阅读说明：本技术 一种通过添加混合镁盐提高赤藓糖醇转化率的方法 (Method for improving erythritol conversion rate by adding mixed magnesium salt ) 是由 李克文 熊小兰 栾庆民 张莉 贾慧慧 张倩 李珍珍 任晓洁 李新华 尹郑 于 2019-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种通过添加混合镁盐提高赤藓糖醇转化率的方法。该方法先进行解脂假丝酵母菌种子液的培养,再对解脂假丝酵母菌种子液进行发酵培养,制得赤藓糖醇。其中,发酵培养基的组分为：葡萄糖0.3～0.35kg/L、有机氮源4～7g/L、无机盐5～6g/L。本方法通过对发酵培养基部分原料替代、由添加单一镁盐改为混合镁盐并调整混合镁盐的比例优化发酵培养基,使其菌种代谢途径更利于生成赤藓糖醇,从而有效地提高赤藓糖醇转化率。(The invention relates to a method for improving erythritol conversion rate by adding a mixed magnesium salt. The method comprises the steps of firstly culturing the candida lipolytica seed solution, and then fermenting and culturing the candida lipolytica seed solution to obtain the erythritol. Wherein, the components of the fermentation medium are as follows: 0.3-0.35 kg/L glucose, 4-7 g/L organic nitrogen source and 5-6 g/L inorganic salt. According to the method, partial raw materials of the fermentation medium are replaced, the single magnesium salt is added to be changed into the mixed magnesium salt, and the proportion of the mixed magnesium salt is adjusted to optimize the fermentation medium, so that the strain metabolic pathway is more favorable for generating erythritol, and the erythritol conversion rate is effectively improved.)

一种通过添加混合镁盐提高赤藓糖醇转化率的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵生产技术领域，特别涉及一种通过添加混合镁盐提高赤藓糖醇转化率的方法。

背景技术

赤藓糖醇在自然界中分布广泛，是一种天然的糖质。赤藓糖醇与蔗糖甜味相似，同时又区别于蔗糖。赤藓糖醇入口清凉，具有很好的加工特性。它可被广泛应用于糖果、饮料、果冻及果冻型饮料、口腔保健品等各种食品和饮料中。同其他糖醇一样，赤藓糖醇不会导致龋齿。其原因在于人体内没有代谢赤鲜糖醇的酶系，所以当小肠吸收进入血液后，不能被代谢，而几乎全部随尿排出体外，适合用作糖尿病患者的甜味剂。它还可以避免像其它糖醇由于用量过大而引起腹胀、肠鸣和腹泻的副作用。另外，赤藓糖醇还可部分替代甘油用于化妆品，延缓化妆品变质；作为有机合成的中间体，用于制造油漆、***和医药等产品的原料；作为高分子聚合物的组分和添加剂，生产聚醚多羟基化合物。赤鲜糖醇是目前国际上唯一采用微生物发酵法生产的糖醇。

赤藓糖醇的制备是以葡萄糖为主要原料，通过添加不同的无机盐由耐高渗酵母在耗氧条件下通过磷酸戊糖途径途径来完成的。赤藓糖醇的发酵根据具体发酵工艺及菌种的不同，发酵周期一般不同，发酵时间越长，染菌机率越大，转化率也就越低。因此在较短的时间内达到较高的转化率，成为赤藓糖醇生产成本的关键因素，同时赤藓糖醇转化率提高后后提取工序收率也会提高。

中国专利文件CN103290068A公开了一株耐高渗出芽短梗霉生产赤藓糖醇的方法，采用木糖为主要碳源的发酵培养基进行生产赤藓糖醇，但是其转化率较低，仅为25～42％。

中国专利文件CN104894095A公开了一种利用赤藓糖醇废弃菌泥生产赤藓糖醇的方法。该方法包括以下步骤：将经过常规斜面活化的菌种，接种至以蔗糖和/或葡萄糖及酵母粉为原料的培养基，经过一级种子培养、二级种子培养和发酵罐发酵，制得赤藓糖醇糖液和菌泥的混合物，分离后将菌泥收集，利用固定化载体对菌泥进行固定化制备固定化颗粒，将固定化颗粒加入葡萄糖及少量氮源的灭菌发酵液中进行发酵，得到赤藓糖醇糖液，赤藓糖醇糖液经脱色和离子交换纯化后，按常规方法浓缩，结晶，离心分离后制得赤藓糖醇晶体。但是该方法的转化率也比较低，仅为30～40％。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种通过添加混合镁盐提高赤藓糖醇转化率的方法，该方法通过改变无机盐的添加种类及比例，可以有效地提高赤藓糖醇转化率。

本发明的技术方案如下：

一种通过添加混合镁盐提高赤藓糖醇转化率的方法，包括步骤如下：

(1)解脂假丝酵母菌种子液的培养：将解脂假丝酵母菌接种到摇瓶培养基中进行摇瓶培养，然后再进行一级种子培养和二级种子培养，得到解脂假丝酵母菌种子液；

(2)发酵培养：将制备完成的解脂假丝酵母菌种子液接入到装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，当发酵液中葡萄糖含量≤0.2g/100mL时发酵结束，制得赤藓糖醇；

其中，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖0.3～0.35kg/L、有机氮源4～7g/L、无机盐5～6g/L；所述有机氮源为酵母粉、大豆蛋白粉的混合物；所述无机盐为硫酸镁、碳酸镁、磷酸二氢钾、柠檬酸铵中的两种以上的组合。

根据本发明优选的，步骤(1)中所述解脂假丝酵母菌的接种具体为：在无菌环境下，用接种环勾取解脂假丝酵母菌1～2环转接至摇瓶培养基中。

根据本发明优选的，步骤(1)中所述摇瓶培养基的组分如下，均为重量百分比：葡萄糖20～25％，酵母膏1.5～2.5％，余量为水。

根据本发明优选的，步骤(1)中所述摇瓶培养的条件为：摇床转速100～105转/分，温度29～32℃，培养周期20～24小时。

根据本发明优选的，步骤(1)中所述一级种子培养和二级种子培养的步骤为：取解脂假丝酵母菌摇瓶培养液接种到一级种子培养基中，在30～34℃，180～200r/min的条件下培养14～20h，接种量为一级种子培养基质量的1～2％；再将该一级种子液以9～10％的接种量，接入二级种子培养基中，在30～34℃，180～200r/min的条件下培养7～12h，得到解脂假丝酵母菌种子液；

其中，一级种子培养基和二级种子培养基的组分如下，均为重量百分比：葡萄糖20～25％，酵母粉1.0～2.0％，硫酸镁0.04～0.06％，柠檬酸铵0.5～0.8％、磷酸二氢钾0.04～0.06％，余量为水。

根据本发明优选的，步骤(2)中所述接入至发酵罐的解脂假丝酵母菌种子液的接种量为9～10％。

根据本发明优选的，步骤(2)中所述无机盐为磷酸二氢钾、硫酸镁、碳酸镁、柠檬酸铵、按重量比1:(0.5～0.8):(0.2～0.5):(8～9)的组合。

根据本发明优选的，步骤(2)中所述发酵培养基成分中葡萄糖为液体葡萄糖，浓度为55～70％，DE值≧95％。

根据本发明优选的，步骤(2)中所述发酵培养的条件为：发酵罐搅拌转速70～100转/分钟，压力为0.05～0.1MPa，通入压缩空气量为0.5～0.8立方米空气/立方米发酵液/分钟，温度为30～34℃，发酵时间为98～102小时。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明在不影响转化率的前提下，将较廉价的大豆蛋白粉部分替代酵母粉，降低原料成本。同时由单一镁盐发酵改为混合镁盐发酵并且调节混合镁盐配比，调整发酵后期pH值由原来的2.5～3.3提高到3.5～4.0，使解脂假丝酵母菌种代谢处于最适合产赤藓糖醇的环境。通过对发酵培养基的优化，将各种酶的协同作用发挥到最利于产赤藓糖醇的条件，可将赤藓糖醇的转化率达到最大，达到了63％，相比现有技术提高了20％以上，明显的提高了发酵液中赤藓糖醇的含量，具有良好的经济效益。

(2)本发明提供的制备方法工序少，成本低，操作简单，同时能使解脂假丝酵母菌代谢效率最大化，从而将发酵周期缩短至98～102h，提高了赤藓糖醇的制备效率，增加了产品的竞争力。

具体实施方式

解脂假丝酵母菌为保龄宝生物股份有限公司自有菌种BLB-24，2010年11月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.4364，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

其他原料均市售可得。

实施例1

一种通过添加混合镁盐提高赤藓糖醇转化率的方法，包括步骤如下：

(1)解脂假丝酵母菌种子液的培养：在无菌环境下，用接种环勾取解脂假丝酵母菌2环转接至摇瓶培养基中，在30℃、105r/min的条件下进行摇瓶培养20小时，取解脂假丝酵母菌摇瓶培养液接种到一级种子培养基中、接种量为一级种子培养基体积的1％，于30±1℃，180r/min的条件下培养14h；再将该一级种子液以10％的接种量，接入二级种子培养基中于30℃，180r/min的条件下培养7h，得到解脂假丝酵母菌种子液；

(2)发酵培养：将制备完成的解脂假丝酵母菌种子液按接种量为9％接入到装有发酵培养基的发酵罐中，在搅拌转速70转/分，通入压缩空气量为0.5立方米空气/立方米发酵液/分钟、罐压0.05MPa、温度30℃的条件下进行发酵培养98小时，当发酵液中葡萄糖含量≤0.2g/100mL时发酵结束，制得赤藓糖醇。

其中，所述摇瓶培养基的组分如下，均为重量百分比：葡萄糖20％，酵母膏2.5％，余量为水；

所述一级种子培养基和二级种子培养基的组分如下，均为重量百分比：葡萄糖20％，酵母膏(粉)2.0％，硫酸镁0.06％，柠檬酸铵0.8％，余量为水；

所述发酵培养基组分为：液体葡萄糖90.3吨、酵母粉0.655吨、大豆蛋白粉0.22吨、磷酸二氢钾100公斤、硫酸镁80公斤、碳酸镁20公斤、柠檬酸铵0.875吨，余量为水，共175吨。

本实施例中发酵中后期pH维持在3.2～3.8之间，发酵周期为98h，制备的发酵液中赤藓糖醇含量检测结果为19.88％，赤藓糖醇的转化率达到61.02％，，产量为33.61吨，纯度为91.15％。

实施例2

一种通过添加混合镁盐提高赤藓糖醇转化率的方法，包括步骤如下：

(1)解脂假丝酵母菌种子液的培养：在无菌环境下，用接种环勾取解脂假丝酵母菌1环转接至摇瓶培养基中，在32℃、105r/min的条件下进行摇瓶培养24小时，取解脂假丝酵母菌摇瓶培养液接种到一级种子培养基中、接种量为一级种子培养基体积的1％，于30±1℃，200r/min的条件下培养20h，；再将该一级种子液以9％的接种量，接入二级种子培养基中于32℃，180-200r/min的条件下培养12h，得到解脂假丝酵母菌种子液；

(2)发酵培养：将制备完成的解脂假丝酵母菌种子液按接种量为10％接入到装有发酵培养基的发酵罐中，在搅拌转速100转/分，通入压缩空气量为0.8立方米空气/立方米发酵液/分钟、罐压0.1MPa、温度34℃的条件下进行发酵培养102小时，当发酵液中葡萄糖含量≤0.2g/100mL时发酵结束，制得赤藓糖醇。

其中，所述摇瓶培养基的组分如下，均为重量百分比：葡萄糖22％，酵母膏2.0％，余量为水；

所述一级种子培养基和二级种子培养基的组分如下，均为重量百分比：葡萄糖22％，酵母膏(粉)1.5％，硫酸镁0.05％，柠檬酸铵0.6％，余量为水；

所述发酵培养基组分为：液体葡萄糖91.38吨、酵母粉0.655吨、大豆蛋白粉0.22吨、磷酸二氢钾100公斤、硫酸镁67公斤、碳酸镁33.5公斤、柠檬酸铵0.875吨，余量为水，共175吨。

本实施例中发酵中后期pH维持在3.5～4.0之间，发酵周期102h，制备的发酵液中赤藓糖醇含量检测结果为20.34％，赤藓糖醇的转化率达到63.03％，，产量为35.13吨，纯度为92％。

实施例3

一种通过添加混合镁盐提高赤藓糖醇转化率的方法，包括步骤如下：

(1)解脂假丝酵母菌种子液的培养：在无菌环境下，用接种环勾取解脂假丝酵母菌2环转接至摇瓶培养基中，在31℃,105转/分的条件下进行摇瓶培养，再取解脂假丝酵母菌摇瓶培养液接种到一级种子培养基中于31℃，搅拌转速190r/min的条件下培养17h，接种量为一级种子培养基质量的1％；再将该一级种子液以10％的接种量，接入二级种子培养基中于31℃，190r/min的条件下培养10h，得到解脂假丝酵母菌种子液；

(2)发酵培养：将制备完成的解脂假丝酵母菌种子液按接种量为9％接入到装有发酵培养基的发酵罐中，在搅拌转速90转/分，通入压缩空气量为0.6立方米空气/立方米发酵液/分钟、罐压0.08MPa、温度30±1℃的条件下进行发酵培养100小时，当发酵液中葡萄糖含量≤0.2g/100mL时发酵结束，制得赤藓糖醇。

其中，所述摇瓶培养基的组分如下，均为重量百分比：葡萄糖25％，酵母膏1.5％，余量为水。

所述一级种子培养基和二级种子培养基的组分如下，均为重量百分比：葡萄糖25％，酵母膏(粉)1.0％，硫酸镁0.04％，柠檬酸铵0.5％，余量为水；

所述发酵培养基成组分：液体葡萄糖90吨、酵母粉0.655吨、大豆蛋白粉0.22、磷酸二氢钾100千克、硫酸镁50千克、碳酸镁50千克、柠檬酸铵0.875吨，余量为水，共175吨。

本实施例中发酵中后期pH维持在3.6～4.0之间，发酵周期为100h，制备的发酵液中赤藓糖醇含量检测结果为20.38％，赤藓糖醇的转化率达到61.88％，产量为33.97吨，纯度为91.3％。

对比例1

一种赤藓糖醇的制备方法，包括步骤如下：

(1)解脂假丝酵母菌种子液的培养：在无菌环境下，用接种环勾取解脂假丝酵母菌2环转接至摇瓶培养基中，在30℃、105r/min的条件下进行摇瓶培养20小时，取解脂假丝酵母菌摇瓶培养液接种到一级种子培养基中、接种量为一级种子培养基体积的1％，于30±1℃，180r/min的条件下培养14h；再将该一级种子液以10％的接种量，接入二级种子培养基中于30℃，180r/min的条件下培养7h，得到解脂假丝酵母菌种子液；

(2)发酵培养：将制备完成的解脂假丝酵母菌种子液按接种量为9％接入到装有发酵培养基的发酵罐中，在搅拌转速70转/分，通入压缩空气量为0.5立方米空气/立方米发酵液/分钟、罐压0.05MPa、温度30℃的条件下进行发酵培养98小时，当发酵液中葡萄糖含量≤0.2g/100mL时发酵结束，制得赤藓糖醇。

其中，所述摇瓶培养基的组分如下，均为重量百分比：葡萄糖20％，酵母膏2.5％，余量为水；

所述一级种子培养基和二级种子培养基的组分如下，均为重量百分比：葡萄糖20％，酵母膏(粉)2.0％，硫酸镁0.06％，柠檬酸铵0.8％，余量为水；

所述发酵培养基组分为：液体葡萄糖89吨、酵母粉0.8吨、磷酸二氢钾100千克、硫酸镁100千克、柠檬酸铵0.875吨余量为水，共175吨。

本实施例中发酵中后期pH维持在2.8～3.2之间，发酵周期为105h，制制备的发酵液中赤藓糖醇含量检测结果为18.9％，赤藓糖醇的转化率达到58.2％，产量为31.67吨，纯度为90.5％。

对比例2

一种赤藓糖醇的制备方法，包括步骤如下：

(1)解脂假丝酵母菌种子液的培养：在无菌环境下，用接种环勾取解脂假丝酵母菌2环转接至摇瓶培养基中，在30℃、105r/min的条件下进行摇瓶培养20小时，取解脂假丝酵母菌摇瓶培养液接种到一级种子培养基中、接种量为一级种子培养基体积的1％，于30±1℃，180r/min的条件下培养14h；再将该一级种子液以10％的接种量，接入二级种子培养基中于30℃，180r/min的条件下培养7h，得到解脂假丝酵母菌种子液；

(2)发酵培养：将制备完成的解脂假丝酵母菌种子液按接种量为9％接入到装有发酵培养基的发酵罐中，在搅拌转速70转/分，通入压缩空气量为0.5立方米空气/立方米发酵液/分钟、罐压0.05MPa、温度30℃的条件下进行发酵培养98小时，当发酵液中葡萄糖含量≤0.2g/100mL时发酵结束，制得赤藓糖醇。

其中，所述摇瓶培养基的组分如下，均为重量百分比：葡萄糖20％，酵母膏2.5％，余量为水；

所述一级种子培养基和二级种子培养基的组分如下，均为重量百分比：葡萄糖20％，酵母膏(粉)2.0％，硫酸镁0.06％，柠檬酸铵0.8％，余量为水；

所述发酵培养基组分为：液体葡萄糖90.5吨、酵母粉0.655吨、大豆蛋白粉0.22吨、磷酸二氢钾100千克、碳酸镁100千克、柠檬酸铵0.875吨，余量为水，共175吨。

本实施例中发酵中后期pH维持在2.8-3.2之间，发酵周期为103h，制备的发酵液中赤藓糖醇含量检测结果为18.8％，赤藓糖醇的转化率达到58.1％，，产量为32.69吨，纯度为90.38％。

综上可知，实施例1-3所制备得到的赤藓糖醇，其转化率都达到了61％以上，而对比例1-2制备得到的赤藓糖醇的转化率均不足60％，因此可知采用混合镁盐，并且将其配成适当的配比可以有效地将赤藓糖醇的转化率提高2～5％，相对现有技术提高了20％以上，具有明显的效果。