一种调节fgfr1活性的抗体及其应用
阅读说明：本技术 一种调节fgfr1活性的抗体及其应用 (Antibody for regulating FGFR1 activity and application thereof ) 是由 陈林 谭乔燕 谢杨丽 陈涵纲 杜晓兰 李芳芳 王祖强 李卓恒 彭秀琴 于 2019-11-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种调节FGFR1活性的抗体及其应用,其具有分子量小、制备简单、质量可控、免疫原性低等优点,该抗体能够与FGFR1特异性结合,且不与FGFR2和FGFR3结合；通过培养人股骨头全层软骨组织发现,该抗体可显著抑制炎症环境中关节软骨细胞基质降解酶的表达。本发明通过建立小鼠膝关节炎模型并关节腔注射抗体发现,该抗体可以延缓DMM模型小鼠的关节炎进程,提示其在制备缓解或治疗骨性关节炎药物中具有良好的应用价值。且该抗体具有靶点明确、特异性强,不易降解等优点,可制备缓解或治疗骨性关节炎药物,有着良好的潜在应用价值。(The invention relates to an antibody for regulating FGFR1 activity and application thereof, wherein the antibody has the advantages of small molecular weight, simple preparation, controllable quality, low immunogenicity and the like, can be specifically combined with FGFR1, and is not combined with FGFR2 and FGFR 3; the antibody can obviously inhibit the expression of articular chondrocyte matrix degrading enzyme in inflammatory environment by culturing the full-thickness cartilage tissue of the human femoral head. According to the invention, the antibody can delay the arthritis process of a DMM model mouse by establishing a mouse gonarthritis model and injecting the antibody into the joint cavity, and the antibody has good application value in preparing a medicine for relieving or treating osteoarthritis. The antibody has the advantages of definite target spot, strong specificity, difficult degradation and the like, can be used for preparing a medicine for relieving or treating osteoarthritis, and has good potential application value.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种调节FGFR1活性的抗体及其应用。
背景技术
骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)为关节慢性进行性病变，多累及负重关节(膝、足、髋关节、腰椎关节等)，主要病理变化为关节软骨退化、变性和继发的骨质增生、骨化，常表现为关节疼痛、活动功能障碍。由于我国正在步入老龄化社会，OA的发病率出现逐年上升的趋势，2015年我国超过1.5亿患者，并将继续增加。国务院办公厅最近印发的《中国防治慢性病中长期规划(2017—2025年)》明确指出，骨骼相关疾病已经成为严重威胁我国居民健康的慢性病之一，是影响国家经济、社会发展的重大公共卫生问题。然而，由于发病机制复杂，除了药物治疗、物理治疗缓解疼痛及最后的全关节置换等手术治疗外，目前尚无可阻止进展和治疗OA安全有效的药物和措施。因此，深入探索OA发生的机制，寻找和开发有效防治OA的药物和措施是我国当前健康领域重大的战略需求。
目前药物靶点的筛选主要集中在细胞膜受体和代谢相关的酶类，如IL-1受体、***素E2合酶(PGES)、TNF-α、Bmp7等。成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast growthfactor receptors,FGFRs)属于酪氨酸激酶家族成员之一，具有自身酪氨酸磷酸化活性，与其相应配体成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factors,FGFs)结合，调节机体多种生理、病理过程，如血管生成、组织器官发育、稳态维持及损伤修复等。目前已发现4种FGFR，即FGFR1-4，同源性达到55～72％。关节软骨细胞中FGFs受体1和3显著表达，且与FGF2有较高亲和力，FGFR1优先被FGF2激活，通过FGFR1-Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2轴促进软骨细胞尤其是纤维软骨的生成，改变新合成II型胶原和Ι型胶原的比值。在OA软骨细胞中，FGFR3表达降低，FGFR1/FGFR3的表达比率升高。研究小组前期利用他莫昔芬可诱导关节软骨特异性敲除FGFR1小鼠模型，通过分析3种关节炎模型(衰老模型、抗原诱导的关节炎模型(Antigen-induced Arthritis，AIA)、和内侧半月板不稳定模型(Destabilization of the MedialMeniscus，DMM))的关节软骨基质丢失及关节软骨退变，结果显示关节软骨细胞敲除FGFR1能够延缓衰老、AIA模型导致的关节软骨基质蛋白多糖的丢失，并减轻DMM模型导致的关节软骨退变。FGFR3表达升高、MMP13表达下降可能是FGFR1敲除保护关节软骨的潜在机制。上述研究结果提示靶向抑制FGFR1可能是缓解或治疗关节软骨损伤和退变的新策略。因此，以FGFR1为干预靶点，筛选特异结合FGFR1，但不结合FGFR2和FGFR3的抗体，研究其在缓解或治疗骨性关节炎疾病中的功能，是一种可行的思路。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种特异调节FGFR1活性的抗体及其应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种调节FGFR1活性的抗体，氨基酸序列为ANKTVALGSN，如SEQ ID NO.1所示。
2、上述一种调节FGFR1活性的抗体在制备缓解或治疗骨性关节炎药物中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的一种调节FGFR1(成纤维细胞生长因子受体1)活性的抗体，其具有分子量小、制备简单、质量可控、免疫原性低等优点，该抗体能够与FGFR1特异性结合，且不与FGFR2和FGFR3结合；通过培养人股骨头全层软骨组织发现，该抗体可显著抑制炎症环境中关节软骨细胞基质降解酶的表达。本发明通过建立小鼠膝关节炎模型并注射抗体发现，该抗体可以延缓DMM模型小鼠的关节炎进程，提示其在制备缓解或治疗骨性关节炎药物中具有良好的应用价值。且该抗体具有靶点明确、特异性强，不易降解等优点，可制备缓解或治疗骨性关节炎药物，有着良好的潜在应用价值。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为目标蛋白的总体指标表位分析。
图2为人关节软骨标本番红-O染色及免疫组织化学染色。
图3为DMM术后8周及12周小鼠膝关节标本藏红-固绿染色及OARSI软骨退变评分。
图4为DMM术后8周小鼠膝关节免疫组织化学染色。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
优选实施例中使用的健康人股骨头取自交通伤股骨头置换病人，经中国人民解放军陆军特色医学中心伦理委员会批准，严格按照《涉及人的生物医学研究国际伦理准则》进行相关实验。ITSTM购自美国Sigma公司，IL-1β购自美国Proteintech公司，戊巴比妥钠购自上海生物工程有限公司，anti-Col II一抗购自美国Abcam公司，anti-ColX一抗购自美国Abcam公司，anti-MMP13一抗购自美国Proteintech公司，anti-Aggrecan一抗购自美国Millipore公司，抗体稀释液购自碧云天生物公司，二甲苯购自重庆煌辉生物化学试剂有限公司，HRP标记的羊抗兔二抗、HRP标记的羊抗小鼠二抗、山羊抗鼠IgG免疫组化试剂盒、山羊抗兔IgG免疫组化试剂盒和DAB显色液均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，番红-O和快绿均购自美国Sigma公司。C57小鼠(8w，雄性，25～30g)购自北京华阜康生物技术有限公司，并饲养在中国人民解放军陆军特色医学中心SPF级动物中心，经实验动物管理委员会许可进行相关实验。
试剂配制：
培养细胞用改良型1×DPBS：称量D-PBS(Gibco)7.68g，去离子水定容至800ml，高压灭菌后4℃储存。
组织用普通1×PBS：去离子水溶解PBS粉剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)1袋，定容至2000ml，磁力搅拌溶解，常温储存。
4％多聚甲醛(PFA)固定液：称量多聚甲醛粉剂(上海生物工程有限公司)40g，1×PBS溶解至900ml，加入适量NaOH粉剂，磁力搅拌加热溶解，调整pH为7.2～7.4，定容于1000ml，4℃储存。
20％快速脱钙液：称量柠檬酸三钠(上海生物工程有限公司)200g，溶于250ml无水甲酸(重庆煌辉生物化学试剂有限公司)，定容至1000ml，常温储存。
实施例一、SEAL(Surface Epitope Antibody Library)技术制备FGFR1特异结合抗体
设计要求：
1.蛋白名：FGFR1
2.物种：Musculus
3.需求抗体类型：Monoclonal
4.蛋白序列：针对以下区域进行设计：158-246，255-357
MWGWKCLLFWAVLVTATLCT ARPAPTLPEQAQPWGVPVEV ESLLVHPGDLLQLRCRLRDDVQSINWLRDGVQLVESNRTR ITGEEVEVRDSIPADSGLYA CVTSSPSGSDTTYFSVNVSDALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPNRRPVAPYWTSPEK MEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPNPTLRWLKNGKEFKPDHRIGGYKVRYATWSIIMDSV VPSDKGNYTCIVENEYGSINHTYQLDVVERSPHRPILQAGLPANKTVALGSNVEFMCKVY SDPQPHIQWLKHIEVNGSKIGPDNLPYVQILKTAGVNTTDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYT CLAGNSIGLSHHSAWLTVLEALEERPAVMTSPLYLEIIIYCTGAFLISCMLGSVIIYKMK SGTKKSDFHSQMAVHKLAKSIPLRRQVTVSADSSASMNSGVLLVRPSRLSSSGTPMLAGV SEYELPEDPRWELPRDRLVLGKPLGEGCFGQVVLAEAIGLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDA TEKDLSDLISEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYASKGNLREYLQARRPPG LEYCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIA DFGLARDIHHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRIYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSP YPGVPVEELFKLLKEGHRMDKPSNCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVAL TSNQEYLDLSIPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHPTQLANSGLK RR
5.制备的抗体能同时识别以下蛋白：
FGFR1_Human
MWSWKCLLFWAVLVTATLCT ARPSPTLPEQAQPWGAPVEV ESFLVHPGDLLQLRCRLRDDVQSINWLRDGVQLAESNRTR ITGEEVEVQDSVPADSGLYA CVTSSPSGSDTTYFSVNVSDALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPNRMPVAPYWTSPEK MEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPNPTLRWLKNGKEFKPDHRIGGYKVRYATWSIIMDSV VPSDKGNYTCIVENEYGSINHTYQLDVVERSPHRPILQAGLPANKTVALGSNVEFMCKVY SDPQPHIQWLKHIEVNGSKIGPDNLPYVQILKTAGVNTTDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYT CLAGNSIGLSHHSAWLTVLEALEERPAVMTSPLYLEIIIYCTGAFLISCMVGSVIVYKMK SGTKKSDFHSQMAVHKLAKSIPLRRQVSADSSASMNSGVLLVRPSRLSSSGTPMLAGVSE YELPEDPRWELPRDRLVLGKPLGEGCFGQVVLAEAIGLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDATE KDLSDLISEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYASKGNLREYLQARRPPGLE YCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADF GLARDIHHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRIYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYP GVPVEELFKLLKEGHRMDKPSNCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVALTS NQEYLDLSMPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHPAQLANGGLKRR
6.制备的抗体不识别以下蛋白：
FGFR2_Musculus
MGLPSTWRYGRGPGIGTVTM VSWGRFICLVLVTMATLSLA RPSFSLVEDTTLEPEEPPTKYQISQPEAYVVAPGESLELQ CMLKDAAVISWTKDGVHLGP NNRTVLIGEYLQIKGATPRDSGLYACTAARTVDSETWYFMVNVTDAISSGDDEDDTDSSE DVVSENRSNQRAPYWTNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPAGGNPTPTMRWLKNGKEFKQE HRIGGYKVRNQHWSLIMESVVPSDKGNYTCLVENEYGSINHTYHLDVVERSPHRPILQAG LPANASTVVGGDVEFVCKVYSDAQPHIQWIKHVEKNGSKYGPDGLPYLKVLKAAGVNTTD KEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFHSAWLTVLPAPVREKEITASPDYLEIAIY CIGVFLIACMVVTVIFCRMKTTTKKPDFSSQPAVHKLTKRIPLRRQVTVSAESSSSMNSN TPLVRITTRLSSTADTPMLAGVSEYELPEDPKWEFPRDKLTLGKPLGEGCFGQVVMAEAV GIDKDKPKEAVTVAVKMLKDDATEKDLSDLVSEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLY VIVEYASKGNLREYLRARRPPGMEYSYDINRVPEEQMTFKDLVSCTYQLARGMEYLASQK CIHRDLAARNVLVTENNVMKIADFGLARDINNIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRVYT HQSDVWSFGVLMWEIFTLGGSPYPGIPVEELFKLLKEGHRMDKPTNCTNELYMMMRDCWH AVPSQRPTFKQLVEDLDRILTLTTNEEYLDLTQPLEQYSPSYPDTRSSCSSGDDSVFSPD PMPYEPCLPQYPHINGSVKT
>FGFR2_Human
MVSWGRFICLVVVTMATLSL ARPSFSLVEDTTLEPEEPPT KYQISQPEVYVAAPGESLEVRCLLKDAAVISWTKDGVHLG PNNRTVLIGEYLQIKGATPR DSGLYACTASRTVDSETWYFMVNVTDAISSGDDEDDTDGAEDFVSENSNNKRAPYWTNTE KMEKRLHAVPAANTVKFRCPAGGNPMPTMRWLKNGKEFKQEHRIGGYKVRNQHWSLIMES VVPSDKGNYTCVVENEYGSINHTYHLDVVERSPHRPILQAGLPANASTVVGGDVEFVCKV YSDAQPHIQWIKHVEKNGSKYGPDGLPYLKVLKAAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEY TCLAGNSIGISFHSAWLTVLPAPGREKEITASPDYLEIAIYCIGVFLIACMVVTVILCRM KNTTKKPDFSSQPAVHKLTKRIPLRRQVTVSAESSSSMNSNTPLVRITTRLSSTADTPML AGVSEYELPEDPKWEFPRDKLTLGKPLGEGCFGQVVMAEAVGIDKDKPKEAVTVAVKMLK DDATEKDLSDLVSEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYASKGNLREYLRARR PPGMEYSYDINRVPEEQMTFKDLVSCTYQLARGMEYLASQKCIHRDLAARNVLVTENNVM KIADFGLARDINNIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRVYTHQSDVWSFGVLMWEIFTLG GSPYPGIPVEELFKLLKEGHRMDKPANCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRI LTLTTNEEYLDLSQPLEQYSPSYPDTRSSCSSGDDSVFSPDPMPYEPCLPQYPHINGSVK T
>FGFR3_Musculus
MVVPACVLVFCVAVVAGATS EPPGPEQRVVRRAAEVPGPE PSQQEQVAFGSGDTVELSCHPPGGAPTGPTVWAKDGTGLV ASHRILVGPQRLQVLNASHE DAGVYSCQHRLTRRVLCHFSVRVTDAPSSGDDEDGEDVAEDTGAPYWTRPERMDKKLLAV PAANTVRFRCPAAGNPTPSISWLKNGKEFRGEHRIGGIKLRHQQWSLVMESVVPSDRGNY TCVVENKFGSIRQTYTLDVLERSPHRPILQAGLPANQTAILGSDVEFHCKVYSDAQPHIQ WLKHVEVNGSKVGPDGTPYVTVLKTAGANTTDKELEVLSLHNVTFEDAGEYTCLAGNSIG FSHHSAWLVVLPAEEELMETDEAGSVYAGVLSYGVVFFLFILVVAAVILCRLRSPPKKGL GSPTVHKVSRFPLKRQVSLESNSSMNSNTPLVRIARLSSGEGPVLANVSELELPADPKWE LSRTRLTLGKPLGEGCFGQVVMAEAIGIDKDRTAKPVTVAVKMLKDDATDKDLSDLVSEM EMMKMIGKHKNIINLLGACTQGGPLYVLVEYAAKGNLREFLRARRPPGMDYSFDACRLPE EQLTCKDLVSCAYQVARGMEYLASQKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLARDVHNLD YYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRVYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGIPVEELFKL LKEGHRMDKPASCTHDLYMIMRECWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRILTVTSTDEYLDLSVP FEQYSPGGQDTPSSSSSGDDSVFTHDLLPPGPPSNGGPRT
>FGFR3_Human
MGAPACALALCVAVAIVAGA SSESLGTEQRVVGRAAEVPG PEPGQQEQLVFGSGDAVELSCPPPGGGPMGPTVWVKDGTG LVPSERVLVGPQRLQVLNAS HEDSGAYSCRQRLTQRVLCHFSVRVTDAPSSGDDEDGEDEAEDTGVDTGAPYWTRPERMD KKLLAVPAANTVRFRCPAAGNPTPSISWLKNGREFRGEHRIGGIKLRHQQWSLVMESVVP SDRGNYTCVVENKFGSIRQTYTLDVLERSPHRPILQAGLPANQTAVLGSDVEFHCKVYSD AQPHIQWLKHVEVNGSKVGPDGTPYVTVLKTAGANTTDKELEVLSLHNVTFEDAGEYTCL AGNSIGFSHHSAWLVVLPAEEELVEADEAGSVYAGILSYGVGFFLFILVVAAVTLCRLRS PPKKGLGSPTVHKISRFPLKRQVSLESNASMSSNTPLVRIARLSSGEGPTLANVSELELP ADPKWELSRARLTLGKPLGEGCFGQVVMAEAIGIDKDRAAKPVTVAVKMLKDDATDKDLS DLVSEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQGGPLYVLVEYAAKGNLREFLRARRPPGLDYSFD TCKPPEEQLTFKDLVSCAYQVARGMEYLASQKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLAR DVHNLDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRVYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGIPV EELFKLLKEGHRMDKPANCTHDLYMIMRECWHAAPSQRPTFKQLVEDLDRVLTVTSTDEY LDLSAPFEQYSPGGQDTPSSSSSGDDSVFAHDLLPPAPPS SGGSRT
7.抗原设计算法中考虑的各项重要参数，结合表1这些参数，从目标蛋白中挑选表位指数最高的10肽片段。
表1.抗原设计算法中的各项重要参数
二级结构
氨基酸特性
折叠/螺旋/转角
抗原增强氨基酸
特殊区域
适应性
N-端,C-端
演化
信号肽
阳性选择
跨膜
辨识度
无序区域
客户要求
可溶性
蛋白特异性
比对
区域特异性
人和小鼠
其它
8.目标蛋白的总体表位指标分析
如图1所示，对目标蛋白的总体表位指标进行分析，X轴表示各个10肽的起始位置，Y轴表示每个表位的指标得分，得分越高，成为成功表位的可能性越高。灰色曲线是每个10肽的得分曲线。蓝色表示被选中的10肽片段。X轴上短柱表示目标蛋白中亲水性的分布：绿色代表亲水，红色代表疏水。如果目标蛋白中存在信号肽和跨膜区，该区域在X轴下方将用粗横线标识。如果有指定设计区域，该要求将在曲线上方用黑色或桃红色粗横线进行标识。选择了6条10肽用于后期SEAL表位库的构建。本实施例按上述方法综合考虑FGFR1蛋白的各项参数指标及特异性要求，得到14种FGFR1抗体。挑选其中综合评分最高的抗体4-3(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)进行后续研究。
实施例二、人工合成与FGFR1特异结合的抗体
根据氨基酸序列，委托上海强耀生物科技有限公司采用标准Fmoc方案固相合成抗体。经测定，合成多肽纯度高于95％，-70℃保存。
实施例三、合成FGFR1抗体对人股骨头全层软骨组织代谢的影响
1、人股骨头全层软骨标本分离、培养
健康人类股骨用1×DPBS漂洗3次，灭菌手术器械将全层软骨组织切成边长约4mm大小方块，1×DPBS漂洗3次，先用DMEM/F12培养基(无血清，含1％(v/v)双抗)培养48h；再用IL-1β(20ng/ml)处理培养人股骨头全层软骨组织块，同时用1μg/ml FGFR1抗体4-3处理分别培养4d和9d，培养基中加1％(v/v)ITSTM诱导液。
2、人股骨头全层软骨组织块固定、脱水、石蜡包埋及切片
4％(w/v)PFA固定全层软骨组织块24h；1×PBS漂洗过夜；20％(w/v)快速脱钙液于4℃摇床上脱钙5～7d(脱钙时间不能过长，否则将影响后续染色)；1×PBS漂洗过夜，彻底清除残留快速脱钙液；梯度脱水：50％(v/v)乙醇30min/次，1次；75％(v/v)乙醇30min/次，1次；85％(v/v)乙醇30min/次，1次；95％(v/v)乙醇30min/次，1次；100％乙醇30min/次，2次；透明：二甲苯透明10min/次，2次；浸蜡：熔点58～60℃石蜡溶液浸末透明后的标本2h/次，3次；包埋：将融化的石蜡吸入包埋盒，标本放入包埋盒，置于包埋机上进行凝固；切片：切片厚度调整为5μm/张。
3、人股骨头全层软骨标本番红O染色
显微镜下选片，60℃烤箱烤片30min；37℃，二甲苯脱蜡30min/次；100％乙醇复水5min/次，2次；95％(v/v)乙醇复水5min/次，1次；85％(v/v)乙醇复水5min/次，1次；75％(v/v)乙醇复水5min/次，1次；去离子浸泡1min/次，3次；1％(v/v)番红O染色5min/次，1次；去离子浸泡1min/次，3次；晾干后中性树脂封片，图像采集。番红O染色如图2中A所示：IL-1β处理后胞外基质着色困难，蛋白聚糖分解增多，而1μg/ml FGFR1抗体4-3能显著降低胞外基质的降解。
4、人股骨头全层软骨标本免疫组织化学染色
显微镜下选片，60℃烤箱烤片30min；37℃，二甲苯脱蜡30min/次；100％乙醇复水5min/次，2次；95％(v/v)乙醇复水5min/次，1次；85％(v/v)乙醇复水5min/次，1次；75％(v/v)乙醇复水5min/次，1次；去离子浸泡1min/次，3次；3％(v/v)H2O2，37℃10min/次，1次，1×PBS洗去残留H2O2，2min/次，3次；0.1％(v/v)胰蛋白酶修复标本抗原决定簇，37℃15min/次，1次，1×PBS洗去残留胰蛋白酶，2min/次，3次；封闭液封闭标本中非特异结合位点，37℃30min/次，1次；一抗稀释液稀释相应一抗MMP13(抗体稀释液按体积1:200稀释，Aggrecan(抗体稀释液按体积1:200稀释)，4℃孵育过夜；1×PBS洗去残留一抗，5min/次，3次；孵育相应二抗，37℃10min/次，1次，1×PBS洗去残留二抗，5min/次，3次；DAB显色液(A液和B液按体积1:19新鲜配制)；过滤水漂洗5min/次；0.05％(w/v)甲基绿复染1min/次；过滤水漂洗1min/次；封片，BX51显微镜对组织切片拍照。免疫组织化学染色如图2中B所示：IL-1β处理后胞外基质蛋白Aggrecan表达降低，分解代谢相关基因MMP13蛋白的表达增加，而1μg/mlFGFR1抗体4-3能降低MMP13的表达，对Aggrecan的表达无明显影响。
实施例四、合成FGFR1抗体对小鼠创伤性关节炎的影响
1、内侧半月板不稳定(Destabilization of the medial meniscus，DMM)模型建立
采用显微外科手术实施DMM手术构建小鼠膝关节关节炎模型。手术分为DMM手术组和假手术Sham组，各组分别设置对照组。手术主要步骤如下：DMM手术组为将小鼠1％(w/v)戊巴比妥钠麻醉固定、消毒后，打开小鼠右侧膝关节，钝性分离软组织，用显微器械切断内侧半月板平台韧带，带线缝合针缝合关节囊，关闭关节腔，最后缝合皮肤；假手术Sham组只是打开小鼠右侧膝关节，钝性分离软组织，不切断内侧半月板平台韧带，缝合皮肤。术中注意避免损伤关节软骨，术后不固定手术肢体，笼内自由活动，腹腔注射青霉素预防感染。
2、关节腔内注射抗体
DMM模型手术后1周DMM手术组和假手术Sham组分别向关节腔内注射抗体，其各自的对照组则注射生理盐水，一周两次，连续4周，术后8周和12周取材。
注射具体方法如下：用生理盐水将FGFR1抗体4-3稀释成1μg/ml，将小鼠戊巴比妥钠麻醉固定、消毒后，用显微刀片切开膝关节处皮肤，暴露关节腔，按照5μl/只/次的量注射在关节腔中，同时按照相同的方法向对照组小鼠关节腔内注射5μl生理盐水，一周两次，连续4周。
3、关节软骨损伤退变病理评分
小鼠关节取材后，4％PFA固定、甲酸(快速脱钙液)脱钙、石蜡包埋切片。小鼠关节的切片有两种方式，即冠状切和矢状切，此处采用矢状切的方式。矢状切片时从内侧半月板开始切片，间隔相应的位置捞片，保证每个个体之间尽量在同样的位置捞片，4个标本/片，约25张片子(关节面出现软组织，表示已经到达切片的终点位置)。每个标本间隔选择同样位置的片子10张，进行番红O-固绿染色，通过IPP软件拍照，采用关节炎评分标准进行关节软骨退变评分与基质丢失评分(选取整个关节中退变最严重的片子进行评分，并且至少两人进行双盲评分，此两种评分方法均是分值越高代表关节炎损伤退变越严重)，具体评分标准参考文献(Tan QY,2018,Osteoarthritis Cartilage)。
番红O-固绿染色结果显示：Sham组术后8周和12周关节表面光滑，胞外基质番红O显著着色。DMM组术后8周和12周关节软骨呈现OA样表型，软骨基质丢失和关节软骨破坏，而术后关节腔连续4周注射FGFR1抗体4-3可显著缓解DMM所致的OA表型(图3中A)。DMM组术后8周标本进行OARSI评分，结果与藏红固绿染色结果一致：与Sham对照组相比，DMM术后股骨总体评分和最大评分以及胫骨总体评分和最大评分都显著性增加。与DMM术后关节腔连续4周注射生理盐水相比，DMM术后关节腔连续4周注射FGFR1抗体4-3显著降低股骨总体评分和最大评分以及胫骨总体评分和最大评分(图3中B)。
4、小鼠关节软骨标本免疫组织化学染色
显微镜下挑选DMM术后8周的切片，60℃烤箱烤片30min；37℃，二甲苯脱蜡30min/次；100％乙醇复水5min/次，2次；95％(v/v)乙醇复水5min/次，1次；85％(v/v)乙醇复水5min/次，1次；75％(v/v)乙醇复水5min/次，1次；去离子浸泡1min/次，3次；3％H2O2，37℃10min/次，1次，1×PBS洗去残留H2O2，2min/次，3次；0.1％(v/v)胰蛋白酶修复标本抗原决定簇，37℃15min/次，1次，1×PBS洗去残留胰蛋白酶，2min/次，3次；封闭液封闭标本中非特异结合位点，37℃30min/次，1次；一抗稀释液稀释相应一抗MMP13(抗体稀释液按体积1:200稀释)，Col II(抗体稀释液按体积1:200稀释)，ColX(抗体稀释液按体积1:500稀释)，4℃孵育过夜；1×PBS洗去残留一抗，5min/次，3次；孵育相应二抗，37℃10min/次，1次，1×PBS洗去残留二抗，5min/次，3次；DAB显色液(A液和B液按体积1:19新鲜配制)；过滤水漂洗5min/次；0.05％(w/v)甲基绿复染1min/次；过滤水漂洗1min/次；封片，BX51显微镜对组织切片拍照。
免疫组织化学染色如图4所示：DMM术后8周胞外基质蛋白Collagen II表达降低，分解代谢相关基因MMP13蛋白的表达增加。另外，软骨细胞肥大相关基因Collagen X蛋白的表达也增加。但是，DMM术后关节腔连续4周注射FGFR1抗体4-3可降低分解代谢相关蛋白Adamts5、MMP13和软骨细胞肥大相关基因Collagen X蛋白的表达，对Collagen II的表达无明显影响。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军特色医学中心
<120> 一种调节FGFR1活性的抗体及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Asn Lys Thr Val Ala Leu Gly Ser Asn
1 5 10