阅读说明：本技术 一种比较分析不同牛支原体菌株毒力的方法 (Method for comparatively analyzing virulence of different mycoplasma bovis strains ) 是由 郝华芳 陈胜利 储岳峰 颜新敏 蔡莉娟 刘永生 于 2019-09-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种不同牛支原体菌株毒力比较分析方法。本发明的比较分析牛支原体菌株毒力的方法是将等活菌菌落浓度的经复苏传代的待比较分析的各待测牛支原体株、牛支原体标准株接种于鸡胚上,再将接种后的鸡胚置于恒温箱培养,定时检测鸡胚状态及死亡情况,统计接种各个菌株的卵黄囊接种鸡胚致死率、尿囊腔接种鸡胚致死率,结合死亡鸡胚尿囊液牛支原体分离鉴定情况,以此进行比较判定。本发明的方法具有操作简单、成本低、实验动物便宜且易得、无需复杂动物饲养管理条件、耗时短、重复性好等优点,极大减少动物试验工作量,避免了使用大动物牛所存在试验操作复杂、试验周期长、工作量大、成本昂贵、实验动物个体差异较大且要求高、重复性不理想等不足。(The invention discloses a comparative analysis method for virulence of different mycoplasma bovis strains. The method for comparatively analyzing the toxicity of the mycoplasma bovis strains comprises the steps of inoculating each mycoplasma bovis strain to be comparatively analyzed and a mycoplasma bovis standard strain which are subjected to resuscitative passage and are to be comparatively analyzed and have the same viable bacteria colony concentration on chick embryos, then placing the inoculated chick embryos in a constant temperature box for culture, regularly detecting the state and the death condition of the chick embryos, counting the lethality rate of the chick embryos inoculated with yolk sacs of each inoculated strain and the lethality rate of the chick embryos inoculated with allantoic cavities, and combining the separation and identification conditions of the mycoplasma bovis of the dead chick embryos to carry out comparison and judgment. The method has the advantages of simple operation, low cost, cheap and easily-obtained experimental animals, no need of complex animal feeding and management conditions, short time consumption, good repeatability and the like, greatly reduces the workload of animal experiments, and avoids the defects of complex operation, long experiment period, large workload, high cost, large individual difference and high requirement of experimental animals, unsatisfactory repeatability and the like when large animal cattle are used.)

一种比较分析不同牛支原体菌株毒力的方法

技术领域

本发明涉及一种同种不同微生物菌株某种性质的比较方法，特别是一种不同牛支原体菌株毒力比较分析方法。

背景技术

支原体(mycoplasma)是一类没有细胞壁、高度多形性、能通过滤菌器的原核细胞型微生物，广泛存在于人体或动物体内，部分具有致病性。牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)是一种重要的病原体，可感染奶牛、黄牛，主要引起犊牛肺炎、关节炎、奶牛***炎等。牛支原体是牛呼吸疾病综合征的一个重要病原，同时也是奶牛***炎的重要病原。目前牛支原体感染在全球范围存在，给养牛业造成巨大经济损失，严重制约着养牛业的发展。牛支原体常常可以从患肺炎犊牛肺脏、***炎奶样、患关节炎牛关节液中分离到，此外，部分健康牛上呼吸道如鼻腔也可分离到牛支原体。牛支原体在我国广泛存在并在多省市流行，给我国奶牛和黄牛养殖业健康可持续发展造成严重威胁

关于牛支原体的毒力，目前研究主要使用牛体，也有家兔、小鼠等其他动物模型的尝试。牛支原体流行菌株众多，基因型有差异，对牛体的致病力存在很大差异。目前，牛支原体的毒力测定主要依赖实验动物牛体，通过牛感染试验来区分不同牛支原体菌株的毒力差异。毒力菌株筛选是灭活疫苗研发中的关键环节，然而，实验动物牛成本高、饲养管理要求高、试验操作难度和强度大、重复性较差等缺点。在牛支原体毒力基因挖掘和鉴定研究、致病机制研究方面，通过突变株(或传代株)与野生株的毒力比较，可以筛选确定毒力基因或蛋白并进行功能研究。因此，建立一种简单分析牛支原体毒力的方法对该病研究和防控具有重要意义。

发明内容

本发明提供一种比较分析不同牛支原体菌株毒力的方法。

本发明的比较分析牛支原体菌株毒力的方法是将等活菌菌落浓度的经复苏传代的待比较分析的各待测牛支原体株、牛支原体标准株接种于鸡胚上，再将接种后的鸡胚置于恒温箱培养，定时检测鸡胚状态及死亡情况，统计接种各个菌株的卵黄囊接种鸡胚致死率、尿囊腔接种鸡胚致死率，结合死亡鸡胚尿囊液牛支原体分离鉴定情况，以此进行比较判定。

优选地，本发明的比较分析牛支原体菌株毒力的方法是：

(1)SPF鸡胚准备：准备7～8日龄的血管清晰、活力旺盛健康的SPF鸡胚；

(2)牛支原体标准株与待测株菌液准备：复苏并传代牛支原体标准株PG45株、待测株，37℃恒温培养箱培养，待牛支原体生长旺盛时，8000～12000rpm离心15min，用生理盐水浓缩菌液至菌液浓度5.0～9.0×10⁹CFU/ml；

(3)鸡胚的接种与观测：用制备好的各待测牛支原体株、牛支原体标准株PG45株菌液接种鸡胚，每个菌株按0.2ml/枚卵黄囊接种于SPF鸡胚，每个菌株接种10枚鸡胚，试验组接种后，孵化箱孵化，每天观察鸡胚状态，记录死亡情况，剖检死亡鸡胚，收集尿囊液用于病原分离和PCR鉴定；

(4)统计分析与结果判定：统计每个菌株的卵黄囊接种、尿囊腔接种鸡胚死亡情况，鸡胚死亡数，计算每个菌株的卵黄囊接种鸡胚致死率、尿囊腔接种鸡胚致死率，结合鸡胚剖检情况，死亡鸡胚尿囊液牛支原体分离鉴定情况，比较待测株与牛支原体标准株PG45株或/和各待测牛支原体，综合比较分析与结果判定。

本发明的比较分析牛支原体菌株毒力的方法可在牛支原体疫苗筛选或制备中的应用。

本发明方法在牛支原体致病机制或毒力研究中的应用。

本发明的有益效果为：本发明的方法具有操作简单、成本低、实验动物便宜且易得、无需复杂动物饲养管理条件、耗时短、重复性好等优点，极大减少动物试验工作量，避免了使用大动物牛所存在试验操作复杂、试验周期长、工作量大、成本昂贵、实验动物个体差异较大且要求高、重复性不理想等不足。因此，本方法适用于可用于简单分析不同牛支原体菌株的毒力，也可用于在疫苗研发中的菌株筛选，以及在牛支原体毒力基因挖掘和鉴定研究中的应用。

具体实施方式

本发明的具体实施如下：

(1)SPF鸡胚准备：准备7～8日龄的健康SPF鸡胚(血管清晰、活力旺盛)，于孵化箱孵化(温度37.0～37.5℃，湿度50％)，于接种前照蛋，弃去无精蛋，死胚及弱胚。

(2)牛支原体标准株与待测株菌液准备：将牛支原体标准株PG45株(美国菌种保藏中心ATCC，编号ATCC 25523)、待测株牛支原体08M株(中国农业科学院兰州兽医研究所分离保存)，分别接种改良Thiaucourt's培养基，37℃恒温培养箱培养，待牛支原体生长旺盛时(待培养基的颜色变黄，或pH值降至6.8～7.0时)，8000rpm离心15min，用生理盐水浓缩菌液至菌液浓度约7.0×10⁹CFU/ml。

(3)鸡胚的接种与观测、数据分析：将制备好的牛支原体菌液接种鸡胚，每个菌株卵黄囊接种10枚SPF鸡胚，每个菌株尿囊腔接种10枚SPF鸡胚，0.2ml/枚。同时设阴性对照组，以同种方式接种生理盐水，0.2ml/枚，共20枚；空白对照组鸡胚未做任何处理，10枚；接种后，孵化箱孵化，每天观察鸡胚1次，观察鸡胚状态，是否有血管游离或间隙模糊，观察鸡胚死亡情况并记录。阴性对照和空白对照鸡胚均无死亡；剖检死亡鸡胚，收集尿囊液用于检测病原(病原分离、PCR鉴定)。统计每个菌株的卵黄囊接种、尿囊腔接种鸡胚死亡数，计算每个菌株的卵黄囊接种鸡胚致死率、尿囊腔接种鸡胚致死率。

牛支原体PCR鉴定(uvrC基因)：

SEQ ID No.1上游引物：5’-TTACGCAAGAGAATGCTTCA-3’，

SEQ ID No.2下游引物：5’-TAGGAAAGCACCCTATTGAT-3’；

PCR体系：PCR mix 12.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、DNA 2μL，ddH2O 8.5μL，25μl体系；PCR反应条件：95℃5min，35个循环(95℃30s，52℃30s，72℃1min40s)，72℃5min，4℃保存。PCR扩增目的片段1626bp。

卵黄囊接种结果见表1，牛支原体标准株PG45株鸡胚死亡时间在1～10d，鸡胚致死率为80％(8/10)，接种7d死亡率为70％；而牛支原体08M株鸡胚死亡时间在1～12d，鸡胚致死率为70％(7/10)，接种7d死亡率为50％。卵黄囊接种牛支原体标准株PG45株鸡胚致死率(80％)高于牛支原体08M株(70％)。

尿囊腔接种结果见表2，牛支原体标准株PG45株鸡胚死亡时间在1～14d，鸡胚致死率为70％(7/10)；而牛支原体08M株鸡胚死亡时间在1～7d，鸡胚致死率为30％(3/10)。可以看出，尿囊腔接种，牛支原体标准株PG45株鸡胚致死率(70％)明显高于牛支原体08M株(30％)。

死亡鸡胚尿囊液接种改良Thiaucourt's培养基，颜色均变黄；死亡鸡胚尿囊液进行PCR鉴定，PCR均阳性。

对牛支原体待测株、标准株PG45株鸡胚致死情况统计分析，综合卵黄囊接种鸡胚致死率、尿囊腔接种鸡胚致死率结果，可以看出，牛支原体标准株PG45株、牛支原体08M株均能致死鸡胚，死亡鸡胚尿囊液均可分离到牛支原体病原；牛支原体标准株PG45株卵黄囊接种鸡胚致死率、尿囊腔接种鸡胚致死率均高于牛支原体08M株。结果表明，牛支原体标准株PG45株毒力比08M株强，08M株具有较强毒力，这与文献报道牛支原体标准株PG45株对犊牛有较强致病力且强于多个牛支原体国内分离株，牛支原体国内分离株08M株也能引起犊牛致病结果相符。本发明的方法测定牛支原体毒力成本低、操作简便、实验动物便宜易得、重复性好等优点。

表1

表2

应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种比较分析不同牛支原体菌株毒力的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列 上游引物(PR)

<400> 1

ttacgcaaga gaatgcttca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列 下游引物(PF)

<400> 2

taggaaagca ccctattgat 20