一种利用pH自平衡催化体系制备木糖醇的方法
阅读说明：本技术 一种利用pH自平衡催化体系制备木糖醇的方法 (Method for preparing xylitol by utilizing pH self-balancing catalytic system ) 是由 应汉杰 柳东 张迪 王振宇 雷鸣 陈勇 牛欢青 于 2019-11-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用pH自平衡催化体系制备木糖醇的方法,其特征在于,木糖、葡萄糖、甲酸类化合物、木糖还原酶、葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、电子载体和水形成生物催化体系,催化木糖反应生成木糖醇。与现有技术相比,本发明通过耦合反应过程,实现反应体系中酸性和碱性产物的相互中和,能够稳定反应过程的pH中和,省去了生产过程pH的调控,因此反应过程更简单、稳定、高效,可以在纯水中进行,从而提高了生产效率、降低了生产成本和操作难度；同时,采用由甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶和木糖还原酶构成的酶偶合反应系统催化生产木糖醇,24小时内从2M木糖中获得了278.4g/L的木糖醇产量,产率高达11.6g/L/h。(The invention discloses a method for preparing xylitol by utilizing a pH self-balancing catalytic system, which is characterized in that xylose, glucose, formic acid compounds, xylose reductase, glucose dehydrogenase, formate dehydrogenase, an electronic carrier and water form a biological catalytic system to catalyze xylose to react to generate xylitol. Compared with the prior art, the method realizes mutual neutralization of acidic and alkaline products in a reaction system through a coupling reaction process, can stabilize pH neutralization in the reaction process, and omits regulation and control of pH in the production process, so that the reaction process is simpler, more stable and more efficient, and can be carried out in pure water, thereby improving production efficiency and reducing production cost and operation difficulty; meanwhile, an enzyme coupling reaction system consisting of formate dehydrogenase, glucose dehydrogenase and xylose reductase is adopted to catalyze and produce the xylitol, the yield of the xylitol of 278.4g/L is obtained from 2M xylose within 24 hours, and the yield reaches 11.6 g/L/h.)
技术领域
本发明涉及木糖醇的制备方法，具体涉及一种利用pH自平衡催化体系制备木糖醇的方法。
背景技术
木糖醇是一种重要的功能性糖醇，广泛用于食品，制药和化学工业，其被美国能源部可再生资源办公室列为十二种优先开发利用的平台化合物之一。近年来，全球对木糖醇的需求稳步增长，木糖醇的高效生产引起了人们的极大关注。
目前，木糖醇主要通过在严格条件下氢化高度纯化的木糖来生产。该化学合成方法具有高能耗、对复杂设备的要求和环境污染风险等缺点。与化学过程相比，酶促过程更温和，更清洁，同时仍然可以选择性地获得木糖醇。因此，木糖醇的酶促生产是化学合成的具有吸引力的替代品。
在酶促过程中，木糖还原酶(XR)是使用辅因子NAD(P)H作为还原能力将木糖一步还原为木糖醇的关键酶，而NAD(P)H必须通过偶合由脱氢酶催化的反应来再生。以前，尝试了具有偶合的XR和NADPH依赖性葡萄糖脱氢酶(GDH)的方法和具有偶合的XR和NADH依赖性甲酸脱氢酶(FDH)的方法，用于酶促生产木糖醇。FDH催化的甲酸类化合物氧化会产生氢氧化物或碳酸氢盐，导致反应溶液中的碱性pH变化，而GDH催化的葡萄糖氧化会产生葡萄糖酸，导致酸性pH变化。因此，在这两种方法中，生产必须在缓冲溶液中进行，或者以相对低的生产率进行复杂的pH控制策略。因此，需要开发一种制备木糖醇pH稳定的反应过程，以简化生物法制备木糖醇的工艺、降低生产成本。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用pH自平衡催化体系制备木糖醇的方法。
发明思路：由于FDH产生的碱和GDH产生的葡萄糖酸彼此中和，该过程可以简单地在纯水中进行而不需要pH调节，该pH中和过程对于生产木糖醇的酶促生产是高效的，因此开发了由偶合的XR-FDH-GDH组成的反应过程，用于酶促生产木糖醇。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种利用pH自平衡催化体系制备木糖醇的方法，其中，木糖、葡萄糖、甲酸类化合物、木糖还原酶(XR)、葡萄糖脱氢酶(GDH)、甲酸脱氢酶(FDH)、电子载体和水形成生物催化体系，催化木糖反应生成木糖醇。
葡萄糖在GDH催化下产生酸性产物葡萄糖酸，这一过程提供电子给电子载体；甲酸或甲酸钠在FDH的催化下产生气体CO2和碱性产物氢氧化物，这一过程也能够提供电子给电子载体。因此在反应中葡萄糖脱氢酶和甲酸脱氢酶的产物能够相互中和，使得反应体系的pH得以稳定，而葡萄糖和甲酸类化合物提供的电子经电子载体可以在木糖还原酶的催化作用下传递给木糖进而生成木糖醇。图1进一步解释了本发明中反应体系pH自平衡的过程。
其中，木糖在生物催化体系中的初始浓度为0.1～3M。
其中，所述葡萄糖脱氢酶来源于Bacillus cereus、Exiguobacterium sibiricum255-15、Thermoplasma acidophilum DSM 1728、Bacillus subtilis；葡萄糖在生物催化体系中的初始浓度为0.1～2M；优选1M。
其中，所述的甲酸类化合物为甲酸或甲酸钠；甲酸类化合物在生物催化体系中的初始浓度为0.1～3M。
其中，所述木糖还原酶来源于Candida tenuis CBS 4435、Rhizopus oryzae、Candida tropicalis IFO 0618或Thermomyces lanuginosus SSBP；木糖还原酶在生物催化体系中的用量为3～6U/mL；优选5U/mL；其中，木糖还原糖的酶活定义：在pH7、25℃条件下，每分钟消耗1mM NADH所需的酶量。
其中，葡萄糖脱氢酶在生物催化体系中的用量为0.5～2.5U/mL；优选1.5U/mL；其中，葡萄糖脱氢酶的酶活定义：用紫外分光光度仪在340nm处检测酶活性，检测条件为：25℃，在pH＝7的100mM的tris-HCl缓冲液中反应，酶活用1分钟内NADH的生成量来表示。葡萄糖脱氢酶购自Amono公司，酶提取自Bacillus cereus。
其中，所述木糖还原酶和葡萄糖脱氢酶由重组大肠杆菌表达，所述木糖还原酶和葡萄糖脱氢酶的表达和提取步骤如下：
(1)将木糖还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因分别进行密码子优化；
(2)将步骤(1)得到的优化的木糖还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因分别亚克隆至质粒pET-28a上，得到重组质粒；
(3)将步骤(2)得到的重组质粒导入E.coli.BL21中，得到重组大肠杆菌；
(4)将步骤(3)得到的重组大肠杆菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中进行活化；
(5)将步骤(4)得到的活化的重组大肠杆菌转接于含卡那霉素的LB液体培养基中继续培养，当OD600达到0.6～0.8时，向所述LB液体培养基中添加IPTG，诱导木糖还原酶和葡萄糖脱氢酶的表达，所述IPTG在LB液体培养基中的浓度为0.8～1.2mM；
(6)收集步骤(5)得到的菌体，进行超声破碎，然后进行离心，上清液即为粗酶液。
步骤(1)中，密码子的优化步骤如下：稀有密码子的分析：稀有密码子主要通过软件E.coli Codon Usage Analysis 2.0分析得到在大肠杆菌中的使用相对频率低于阈值(10‰)的密码子。优化稀有密码子：根据不同密码子在大肠杆菌中的使用频率将使用频率低于阈值的密码子进行优化。按照大肠杆菌的密码子偏好对木糖还原酶基因和甲酸脱氢酶基因序列进行优化，优化后的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
步骤(2)中，将优化的木糖还原酶基因和甲酸脱氢酶基因分别亚克隆于质粒pET-28a的EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点之间，即构成重组质粒。
步骤(5)中LB液体培养基中添加IPTG后，在20℃，200rpm培养12h进行木糖还原酶和甲酸脱氢酶的诱导表达。
其中，所述甲酸脱氢酶来源于Candida Boidinii、Pichia pastoris GS115、Clostridium ljungdahlii、Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774；甲酸脱氢酶在生物催化体系中的用量为0.5～2.5U/mL；优选1.5U/mL；其中，甲酸脱氢酶的酶活定义：在pH7、25℃条件下，每分钟生成1mM NADH所需的酶量。
其中，所述的电子载体为NAD+、NADP+、FAD、FMN和甲基紫精中的任意一种，优选NAD+；电子载体在生物催化体系中的初始浓度为0.5～10mM。
图1进一步解释了本发明中反应体系pH自平衡的过程，XR将木糖还原为木糖醇，其中NADH被消耗，NADH在FDH和GDH催化的反应中再生，FDH由甲酸钠产生的碱性产物与GDH由葡萄糖产生的酸性产物相互中和，因此该过程可在纯水中简单进行。
其中，所述反应温度为20～40℃，反应时间为2～72h。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
(1)本发明通过耦合反应过程，实现反应体系中酸性和碱性产物的相互中和，能够稳定反应过程的pH中和，省去了生产过程pH的调控，因此反应过程更简单、稳定、高效，可以在纯水中进行，从而提高了生产效率、降低了生产成本和操作难度。
(2)本发明采用由甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶和木糖还原酶构成的酶偶合反应系统催化生产木糖醇，24小时内从2M木糖中获得了278.4g/L的木糖醇产量，产率高达11.6g/L/h。
附图说明
图1本发明的反应体系pH自平衡的示意图。
图2为重组质粒pET-28a-teXR的图谱。
图3为重组质粒pET-28a-FDH的图谱。
图4为重组大肠杆菌表达的木糖还原酶和甲酸脱氢酶的电泳图。
图5为对比例1中木糖醇浓度以及pH随时间的变化。
图6为对比例2中木糖醇浓度以及pH随时间的变化。
图7为实施例3中底物浓度以及木糖醇浓度及pH随时间的变化。
图8为实施例4中三种不同类型辅因子催化反应下葡萄糖和木糖醇浓度随时间的变化。
图9为实施例5中不同酶用量对葡萄糖和木糖醇浓度的影响。
图10为实施例6中木糖的浓度对葡萄糖和木糖醇浓度的影响。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：木糖还原酶和甲酸脱氢酶的诱导和表达
1、在NCBI数据库中查找到来自Candida tenuis CBS 4435(GenBank登录号：AF074484.1)的XR基因和来自Candida Boidinii的FDH基因(GenBank登录号：CAA09466.2)，按照大肠杆菌的密码子偏好对木糖还原酶基因和甲酸脱氢酶基因序列进行优化，优化后的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，核苷酸序列由金唯智公司合成。
稀有密码子的分析：稀有密码子主要通过软件E.coli Codon Usage Analysis2.0分析得到在大肠杆菌中的使用相对频率低于阈值(10‰)的密码子。优化稀有密码子：根据不同密码子在大肠杆菌中的使用频率将使用频率低于阈值的密码子进行优化。
2、将优化的木糖还原酶基因和甲酸脱氢酶基因分别亚克隆于质粒pET-28a的EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点之间，即构成重组质粒，质粒由金唯智公司合成，步骤如下：
(1)利用金唯智自有技术合成扩增DNA序列Candida tenuis和Candida Boidinii优化后的目的基因所需引物。
(2)使用步骤(1)得到的DNA扩增引物进行高保真聚合酶扩增，扩增后的目的片段使用胶回收试剂盒回收，Candida tenuis木糖还原酶基因和Candida Boidinii甲酸脱氢酶基因克隆位点为5'EcoRI/3'HindIII；载体pET-28a使用限制性内切酶EcoRI/HindIII酶切，保存待用。
(3)使用多段重组酶将Candida tenuis和Candida Boidinii***片段和上述以限制性内切酶EcoRI/HindIII双酶切线性化后的pET-28a酶切产物分别进行重组反应，取连接后产物转化至DH5a大肠杆菌感受态细胞(自制)中，将转化菌均匀涂布在含有卡那霉素抗生素的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。
多段重组体系：
基因片段6μL
酶切后载体3μL
多段重组酶(含Buffer)11μL
50℃反应1h
(4)通过菌落PCR进行阳性克隆鉴定。用无菌的牙签将单个菌落挑至200μLLB培养基中混匀，37℃培养3h。
(5)选取克隆作DNA测序
根据测序结果，确认正确克隆，需要制备质粒时，将对应的菌接种至4mL含有卡那霉素LB培养基中抽提质粒。木糖还原酶和甲酸脱氢酶重组质粒的图谱分别见图2和图3。
3、构建好的重组质粒通过热激转化导入E.coli BL21(DE3)菌株，具体步骤如下：
(1)从-80℃冰箱中取出E.coli BL21(DE3)的感受态细胞(Sangon Biotech OrderNO.B528414)，室温下使其解冻，解冻后立即置于冰上；
(2)加入步骤1得到的重组质粒DNA溶液(含量不超过50ng，体积不超过10μL)，轻轻摇匀，冰上放置30min后，42℃水浴90s，热激后迅速置于冰上冷却5min；
(3)向步骤(2)得到的体系中加入1mLLB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达卡那霉素抗性基因；
其中，LB液体培养基配方如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。
(4)将步骤(3)得到的菌液摇匀后取80μL涂布于含卡那霉素的LB筛选平板上，37℃培养12h。同时设置两组对照，对照一：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其他操作相同，正常情况下在含抗性的LB筛选平板上应该不生长；对照二：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取菌液涂布于不含抗性的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落；
其中，含卡那霉素的LB筛选平板的配方如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，卡那霉素终浓度50μg/mL。
LB平板的配方如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L。
4、挑取若干在含卡那霉素的LB筛选平板上成功生长的单菌落，转接入含抗性的LB液体培养基继续培养，提取质粒(质粒提取试剂盒购自TaKaRa公司)，用EcoRⅠ和HindⅢ进行酶切，30℃反应1h。
其中，含抗性的LB液体培养基的配方如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，卡那霉素终浓度50μg/mL。
5、将重组大肠杆菌转接于5mL含抗性的LB液体培养基中，37℃，200rpm条件下培养10h，取2mL转接于200mL含抗性的LB液体培养基中，37℃，200rpm条件下培养2h至OD600＝0.6～0.8，加入终浓度1mM IPTG，在20℃，200rpm条件下培养12h进行木糖还原酶和甲酸脱氢酶的诱导表达。
6、收集步骤5的菌体，分装，用100mM pH＝7的Tris-HCl缓冲液清洗两次，每次离心弃上清，离心条件：8000rpm，4℃，离心10min。然后进行超声破碎，超声条件：200W，15min。超声后的产物离心(8000rpm，4℃，离心20min)，得到的上清即为粗酶液，然后进一步浓缩。
其中，所述的浓缩为使用Ultra 30K超滤管将FDH的粗酶溶液浓缩；使用Ultra 10K超滤管将XR的粗酶溶液浓缩。浓缩后木糖还原酶的酶活为30.34U/mg，甲酸脱氢酶的酶活为：11.55U/mg。
7、将步骤6得到的粗酶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳结果见图4，与木糖还原酶的条带(约35KD)和甲酸脱氢酶(约48KD)相符，表明木糖还原酶和甲酸脱氢酶的诱导表达成功。
8、用紫外分光光度仪在340nm处检测酶活性，检测条件为：25℃，在pH＝7的100mM的Tris-HCl缓冲液中反应，酶活用1分钟内NADH的消耗量或生成量来表示。
对比例1：通过XR-FDH耦合反应生产木糖醇，按如下体系添加进行酶催化反应：
用甲酸钠作为FDH底物进行反应。FDH从甲酸钠中取出两个电子形成NADH，在溶液中留下CO2和OH-。随着反应的进行，XR-FDH反应混合物的pH逐渐升高，最终升至8.3(见图5)。反应将在25小时内停止，并且可以消耗1M木糖，木糖醇产量为143.1g/L。
对比例2：方法对比例1，所不同是通过XR-GDH耦合反应生产木糖醇
用葡萄糖作为GDH底物进行反应。GDH从葡萄糖中取出两个电子形成NADH，在溶液中留下葡萄糖酸和H+。随着反应的进行，从图6中明显看出XR-GDH反应混合物的pH逐渐降低至6.0以下，对酶催化产生抑制作用。反应逐渐变慢甚至停止，木糖醇产量低。其中，葡萄糖脱氢酶购自Amono公司，酶提取自Bacillus cereus。用紫外分光光度仪在340nm处检测酶活性，检测条件为：25℃，在pH＝7的100mM的Tris-HCl缓冲液中反应，酶活用1分钟内NADH的生成量来表示。
实施例2不同来源酶偶合表达
表1正交实验因素与水平
表2正交实验设计与结果的极差分析
在本实验中，选择FDH、GDH、XR三个因素的四个不同水平作为研究对象(见表1)。本实验反应体系为木糖2M、葡萄糖1M、甲酸钠1M、NADH 0.5mM、XR 5U/mL、FDH 1.5U/mL、GDH1.5U/mL。在本实验中，我们使用极差分析对酶耦合催化体系的正交实验结果进行计算，得到K1、K2、K3和k1、k2、k3和R。其中，K1、K2、K3为相应因素各水平实验结果的总和，k1、k2、k3为相应因素各水平实验结果的平均值，R值为各因素的极差，即各因素水平间最大值与最小值的差值。从表2得出本次实验的最佳条件为：A1B1C1。因此来自Candida tenuis CBS 4435(GenBank登录号：AF074484.1)的XR基因、来自Candida Boidinii的FDH基因(GenBank登录号：CAA09466.2)及来自Bacillus cereus的GDH基因催化底物效果最佳。产物中木糖醇的浓度可达278.4g/L，相对高的产率为11.6g/L/h。
实施例3通过XR-FDH-GDH耦合反应生产木糖醇，按如下体系添加进行酶催化反应：
本实验优选来自Candida tenuis CBS 4435(GenBank登录号：AF074484.1)的XR基因、来自Candida Boidinii的FDH基因(GenBank登录号：CAA09466.2)及来自Bacilluscereus的GDH基因。偶合XR-FDH-GDH反应实现反应酸碱自中和、pH稳定，该过程在纯水中进行不需要pH调节。图7显示，在纯水中，反应在24小时内完成，整个反应过程中pH保持在6.6±0.1。反应结束后加热使酶失活，经水系滤膜过滤后液相检测产物成分，液相条件：(1)层析柱为Aminex HPX-87C，流动相为超纯水，流速0.6mL/min，柱温80℃，用折光检测仪RID检测。结果显示木糖和葡萄糖已经完全转化。(2)层析柱为Aminex HPX-87H，流动相为5mMH2SO4，流速0.4mL/min，柱温45℃，用折光检测仪RID检测木糖醇含量。产物中木糖醇的浓度可达278.4g/L，相对高的产率为11.6g/L/h。
实施例4
方法同实例3，所不同是酶偶合系统中研究三种不同类型辅因子情况下的催化反应。辅因子三种情况分别为0.5mM NADH、0.5mM NADPH和0.25mMNADH+0.25mM NADPH。图8显示在24小时内0.5mM NADH体系中木糖和葡萄糖已经完全转化。同时，液相结果显示辅因子为0.5mM NADH体系中木糖和葡萄糖完全转化，辅因子为0.5mM NADPH体系反应在3小时内突然结束，并且木糖醇的产率小于0.1g/g。该反应未能继续，因为酶可能变性并且观察到在强酸性(pH＝4.27)中沉淀。辅因子为0.25mMNADH+0.25mM NADPH体系约85％的底物在pH最终在24小时降至4.27之前转化。
实施例5
方法同实例3，所不同是酶偶合系统中研究三种不同FDH和GDH酶活情况下的催化反应。FDH和GDH酶活三种组合情况分别为FDH 1.0U/mL+GDH 1.0U/mL、FDH 1.5U/mL+GDH1.5U/mL和FDH 2.0U/mL+GDH 2.0U/mL。
液相结果显示FDH 1.0U/mL+GDH 1.0U/mL体系木糖和葡萄糖未完全转化，反应不能在24小时内完成，导致生产率降低。FDH 1.5U/mL+GDH 1.5U/mL体系在24h内完全转化木糖和葡萄糖(见图9)。FDH 2.0U/mL+GDH 2.0U/mL体系虽然反应在较高的酶活性下进行，但反应进行快以至于0.5M甲酸钠被快速消耗，并且系统很快处于酸性环境中。因此，酶已经失活，反应不能继续进行。
实施例6
方法同实例3，所不同是酶偶合系统中研究四种不同木糖浓度情况下的催化反应。木糖浓度四种木糖浓度分别为1.5M、2M、2.5M和3M。液相结果显示在2M木糖以上清楚地观察到底物抑制。图10显示当木糖高于2M时，木糖醇的反应速度和最终浓度都明显降低，因此木糖的最佳浓度设定为2M。
结论：将实施例3～实施例6与对比例1和对比例2相比，结果表明，本发明采用由甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶和木糖还原酶构成的酶偶合反应系统催化生产木糖醇，其在实现反应体系中酸性和碱性产物的相互中和的同时，木糖醇的产量以及产率均远高于单独的使用甲酸脱氢酶或葡萄糖脱氢酶。这是因为，构建的由甲酸脱氢酶(FDH)，葡萄糖脱氢酶(GDH)和木糖还原酶(XR)组成的偶联酶系统，其中由FDH产生的碱性产物GDH产生的酸性产物在辅因子再生过程中可以相互中和。建立了酸碱自中和、pH稳定的反应过程。此时，体系中的酶能够充分发挥催化能力。而对比例中，pH因无法中和，随反应进行升高或降低，影响酶活，从而木糖醇产量也低。
本发明提供了一种利用pH自平衡催化体系制备木糖醇的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种利用pH自平衡催化体系制备木糖醇的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 966
<212> DNA
<213> 木糖还原酶(Candida tenuis)
<400> 1
agcgccagca tcccggatat caaactgagc agcggtcatc tgatgccgag cattggcttt 60
ggctgctgga aactggccaa tgcaaccgcc ggcgaacagg tgtatcaggc aattaaggcc 120
ggctatcgcc tgtttgacgg cgcagaagac tacggcaatg aaaaagaagt tggcgatggc 180
gttaaacgcg ccattgatga aggcctggtg aaacgcgagg agatttttct gaccagcaaa 240
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gatctgaaag tggactatgt tgatctgttt ctgattcatt ttccgattgc atttaagttt 360
gtgccgattg aagagaagta tccgccgggc ttctattgcg gcgacggcaa caacttcgtt 420
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cgttgggcag cccagcgtgg tatcgcagtg attcctaaaa gtaacctgcc ggagcgtctg 840
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gtgtaa 966
<210> 2
<211> 1095
<212> DNA
<213> 甲酸脱氢酶(Candida boidinii)
<400> 2
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catgacaaaa aataa 1095