阅读说明：本技术 一种氢化可的松的生产发酵工艺 (Production fermentation process of hydrocortisone ) 是由 孙琼芳 付林 徐明琴 冯蕾 朱云 王霜 刘威 田玉林 于 2019-12-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种氢化可的松的生产发酵工艺,包括如下步骤：S1：菌种传代：选取蓝色犁头霉,培养温度为28℃摄氏度,培养时间为7～8天,至长出灰色的气生菌丝；S2：菌种扩大培养：将步骤(1)的菌种接入已灭菌的种子罐,进行一级培养；S3：发酵培养：在无菌条件下,将步骤S3中培养出的种子液接入发酵罐,发酵罐内放置有第二培养基；发酵过程中,检测发酵液的PH值小于3.8、DO值大于20％、PMV大于10％、还原糖的含量在1.0～2.0％之间、游离氨基氮的含量40～150mg/ml之间、游离磷酸根的含量20～500ug/ml之间；S4：底物转化。本发明较大程度地提高了氢化可的松生产的效率,降低了生产的综合成本。(The invention discloses a production fermentation process of hydrocortisone, which comprises the following steps: s1: and (3) strain passage: selecting Absidia coerulea, culturing at 28 ℃ for 7-8 days until gray aerial hyphae grow out; s2: and (3) strain amplification culture: inoculating the strain obtained in the step (1) into a sterilized seeding tank for primary culture; s3: fermentation culture: under the aseptic condition, the seed solution cultured in the step S3 is inoculated into a fermentation tank, and a second culture medium is placed in the fermentation tank; in the fermentation process, detecting that the pH value of the fermentation liquor is less than 3.8, the DO value is more than 20%, the PMV is more than 10%, the content of reducing sugar is 1.0-2.0%, the content of free amino nitrogen is 40-150 mg/ml, and the content of free phosphate radical is 20-500 ug/ml; s4: and (4) substrate conversion. The invention improves the production efficiency of hydrocortisone to a great extent and reduces the comprehensive cost of production.)

一种氢化可的松的生产发酵工艺

技术领域

本发明涉及氢化可的松生产工艺改进技术领域，尤其涉及一种氢化可的松的生产发酵工艺。

背景技术

我国自60年代初采用蓝色犁头霉(Absidiacoerulea)做为工业化生产氢化可的松的菌株以来,创造了显著的经济效益。但其生物转化过程中一直存在着副产物多、氢化可的松收率低的问题。为提高产物的转化率,不少科研工作者进行了大量研究，包括第一个阶段诱变育种或发酵工艺的改进，第二个阶段底物转化。目前第二个阶段底物转化主要有以下六种方法：(1)一步转化法；(2)静息细胞转化法；(3)协同转化法；(4)固定化细胞转化技术；(5)无细胞体系转化法；(6)原生质体转化技术。

发明内容

本发明提出了一种氢化可的松的生产发酵工艺，以解决上述背景技术中提出的问题。

本发明提出了一种氢化可的松的生产发酵工艺，包括如下步骤：

S1：菌种传代：选取蓝色犁头霉，蓝色犁头霉采用斜面传代，培养基为PDA培养基，培养温度为28℃摄氏度，培养时间为7～8天，至长出灰色的气生菌丝；

S2：菌种扩大培养：将步骤(1)的菌种接入已灭菌的种子罐，且种子罐内放置有第一培养基，进行一级培养，控制发酵温度28±0.5℃，搅拌0～500rpm，压力0.02～0.08Mpa，培养10～24小时；

S3：发酵培养：

在无菌条件下，将步骤S3中培养出的种子液接入发酵罐，发酵罐内放置有第二培养基，且控制发酵温度28±0.5℃，搅拌0～500rpm，压力0.02～0.08Mpa，培养8～24小时；

发酵过程中，检测发酵液的PH值小于3.8、DO值大于20％、PMV大于10％、还原糖的含量在1.0～2.0％之间、游离氨基氮的含量40～150mg/ml之间、游离磷酸根的含量20～500ug/ml之间，400倍光学显微镜下菌丝着色深、分枝多而粗、孢子囊大部分萌发、部分菌丝主干略有膨大且透明；

S4：底物转化：当微生物培养符合要求时，开始调节发酵液的PH值，控制在5.4～5.8之间，温度控制在26±0.5℃，搅拌控制在100～300rpm，空气流量控制在20～400L/min，罐压控制在0～0.02Mpa，待系统稳定后，加入用水:乙醇＝1:4的溶液溶解完全的R.S.A溶液，R.S.A重量与发酵液体积比值为(w/v)＝2.5g/L，加入底物以后,调节通气比为1:0～0.5,搅拌转速为100～500rpm,控制温度为28±0.5℃，在该条件下，转化反应15～25小时，R.S.A含量(HPLC)小于1％时放罐。

优选的，在步骤S2中，第一培养基配方，按百分比计为：葡萄糖0.8～1.5％、玉米浆0.5～1.6％、酵母膏0.1～1.2％、硫酸铵0.1～1.0％、硫酸镁0.01～0.1％、豆油0.01～0.1％、其余为水；pH值6.1～6.5。

优选的，在步骤S3中，第二培养基配方，按百分比计为：葡萄糖0.5～1.5％、玉米浆0.5～1.5％、酵母膏0.1～0.6％、硫酸铵0.1～1.0％、硫酸镁0.01～0.1％、豆油0.01～0.1％、其余为水；pH值6.1～6.5。

优选的，所述的培养基灭菌温度为118～125摄氏度，时间为30分钟。

本发明提出的一种氢化可的松的生产发酵工艺，有益效果在于：本发明通过对发酵配方中氮源和酶的活性因子的浓度的优化，搅拌桨型号的调整以及在发酵过程对搅拌转速和空气流量的优化调控，在保证氢化可的松产品产量和品质的前提下，使氢化可的松的生物转化反应过程速率大幅度提高；在底物RSA浓度不低于2.5g/L(RSA重量/发酵液总体积)的浓度条件下，生物转化反应18～24小时后，RSA残留量小于1％(HPLC)，氢化可的松占比大于70％，最大副产物表氢化可的松占比小于12％；微生物培养的移种时机、底物转化开始时机及放罐最佳时机的确定较大程度地提高了氢化可的松生产的效率，降低了生产的综合成本。

附图说明

图1为本发明发酵液中目的产物氢化可的松和主要副产物表氢化可的松的HPLC图。

图2为本发明发酵液中目的产物氢化可的松和主要副产物表氢化可的松的含量及比值对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来对本发明做进一步说明。

实施例1

本发明提出了一种氢化可的松的生产发酵工艺，包括如下步骤：

在培养基为PDA的培养基试管斜面上，将蓝色犁头霉菌在无菌条件下接种于该种培养基上，控制培养温度为28±0.5℃，培养时间为7～8天，以长出充满试管的灰色孢子丝，然后将上述菌种的孢子在无菌条件下用一定量的无菌水洗脱，无菌孢子液另存于无菌接种瓶中；再将上述无菌孢子液在无菌条件下接入已灭菌好的装有10L培养基的种子罐中，控制搅拌转速0～400rpm，无菌空气流量0～30L/min，培养温度28±0.5℃，压力0.04Mpa，培养时间15小时。种子罐内的第一培养基配方按百分比为：葡萄糖1.0％，玉米浆粉0.3％，酵母膏0.2％，硫酸铵0.2％，硫酸镁0.02％，豆油0.05％，其余为水，pH值为6.3，培养基在121℃灭菌30分钟。

再将上述种子液体积的三分之一移入已灭菌好的装有23L培养基的发酵罐中进行培养，接种后的发酵体积为26L，控制搅拌转速0～400rpm，无菌空气流量0～70L/min，培养温度28±0.5℃，压力0.04Mpa，培养时间10小时。发酵罐内的第二培养基配方按百分比为：葡萄糖1.3％，玉米浆粉0.4％，酵母膏0.2％，硫酸铵0.2％，硫酸镁0.02％，豆油0.05％，其余为水，pH值为6.3，培养基在121℃灭菌30分钟。检测得到发酵液中还原糖含量、氨基氮含量、磷含量。

待发酵罐培养10小时后，用20～30％液碱将发酵液pH调至5.6，罐温降至25±0.5℃，调整空气流量10L/min，搅拌转速60rpm，控制溶解氧不低于20％，罐压0.03Mpa；将65g含量大于98％的R.S.A固体粉末用80％(v/v)乙醇溶液(乙醇:水＝4:1)840mL在60～79℃下完全溶解后，加入到上述发酵液中开始进行生物转化反应，同时调整发酵罐温度为28±0.5℃。

生物转化反应进行14小时以后，每隔2小时取样送检，检测R.S.A、氢化可的松和表氢化可的松的含量。HPLC数据中R.S.A的面积百分比小于1％时，结束反应。该批次实例中生物转化反应进行22.8小时放罐。

发酵液中底物R.S.A、目的产物氢化可的松和主要副产物表氢化可的松的HPLC图见图1，生物转化反应过程发酵液中R.S.A、目的产物氢化可的松和主要副产物表氢化可的松的含量对比图见图2所示。

发酵液目的产物氢化可的松检测方法：(参照中国药典2015年版)

1、色谱系统

仪器：HPLC(岛津LC-20A/Agilent1200)

检测器：UV检测器

检测波长：245nm

柱温：30℃

流速：1.0ml/min

色谱柱：C18(250*4.6mm,5um)

进样体积：10ul

流动相：

MPA:33％乙腈

MPB:乙腈

洗脱梯度：

时间(t/min)	MPA(％)	MPB(％)
			0	100	0
5	95	5
			10	40	60
20	40	60
			20.01	100	0
25	100	0

氢化可的松保留时间大约在9±1min，若保留时间不在此范围内，可适当调节流动相比例或改变流速。

2、对照品溶液配制：

精密称定氢化可的松对照品约20mg，置100ml量瓶中，加无水乙醇溶解稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；同法分别配制表氢化可的松、R.S.A的对照品溶液。

3、供试品溶液配制：

取发酵液适量，准确吸取一定体积与无水甲醇以(v/v)4:1混合，摇匀10min，于4000r/min离心5min，取上清液，再于12000r/min离心5min，取上清即得。

实施例2

本发明提出了一种氢化可的松的生产发酵工艺，包括如下步骤：

在培养基为PDA的培养基试管斜面上，将蓝色犁头霉菌在无菌条件下接种于该种培养基上，控制培养温度为28±0.5℃，培养时间为7～8天，以长出充满试管的灰色孢子丝，然后将上述菌种的孢子在无菌条件下用一定量的无菌水洗脱，无菌孢子液另存于无菌接种瓶中；再将上述无菌孢子液在无菌条件下接入已灭菌好的装有500L培养基的种子罐中，控制搅拌转速0～200rpm，无菌空气流量0～300L/min，培养温度28±0.5℃，压力0.04Mpa，培养时间15小时。种子罐内的第一培养基配方按百分比为：葡萄糖1.0％，玉米浆粉0.3％，酵母膏0.2％，硫酸铵0.2％，硫酸镁0.02％，豆油0.05％，其余为水，pH值为6.3，培养基在121℃灭菌30分钟。

再将上述种子液全部移入已灭菌好的装有4500L培养基的发酵罐中进行培养，接种后的发酵体积为5000L，控制搅拌转速0～200rpm，无菌空气流量0～700L/min，培养温度28±0.5℃，压力0.04Mpa，培养时间10小时。发酵罐内的第二培养基配方按百分比为：葡萄糖1.3％，玉米浆粉0.4％，酵母膏0.2％，硫酸铵0.2％，硫酸镁0.02％，豆油0.05％，其余为水，pH值为6.3，培养基在121℃灭菌30分钟。检测得到发酵液中还原糖含量、氨基氮含量、磷含量。

待发酵罐培养10小时后，用20～30％液碱将发酵液pH调至5.6，罐温降至25±0.5℃，调整空气流量260L/min，搅拌转速60rpm，控制溶解氧不低于20％，罐压0.03Mpa；将12.50kg含量不低于98％的R.S.A固体粉末用80％(v/v)乙醇溶液(乙醇:水＝4:1)160L在60～79℃下完全溶解后，加入到上述发酵液中开始进行生物转化反应，同时调整发酵罐温度为28±0.5℃。

生物转化反应进行14小时以后，每隔2小时取样送检，检测R.S.A、氢化可的松和表氢化可的松的含量。HPLC数据中R.S.A的面积百分比小于1％时，结束反应。该批次实例中生物转化反应进行24.7小时放罐。

发酵液中底物R.S.A、目的产物氢化可的松和主要副产物表氢化可的松的HPLC图见图1，发酵液中R.S.A、目的产物氢化可的松和主要副产物表氢化可的松的含量对比图见图2所示。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。