所检测的光生成流动流中的对象的空间数据。对象的空间数据可以根据检测到的光吸收、检测到的光散射、检测到的光发射或其任何组合生成。在一些情况下，对象的空间数据是根据从样品(例如从明场光检测器)检测到的光吸收生成的。在其他情况下，根据从样品(例如从侧向散射检测器、前向散射检测器或侧向散射检测器和前向散射检测器的组合)检测的光散射生成对象的空间数据。在又一些情况下，根据来自样品的发射光，例如来自添加到样品的荧光团的光来生成对象的空间数据。在再一些情况下，根据检测到的光吸收、检测到的光散射和检测到的光发射的组合生成对象的空间数据。

在某些实施例中，根据频率编码的数据(例如，频率编码的荧光数据)计算空间数据。在这些实施例中，通过检测来自被多个频移光束和本地振荡器光束照射的对象的光来生成频率编码的数据。在一个示例中，跨(水平轴线)流动流的多个位置由包括本地振荡器光束和多个射频移位激光束的激光束照射，使得跨流动流的不同位置被射频移位束中的一个和本地振荡器光束照射。在一些情况下，本地振荡器是来自激光器的频移光束。在该示例中，跨流动流中的颗粒的每个空间位置由不同的拍频表征，该拍频对应于在该位置处本地振荡器光束的频率与射频移位光束的频率之间的差。在一些实施例中，来自对象的频率编码的数据包括跨流动流中的颗粒的水平轴线的空间编码的拍频。

在实施例中，可以通过执行频率编码的数据的变换来根据频率编码的数据计算空间数据。在一个示例中，通过对频率编码的数据执行傅里叶变换(FT)来计算空间数据。在另一示例中，通过对频率编码的数据执行离散傅里叶变换(DFT)来计算空间数据。在又一示例中，通过对频率编码的数据执行短时傅立叶变换(STFT)来计算空间数据。在又一示例中，用数字锁定放大器计算空间数据以对频率编码的数据进行外差和解复用。

在一些实施例中，方法包括根据所检测的光生成流动流中的对象的图像。可以根据检测到的光吸收、检测到的光散射、检测到的光发射或其任何组合生成对象的图像。在一些情况下，根据从样品(例如从明场光检测器)检测到的光吸收生成对象的图像。在这些情况下，基于来自流动流中的细胞的明场图像数据生成对象的图像。在其他情况下，根据从样品(例如从侧向散射检测器、前向散射检测器或者侧向散射检测器和前向散射检测器的组合)检测的光散射来生成对象的图像。在这些情况下，基于散射光图像数据生成对象的图像。在又一些情况下，根据来自样品的发射光，例如来自添加到样品的荧光团的光生成对象的图像。在这些情况下，基于荧光图像数据(即，来自细胞上或细胞中的荧光化合物的成像数据)生成对象的图像。在再一些情况下，根据检测到的光吸收、检测到的光散射和检测到的光发射的组合生成对象的图像。

可以根据检测到的光生成对象的一个或更多个图像。在一些实施例中，根据检测到的光的每种形式生成单个图像。例如，根据检测到的光吸收生成对象的第一图像；根据检测到的光散射生成对象的第二图像，并且根据检测到的光发射生成对象的第三图像。在其他实施例中，根据检测到的光的每种形式生成两个或更多个图像，诸如3个或更多个，诸如4个或更多个，诸如5个或更多个，并且包括10个或更多个图像或它们的组合。

在某些实施例中，方法包括生成流动流中的对象的图像掩模。在这些实施例中，可以首先根据流动流中的对象的灰度图像生成图像掩模。在本文中，术语“灰度”以其常规意义使用，是指由基于每个像素处的光强度的变化的灰度梯度组成的流动流中的对象的图像。如下面更详细描述的，在实施例中根据灰度图像确定像素强度阈值，其中像素强度阈值用于将每个像素转换成用于生成对象的图像掩模的二进制值。在一些实施例中，通过最小化灰度图像的类内方差并计算基于最小化的类内方差的像素强度阈值来确定像素强度阈值。在一些实施例中，像素强度阈值是用算法确定的，其中，所检测的光数据包括遵循双峰直方图的两类像素(具有前景像素和背景像素)，计算使两类分离从而使得它们的组合的类内方差最小的最佳阈值。在其他实施例中，方法包括计算使两个类分离从而使得它们的类间方差最大的最佳阈值。

在生成图像掩模时，将对象的灰度图像中的每个像素与所确定的强度阈值进行比较，并且将其转换为二进制像素值。可以按照任何期望的顺序将对象的灰度图像中的每个像素与所确定的强度阈值进行比较。在一些实施例中，将沿对象的灰度图像中的每个水平行的像素与所确定的强度阈值进行比较。在一些情况下，将从对象的灰度图像的左侧到对象的灰度图像的右侧的每个像素与所确定的强度阈值进行比较。在其他情况下，将从对象的灰度图像的右侧到对象的灰度图像的左侧的每个像素与所确定的强度阈值进行比较。在其他实施例中，将沿对象的灰度图像中的每个垂直列的像素与所确定的强度阈值进行比较。在一些情况下，将沿每个垂直列从对象的灰度图像的顶部到对象的灰度图像的底部的每个像素与所确定的强度阈值进行比较。在其他情况下，将沿每个垂直列从对象的灰度图像的底部到对象的灰度图像的顶部的每个像素与所确定的强度阈值进行比较。

取决于被成像的流动流中的对象的大小和用于收集来自样品的光的光学设备(下面更详细地描述)，可以将对象的灰度图像中的所有部分像素与强度阈值进行比较。例如，在实施本发明方法时，可以将对象的灰度图像中的50％或更多的像素与强度阈值进行比较，例如，对象的灰度图像中的60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多，并且包括99％或更多的像素。在某些实施例中，将对象的灰度图像中的所有(100％)像素与强度阈值进行比较。

如上所述，对象的灰度图像中的每个像素被转换成二进制像素值。取决于所检测的光的类型，每个像素被分配二进制像素值1或二进制像素值0。在一个示例中，方法包括检测来自流动流的光吸收(例如明场图像数据)，并且将二进制像素值1分配给对象的灰度图像中的像素强度小于强度阈值的每个像素，而将二进制像素值0分配给对象的灰度图像中的像素强度大于强度阈值的每个像素。在另一情况下，方法包括检测来自流动流中的对象的光散射，并且将二进制像素值1分配给灰度图像中的像素强度大于强度阈值的每个像素，而将二进制像素值0分配给像素强度小于强度阈值的每个像素。在又一个示例中，方法包括检测来自流动流中的对象的荧光，并且将二进制像素值1分配给对象的灰度图像中的像素强度大于强度阈值的每个像素，而将二进制像素值0分配给像素强度小于强度阈值的每个像素。

在将二进制像素值被分配给对象的灰度图像中的跨水平行的每个像素的情况下，在一些实施例中，方法还包括确定跨水平行具有二进制像素值1的第一个像素并确定水平行中具有二进制像素值1的最后一个像素。在一个示例中，方法包括确定从水平行的左侧起具有分配的二进制像素值1的第一个像素并确定从水平行的左侧起具有分配的二进制像素值1的最后一个像素。在另一个示例中，方法包括确定从水平行的右侧起具有分配的二进制像素值1的第一个像素并确定从水平行的右侧起具有分配的二进制像素值1的最后一个像素。在其他实施例中，方法还包括确定跨水平行具有二进制像素值的第一个像素并确定水平行中的具有二进制像素值0最后一个像素。在一个示例中，方法包括确定从水平行的左侧起具有分配的二进制像素值0的第一个像素并确定从水平行的左侧起具有分配的二进制像素值0最后一个像素。在另一个示例中，方法包括确定从水平行的右侧起具有分配的二进制像素值0的第一个像素并确定从水平行的右侧起具有分配的二进制像素值0的最后一个像素。

在将二进制像素值被分配给对象的灰度图像中的沿垂直列的每个像素的情况下，在一些实施例中，方法还包括确定沿垂直列的具有二进制像素值1的第一个像素并确定沿垂直列的具有二进制像素值1的最后一个像素。在一个示例中，方法包括确定从垂直列的顶部起具有分配的二进制像素值1的第一个像素并确定从垂直列的顶部起具有分配的二进制像素值1的最后一个像素。在另一个示例中，方法包括确定从垂直列的底部起具有分配的二进制像素值1的第一个像素并确定从垂直列的底部起具有分配的二进制像素值1的最后一个像素。在其他实施例中，方法还包括确定沿垂直列的具有二进制像素值0的第一个像素并确定垂直列中的具有二进制像素值0的最后一个像素。在一个示例中，方法包括确定从垂直列的顶部起具有分配的二进制像素值0的第一个像素并确定从垂直列的顶部起具有分配的二进制像素值0的最后一个像素。在另一个示例中，方法包括确定从垂直列的底部起具有分配的二进制像素值0的第一个像素并确定从垂直列的底部起具有分配的二进制像素值0的最后一个像素。

在一些实施例中，方法包括基于空间数据来评估对象的一个或更多个特性。例如，方法可以包括基于空间数据来确定对象的大小、对象的质心、对象沿水平轴线或垂直轴线的偏心率或它们的组合。在一些情况下，方法包括基于对象的空间数据来评估大小、质心和偏心率中的一个或更多个，并且确定对象是否是细胞聚集体。在某些情况下，基于对象的大小和质心来确定对象为细胞聚集体。在其他情况下，基于所确定的对象的大小和偏心率，确定对象为细胞聚集体。在另外的情况下，基于所确定的对象的质心和偏心率，确定对象为细胞聚集体。在另外的情况下，基于所确定的对象的大小、质心和偏心率，确定对象为细胞聚集体。

在一些实施例中，方法包括基于所生成的图像评估对象的一个或更多个特性。例如，方法可以包括基于所生成的图像来确定对象的大小、对象的质心、对象沿水平轴线或垂直轴线的偏心率或它们的组合。在一些情况下，方法包括基于所生成的对象的图像来评估大小、质心和偏心率中的一个或更多个，并且确定对象是否是细胞聚集体。在某些情况下，基于对象的大小和质心确定对象为细胞聚集体。在其他情况下，基于所确定的对象的大小和偏心率，确定对象为细胞聚集体。在另外的情况下，基于所确定的对象的质心和偏心率，确定对象为细胞聚集体。在另外的情况下，基于所确定的对象的大小、质心和偏心率，确定对象为细胞聚集体。

在一些实施例中，方法还包括计算对象的图像矩。在本文中，术语“图像距”以其常规意义使用，以指代图像(例如，生成的图像或生成的图像掩模)中的空间数据或像素强度的加权平均值。如下所述，所确定的图像距可以用于计算对象的像素的总强度、对象占据的总面积、对象的质心(即，几何中心)以及(例如，在图像或图像掩模中)对象的取向。在一些实施例中，根据下式计算图像矩：

其中m是沿x轴计算的图像距；而n是沿y轴计算的图像距。在一些情况下，方法包括计算对象沿水平轴线的一阶图像矩。在其他情况下，方法包括计算对象沿水平轴线的二阶图像矩。在又一些情况下，方法包括计算对象沿垂直轴线的一阶图像矩。在再一些情况下，方法包括计算对象沿垂直轴线的二阶图像矩。

在一些实施例中，基于所计算的图像矩和空间数据来确定对象的一种或更多种属性。例如，方法可包括基于计算的图像距和空间数据确定细胞的大小、细胞的质心或细胞的偏心率。在这些实施例中，方法包括计算一个或更多个图像距，然后使用所计算的图像距和空间数据两者来确定细胞的特性。

在一些实施例中，基于所计算的图像矩和所生成的图像来确定对象的一种或更多种属性。例如，方法可包括基于所计算的图像矩和所生成的对象的图像(例如，图像或图像掩模)来确定细胞的大小、细胞的质心或细胞的偏心率。在这些实施例中，方法包括计算一个或更多个图像距，然后使用计算的图像距和对象的图像来确定细胞的特征。

在一些情况下，可以根据图像矩和所生成的对象的图像来计算质心。例如，可以根据下式，根据所计算的图像矩和所生成的图像来确定对象的质心：

在其他情况下，可以根据图像矩和所生成的对象的图像来计算对象的取向。例如，可以根据下式，根据所计算的图像矩和所生成的图像来确定对象的取向：

在再一些情况下，可以根据图像矩和所生成的对象的图像来计算对象的偏心率。例如，可以根据下式，根据计算的图像矩和生成的图像来确定对象的偏心率：

在一些实施例中，方法包括对以下一项或更多项进行评估：1)所计算的对象的大小；2)对象的质心；以及3)对象的偏心率，并识别对象是颗粒的聚集体(例如，细胞聚集体)还是单个颗粒(例如，单细胞)。在一些情况下，基于所计算的对象的大小将对象确定为聚集体。在一个示例中，将计算的对象的大小与感兴趣细胞的预定大小进行比较，以将对象分类为单个颗粒(例如，单细胞)或聚集体。在该示例中，可以使用标准校准样品或参考大小数据来确定预定大小。在另一示例中，将所计算的对象的大小与阈值进行比较，使得在确定对象的大小大于阈值的情况下，对象被分类为是聚集体。

在其他情况下，基于所计算的对象的质心确定对象为聚集体。在一个示例中，将所计算的对象的质心与感兴趣细胞的预定质心进行比较，以将对象分类为单个颗粒(例如，单细胞)或聚集体。在该情况下，可以使用标准校准样品或感兴趣细胞的参考质心数据来确定预定质心。

在又一些情况下，基于所计算的对象的偏心率来确定对象是聚集体。在一个示例中，将计算的对象的偏心率与感兴趣的细胞的预定偏心率进行比较，以将对象分类为单个颗粒(例如，单细胞)或聚集体。在该示例中，可以使用标准校准样品或感兴趣的细胞的参考偏心数据来确定预定偏心。

在某些情况下，基于所确定的对象的大小和质心将对象识别为聚集体。在其他情况下，基于所确定的对象的大小和偏心率将对象识别为聚集体。在又一些情况下，基于所确定的对象的质心和偏心率将对象识别为聚集体。在再一些情况下，基于所确定的对象的大小、质心和偏心率将对象识别为聚集体。

在确定对象是否是聚集体(例如，细胞聚集体)时，在某些情况下，方法包括：1)基于所计算的图像矩和空间数据来评估所述对象的一种或更多种属性；以及2)评估来自流动流的询问区域中的对象的光散射检测器输出信号。在这些实施例中，光散射检测器输出信号可以是前向光散射检测器输出或侧向光散射检测器输出或它们的组合。在实施例中，光散射检测器输出信号可以是信号脉冲宽度、信号脉冲高度和信号脉冲面积或它们的组合。在一个示例中，方法包括基于所计算的图像距和空间数据来评估对象的一种或更多种属性(大小、质心、偏心率)，以及评估光散射检测器输出信号的脉冲宽度。在另一示例中，方法包括基于所计算的图像距和空间数据来评估对象的一种或更多种属性(大小、质心、偏心率)，以及评估光散射检测器输出信号的脉冲高度。在又一示例中，方法包括基于所计算的图像距和空间数据来评估对象的一种或更多种属性(大小、质心、偏心率)，以及评估光散射检测器输出信号的脉冲面积。

在某些情况下，方法包括：1)基于所计算的图像距和所生成的图像来评估所述对象的一种或更多种属性；以及2)评估来自流动流的询问区域中的对象的光散射检测器输出信号。在这些实施例中，光散射检测器输出信号可以是前向光散射检测器输出或侧向光散射检测器输出或它们的组合。在实施例中，光散射检测器输出信号可以是信号脉冲宽度、信号脉冲高度和信号脉冲面积或它们的组合。在一个示例中，方法包括基于所计算的图像距和所生成的图像来评估对象的一种或更多种属性(大小、质心、偏心率)，以及评估光散射检测器输出信号的脉冲宽度。在另一示例中，方法包括基于所计算的图像距和所生成的图像来评估对象的一种或更多种属性(大小、质心、偏心率)，以及评估光散射检测器输出信号的脉冲高度。在又一示例中，方法包括基于所计算的图像距和所生成的图像来评估对象的一种或更多种属性(大小、质心、偏心率)，以及评估光散射检测器输出信号的脉冲面积。

在某些实施例中，方法包括：1)评估光散射检测器输出信号的脉冲宽度、脉冲高度和脉冲面积中的每一个，接着是2)基于所计算的图像矩和空间数据来评估对象的一种或更多种属性(大小、质心、偏心率)。在这些实施例中，可以从侧向散射检测器和前向散射检测器中的一个或更多个收集光散射检测器输出信号。在一些情况下，从侧向散射检测器收集在根据这些实施例的主题方法中使用的光散射检测器输出信号。在其他情况下，从前向散射检测器收集在主题方法中使用的光散射检测器输出信号。在其他情况下，从侧向散射检测器和前向散射检测器收集在主题方法中使用的光散射检测器输出信号。

在某些实施例中，方法包括：1)评估光散射检测器输出信号的脉冲宽度、脉冲高度和脉冲面积中的每一个，接着是2)基于所计算的图像距和所生成的图像来评估对象的一种或更多种属性(大小、质心、偏心率)。在这些实施例中，可以从侧向散射检测器和前向散射检测器中的一个或更多个收集光散射检测器输出信号。在一些情况下，从侧向散射检测器收集在根据这些实施例的主题方法中使用的光散射检测器输出信号。在其他情况下，从前向散射检测器收集在主题方法中使用的光散射检测器输出信号。在其他情况下，从侧向散射检测器和前向散射检测器收集在主题方法中使用的光散射检测器输出信号。

在一些情况下，方法包括确定对象是其中两个或更多个细胞跨流动流的水平轴线对齐在一起的水平细胞聚集体，所述两个或更多个细胞诸如是3个或更多个细胞，诸如4个或更多个细胞，并且包括5个或更多个细胞。在其他情况下，方法包括确定对象是其中两个或更多个细胞沿流动流的垂直轴线(即，纵向轴线)对齐在一起的垂直细胞聚集体，所述两个或更多个细胞诸如是3个或更多个细胞，诸如4个或更多个细胞，并且包括5个或更多个细胞。在又一些情况下，方法包括确定对象是组合细胞聚集体，该组合细胞聚集体具有跨水平轴线对齐在一起的两个或更多个细胞以及具有沿垂直轴线对齐在一起的两个或更多个细胞。

图1A和图1B描绘了根据某些实施例的成像细胞聚集体的图像。图1A描述了具有沿垂直轴线(即，沿流动流的纵向轴线)对齐在一起的两个细胞的垂直取向的细胞聚集体。在一些实施例中，图1A中的对象基于沿y轴的所计算的二阶图像矩能够被识别为垂直对齐的细胞聚集体。图1B描述了具有沿水平轴线(即，与流动流的纵向轴线正交)对齐在一起的两个细胞的水平取向的细胞聚集体。在一些实施例中，图1B中的对象基于沿x轴的所计算的二阶图像矩能够被识别为水平对齐的细胞聚集体。

图2A和图2B描绘了根据某些实施例使用图像和计算的偏心率来区分单细胞和细胞的聚集体。图2A描述了单细胞，图2B描述了4个细胞的聚集体。基于光散射检测器输出信号，图2A中的单细胞和图2B中的细胞聚集体表现出类似的输出信号参数(例如，输出信号脉冲宽度、脉冲高度和脉冲面积)。通过生成图2A和图2B中描述的图像并计算偏心率，根据本发明的方法，图2A中的对象能够被正确地识别为单细胞，图2B中的对象能够被正确地识别为细胞聚集体。

图3描绘了根据某些实施例的用于对流动流中的对象进行成像和表征的流程图。在步骤301，检测来自流动流中的对象的光(光吸收、散射光或发射)。在步骤302，生成对象的空间数据。在步骤303，生成对象的图像(例如，灰度图像)。在步骤304，基于图像的像素确定像素强度阈值。在某些实施例中，在步骤305，通过将每个像素的强度与所确定的像素强度阈值进行比较，将图像中的每个像素转换成二进制像素值。然后在步骤306，使用二进制像素值生成图像掩模。在步骤307，根据空间数据、生成的图像(或图像掩模)确定成像对象的一种或更多种属性。在步骤308，基于所确定的属性，将对象识别为聚集体(例如，细胞聚集体)或单个颗粒(例如，单细胞)。在一些情况下，评估光散射检测器输出信号(脉冲宽度、脉冲高度和脉冲面积)(步骤309)，并且所述光散射检测器输出信号还被用于识别对象。

如上文所概述，本发明的方法还包括基于空间数据、所产生的图像、所产生的图像掩模、所计算的图像矩、对象的一个或更多个所确定的性质(例如，大小、质心、偏心率)或它们的组合来分选对象。在本文中，术语“分选”以其常规意义使用，是指分离样品的组分(例如，含有细胞的液滴、含有诸如生物大分子的非细胞颗粒的液滴)，并且在一些情况下，将分离的组分递送至一个或更多个样品收集容器。例如，方法可以包括分选样品的2种或更多种组分，例如3种或更多种组分，例如4种或更多种组分，例如5种或更多种组分，例如10种或更多种组分，例如15种或更多种组分，并且包括分选样品的25种或更多种组分。在一些实施例中，所述对象被识别为单细胞并分选至第一样品组分收集位置。在其他实施例中，所述对象被识别为细胞聚集体，并被分选至第二样品组分收集位置。在一些情况下，第一样品组分收集位置包括样品收集容器，第二样品组分收集位置包括废物收集容器。

在从流动流中的样品分选对象时，方法包括例如用计算机进行数据采集、分析和记录，其中，多个数据通道对来自用于生成对象的图像或图像掩模的每个检测器(例如，散射检测器、明场光检测器或荧光检测器)的数据进行记录。在这些实施例中，分析包括对颗粒进行分类和计数，使得每个颗粒作为一组数字化参数值存在。主题系统(在下面进行描述)可以被设置为触发选定的参数以便将感兴趣的颗粒与背景和噪声区分开。

然后，可以基于针对整个群体收集的数据通过“门控”进一步分析感兴趣的特定亚群(例如单细胞)。为了选择合适的门，绘制数据以便获得可能的亚群的最佳分离。该过程可以通过绘制图像矩或一个或更多个所确定的属性中的一个或更多个(例如，大小、质心、偏心率)来执行。在其他实施例中，方法包括在二维点图上绘制前向光散射(FSC)与侧向(即，正交)光散射(SSC)的对比。在又一些实施例中，方法包括针对前向光散射(FSC)和侧向(即，正交)光散射(SSC)中的一个或更多个来绘制所确定的属性(例如，大小、质心、偏心率)中的一个或更多个。在再一些实施例中，方法包括针对前向光散射(FSC)和侧向(即，正交)光散射(SSC)来门控颗粒群，随后根据基于对象的图像所确定的特性(例如，大小、质心、偏心率)中的一个或更多个进行门控。在再一些实施例中，方法包括根据基于对象的图像的所确定的属性的一个或更多个(例如，大小、质心、偏心率)来门控颗粒群，随后针对前向光散射(FSC)和侧向(即，正交)光散射(SSC)来门控颗粒群。在又一些实施例中，方法包括基于对象的图像来评估前向光散射(FSC)和侧向(即正交)光散射(SSC)输出信号以及所确定的属性中的一个或更多个(例如，大小、质心、偏心率)，并将对象分类为单个颗粒(例如，单细胞)或聚集体(例如，细胞聚集体)，随后基于对象的分类进行门控。

然后选择对象的亚群(即，在门中的那些单细胞)并排除不在门中的颗粒。在期望的情况下，可以通过使用计算机屏幕上的光标在期望的亚群周围画线来选择门。然后，通过绘制这些颗粒的其他参数(例如荧光)，仅对门内的那些颗粒进一步分析。在需要的情况下，上述分析可以配置成产生样品中的感兴趣的颗粒的计数。

在一些实施例中，用于分选样品的组分的方法包括用具有偏转板的颗粒分选模块来分选颗粒(例如，生物样品中的细胞)，例如于2017年3月28日提交的美国专利公开号2017/0299493中所述，其公开内容通过引用并入本文。在某些实施例中，使用具有多个分选决定单元的分选决定模块来分选样品的细胞，诸如在2019年2月8号提交的美国临时专利申请第62/803,264号中所描述的，其公开内容通过引用并入本文。

·用于表征样品中的颗粒的系统

如上所述，本发明的方面包括用于表征样品的颗粒(例如，生物样品中的细胞)的系统。根据某些实施例的系统包括光源、光检测系统和处理器，光源配置成照射在流动流中具有细胞的样品，光检测系统具有光检测器，并且处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，指令在由处理器执行时使处理器生成询问区域中的流动流中的对象的空间数据，并且基于该空间数据确定流动流中的对象是否为细胞聚集体。

所感兴趣的系统包括配置成照射流动流中的样品的光源。在实施例中，光源可以是任何合适的宽带或窄带光源。根据样品中的组分(例如细胞、珠、非细胞颗粒等)，光源可以配置成发射范围为200nm至1500nm，例如250nm至1250nm，例如300nm至1000nm，例如350nm至900nm，并且包括400nm至800nm变化的波长的光。例如，光源可以包括发射波长为200nm至900nm的光的宽带光源。在其他情况下，光源包括发射波长为200nm至900nm的波长的窄带光源。例如，光源可以是窄带LED(1nm-25nm)，其发射波长范围为200nm到900nm的光。

在一些实施例中，光源是激光器。感兴趣的激光器可以包括脉冲激光器或连续波激光器。例如，激光器可以是气体激光器，例如氦-氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、CO₂激光器、CO激光器、氩-氟(ArF)受激准分子激光器、氪-氟(KrF)受激准分子激光器、氙-氯(XeCl)受激准分子激光器或氙-氟(XeF)受激准分子激光器或它们的组合；染料激光器，例如芪、香豆素或罗丹明激光器；金属蒸气激光器，例如氦-镉(HeCd)激光器、氦-汞(HeHg)激光器、氦-硒(HeSe)激光器、氦-银(HeAg)激光器、锶激光器、氖-铜(NeCu)激光器、铜激光器或金激光器及它们的组合；固态激光器，例如红宝石激光器、Nd:YAG激光器、NdCrYAG激光器、Er:YAG激光器、Nd:YLF激光器，Nd:YVO₄激光器，Nd:YCa₄O(BO₃)₃激光器，Nd:YCOB激光器、钛蓝宝石激光器、铥YAG激光器、镱YAG激光器、三氧化二镱激光器或铈掺杂激光器及它们的组合；半导体二极管激光器、光泵浦半导体激光器(OPSL)，或者上述激光器中的任何一个的倍频或三倍频实现。

在其他实施例中，光源是非激光光源，例如灯，包括但不限于卤素灯、氘弧光灯、氙弧灯、发光二极管，例如具有连续光谱的宽带LED、超发光发光二极管、半导体发光二极管、宽谱LED白光源、集成的多LED。在一些情况下，非激光光源是稳定的光纤耦合宽带光源、白光源、其他光源或它们的任意组合。

在某些实施例中，光源是光束发生器，其配置成产生两束或更多束频移光。在一些情况下，光束发生器包括激光器、射频发生器，所述射频发生器配置成将射频驱动信号施加至声光装置以产生两个或更多个角度偏转的激光束。在这些实施例中，激光器可以是脉冲激光器或连续波激光器。例如，所感兴趣的光束发生器中的激光器可以是气体激光器，例如氦-氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、CO₂激光器、CO激光器、氩-氟(ArF)受激准分子激光器、氪-氟(KrF)受激准分子激光器、氙氯(XeCl)受激准分子激光器或氙-氟(XeF)受激准分子激光器或它们的组合；染料激光器，例如芪、香豆素或罗丹明激光器；金属蒸气激光器，例如氦-镉(HeCd)激光器、氦-汞(HeHg)激光器、氦-硒(HeSe)激光器、氦-银(HeAg)激光器、锶激光器、氖-铜(NeCu)激光器、铜激光器或金激光器及它们的组合；固态激光器，例如红宝石激光器，Nd：YAG激光器、NdCrYAG激光器、Er:YAG激光器、Nd:YLF激光器，Nd:YVO₄激光器，Nd:YCa₄O(BO₃)₃激光器，Nd:YCOB激光器、钛蓝宝石激光器、铥YAG激光器、镱YAG激光器、三氧化二镱激光器或铈掺杂激光器及它们的组合。

声光装置可以是配置成使用所施加的声波来频移激光的任何方便的声光协议。在某些实施例中，声光装置是声光偏转器。主题系统中的声光装置配置成根据来自激光器的光及所施加的射频驱动信号产生角度偏转的激光束。射频驱动信号可以用任何合适的射频驱动信号源施加到声光装置，例如直接数字合成器(DDS)、任意波形发生器(AWG)或电脉冲发生器。

在实施例中，控制器配置成将射频驱动信号施加到声光装置以在输出激光束中产生期望数量的角度偏转的激光束，诸如配置成施加3个或更多个射频驱动信号，诸如4个或更多个射频驱动信号，诸如5个或更多个射频驱动信号，诸如6个或更多个射频驱动信号，诸如7个或更多个射频驱动信号，诸如8个或更多个射频驱动信号，诸如9个或更多个射频驱动信号，诸如10个或更多个射频驱动信号，诸如15个或更多个射频驱动信号，诸如25个或更多个射频驱动信号，诸如50个或更多个射频驱动信号，并且包括配置成施加100个或更多个射频驱动信号。

在一些情况下，为了在输出激光束中产生角度偏转的激光束的强度分布，控制器配置成施加幅度变化的射频驱动信号，幅度的变化例如为约0.001V至约500V，例如为约0.005V至约400V，例如为约0.01V至约300V，例如为约0.05V至约200V，例如为约0.1V至约100V，例如为约0.5V至约75V，例如为约1V至50V，例如为约2V至40V，例如为为3V至约30V，并且包括约5V至约25V。在一些实施例中，每个施加的射频驱动信号的频率为约0.001MHz至约500MHz，例如为约0.005MHz至约400MHz，例如为约0.01MHz至约300MHz，例如为约0.05MHz至约200MHz，例如为约0.1MHz至约100MHz，例如为约0.5MHz至约90MHz，例如为约1MHz至约75MHz，例如为约2MHz至约70MHz，例如为约3MHz至约65MHz，例如为约4MHz至约60MHz，例如为约5MHz至约50MHz。

在某些实施例中，控制器具有处理器，所述处理器具有可操作地耦合到该处理器的存储器，使得该存储器包括存储于其上的指令，所述指令在由所述处理器执行时使所述处理器产生具有角度偏转的激光束的输出激光束，所述角度偏转的激光束具有所期望的强度分布。例如，存储器可以包括用于产生具有相同强度的两个或更多个角度偏转的激光束的指令，所述两个或更多个例如为3个或更多个，例如为4个或更多个，例如为5个或更多个，例如为10个或更多个，例如为25个或更多个，例如为50个或更多个，并且包括存储器可以包括用于产生具有相同强度的100个或更多个角度偏转的激光束的指令。在其他实施例中，可以包括用于产生具有不同强度的两个或更多个角度偏转的激光束的指令，所述两个或更多个例如为3个或更多个，例如为4个或更多个，例如为5个或更多个，例如为10个或更多个，例如为25个或更多个，例如为50个或更多个，并且包括可以包括用于产生具有不同强度的100个或更多个角度偏转的激光束的指令的存储器。

在某些实施例中，所述控制器具有处理器，所述处理器具有可操作地耦合到该处理器的存储器，使得该存储器包括存储于其上的指令，所述指令在由处理器执行时使该处理器产生输出激光束，所述输出激光束具有沿所述水平轴线从所述输出激光束的边缘到中心增加的强度。在这些情况下，沿水平轴线的角度偏转的激光束在输出光束的中心处的强度可以为角度偏转的激光束在输出激光束的边缘处的强度的0.1％至约99％，例如为0.5％至约95％，例如为1％至约90％，例如为约2％至约85％，例如为约3％至约80％，例如为约4％至约75％，例如为约5％至约70％，例如为约6％至约65％，例如为约7％至约60％，例如为约8％至约55％，并且包括为沿水平轴线的角度偏转的激光束在输出激光束的边缘处的强度的约10％至约50％。在其他实施例中，控制器具有处理器，处理器具有可操作地耦合到该处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使该处理器产生输出激光束，输出激光束具有沿水平轴线从输出激光束的边缘到中心增加的强度。在这些情况下，沿水平轴线的角度偏转的激光束在输出光束的边缘处的强度可以为角度偏转的激光束在输出激光束的中心处的强度的0.1％至约99％，例如为0.5％至约95％，例如为1％至约90％，例如为约2％至约85％，例如为约3％至约80％，例如为约4％至约75％，例如为约5％至约70％，例如为约6％至约65％，例如为约7％至约60％，例如为约8％至约55％，并且包括为沿水平轴线的角度偏转的激光束在输出激光束的中心处的强度的约10％至约50％。在又一些实施例中，控制器具有处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使处理器产生具有沿水平轴线的高斯分布的强度轮廓的输出激光束。在再一些其他实施例中，控制器具有处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使处理器产生具有沿水平轴线的顶帽强度分布的输出激光束。

在实施例中，所感兴趣的光束发生器可以配置成在输出激光束中产生空间上分离的角度偏转的激光束。取决于所施加的射频驱动信号和输出激光束的期望的照射分布，角度偏转的激光束可以被分开0.001μm或更多，诸如被分开0.005μm或更多，诸如被分开0.01μm或更多，诸如被分开0.05μm或更多，诸如被分开0.1μm或更多，诸如被分开0.5μm或更多，诸如被分开1μm或更多，诸如被分开5μm或更多，诸如被分开10μm或更多，诸如被分开100μm或更多，诸如被分开500μm或更多，诸如被分开1000μm或更多，并且包括被分开5000μm或更多。在一些实施例中，系统配置成在输出激光束中产生例如与沿输出激光束的水平轴线的相邻的角度偏转的激光束交叠的角度偏转的激光束。相邻的角度偏转的激光束之间的交叠(例如，束斑的交叠)可以是0.001μm或更大的交叠，例如0.005μm或更大的交叠，例如0.01μm或更大的交叠，例如0.05μm或更大的交叠，例如0.1μm或更大的交叠，例如0.5μm或更大的交叠，例如1μm或更大的交叠，例如5μm或更大的交叠，例如10μm或更大的交叠，并且包括100μm或更大的交叠。

在某些情况下，配置成产生两束或更多束频移光的光束发生器包括激光激发模块，如美国专利第9,423,353号；第9,784,661号和第10,006,852号以及美国专利公开号2017/0133857和2017/0350803中描述的，其公开内容通过引用并入本文。

在实施例中，系统包括光检测系统，其具有用于检测和测量来自样品的光的一个或更多个光检测器。感兴趣的光检测器可以配置成测量来自样品的光吸收(例如，对于明场光数据)、光散射(例如，前向或侧向散射光数据)、光发射(例如，荧光数据)或它们的组合。感兴趣的光检测器可以包括(但不限于)光学传感器，例如有源像素传感器(APS)、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合装置(CCD)、增强型电荷耦合装置(ICCD)、发光二极管、光子计数器、辐射热测量计、热电检测器、光敏电阻器、光伏电池、光电二极管、光电倍增管、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及它们的组合，以及其他光检测器。在某些实施例中，来自样品的光利用电荷耦合装置(CCD)、半导体电荷耦合装置(CCD)、有源像素传感器(APS)、互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器或N型金属氧化物半导体(NMOS)图像传感器来测量。

在一些实施例中，感兴趣的光检测系统包括多个光检测器。在一些情况下，光检测系统包括多个固态检测器，例如光电二极管。在某些情况下，光检测系统包括光检测器阵列，例如光电二极管阵列。在这些实施例中，光检测器阵列可以包括4个或更多个光检测器，诸如10个或更多个光检测器，诸如25个或更多个光检测器，诸如50个或更多个光检测器，诸如100个或更多个光检测器，诸如250个或更多个光检测器，诸如500个或更多个光检测器，诸如750个或更多个光检测器，以及包括1000个或更多个光检测器。例如，检测器可以是具有4个或更多光电二极管的光电二极管阵列，所述4个或更多光电二极管例如10个或更多光电二极管，例如25个或更多光电二极管，例如50个或更多光电二极管，例如100个或更多光电二极管，例如250个或更多光电二极管，例如500个或更多光电二极管，例如750个或更多光电二极管，以及包括1000个或更多光电二极管。

光检测器可以根据需要设置成任何几何构造，其中感兴趣的设置包括但不限于正方形构造、矩形构造、梯形构造、三角形构造、六边形构造、七边形构造、八边形构造、九边形构造、十边形构造、十二边形构造、圆形构造、椭圆形构造以及不规则图案构造。光检测器阵列中的光检测器可以相对于另一个光检测器(如在X-Z平面中所参考的)呈10°到180°的角度定向，例如为15°到170°，例如为20°到160°，例如为25°到150°，例如为30°到120°，并且包括45°到90°。光检测器阵列可以是任何合适的形状，并且可以是直线形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等，可以是曲线形状，例如圆形、椭圆形，以及不规则形状，例如与平面顶部耦合的抛物线底部。在某些实施例中，光检测器阵列具有矩形形状的有源表面。

阵列中的每个光检测器(例如光电二极管)可以具有有源表面，该有源表面的宽度为5μm至250μm、例如为10μm至225μm、例如为15μm至200μm、例如为20μm至175μm、例如为25μm至150μm、例如为30μm至125μm并且包括50μm至100μm，并且该有源表面的长度为5μm至250μm、例如为10μm至225μm、例如为15μm至200μm、例如为20μm至175μm、例如为25μm至150μm、例如为30μm至125μm并且包括50μm至100μm，其中阵列中的每个光检测器(例如光电二极管)的表面积范围为25μm²至10000μm²、例如为50μm²至9000μm²、例如为75μm²至8000μm²、例如为100μm²至7000μm²、例如为150μm²至6000μm²并且包括200μm²至5000μm²。

光检测器阵列的大小可以根据光的量和强度、光检测器的数量和期望的灵敏度而变化，并且长度可以为0.01mm到100mm，例如为0.05mm到90mm，例如为0.1mm到80mm，例如为0.5mm到70mm，例如为1mm到60mm，例如为2mm到50mm，例如为3mm到40mm，例如为4mm到30mm，并且包括5mm到25mm。光检测器阵列的宽度也可以变化为0.01mm至100mm，例如为0.05mm至90mm，例如为0.1mm至80mm，例如为0.5mm至70mm，例如为1mm至60mm，例如为2mm至50mm，例如为3mm至40mm，例如为4mm至30mm，并且包括5mm至25mm。这样，光检测器阵列的有源表面的范围可以为0.1mm²到10000mm²，例如为0.5mm²到5000mm²，例如为1mm²到1000mm²，例如为5mm²到500mm²，并且包括10mm²到100mm²。

感兴趣的光检测器配置成测量在一个或更多个波长处收集的光，诸如在2个或更多个波长处，诸如在5个或更多个不同波长处，诸如在10个或更多个不同波长处，诸如在25个或更多个不同波长处，诸如在50个或更多个不同波长处，诸如在100个或更多个不同波长处，诸如在200个或更多个不同波长处，诸如在300个或更多个不同波长处，并且包括测量由流动流中的样品发射的在400个或更多个不同波长处的光。

在一些实施例中，光检测器配置成测量在波长范围(例如，200nm至1000nm)上收集的光。在某些实施例中，感兴趣的光检测器配置成收集一定波长范围上的光谱。例如，系统可以包括一个或更多个检测器，所述一个或更多个检测器配置成收集波长范围为200nm至1000nm的一个或更多个波长范围上的光谱。在其他实施例中，感兴趣的检测器配置成测量来自流动流中的样品的一个或更多个特定波长处的光。例如，系统可以包括一个或更多个检测器，所述一个或更多个检测器配置成测量以下波长中的一个或更多个处的光：450nm、518nm、519nm、561nm、578nm、605nm、607nm、625nm、650nm、660nm、667nm、670nm、668nm、695nm、710nm、723nm、780nm、785nm、647nm、617nm及它们的任何组合。

光检测系统配置成连续地或以离散间隔测量光。在一些情况下，感兴趣的光检测器配置成连续地测量所收集光。在其他情况下，光检测系统配置成以离散间隔进行测量，诸如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒并且包括每1000毫秒或以一些其他间隔来测量光。

在实施例中，系统配置成分析来自被照射样品的光并且生成流动流中的对象的空间数据。所感兴趣的系统可以包括计算机控制系统，其中该系统进一步包括用于实践本文所述方法的系统的完全自动化或部分自动化的一个或更多个计算机。在一些实施例中，系统包括具有计算机可读存储介质的计算机，计算机可读存储介质具有存储在其上的计算机程序，其中当计算机程序加载在计算机上时包括指令，所述指令用于用光源照射具有流动流中的样品的流动池，并且用具有多个光检测器的光检测系统检测来自流动池的光，并且生成流动流中的对象的空间数据，并且基于空间数据确定对象是否为聚集体(例如，细胞聚集体)。

在一些实施例中，系统配置成实时产生流动流中的对象的图像，例如使得基于所产生的图像能够分选样品的一种或更多种组分。在一些实施例中，系统包括具有计算机可读存储介质的计算机，计算机可读存储介质具有存储在其上的计算机程序，其中当计算机程序在加载在所述计算机上时包括指令，所述指令用于用光源照射具有流动流中的样品的流动池，并且用具有多个光检测器的光检测系统检测来自所述流动池的光，并且生成流动流中的对象的图像，并且基于所生成的图像确定所成像的对象是否是聚集体(例如，细胞聚集体)。

在一些实施例中，系统包括具有计算机可读存储介质的计算机，计算机可读存储介质具有存储在其上的计算机程序，其中当计算机程序被加载在计算机上时还包括指令，所述指令用于根据所检测的光生成流动流中的对象的图像。可以根据检测到的光吸收、检测到的光散射、检测到的光发射或其任何组合生成图像。在某些实施例中，流动流中的对象的图像是灰度图像。在一些情况下，由主题系统根据从样品(诸如从明场光检测器)检测到的光吸收生成灰度图像。在这些情况下，基于来自流动流中的细胞的明场图像数据生成灰度图像。在其他情况下，主题系统根据从样品(诸如侧向散射检测器、前向散射检测器或侧向散射检测器和前向散射检测器的组合)检测到的光散射生成灰度图像。在这些情况下，基于散射光图像数据生成灰度图像。在又一些情况下，主题系统根据来自样品的发射光，诸如来自添加到样品的荧光团的光生成灰度图像。在这些情况下，基于荧光图像数据(即，来自细胞上或细胞中的荧光化合物的成像数据)生成灰度图像。在另外的其他情况下，主题系统根据检测到的光吸收、检测到的光散射和检测到的光发射的组合来生成灰度图像。

主题系统可以配置成根据所检测的光生成对象的一个或更多个图像。在一些实施例中，根据每种形式的检测光生成单个图像。例如，根据检测到的光吸收生成对象的第一图像；根据检测到的光散射生成对象的第二图像，并且根据检测到的光发射生成对象的第三图像。在其他实施例中，根据每种形式的检测光生成两个或更多个图像，诸如3个或更多个，诸如4个或更多个，诸如5个或更多个，并且包括10个或更多个图像或它们的组合。

在一些实施例中，系统包括具有计算机可读存储介质的计算机，该计算机可读存储介质具有存储在其上的计算机程序，其中当计算机程序被加载在计算机上时还包括用于生成对象的图像掩模的指令。在这些实施例中，系统包括具有指令的存储器，所述指令用于根据灰度图像确定像素强度阈值。在一些实施例中，计算机程序包括指令，所述指令在由处理器执行时使处理器通过最小化灰度图像的类内方差并计算基于该最小化的类内方差(或类间方差最大)的像素强度阈值来根据灰度图像确定像素强度阈值。

系统包括具有指令的存储器，所述指令用于将灰度图像中的每个像素与所确定的强度阈值进行比较，并且将每个像素转换为二进制像素值。在一些实施例中，存储器包括用于将灰度图像中的沿每个水平行的像素与所确定的强度阈值进行比较的指令。在一些情况下，存储器包括用于将从灰度图像的左侧到灰度图像的右侧的像素与所确定的强度阈值进行比较的指令。在其他情况下，存储器包括用于将从灰度图像的右侧到灰度图像的左侧的像素与所确定的强度阈值进行比较的指令。在其他实施例中，存储器包括将沿灰度图像中的每个垂直列的像素与所确定的强度阈值进行比较的指令。在一些情况下，存储器包括用于将沿每个垂直列从灰度图像的顶部到灰度图像的底部的像素与所确定的强度阈值进行比较的指令。在其他情况下，存储器包括用于将沿每个垂直列从灰度图像的底部到灰度图像的顶部的像素与所确定的强度阈值进行比较的指令。

取决于所检测的光的类型，每个像素被分配二进制像素值1或二进制像素值0。在一个示例中，系统包括计算机程序，该计算机程序包括指令，所述指令用于检测来自流动流的光吸收(例如明场图像数据)，并且将二进制像素值1分配给灰度图像中像素强度小于强度阈值的每个像素，而将二进制像素值0分配给灰度图像中像素强度大于强度阈值的每个像素。在另一示例中，系统包括计算机程序，该计算机程序包括指令，所述指令用于检测来自流动流中的对象的光散射，并且将二进制像素值1分配给灰度图像中的像素强度大于强度阈值的每个像素，而将二进制像素值0分配给灰度图像中的像素强度小于强度阈值的每个像素。在又一示例中，系统包括计算机程序，该计算机程序包括指令，所述指令用于检测来自流动流中的对象的荧光，并且将二进制像素值1分配给灰度图像中的像素强度大于强度阈值的每个像素，而将二进制像素值0分配给像素强度小于强度阈值的像素。

在主题系统将二进制像素值分配给灰度图像中的跨水平行的每个像素的情况下，在一些实施例中，系统包括计算机程序，该计算机程序包括用于进一步确定跨水平行具有二进制像素值1的第一个像素并确定水平行中具有二进制像素值1的最后一个像素的指令。在一个示例中，系统包括计算机程序，该计算机程序包括用于确定从水平行左侧起具有分配的二进制像素值1的第一个像素并确定从水平行左侧起具有所分配的二进制像素值1的最后一个像素的指令。在另一实施例中，系统包括计算机程序，该计算机程序包括用于确定从水平行右侧起具有所分配的二进制像素值1的第一个像素并确定从水平行右侧起具有所分配的二进制像素值1的最后一个像素的指令。在其他实施例中，系统包括计算机程序，所述计算机程序包括用于进一步确定跨水平行的具有二进制像素值为0的第一个像素并确定水平行中的具有二进制像素值为0的最后一个像素的指令。在一个示例中，系统包括计算机程序，所述计算机程序包括用于确定从水平行左侧起具有分配的二进制像素值0的第一个像素并确定从水平行左侧起具有分配的二进制像素值0的最后一个像素的指令。在另一示例中，系统包括计算机程序，该计算机程序包括用于确定从水平行右侧起具有所分配的二进制像素值0的第一个像素并确定从水平行右侧起具有所分配的二进制像素值0的最后一个像素的指令。

在二进制像素值被分配给灰度图像中沿垂直列的每个像素的情况下，在一些实施例中，系统包括计算机程序，该计算机程序包括用于进一步确定沿垂直列的具有二进制像素值1的第一个像素并确定沿垂直列的具有二进制像素值1的最后一个像素的指令。在一个示例中，系统包括计算机程序，该计算机程序包括用于确定从垂直列的顶部起具有分配的二进制像素值1的第一个像素并确定从垂直列的顶部起具有分配的二进制像素值1的最后一个像素的指令。在另一示例中，系统包括计算机程序，该计算机程序包括用于确定从垂直列的底部起具有分配的二进制像素值1的第一个像素并确定从垂直列的底部起具有分配的二进制像素值1的最后一个像素的指令。在其他实施例中，系统包括计算机程序，该计算机程序包括用于进一步确定沿垂直列的具有二进制像素值0的第一个像素并确定垂直列中的具有二进制像素值0的最后一个像素的指令。在一个示例中，系统包括计算机程序，所述计算机程序包括用于确定从垂直列顶部起具有分配的二进制像素值0的第一个像素并确定从垂直列顶部起具有分配的二进制像素值0的最后一个像素。在另一个示例中，系统包括计算机程序，所述计算机程序包括用于确定从垂直列底部起具有分配的二进制像素值0的第一个像素并确定从垂直列底部起具有分配的二进制像素值0的最后一个像素的指令。

在一些实施例中，系统包括具有计算机可读存储介质的计算机，所述计算机可读存储介质具有存储在其上的计算机程序，其中当所述计算机程序被加载在所述计算机上时还包括用于基于所计算的图像距和空间数据来确定所述对象的一种或更多种属性的指令。例如，系统可以包括具有指令的存储器，所述指令用于基于所计算的图像矩和空间数据来确定细胞的大小、细胞的质心或细胞的偏心率。在这些实施例中，系统配置成计算一个或更多个图像矩，然后使用所计算的图像矩和空间数据两者来确定细胞的特性。

在一些实施例中，系统包括具有计算机可读存储媒体的计算机，所述计算机可读存储媒体上存储有计算机程序，其中当所述计算机程序在加载到所述计算机上时还包括用于基于所述所计算的图像矩和所产生的图像来确定所述对象的一个或更多个特性的指令。例如，系统可以包括具有指令的存储器，所述指令用于基于所计算的图像矩和所生成的对象的图像(例如，图像或图像掩模)来确定细胞的大小、细胞的质心或细胞的偏心率。在这些实施例中，系统配置成计算一个或更多个图像矩，然后使用计算的图像矩和对象的图像两者来确定细胞的特性。

在一些情况下，可以根据图像矩和所生成的对象的图像来计算质心。例如，系统可以配置成根据下式、根据所计算的图像矩和所生成的图像来确定对象的质心：

在其他情况下，可以根据图像矩和所生成的对象的图像来计算对象的取向。例如，系统可以配置成根据下式、根据计算的图像距和生成的图像来确定对象的取向：

在再一些情况下，可以根据图像矩和所生成的对象的图像来计算对象的偏心率。例如，系统可以配置成根据下式、根据计算的图像矩和生成的图像来确定对象的偏心率：

在某些实施例中，系统包括具有计算机可读存储介质的计算机，所述计算机可读存储介质具有存储在其上的计算机程序，其中，当所述计算机程序被加载在所述计算机上时还包括用于评估以下各项中的一项或更多项的指令：1)所计算的对象的大小；2)对象的质心；以及3)对象的偏心率，并识别对象是颗粒的聚集体(例如，细胞聚集体)还是单个颗粒(例如，单细胞)。在一些情况下，系统配置成基于所计算的对象的大小来确定对象是聚集体。在其他情况下，系统配置成基于所计算的对象的质心来确定对象是聚集体。在又一些情况下，系统配置成基于所计算的对象的偏心率来确定对象是聚集体。

在某些情况下，系统包括具有指令的存储器，所述指令用于以下操作：1)基于所计算的图像矩和空间数据来评估所述对象的一种或更多种属性；以及2)评估来自流动流的询问区域中的对象的光散射检测器输出信号。在这些实施例中，光散射检测器输出信号可以是前向光散射检测器输出或侧向光散射检测器输出或它们的组合。在实施例中，光散射检测器输出信号可以是信号脉冲宽度、信号脉冲高度和信号脉冲面积或它们的组合。在一个示例中，系统包括具有指令的存储器，所述指令用于基于所计算的图像距和空间数据来评估对象的一种或更多种属性(大小、质心、偏心率)以及评估光散射检测器输出信号的脉冲宽度。在另一示例中，系统包括具有指令的存储器，所述指令用于基于所计算的图像距和空间数据来评估对象的一种或更多种属性(大小、质心、偏心率)以及评估光散射检测器输出信号的脉冲高度。在又一示例中，系统包括具有指令的存储器，所述指令用于基于所计算的图像距和空间数据来评估对象的一种或更多种属性(大小、质心、偏心率)以及评估光散射检测器输出信号的脉冲面积。

在某些实施例中，系统包括具有指令的存储器，所述指令用于以下操作：1)评估光散射检测器输出信号的脉冲宽度、脉冲高度和脉冲面积中的每个，接着是2)基于所计算的图像矩和空间数据来评估对象的一种或更多种属性(大小、质心、偏心率)。在这些实施例中，可以从侧向散射检测器和前向散射检测器中的一个或更多个收集光散射检测器输出信号。在一些情况下，从侧向散射检测器收集根据这些实施例的主题系统所使用的光散射检测器输出信号。在其他情况下，从前向散射检测器收集所使用的光散射检测器输出信号。在又一些情况下，从侧向散射检测器和前向散射检测器收集所使用的光散射检测器输出信号。

在某些情况下，系统包括具有指令的存储器，所述指令用于以下操作：1)基于所计算的图像距和所生成的图像来评估对象的一种或更多种属性；以及2)评估来自流动流的询问区域中的对象的光散射检测器输出信号。在这些实施例中，光散射检测器输出信号可以是前向光散射检测器输出或侧向光散射检测器输出或它们的组合。在实施例中，光散射检测器输出信号可以是信号脉冲宽度、信号脉冲高度和信号脉冲面积或它们的组合。在一个示例中，系统包括具有指令的存储器，所述指令用于基于所计算的图像距和所生成的图像来评估对象的一种或更多种属性(大小、质心、偏心率)，以及评估光散射检测器输出信号的脉冲宽度。在另一示例中，系统包括具有指令的存储器，所述指令用于基于所计算的图像距和所生成的图像来评估对象的一种或更多种属性(大小、质心、偏心率)以及评估光散射检测器输出信号的脉冲高度。在又一示例中，系统包括具有指令的存储器，所述指令用于基于所计算的图像距和所生成的图像来评估对象的一种或更多种属性(大小、质心、偏心率)以及评估光散射检测器输出信号的脉冲面积。

在某些实施例中，系统包括具有指令的存储器，所述指令用于以下操作：1)评估光散射检测器输出信号的脉冲宽度、脉冲高度和脉冲面积中的每一个，接着是2)基于所计算的图像距和所生成的图像来评估对象的一种或更多种属性(大小、质心、偏心率)。在这些实施例中，可以从侧向散射检测器和前向散射检测器中的一个或更多个收集光散射检测器输出信号。在一些情况下，从侧向散射检测器收集根据这些实施例的主题系统所使用的光散射检测器输出信号。在其他情况下，从前向散射检测器收集所使用的光散射检测器输出信号。在其他情况下，从侧向散射检测器和前向散射检测器收集所使用的光散射检测器输出信号。

在一些情况下，系统包括具有指令的存储器，所述指令用于确定对象是其中两个或更多个细胞跨流动流的水平轴线对齐在一起的水平细胞聚集体，，两个或更多个细胞诸如是3个或更多个细胞，诸如4个或更多个细胞，并且包括5个或更多个细胞。在其他情况下，系统包括具有用于确定对象是垂直细胞聚集体的指令的存储器，其中两个或更多个细胞沿流动流的垂直轴线(即，纵向轴线)对齐在一起，两个或更多个细胞诸如是3个或更多个细胞，诸如4个或更多个细胞并且包括5个或更多个细胞。在又一些情况下，系统包括具有用于确定对象是组合细胞聚集体的指令的存储器，该组合细胞聚集体具有在水平轴线上对齐在一起的两个或更多细胞以及具有在垂直轴线上对齐在一起的两个或更多细胞。

在一些实施例中，系统包括具有指令的存储器，所述指令用于根据流动流中的对象的频率编码的数据计算空间数据。在这些实施例中，系统配置成通过执行频率编码的数据的变换来计算空间数据。在一个示例中，通过对频率编码的数据执行傅里叶变换(FT)来计算空间数据。在另一示例中，通过对频率编码的数据执行离散傅里叶变换(DFT)来计算空间数据。在又一示例中，通过对频率编码的数据执行短时傅立叶变换(STFT)来计算空间数据。在再一示例中，用数字锁定放大器计算空间数据以对频率编码的数据进行外差和解复用。

根据一些实施例的分拣系统可以包括显示器和操作者输入装置。操作者输入装置可以例如是键盘、鼠标等。处理模块包括处理器，该处理器可以访问存储器，该存储器具有存储在其上的用于执行主题方法的步骤的指令。处理模块可以包括操作系统、图形用户接口(GUI)控制器、系统存储器、存储器存储装置、输入输出控制器、高速缓冲存储器、数据备份单元和许多其他装置。处理器可以是市场上可买到的处理器，或者它可以是现在或将成为可用的其他处理器之一。处理器以公知的方式执行操作系统，并且操作系统以公知的方式与固件和硬件进行接口连接，并且便于处理器协调和执行可以以如本领域所公知的诸如Java、Perl、C++、其他高级或低级语言以及它们的组合的各种编程语言编写的各种计算机程序的功能。操作系统通常与处理器协作、协调并执行计算机的其他部件的功能。操作系统还提供调度、输入-输出控制、文件和数据管理、存储器管理、以及通信控制和相关服务，所有这些都是根据已知技术的。处理器可以是任何合适的模拟或数字系统。在一些实施例中，处理器包括提供例如负反馈控制的反馈控制的模拟电子设备。

系统存储器可以是各种已知或未来的存储器存储装置中的任何一种。示例包括任何通常可用的随机存取存储器(RAM)、诸如驻留硬盘或磁带的磁介质、诸如读写光盘的光介质、闪速存储器装置或其他存储器存储装置。存储器存储装置可以是各种已知或未来装置中的任何一种，包括光盘驱动器、磁带驱动器、可移动硬盘驱动器或磁盘驱动器。这种类型的存储器存储装置通常从程序存储介质(未示出)读取和/或向其写入，该程序存储介质分别诸如光盘、磁带、可移动硬盘或软盘。这些程序存储介质中的任何一个，或者现在使用的或以后可能开发的其他介质，可以被认为是计算机程序产品。如将理解的，这些程序存储介质通常存储计算机软件程序和/或数据。计算机软件程序，也称为计算机控制逻辑，通常存储在系统存储器和/或与存储器存储装置结合使用的程序存储装置中。

在一些实施例中，描述了一种计算机程序产品，其包括计算机可用介质，该计算机可用介质具有存储在其中的控制逻辑(计算机软件程序，包括程序代码)。在由计算机的处理器执行时，控制逻辑使处理器执行本文所述的功能。在其他实施例中，主要使用例如硬件状态机使一些功能在硬件中实现。实现硬件状态机以便执行本文描述的功能对于相关领域的技术人员来说是显而易见的。

存储器可以是处理器可以在其中存储和检索数据的任何适当的装置，诸如磁、光或固态存储装置(包括磁盘或光盘或磁带或RAM，或任何其他适当的固定或便携式装置)。处理器可以包括适于从携带必要程序代码的计算机可读介质编程的通用数字微处理器。编程可以通过通信信道远程地提供给处理器，或者可以使用与存储器相连接的那些装置中的任何一个预先存储在诸如存储器或一些其他便携式或固定计算机可读存储介质的计算机程序产品中。例如，磁盘或光盘可以携带编程，并且能够被盘写入器/读取器读取。主题系统还包括例如用于实施上述方法的计算机程序产品、算法形式的编程。根据本发明的编程能够记录在计算机可读介质上，例如，能够被计算机直接读取和访问的任何介质。这样的介质包括但不限于：磁存储介质，例如软盘、硬盘存储介质和磁带；光学存储介质，例如CD-ROM；电存储介质，例如RAM和ROM；便携式闪速存储驱动器；以及这些种类的混合，例如磁/光存储介质。

处理器还可以访问通信信道以与远程位置处的用户通信。远程位置意味着用户不直接与系统联系，而将输入信息从外部装置中继到输入管理器，外部装置诸如被连接到广域网(“WAN”)、电话网络、卫星网络或任何其他合适的通信信道的计算机，包括移动电话(即，智能电话)。

在一些实施例中，根据本公开内容的系统可以配置成包括通信接口。在一些实施例中，通信接口包括用于与网络和/或另一装置通信的接收器和/或发射器。通信接口能够被配置用于有线或无线通信，包括但不限于射频(RF)通信(例如，射频识别(RFID)、Zigbee通信协议、WiFi、红外线、无线通用串行总线(USB)、超宽带(UWB)、通信协议和蜂窝通信，诸如码分多址(CDMA)或全球移动通信系统(GSM)。

在一个实施例中，通信接口配置成包括一个或更多个通信端口，例如，物理端口或接口，诸如USB端口、RS-232端口或任何其他合适的电连接端口，以允许主题系统与其他外部装置之间的数据通信，所述其他外部装置诸如配置成用于类似的补充数据通信的计算机终端(例如，在医师的办公室或在医院环境中)。

在一个实施例中，通信接口被配置用于红外通信、通信或任何其他合适的无线通信协议，以使得主题系统能够与其他装置通信，所述其他装置诸如计算机终端和/或网络、支持通信的移动电话、个人数字助理或用户可以结合使用的任何其他通信装置。

在一个实施例中，通信接口配置成提供用于通过蜂窝电话网络利用互联网协议(IP)的数据传输、短消息服务(SMS)的连接、到连接到互联网的局域网(LAN)上的个人计算机(PC)的无线连接、或者到WiFi热点处的互联网的WiFi连接。

在一个实施例中，主题系统配置成例如使用诸如802.11或RF协议或IrDA红外协议的通用标准，经由通信接口与服务器装置无线通信。服务器装置可以是另一便携式装置，诸如智能电话、个人数字助理(PDA)或笔记本计算机。在一些实施例中，服务器装置具有显示器，例如液晶显示器(LCD)，以及输入装置，例如按钮、键盘、鼠标或触摸屏。

在一些实施例中，通信接口配置成使用上述通信协议和/或机制中的一个或更多个来与网络或服务器装置自动地或半自动地传送存储在主题系统中(例如在可选的数据存储单元中)的数据。

输出控制器可以包括针对用于向用户呈现信息的各种已知显示设备中的任一种的控制器，无论是人还是机器，无论是本地的还是远程的。如果显示装置之一提供视觉信息，则该信息通常可以在逻辑上和/或物理上被组织为图像元素阵列。图形用户接口(GUI)控制器可以包括用于在系统与用户之间提供图形输入和输出接口以及用于处理用户输入的各种已知或未来软件程序中的任何软件程序。计算机的功能元件可以经由系统总线彼此通信。在替代实施例中，可以使用网络或其他类型的远程通信来实现这些通信中的一些。根据已知技术，输出管理器还可以例如通过因特网、电话或卫星网络向远程位置处的用户提供由处理模块生成的信息。输出管理器对数据的呈现可根据各种已知技术来实现。作为一些示例，数据可以包括SQL、HTML或XML文档、电子邮件或其他文件、或其他形式的数据。数据可以包括因特网URL地址，使得用户可以从远程源检索附加的SQL、HTML、XML或其他文档或数据。主题系统中存在的一个或更多个平台可以是已知计算机平台中的任何类型或将来开发的类型，尽管它们通常是通常被称为服务器的一类计算机。然而，它们也可以是主机计算机、工作站或其他计算机类型。它们可以通过任何已知或未来类型的电缆或包括无线系统的其他通信系统以联网或其他方式连接。它们可以是共处一地的，或者它们可以是物理上分离的。可能地，取决于所选择的计算机平台的类型和/或构造，可以在任何计算机平台上采用各种操作系统。适当的操作系统包括Windows10、WindowsWindows XP、Windows7、Windows8、iOS、Sun Solaris、Linux、OS/400、Compaq Tru64 Unix、SGI IRIX、SiemensReliant Unix、Ubuntu、Zorin OS等。

在某些实施例中，主题系统包括一个或更多个光学调整部件，所述一个或更多个光学调整部件用于调整诸如照射到样品上的光(例如，来自激光)或从样品收集的光(例如，散射、荧光)之类的光。例如，光学调节可以是增加光的大小、光的焦点或使光准直。在一些情况下，光学调节是放大协议，以便增加光(例如，束斑)的大小，诸如将大小增加5％或更多，诸如增加10％或更多，诸如增加25％或更多，诸如增加50％或更多，并且包括将大小增加75％或更多。在其他实施例中，光学调节包括使光聚焦以便减小光的大小，例如减小5％或更大，例如减小10％或更大，例如减小25％或更大，例如减小50％或更大，并且包括将束斑的大小减小75％或更大。在某些实施例中，光学调整包括使光准直。术语“准直”在其常规意义上用于指代光学地调整光传播的共线性或减少来自传播的共同轴的光的发散。在一些情况下，准直包括使光束的空间横截面变窄(例如，减小激光器的光束轮廓)。

在一些实施例中，光学调整部件为具有0.1至0.95的放大率的聚焦透镜，例如0.2至0.9的放大率，例如0.3至0.85的放大率，例如0.35至0.8的放大率，例如0.5至0.75的放大率，并且包括0.55至0.7的放大率，例如0.6的放大率。例如，在某些情况下，聚焦透镜是具有大约0.6的放大率的双消色差的缩小透镜。聚焦透镜的焦距可以变化，范围为5mm至20mm，例如6mm至19mm，例如7mm至18mm，例如8mm至17mm，例如9mm至16，并且包括范围为10mm至15mm的焦距。在某些实施例中，聚焦透镜具有约13mm的焦距。

在其他实施例中，光学调整部件是准直器。准直器可以是任何方便的准直协议，诸如一个或更多个反射镜或曲面透镜或它们的组合。例如，在某些情况下，准直器是单个准直透镜。在其他情况下，准直器是准直镜。在另外的情况下，准直器包括两个透镜。在另外的其他情况下，准直器包括反射镜和透镜。在准直器包括一个或更多个透镜的情况下，准直透镜的焦距可以变化，范围为5mm至40mm，例如为6mm至37.5mm，例如为7mm至35mm，例如为8mm至32.5mm，例如为9mm至30mm，例如为10mm至27.5mm，例如为12.5mm至25mm，并且包括范围为15mm至20mm的焦距。

在一些实施例中，主题系统包括具有喷嘴孔的流动池喷嘴，所述喷嘴孔配置成使流动流流动通过流动池喷嘴。本发明的流动池喷嘴具有将流体样品传播到样品询问区域的孔口，其中，在一些实施例中，流动池喷嘴包括限定纵向轴线的近侧圆柱形部分和终止于具有横向于纵向轴线的喷嘴孔的平坦表面的远侧截头圆锥形部分。近侧圆柱形部分的长度(如沿纵向轴线测量的)可以变化的范围为1mm至15mm，例如为1.5mm至12.5mm，例如为2mm至10mm，例如为3mm至9mm，并且包括4mm至8mm。远侧截头圆锥形部分的长度(如沿纵向轴线测量的)也可以变化，范围为1mm至10mm，例如为2mm至9mm，例如为3mm至8mm，并且包括4mm至7mm。在一些实施例中，流动池喷嘴室的直径的变化范围可以为1mm至10mm，例如为2mm至9mm，例如为3mm至8mm，并且包括4mm至7mm。

在某些情况下，喷嘴室不包括圆柱形部分，并且整个流动池喷嘴室是截头圆锥形的。在这些实施例中，截头圆锥形喷嘴室的长度(如沿横向于喷嘴孔的纵向轴线所测量的)范围可以为1mm至15mm，例如为1.5mm至12.5mm，例如为2mm至10mm，例如为3mm至9mm，并且包括4mm至8mm。截头圆锥形喷嘴室的近端部分的直径范围可以为1mm至10mm，例如为2mm至9mm，例如为3mm至8mm，并且包括4mm至7mm。

在实施例中，样品流动流从流动池喷嘴的远端处的孔口发出。根据流动流的期望特性，流动池喷嘴孔口可以是任何合适的形状，其中所感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等，曲线横截面形状，例如圆形、椭圆形，以及不规则形状，例如连接到平面顶部的抛物线底部。在某些实施例中，感兴趣的流动池喷嘴具有圆形孔口。在一些实施例中，喷嘴孔口的大小的变化范围可以为1μm至20000μm，例如为2μm至17500μm，例如为5μm至15000μm，例如为10μm至12500μm，例如为15μm至10000μm，例如为25μm至7500μm，例如为50μm至5000μm，例如为75μm至1000μm，例如为100μm至750μm，并且包括150μm至500μm。在某些实施例中，喷嘴孔口为100μm。

在一些实施例中，所述流动池喷嘴包括样品注入端口，样品注入端口被配置向流动池喷嘴提供样品。在实施例中，样品注入系统配置成向流动池喷嘴室提供合适的样品流。取决于流动流的期望特性，通过样品注入端口输送到流动池喷嘴室的样品的速率可以是1μL/sec或更大，例如2μL/sec或更大，例如3μL/sec或更大，例如5μL/sec或更大，例如10μL/sec或更大，例如15μL/sec或更大，例如25μL/sec或更大，例如50μL/sec或更大，例如100μL/sec或更大，例如150μL/sec或更大，例如200μL/sec或更大，例如250μL/sec或更大，例如300μL/sec或更大，例如350μL/sec或更大，例如400μL/sec或更大，例如450μL/sec或更大，并且包括500μL/sec或更大。例如，样品流速的范围可以为1μL/sec至约500μL/sec，例如为2μL/sec至约450μL/sec，例如为3μL/sec至约400μL/sec，例如为4μL/sec至约350μL/sec，例如为5μL/sec至约300μL/sec，例如为6μL/sec至约250μL/sec，例如为7μL/sec至约200μL/sec，例如为8μL/sec至约150μL/sec，例如为9μL/sec至约125μL/sec，并且包括10μL/sec至约100μL/sec。

样品注入端口可以是位于喷嘴室的壁中的孔口，或者可以是位于喷嘴室的近端处的导管。在样品注入端口是定位于喷嘴室的壁中的孔口的情况下，样品注入端口孔口可以是任何合适的形状，其中感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等，曲线横截面形状，例如圆形、椭圆形等，以及不规则形状，例如连接到平面顶部的抛物线形底部。在某些实施例中，样品注入端口具有圆形孔口。样品注入端口孔口的大小可以根据形状而变化，在某些情况下，开口范围为0.1mm至5.0mm、例如为0.2mm至3.0mm、例如为0.5mm至2.5mm、例如为0.75mm至2.25mm、例如为1mm至2mm并且包括1.25mm至1.75mm、例如1.5mm。

在某些情况下，样品注入端口是定位在流动池喷嘴室的近端处的导管。例如，样品注入端口可以是定位成使样品注入端口的孔口与流动池喷嘴孔口成直线的导管。在样品注入端口是与流动池喷嘴孔口呈直线定位的导管的情况下，样品注入管的横截面形状可以是任何合适的形状，其中所感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等，曲线横截面形状，例如圆形、椭圆形，以及不规则形状，例如连接到平面顶部的抛物线底部。导管的孔口可以根据形状而变化，在某些情况下，开口范围为0.1mm至5.0mm，例如为0.2至3.0mm，例如为0.5mm至2.5mm，例如为0.75mm至2.25mm，例如为1mm至2mm，并且包括1.25mm至1.75mm，例如1.5mm。样品注入端口的尖端的形状可以与样品注入管的横截面形状相同或不同。例如，样品注入端口的孔口可以包括斜面尖端，该斜面尖端的斜角范围为1°至10°、诸如为2°至9°、诸如为3°至8°、诸如为4°至7°并且包括5°。

在一些实施例中，流动池喷嘴还包括鞘流体注入端口，所述鞘流体注入端口被配置向流动池喷嘴提供鞘流体。在实施例中，鞘流体注入系统配置成向流动池喷嘴室提供鞘流动流，例如与样品结合以产生围绕样品流动流的鞘流体的层状流动流。取决于流动流的所需特性，输送到流动池喷嘴室的鞘流体的速率可为25μL/sec或更大，例如50μL/sec或更大，例如75μL/sec或更大，例如100μL/sec或更大，例如250μL/sec或更大，例如500μL/sec或更大，例如750μL/sec或更大，例如1000μL/sec或更大，并且包括2500μL/sec或更大。例如，鞘流动流速范围可以为1μL/sec到约500μL/sec，例如为2μL/sec到约450μL/sec，例如为3μL/sec到约400μL/sec，例如为4μL/sec到约350μL/sec，例如为5μL/sec到约300μL/sec，例如为6μL/sec到约250μL/sec，例如为7μL/sec到约200μL/sec，例如为8μL/sec到约150μL/sec，例如为9μL/sec到约125μL/sec，并且包括10μL/sec到约100μL/sec。

在一些实施例中，所述鞘流体注入端口是定位在所述喷嘴室的壁中的孔口。鞘流体注入端口孔可以是任何合适的形状，其中感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等，曲线横截面形状，例如圆形、椭圆形，以及不规则形状，例如连接到平面顶部的抛物线底部。样品注入端口孔口的大小可以根据形状而变化，在某些情况下，开口范围为0.1mm至5.0mm、例如为0.2至3.0mm、例如为0.5mm至2.5mm、例如为0.75mm至2.25mm、例如为1mm至2mm并且包括1.25mm至1.75mm，例如1.5mm。

在某些情况下，主题系统包括与流动池喷嘴孔口流体连通的样品询问区域。在这些情况下，样品流动流从流动池喷嘴的远端处的孔口发出，并且流动流中的颗粒可以在样品询问区域处用光源照射。询问区域的大小可以取决于流量喷嘴的特性而变化，流量喷嘴的特性例如为喷嘴孔口的大小和样品注入端口的大小。在实施例中，询问区域的宽度可以为0.01mm或更大，诸如为0.05mm或更大，诸如为0.1mm或更大，诸如为0.5mm或更大，诸如为1mm或更大，诸如为2mm或更大，诸如为3mm或更大，诸如为5mm或更大，并且包括10mm或更大。询问区域的长度也可以变化，在一些情况下范围为0.01mm或更大，例如0.1mm或更大，例如0.5mm或更大，例如1mm或更大，例如1.5mm或更大，例如2mm或更大，例如3mm或更大，例如5mm或更大，例如10mm或更大，例如15mm或更大，例如20mm或更大，例如25mm或更大，并且包括50mm或更大。

询问区域可配置成促进对发射的流动流的平面横截面的照射或者可配置成促进对预定长度的漫射场(例如，用漫射激光器或灯)的照射。在一些实施例中，询问区域包括促进照射发射的流动流的预定长度的透明窗口，所述发射的流动流的预定长度例如为1mm或更长，例如为2mm或更长，例如为3mm或更长，例如为4mm或更长，例如为5mm或更长并且包括10mm或更长。取决于用于照射发射的流动流的光源(如下文所述)，询问区域可配置成使范围为100nm至1500nm、例如150nm至1400nm、例如200nm至1300nm、例如250nm至1200nm、例如300nm至1100nm、例如350nm至1000nm、例如400nm至900nm且包括500nm至800nm的光通过。因此，询问区域可以由使期望波长范围的光通过的任何透明材料形成，包括但不限于：光学玻璃、硼硅酸盐玻璃、耐热玻璃、紫外石英、红外石英、蓝宝石以及塑料，例如聚碳酸酯、聚氯乙烯(PVC)、聚氨酯、聚醚、聚酰胺、聚酰亚胺，或这些热塑性塑料的共聚物，例如PETG(乙二醇改性聚对苯二甲酸乙二醇酯)，以及其他聚合塑料材料，包括聚酯，其中，感兴趣的聚酯可以包括但不限于聚(对苯二甲酸亚烷基酯)，例如聚(对苯二甲酸乙二醇酯)(PET)、瓶级PET(基于单乙二醇、对苯二甲酸和其他共聚单体例如间苯二甲酸、环己烯二甲醇等制成的共聚物)、聚(对苯二甲酸丁二醇酯)(PBT)和聚(对苯二甲酸己二醇酯)；聚(己二酸亚烷基酯)，如聚(己二酸亚乙酯)、聚(己二酸1，4-亚丁基酯)和聚(己二酸六亚甲基酯)；聚(辛二酸亚烷基酯)如聚(辛二酸亚乙酯)；聚(癸二酸亚烷基酯)，例如聚(癸二酸乙二醇酯)；聚(ε-己内酯)和聚(β-丙内酯)；聚(间苯二甲酸亚烷基酯)如聚(间苯二甲酸乙二醇酯)；聚(2,6-萘-二羧酸亚烷基酯)如聚(2,6-萘-二羧酸乙二醇酯)；聚(亚烷基磺酰基-4,4'-二苯甲酸酯)，例如聚(亚乙基磺酰基-4,4'-二苯甲酸酯)；聚(对苯撑二羧酸亚烷基酯)，例如聚(对苯撑二羧酸亚乙基酯)；聚(反式-1,4-环己烷二基二羧酸亚烷基酯)如聚(反式-1,4-环己烷二基二羧酸亚乙基酯)；聚(二羧酸1,4-环己烷-二亚甲基亚烷基酯)如聚(二羧酸1,4-环己烷-二亚甲基亚乙基酯)；聚([2.2.2]-二环辛烷-1,4-二亚甲基亚烷基二羧酸酯)如聚([2.2.2]-二环辛烷-1,4-二亚甲基亚乙基二羧酸酯)；乳酸聚集体物和共聚物，例如(S)-聚丙交酯、(R,S)-聚丙交酯、聚(四甲基乙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)；和双酚A、3,3'-二甲基双酚A、3,3',5,5'-四氯双酚A、3,3',5,5'-四甲基双酚A的聚碳酸酯；聚酰胺，例如聚(对苯二甲酰对苯二胺)；聚酯，例如聚对苯二甲酸乙二醇酯，例如Mylar^TM聚对苯二甲酸乙二醇酯。在一些实施例中，主题系统包括位于样品询问区域中的反应杯。在实施例中，反应杯可以使范围为100nm至1500nm的光通过，例如为150nm至1400nm，例如为200nm至1300nm，例如为250nm至1200nm，例如为300nm至1100nm，例如为350nm至1000nm，例如为400nm至900nm，并且包括500nm至800nm的光通过。

在一些实施例中，主题系统包括用于分选样品的细胞的颗粒分选部件。在某些情况下，颗粒分选部件是颗粒分选模块，例如在2017年3月28日申请的美国专利公开第2017/0299493号和在2018年10月30日申请的美国临时专利申请第62/752,793号中描述的，其公开内容通过引用并入本文。在某些实施例中，颗粒分选部件包括一个或更多个液滴偏转器，例如在2017年6月14日提交的美国专利公开第2018/0095022号中描述的，其公开内容通过引用并入本文。

在一些实施例中，主题系统是流式细胞术系统。合适的流式细胞术系统可以包括但不限于在Ormerod(编)，Flow Cytometry:A Practical Approach，Oxford Univ出版社(1997)；Jaroszeski等(编辑)，Flow Cytometry Protocols，Methods in MolecularBiology第91期，Humana出版社(1997)；Practical Flow Cytometry，第3版，Wiley-Liss(1995)；Virgo等(2012)Ann Clin Biochem.一月；49(pt 1)：17-28；Linden等，Semin ThromHemost，2004年10月，30(5):502-11；Alison等人，J Pathol，2010年12月；222(4)：335-344；以及Herbig等(2007)Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.24(3)：203-255；其公开内容通过引用并入本文。在某些情况下，感兴趣的流式细胞术系统包括：BD BiosciencesFACSCanto^TM II流式细胞仪、BD Accuri^TM流式细胞仪、BD Biosciences FACSCelesta^TM流式细胞仪、BD Biosciences FACSLyric^TM流式细胞仪、BD Biosciences FACSVerse^TM流式细胞仪、BD Biosciences FACSymphony^TM流式细胞仪、BD Biosciences LSRFortessa^TM流式细胞仪、BD Biosciences LSRFortess^TM X-20流式细胞仪和BD Biosciences FACSCalibure^TM细胞分选仪、BD Biosciences FACSCount^TM细胞分选仪、BD Biosciences FACSLyric^TM细胞分选仪和BD Biosciences Via^TM细胞分选仪、BD Biosciences Influx^TM细胞分选仪、BDBiosciences Jazz^TM细胞分选仪、BD Biosciences Aria^TM细胞分选仪和BD BiosciencesFACSMelody^TM细胞分选仪等。

在一些实施例中，主题颗粒分选系统是流式细胞术系统，例如美国专利第10,006,852、9,952,076、9,933,341、9,784,661、9,726,527、9,453,789、9,200,334、9,097,640、9,095,494、9,092,034、8,975,595、8,753,573、8,233,146、8,140,300、7,544,326、7,201,875、7,129,505、6,821,740、6,813,017、6,809,804、6,372,506、5,700,692、5,643,796、5,627,040、5,620,842、5,602,039号中描述的；其公开内容通过引用并入本文。

在某些情况下，主题系统是流式细胞术系统，其配置成通过使用射频标记发射(FIRE)的荧光成像来对流动流中的颗粒进行成像，例如在Diebold等人的NaturePhotonics的第7(10)卷806-810(2013)中所描述的，以及在美国专利第9,423,353、9,784,661和10,006,852号中以及美国专利公开第2017/0133857和2017/0350803号中描述的，其公开内容通过引用并入本文。

集成电路设备

本公开内容的方面还包括集成电路设备，其经编程以生成流动流中的对象的空间数据并且基于空间数据确定对象是否是聚集体(例如，细胞聚集体)。在某些实施例中，本发明的集成电路设备配置成对对象进行分选。在一些实施例中，感兴趣的集成电路设备包括现场可编程门阵列(FPGA)。在其他实施例中，集成电路设备包括专用集成电路(ASIC)。在其他实施例中，集成电路设备包括复杂可编程逻辑器件(CPLD)。

根据某些实施例的集成电路设备经编程以产生流动流中的对象的空间数据。在一些实施例中，集成电路设备经编程以根据来自光吸收检测器的数据信号(例如明场图像数据)生成空间数据。在其他实施例中，集成电路设备经编程以根据来自光散射检测器的数据信号(例如，前向散射图像数据、侧向散射图像数据)生成空间数据。在又一些其他实施例中，集成电路设备经编程以根据来自光发射检测器的数据信号(例如，荧光标记图像数据)生成空间数据。在再一些其他情况下，集成电路设备经编程以根据检测到的光吸收、检测到的光散射和检测到的荧光中的两个或更多个的组合产生对象的空间数据。

在一些实施例中，集成电路设备经编程以基于空间数据确定对象的大小。在其他实施例中，集成电路设备经编程以基于空间数据确定对象的质心。在其他实施例中，集成电路设备经编程以基于空间数据确定对象的偏心率。在某些实施例中，基于空间数据计算图像矩。在一些情况下，集成电路设备经编程以用于计算所述对象沿水平轴线的一阶图像矩。在其他情况下，集成电路设备经编程以用于计算对象沿水平轴线的二阶图像矩。在又一些情况下，集成电路设备经编程以用于计算所述对象沿垂直轴线的一阶图像矩。在再一些其他情况下，集成电路设备经编程以计算对象沿垂直轴线的二阶图像矩。

在一些实施例中，集成电路设备经编程以根据检测到的光生成流动流中的对象的图像。图像可以根据检测到的光吸收、检测到的光散射、检测到的光发射或其任何组合生成。主题集成电路设备可以经编程以根据检测到的光生成对象的一个或更多个图像。在一些实施例中，根据每种形式的检测光生成单个图像。例如，根据检测到的光吸收生成对象的第一图像；根据检测到的光散射生成对象的第二图像，并且根据检测到的光发射生成对象的第三图像。在其他实施例中，根据每种形式的检测光生成两个或更多个图像，诸如3个或更多个，诸如4个或更多个，诸如5个或更多个，并且包括10个或更多个图像或它们的组合。

在一些实施例中，所述集成电路设备经编程以产生所述对象的图像掩模。在这些实施例中，集成电路设备经编程以根据灰度图像确定像素强度阈值。在一些实施例中，集成电路设备经编程以通过最小化灰度图像的类内方差并计算基于最小化的类内方差(或其中类间方差最大)的像素强度阈值来根据灰度图像确定像素强度阈值。

集成电路设备经编程以将灰度图像中的每个像素与所确定的强度阈值进行比较，并将每个像素转换为二进制像素值。在一些实施例中，集成电路设备经编程以将灰度图像中的沿每个水平行的像素与所确定的强度阈值进行比较。在一些情况下，集成电路设备经编程以将从灰度图像的左侧到灰度图像的右侧的像素与所确定的强度阈值进行比较。在其他情况下，集成电路设备经编程以将从灰度图像的右侧到灰度图像的左侧的像素与所确定的强度阈值进行比较。在其他实施例中，集成电路设备经编程以将沿灰度图像中的每个垂直列的像素与所确定的强度阈值进行比较。在一些情况下，集成电路设备经编程以将沿每一垂直列从灰度图像的顶部到灰度图像的底部的像素与所确定的强度阈值进行比较。在其他情况下，集成电路设备经编程以将沿每一垂直列从灰度图像的底部到灰度图像的顶部的像素与所确定的强度阈值进行比较。

取决于所检测的光的类型，每个像素被分配二进制像素值1或二进制像素值0。在一个示例中，集成电路设备经编程以检测来自流动流的光吸收(例如明场图像数据)，并且灰度图像中的每个像素在像素强度小于强度阈值时被分配二进制像素值1，而在当灰度图像的像素强度大于强度阈值时被分配二进制像素值0。在另一示例中，集成电路设备经编程以检测来自流动流中的对象的光散射，并且灰度图像中的每个像素在像素强度大于强度阈值时被分配二进制像素值1，并且当像素强度小于强度阈值时被分配二进制像素值0。在又一示例中，集成电路设备经编程以检测来自流动流中的对象的荧光，并且灰度图像中的每个像素在像素强度大于强度阈值时被分配二进制像素值1，并且在像素强度小于强度阈值时被分配二进制像素值0。

在主题系统将二进制像素值分配给跨水平行的灰度图像中的每个像素的情况下，在一些实施例中，集成电路设备经编程以确定跨水平行的具有二进制像素值1的第一个像素，并确定水平行中具有二进制像素值1的最后一个像素。在一个示例中，集成电路设备经编程以确定从水平行左侧起具有分配的二进制像素值1的第一个像素，并确定从水平行左侧起具有分配的二进制像素值1的最后一个像素。在又一示例中，集成电路设备经编程以确定从水平行右侧起具有分配的二进制像素值1的第一个像素，并确定从水平行右侧起具有分配的二进制像素值1的最后一个像素。在另一示例中，集成电路设备经编程以确定跨水平行的具有二进制像素值0的第一个像素，并确定水平行中的具有分配的二进制像素值0的最后一个像素。在一个示例中，集成电路设备经经编程以确定从水平行左侧起具有分配的二进制像素值0的第一个像素，并确定从水平行左侧起具有分配的二进制像素值0的最后一个像素。在另一示例中，集成电路设备经编程以确定从水平行的右侧起具有分配的二进制像素值0的第一个像素，并确定从水平行的右侧起具有分配的二进制像素值0的最后一个像素。

在将二进制像素值分配给沿垂直列的灰度图像中的每个像素的情况下，在一些实施例中，该集成电路设备经编程以确定沿垂直列的具有二进制像素值1的第一个像素，并确定沿垂直列的具有二进制像素值1的最后一个像素。在一个示例中，该集成电路设备经编程以确定从垂直列的顶部起具有分配的二进制像素值1的第一个像素，并确定从垂直列的顶部起具有分配的二进制像素值1的最后一个像素。在又一示例中，该集成电路设备经编程以确定从垂直列的底部起具有分配的二进制像素值1的第一个像素，并确定从垂直列的底部起具有分配的二进制像素值1的最后一个像素。在其他实施例中，该集成电路设备经编程以确定沿垂直列的具有二进制像素值0的第一个像素，并确定垂直列中的具有分配的二进制像素值0的最后一个像素。在一个示例中，该集成电路设备经编程以确定从垂直列的顶部起具有分配的二进制像素值0的第一个像素，并确定从垂直列的顶部起具有分配的二进制像素值0的最后一个像素。在又一个示例中，该集成电路设备经编程以确定从垂直列的底部起具有分配的二进制像素值0的第一个像素，并且确定从垂直列的底部起具有分配的二进制像素值0的最后一个像素。

在一些实施例中，集成电路设备经编程以基于所计算的图像矩和所产生的图像来确定对象的一或多个特性。例如，集成电路设备经编程以基于计算的图像距和生成的对象的图像(例如，图像或图像掩模)来确定细胞的大小、细胞的质心或细胞的偏心率。在这些实施例中，集成电路设备经编程以计算一个或更多个图像距，然后使用计算的图像距和对象的图像二者来确定细胞的特性。

在一些情况下，可以根据图像矩和所生成的对象的图像来计算质心。例如，集成电路设备可经编程以根据下式、根据计算的图像矩和生成的图像来确定对象的质心：

在其他情况下，可以根据图像矩和所生成的对象的图像来计算对象的取向。例如，集成电路设备经编程以根据下式、根据计算的图像距和生成的图像来确定对象的取向：

在又一些情况下，可以根据图像矩和所生成的对象的图像来计算对象的偏心率。例如，集成电路设备经编程以根据下式、根据计算的图像矩和生成的图像来确定对象的偏心率：

在某些实施例中，集成电路设备经编程以评估以下各项中的一项或更多项：1)所计算的对象的大小；2)对象的质心；以及3)对象的偏心率，并识别对象是颗粒的聚集体(例如，细胞聚集体)还是单个颗粒(例如，单细胞)。在一些情况下，集成电路设备经编程以基于所计算的对象的大小来确定对象是聚集体。在其他情况下，集成电路设备经编程以基于所计算的对象的质心来确定对象是聚集体。在其他情况下，集成电路设备经编程以基于所计算的对象的偏心率来确定对象是聚集体。

在某些情况下，所述集成电路设备经编程以进行：1)基于所计算的图像矩和空间数据来评估所述对象的一种或更多种属性；以及2)评估来自流动流的询问区域中的对象的光散射检测器输出信号。在一些实施例中，集成电路设备经编程以评估来自前向散射光检测器的输出信号。在其他实施例中，集成电路设备经编程以评估来自侧向散射光检测器的输出信号。在某些实施例中，集成电路设备经编程以针对脉冲宽度、脉冲高度和脉冲面积中的一个或更多个来评估光散射检测器输出信号。

在某些情况下，所述集成电路设备经编程以进行：1)基于所计算的图像距和所生成的图像来评估所述对象的一种或更多种属性；以及2)评估来自流动流的询问区域中的对象的光散射检测器输出信号。在这些实施例中，光散射检测器输出信号可以是前向光散射检测器输出或侧向光散射检测器输出或它们的组合。在实施例中，光散射检测器输出信号可以是信号脉冲宽度、信号脉冲高度和信号脉冲面积或它们的组合。在一个示例中，集成电路设备经编程以基于计算的图像距和生成的图像来评估对象的一种或更多种属性(大小、质心、偏心率)，并且评估光散射检测器输出信号的脉冲宽度。在另一示例中，集成电路设备经编程以基于计算的图像距和生成的图像评估对象的一种或更多种属性(大小、质心、偏心率)，并且评估光散射检测器输出信号的脉冲高度。在又一示例中，集成电路设备经编程以基于计算的图像距和生成的图像评估对象的一种或更多种属性(大小、质心、偏心率)，并且评估光散射检测器输出信号的脉冲面积。

在某些实施例中，所述集成电路设备经编程以进行：1)评估光散射检测器输出信号的脉冲宽度、脉冲高度和脉冲面积中的每一个，接着是2)基于所计算的图像矩和空间数据来评估对象的一种或更多种属性(大小、质心、偏心率)。在这些实施例中，可从侧向散射检测器和前向散射检测器中的一个或更多个收集光散射检测器输出信号。在一些情况下，从侧向散射检测器收集根据这些实施例使用的光散射检测器输出信号。在其他情况下，从前向散射检测器收集所使用的光散射检测器输出信号。在又一些情况下，从侧向散射检测器和前向散射检测器收集所使用的光散射检测器输出信号。

在某些实施例中，所述集成电路设备经编程以进行：1)评估光散射检测器输出信号的脉冲宽度、脉冲高度和脉冲面积中的每一个，接着是2)基于所计算的图像距和所生成的图像来评估对象的一种或更多种属性(大小、质心、偏心率)。在这些实施例中，可以从侧向散射检测器和前向散射检测器中的一个或更多个收集光散射检测器输出信号。在一些情况下，从侧向散射检测器收集根据这些实施例使用的光散射检测器输出信号。在其他情况下，从前向散射检测器收集所使用的光散射检测器输出信号。在又一些情况下，从侧向散射检测器和前向散射检测器收集所使用的光散射检测器输出信号。

在一些情况下，集成电路设备经编程以确定对象是其中两个或更多个细胞跨流动流的水平轴线对齐在一起的水平细胞聚集体，两个或更多个细胞诸如是3个或更多个细胞，诸如4个或更多个细胞并且包括5个或更多个细胞。在其他情况下，集成电路设备经编程以确定对象是其中两个或更多个细胞沿流动流的垂直轴线(即，纵向轴线)对齐在一起的垂直细胞聚集体，两个或更多个细胞例如是3个或更多个细胞，例如4个或更多个细胞且包括5个或更多个细胞。在又一些情况下，集成电路设备经编程以确定对象是组合细胞集合体，该组合细胞集合体具有跨水平轴线对齐在一起的两个或更多个细胞以及具有沿垂直轴线对齐在一起的两个或更多个细胞。

在一些实施例中，集成电路设备经编程以根据流动流中的对象的频率编码的数据来计算空间数据。在这些实施例中，集成电路设备经编程以通过执行频率编码的数据的变换来计算空间数据。在一个示例中，通过对频率编码的数据执行傅里叶变换(FT)来计算空间数据。在另一示例中，通过对频率编码的数据执行离散傅里叶变换(DFT)来计算空间数据。在又一示例中，通过对频率编码的数据执行短时傅立叶变换(STFT)来计算空间数据。在再一示例中，用数字锁定放大器计算空间数据以对频率编码的数据进行外差和解复用。

在某些实施例中，集成电路设备经编程以基于所产生的图像或基于所计算的参数(例如，质心、偏心率等)而做出分选决策(如上文所描述)。在这些实施例中，分析包括对颗粒进行分类和计数，使得每个颗粒作为一组数字化参数值存在。主题集成电路设备可以经编程以基于选定的参数触发分选部件，以便将感兴趣的颗粒与背景和噪声区分开。

·套件

本公开内容的方面还包括套件，其中套件包括本文所述的集成电路设备中的一个或更多个。在一些实施例中，套件还可以包括诸如以计算机可读介质(例如，闪存驱动器、USB存储装置、光盘、DVD、蓝光盘等)或者用于从互联网web协议或云服务器下载编程的说明书的形式的用于主题系统的编程。套件还可以包括用于实施主题方法的说明书。这些说明书可以以多种形式存在于本发明的套件中，其中的一种或多种可以存在于套件中。这些说明书可以存在的一种形式是作为印刷信息印刷在合适的介质或基质上，例如在套件的包装中、在包装插页等中其上印刷有信息的一张纸或多张纸。这些说明书的又一种形式是其上记录了信息的计算机可读介质，例如磁盘、光盘(CD)、便携式闪存驱动器等。这些说明书可能存在的又一种形式是可以用于经由因特网以访问在移除的站点处的信息的网站地址。

·实用性

主题系统、方法和计算机系统可用于需要分析和分选流体介质中的样品(例如生物样品)中的颗粒组分的各种应用中。在一些实施例中，本文所述的系统和方法可用于用荧光标记物标记的生物样品的流式细胞术表征。在其他实施例中，所述系统和方法可用于发射光的光谱学。此外，主题系统和方法可用于增加从(例如流动流中的)样品收集的光的可获得的信号。在某些情况下，本公开内容用于增强对从流式细胞仪中的流动流中被照射的样品所收集的光的测量。本公开内容的实施例被用于需要提供在细胞分选期间具有提高的细胞分选精度、增强的颗粒收集、颗粒充电效率、更精确的颗粒充电和增强的颗粒偏转的一种流式细胞仪的情况。

还发现本公开内容的实施例可用于其中从生物样品制备的细胞可能需要用于研究、实验室测试或用于治疗的应用。在一些实施例中，本发明方法和装置可以有利于获得从目标流体或组织生物样品制备的单细胞。例如，本发明的方法和系统便于从流体或组织样品中获得细胞，以用作对疾病(如癌症)的研究或诊断的样品。同样，本发明方法和系统可以有利于从流体或组织样品中获得细胞以用于治疗。本公开内容的方法和装置允许以与传统流式细胞术系统相比增强的效率和低的成本从生物样品(例如，器官、组织碎片、流体)分离和收集细胞。

尽管有所附权利要求，本公开内容还受到以下条款限定：

1.一种用于确定流动流中的对象是否为细胞聚集体的方法，该方法包括：

检测来自流动流中包括细胞的样品的光；

生成询问区域中的流动流中的对象的空间数据，以获得该对象的空间数据；以及

基于该空间数据确定流动流中的对象是否为细胞聚集体。

2.根据条款1所述的方法，其中，检测来自流动流中的样品的光包括检测来自流动流中的样品的光散射。

3.根据条款2所述的方法，其中，该方法包括检测来自流动流中的样品的前向散射光。

4.根据条款2所述的方法，其中，该方法包括检测来自流动流中的样品的侧向散射光。

5.根据条款1至4中任一项所述的方法，还包括基于空间数据确定对象的大小。

6.根据条款1至5中任一项所述的方法，还包括基于空间数据确定对象的质心。

7.根据条款1至6中任一项所述的方法，还包括基于空间数据确定对象的偏心率。

8.根据条款1至7中任一项所述的方法，还包括基于空间数据计算对象的图像矩。

9.根据条款8所述的方法，其中，该方法包括计算对象沿水平轴线的一阶图像矩。

10.根据条款8所述的方法，其中，该方法包括计算对象沿水平轴线的二阶图像矩。

11.根据条款8所述的方法，其中，该方法包括计算对象沿垂直轴线的一阶图像矩。

12.根据条款8所述的方法，其中，该方法包括计算对象沿垂直轴线的二阶图像矩。

13.根据条款1至12中任一项所述的方法，还包括根据空间数据生成对象的图像。

14.根据条款12所述的方法，其中，生成询问区域中的对象的图像包括生成对象的图像掩模。

15.根据条款14所述的方法，其中，生成图像掩模包括：

生成流动流中的对象的灰度图像；

根据灰度图像确定像素强度阈值；

将来自灰度图像的每个像素与所确定的阈值进行比较；以及

将每个像素转换成二进制像素值。

16.根据条款15所述的方法，其中，图像掩模包括具有像素值1的像素。

17.根据条款15至16中任一项所述的方法，还包括基于所生成的图像掩模来确定对象的大小。

18.根据条款15至16中任一项所述的方法，还包括基于所生成的图像掩模确定对象的质心。

19.根据条款15至16中任一项所述的方法，还包括基于所生成的图像掩模来确定对象的偏心率。

20.根据条款1至19中任一项所述的方法，其中，该方法包括确定对象是单细胞。

21.根据条款1至19中任一项所述的方法，其中，该方法包括确定对象是包括两个或更多个细胞的细胞聚集体。

22.根据条款21所述的方法，还包括确定细胞聚集体包括沿流动流的纵向轴线对齐在一起的两个或更多个细胞。

23.根据条款21所述的方法，还包括确定细胞聚集体包括沿流动流的水平轴线对齐在一起的两个或更多个细胞。

24.根据条款1至23中任一项所述的方法，还包括用光源照射流动流。

25.根据条款24所述的方法，其中，用200nm至800nm的波长的光源照射流动流。

26.根据条款1至25中任一项所述的方法，其中，该方法包括生成频率编码的图像。

27.根据条款26所述的方法，其中，生成频率编码的图像包括利用第一频移光束和第二频移光束照射流动流。

28.根据条款27所述的方法，其中，第一频移光束包括本地振荡器(LO)光束，并且第二频移光束包括射频梳状光束。

29.根据条款27至28中任一项所述的方法，还包括：

将射频驱动信号施加到声光装置；以及

用激光器照射该声光装置以产生第一频移光束和第二频移光束。

30.根据条款26至29中任一项所述的方法，其中，方法包括根据来自对象的频率编码的荧光数据计算空间数据。

31.根据条款30所述的方法，还包括通过执行频率编码的荧光数据的变换来计算对象的空间数据。

32.根据条款31所述的方法，其中，通过对频率编码的荧光数据执行傅里叶变换(FT)来计算空间数据。

33.根据条款31所述的方法，其中，通过对频率编码的荧光数据执行离散傅里叶变换(DFT)来计算空间数据。

34.根据条款30所述的方法，其中，通过对频率编码的荧光数据执行短时傅里叶变换(STFT)来计算空间数据。

35.根据条款30所述的方法，其中，利用数字锁定放大器计算空间数据以对频率编码的荧光数据进行外差和解复用。

36.根据条款1至29中任一项的方法，还包括对对象进行分选。

37.一种系统，包括：

光源，其配置成照射流动流中包括细胞的样品；

一种光检测系统，包括光检测器；以及

处理器，其包括可操作地耦合到该处理器的存储器，其中，该存储器包括存储于其上的指令，所述指令在由处理器执行时使该处理器：

生成询问区域中流动流中的对象的空间数据以产生对象的空间数据；以及

基于该空间数据确定该流动流中的对象是否为细胞聚集体。

38.根据条款37所述的系统，其中，光检测系统包括配置成检测来自流动流中的样品的光散射的光检测器。

39.根据条款38所述的系统，其中，光检测器配置成检测来自流动流中的样品的前向散射光。

40.根据条款38所述的系统，其中，光检测器配置成检测来自流动流中的样品的侧向散射光。

41.根据条款37至40中任一项所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使处理器基于空间数据确定对象的大小。

42.根据条款37至41中任一项所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使处理器基于空间数据确定对象的质心。

43.根据条款37至42中任一项所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使处理器基于空间数据确定对象的偏心率。

44.根据条款37至43中任一项所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使处理器基于空间数据计算对象的图像矩。

45.根据条款44所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使处理器计算对象沿水平轴线的一阶图像矩。

46.根据条款44所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使处理器计算对象沿水平轴线的二阶图像矩。

47.根据条款44所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使处理器计算对象沿垂直轴线的一阶图像矩。

48.根据条款44所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使处理器计算对象沿垂直轴线的二阶图像矩。

49.根据条款37至48中任一项所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使处理器根据空间数据生成对象的图像。

50.根据条款49所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使处理器生成对象的图像掩模。

51.根据条款50所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使处理器：

生成流动流中的对象的灰度图像；

根据所述灰度图像确定像素强度阈值；

将来自灰度图像的每个像素与所确定的阈值进行比较；以及

将每个像素转换成二进制像素值。

52.根据条款51所述的系统，其中，图像掩模包括具有像素值1的像素。

53.根据条款51至52中任一项所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使处理器基于生成的图像掩模确定对象的大小。

54.根据条款51至52中任一项所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使处理器基于生成的图像掩模确定对象的质心。

55.根据条款41至42中任一项所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使处理器基于生成的图像掩模确定对象的偏心率。

56.根据条款37至55中任一项所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使处理器确定对象是单细胞。

57.根据条款37至55中任一项所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使处理器确定对象是包括两个或更多个细胞的细胞聚集体。

58.根据条款57所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使处理器确定细胞聚集体包括沿流动流的纵向轴线对齐在一起的两个或更多个细胞。

59.根据条款57所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使处理器确定细胞聚集体包括沿流动流的水平轴线对齐在一起的两个或更多个细胞。

60.根据条款37至59中任一项所述的系统，包括集成电路部件，该集成电路部件经编程以生成以下各项中的一个或更多个：

流动流中对象的空间数据；

流动流中的对象的图像；或

对象的图像掩模。

61.根据条款60所述的系统，其中，集成电路部件包括现场可编程门阵列(FPGA)。

62.根据条款60所述的系统，其中，集成电路部件包括专用集成电路(ASIC)。

63.根据条款60所述的系统，其中，集成电路部件包括复杂可编程逻辑器件(CPLD)。

64.根据条款37至63中任一项所述的系统，其中，光源包括配置成至少生成第一频移光束和第二频移光束的光束发生器部件。

65.根据条款64的系统，其中，光束发生器包括声光偏转器。

66.根据条款64至65中任一项所述的系统，其中，光束发生器包括直接数字合成器(DDS)RF梳状发生器。

67.根据条款64至66中任一项所述的系统，其中，光束发生器部件配置成产生频移的本地振荡器光束。

68.根据条款64至67中任一项所述的系统，其中，光束生成器部件配置成生成多个频移梳状光束。

69.根据条款64至68中任一项所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使处理器生成频率编码的图像。

70.根据条款69所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使该处理器根据来自对象的频率编码的荧光数据生成频率编码的图像。

71.根据条款70所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使该处理器执行频率编码的荧光数据的变换以计算对象的空间数据。

72.根据条款71所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使该处理器执行频率编码的荧光数据的傅里叶变换以计算对象的空间数据。

73.根据条款72所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使该处理器执行频率编码的荧光数据的离散傅里叶变换以计算对象的空间数据。

74.根据条款72所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使该处理器执行频率编码的荧光数据的短时傅里叶变换以计算对象的空间数据。

75.根据条款72所述的系统，其中，存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使该处理器利用用于计算对象的空间数据的数字锁定放大器对频率编码的荧光数据进行外差和解复用。

76.根据条款37至75中任一项所述的系统，其中，光源包括激光器。

77.根据条款76所述的系统，其中，激光器是连续波激光器。

78.根据条款37至77中任一项所述的系统，其中系统是流式细胞仪。

79.根据条款37至78中任一项所述的系统，其还包括细胞分选器。

80.根据条款79所述的系统，其中，细胞分选器包括液滴偏转器。

81.根据条款37至80中任一项所述的系统，其中，系统还包括：

包括孔口的流动池喷嘴；以及

样品询问区域，其与流动池喷嘴孔口流体连通以利用光源照射流动流中的样品。

82.根据条款81所述的系统，还包括定位在样品询问区域中的反应杯。

83.一种集成电路，经编程以进行：

生成询问区域中的流动流中的对象的空间数据以产生该对象的空间数据；以及

基于空间数据确定流动流中的对象是否为细胞聚集体。

84.根据条款83所述的集成电路，其中，集成电路经编程以基于空间数据确定对象的大小。

85.根据条款83至84中任一项所述的集成电路，其中，集成电路经编程以基于空间数据确定对象的质心。

86.根据条款83至85中任一项所述的集成电路，其中，集成电路经编程以基于空间数据确定对象的偏心率。

87.根据条款83至86中任一项所述的集成电路，其中，集成电路经编程以基于空间数据计算对象的图像距。

88.根据条款87所述的集成电路，其中，集成电路经编程以计算对象沿水平轴线的一阶图像矩。

89.根据条款87所述的集成电路，其中，集成电路经编程以计算对象沿水平轴线的二阶图像矩。

90.根据条款87所述的集成电路，其中，集成电路经编程以计算对象沿垂直轴线的一阶图像矩。

91.根据条款87所述的集成电路，其中，集成电路经编程以计算对象沿垂直轴线的二阶图像矩。

92.根据条款83至91中任一项所述的集成电路，其中，集成电路经编程以根据空间数据生成对象的图像。

93.根据条款83至92中任一项所述的集成电路，其中，集成电路经编程以生成对象的图像掩模。

94.根据条款93所述的集成电路，其中，集成电路经编程以进行：

生成流动流中的对象的灰度图像；

根据灰度图像确定像素强度阈值；

将来自所述灰度图像的每个像素与所确定的阈值进行比较；以及

将每个像素转换成二进制像素值。

95.根据条款94所述的集成电路，其中，集成电路经编程以向像素强度大于阈值的灰度图像的每个像素分配像素值1，并且向像素强度小于阈值的灰度图像的每个像素分配像素值0。

96.根据条款93至95中任一项所述的集成电路，其中，集成电路经编程以基于所生成的图像掩模来确定对象的大小。

97.根据条款93至95中任一项所述的集成电路，其中集成电路经编程以基于生成的图像掩模确定对象的质心。

98.根据条款93至95中任一项所述的集成电路，其中集成电路经编程以基于生成的图像掩模确定对象的偏心率。

99.根据条款83至98中任一项所述的集成电路，其中，集成电路经编程以确定对象是单细胞。

100.根据条款83至98中任一项所述的集成电路，其中，所述集成电路经编程以确定对象是包括两个或更多个细胞的细胞聚集体。

101.根据条款100所述的集成电路，其中，集成电路经编程以确定细胞聚集体包括沿流动流的纵向轴线对齐在一起的两个或者更多个细胞。

102.根据条款100所述的集成电路，其中，集成电路经编程以确定细胞聚集体包括沿流动流的水平轴线对齐在一起的两个或者更多个细胞。

103.根据条款83至102中任一项所述的集成电路，其中，该集成电路是现场可编程门阵列(FPGA)。

104.根据条款83至102中任一项所述的集成电路，其中，该集成电路是专用集成电路(ASIC)。

105.根据条款83至102中任一项所述的集成电路，其中，该集成电路是复杂可编程逻辑器件(CPLD)。

106.根据条款83至105中任一项所述的集成电路，其中，集成电路经编程以根据来自对象的频率编码的荧光数据生成空间数据。

107.根据条款106所述的集成电路，其中，集成电路经编程以执行频率编码的荧光数据的变换来计算对象的空间数据。

108.根据条款106所述的集成电路，其中，集成电路经编程以执行频率编码的荧光数据的傅里叶变换来计算对象的空间数据。

109.根据条款106所述的集成电路，其中，集成电路经编程以执行频率编码的荧光数据的离散傅里叶变换来计算对象的空间数据。

110.根据条款106所述的集成电路，其中，集成电路经编程以执行频率编码的荧光数据的短时傅里叶变换来计算对象的空间数据。

111.根据条款106所述的集成电路，其中，集成电路经编程以利用用于计算对象的空间数据的数字锁定放大器对频率编码的荧光数据进行外差和解复用。

112.根据条款106至111中任一项所述的集成电路，其中集成电路经编程以根据频率编码的荧光数据生成对象的频率编码的图像。

尽管为了清楚理解的目的，已经通过说明和实施例的方式相当详细地描述了前述发明，但是根据本发明的教导，本领域普通技术人员容易理解的是，在不背离所附权利要求的精神或范围的情况下，可以对其进行某些改变和修改。

因此，前面仅仅说明了本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够设计出各种布置，尽管本文没有明确描述或示出，但是这些布置体现了本发明的原理并且包括在本发明的精神和范围内。此外，本文中引用的所有示例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理以及发明人为了促进本领域而贡献的概念，并且应被解释为不限于这些具体引用的示例和条件。此外，本文中叙述本发明的原理、方面和实施例以及其具体示例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等同物两者。另外，这样的等同物旨在包括当前已知的等同物和将来开发的等同物，即，不管结构如何，所开发的任何元件都执行相同功能。此外，无论权利要求中是否明确地引用本文所公开的内容，此类公开都不是旨在专供公众使用的。

因此，本发明的范围不旨在限制于本文示出和描述的示例性实施例。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求来体现。在权利要求中，35 U.S.C.§112(f)或35 U.S.C.§112(6)被明确地定义为仅当在权利要求中的此类限制的开始处引用确切短语"用于…的手段"或确切短语"用于…的步骤"时才被援引以用于权利要求中的限制；如果在权利要求的限制中没有使用此类确切短语，则35 U.S.C.§112(f)或35 U.S.C.§112(6)不被引用。