阅读说明：本技术 一种锰过氧化物酶的共交联固定化方法 (Co-crosslinking immobilization method of manganese peroxidase ) 是由 吴嘉沁 张瑞丰 李艳 肖通虎 龙能兵 于 2019-05-07 设计创作，主要内容包括：本发明是关于一种锰过氧化物酶的共交联固定化方法。使用油溶性的异氰脲酸三丙烯酸酯作为交联剂,水相中的反应物为含有氨基的锰过氧化物酶以及胺化环氧树脂与β-环糊精形成的超分子复合物,利用双键与氨基的迈克尔加成反应,在较低的温度下发生共交联聚合反应,制备出不同负载量的固定化锰过氧化物酶。通过控制交联程度,提高分散性,改善其内部的传质微环境,该固定化酶具有较高的催化活性,负载量在78mg酶/g载体时具有最高的比活性,达到游离酶的94％。(The invention relates to a co-crosslinking immobilization method of manganese peroxidase, which uses oil-soluble isocyanuric acid triacrylate as a crosslinking agent, reactants in a water phase are manganese peroxidase containing amino and a supermolecular complex formed by aminated epoxy resin and β -cyclodextrin, and the co-crosslinking polymerization reaction is carried out at a lower temperature by utilizing the Michael addition reaction of double bonds and amino to prepare immobilized manganese peroxidase with different loading amounts.)

一种锰过氧化物酶的共交联固定化方法

技术领域

本发明涉及固定化酶生物催化技术领域，尤其是一种锰过氧化物酶的共交联固定化方法，该新型固定化锰过氧化物酶可专门用于燃料脱色及木质素清除。

背景技术

锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)一种能够氧化木质素的过氧化物酶(等电点为4.5)，它是一种需要H₂O₂的血红素糖蛋白。二十世纪八十年代，研究者先后从白腐菌培养液中提取锰过氧化物酶，锰过氧化物酶可将Mn²⁺氧化为Mn³⁺，Mn³⁺通过螯合作用与有机酸结合而变成稳定的高氧化还原电势。锰过氧化物酶的晶体结构中含有17％左右的中性糖类以及80％以上的酸性氨基酸。锰过氧化物酶分子量在38～62.5kDa之间，几乎所有纯的锰过氧化物酶分子量在45kDa左右。

锰过氧化物酶的底物专一性弱，具有氧化降解各类芳香族化合物的独特能力，在纸浆的生物漂白、有机污染物的降解、染料的脱色、褐煤的生物降解、农业废弃物的处理和催化聚合反应等方面得到了较多的研究与应用。工业“三废”、化学农药分解时往往产生毒性物质，锰过氧化物酶对许多结构不同的高毒性、高分子难降解有机化学物质具有光谱的降解能力，如杀虫剂，包括有机氯化物染料、硝基***、氰化物、多环芳烃、二氧六环类、四氯化碳等，经过氧化、还原、还原脱氯、羟化、环断裂等逐步降解为CO₂和其它降解产物。染料是纺织、印染等染色废水的主要污染物，染料脱色是印染废水治理的关键环节。锰过氧化物酶经H₂O₂引发一系列自由基链反应，依靠氧化还原反应对染料进行脱色、降解和矿化。在农作物及树木等植物中，木质素大约占15％～20％。锰过氧化物酶只降解其中的木质素而保留纤维素和半纤维素，此纤维素和半纤维素可被利用于制纤维二糖和多聚糖等药品的原料。

固定化酶就是通过化学手段将水溶性的游离酶变成不溶性的固体酶，固定化有很多优点：例如固定化的锰过氧化物酶可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低；固定化的锰过氧化物酶极易与反应体系分离，简化了操作工艺；固定化的锰过氧化物酶其储存稳定性和热稳定性都得到了提高；固定化酶的催化反应过程更易控制；固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作。酶的交联是一种非常有效的固定化方法，其所形成的产物称为交联酶聚集体。最常用的交联剂为水溶性的戊二醛，它反应活性高，用量难以控制，很容易造成酶的过度交联，使酶的活性有很大的损失，此外，传统的交联法往往须要在交联之前使酶分子沉淀聚集，这样既会造成酶的浪费，又会阻断传质通道，无法充分发挥酶的催化效率。

本发明专利提供一种共交联的方法用于锰过氧化物酶的固定，利用锰过氧化物酶分子上的氨基与丙烯酸酯类交联剂发生迈克尔加成反应，同时还引入含有β-环糊精的结构单元，这样既能为催化反应提供空间，降低传质阻力，同时还能增加亲水性，提高酶的活性。使用这种共交联方法，酶的负载量和催化活性高，稳定性好，固定化酶呈颗粒状，催化反应容易操作。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种锰过氧化物酶的固定化方法，这种方法是基于锰过氧化物酶与另一种含有机胺的分子复合物的共交联反应，交联反应的基础是丙烯酸酯与氨基的迈克尔加成，该反应在常温下就能快速发生，因而不会对酶的整体结构造成破坏，共交联法负载效率高，稳定性好，同时还能调节固定化酶的微环境，使其保持高的催化活性。

1、本发明解决技术问题所采用的技术方案为：一种水/油两相的交联反应，油相为交联剂异氰脲酸三丙烯酸酯，其结构如图1所示，水相中的反应物为锰过氧化物酶及β-环糊精与胺化环氧树脂的超分子复合物，固定化酶的负载量是通过锰过氧化物酶的浓度来调节。

非常有益的是，通过多相反应可以控制交联程度，避免酶的过度交联，同时交联剂含有多个双键，使交联产物形成支化结构，更大限度地阻止酶的聚集，增强酶的活力；

非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物与酶分子产生强的亲和力，导致交联反应能使锰过氧化物酶能以接近100％的利用率被固定化，交联反应发生后，液相中几乎没有残留的锰过氧化物酶；

非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物具有弯曲的刚性结构，它带来了充足的自由体积，为生物大分子与底物相互作用提供传质通道，同时为生物大分子的构象提供稳定性，从而提高了固定化酶的催化活性。

2、本发明解决另一个技术问题所采用的技术方案为：一种上述固定化酶的制备方法，其特征步骤为：1)将双酚A环氧树脂(牌号为E-44，环氧值为0.44，数均分子量为454)、甲醇和二乙烯三胺三种组分按照2∶2∶1的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；3)将锰过氧化物酶溶解在pH＝7.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的锰过氧化物酶溶液与上述分子复合物水溶液按照55mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；5)在搅拌下将1.2g异氰脲酸三丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置6～7小时，过滤后即得到不同负载量的固定化锰过氧化物酶的产物。

非常有益的是，交联剂中的一个双键首先与分子复合物上的氨基发生反应，形成具有乳化作用的产物，油相在反应启动后会很快分散直至消失，锰过氧化物酶首先通过吸附方式进入聚合物中，然后交联剂上的双键与酶上的氨基进行缓慢的反应，最终变成共交联的固定化酶产物；

非常有益的是，利用β-环糊精与疏水苯环的相互作用引入亲水基团，避免使用化学键，并通过交联反应使β-环糊精无法脱离聚合物，使固定化酶的制备简化；

非常有益的是，整个聚合过程中不加入其它有机溶剂，不需要更高的温度。

本发明的优点在于：1)利用水/油双相反应实现酶的交联，降低了酶的交联程度；2)引入β-环糊精分子复合物改善了固定化锰过氧化物酶的微环境，提高了酶的催化反应活性；3)共交联固定法能使锰过氧化物酶以极高的效率被固定化；4)采用多官能度的交联剂能使固定化产物形成支化结构，阻止酶的聚集，提高酶的催化性能。

具体实施方式

酶的固定化

1)将双酚A环氧树脂(牌号为E-44，环氧值为0.44，数均分子量为454)、甲醇和二乙烯三胺三种组分按照2∶2∶1的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；

2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；

3)将锰过氧化物酶溶解在pH＝7.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；

4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的锰过氧化物酶溶液与上述分子复合物水溶液按照55mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；

5)在搅拌下将1.2g异氰脲酸三丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，同时油相消失，停止搅拌使反应体系放置6～7小时，过滤后即得到不同负载量的固定化锰过氧化物酶的产物。

固定化酶的负载量测定：

由于共交联法固定锰过氧化物酶后，反应残留液中测不到锰过氧化物酶的活性，说明经过交联后，锰过氧化物酶全部进入到固体颗粒中，所以负载量的计算用以下公式：

其中：C为共交联酶溶液的浓度(mg/mL)；V为共交联酶溶液的体积(mL)；m为固定化酶干态质量(g)。

酶活力测定：

(1)游离酶活力测定：反应体系含50mmol/L pH为4.5的丙二酸-丙二酸钠缓冲液3.4mL，1.6mmol/L的MnSO₄溶液0.1mL，酶液0.4mL，室温下加入1.75mmol/L的0.1mL H₂O₂启动反应，测定反应最初4min内在270nm处的吸光度，以H₂O代替H₂O₂作为对照。按下式测定酶活力，每1min使1μmol/L的Mn²⁺转化为Mn³⁺所需的酶量为一个酶活单位。

式中：X为酶活力(U)；ΔA为所测定的每分钟吸光度的变化；ε为常数，对该方法而言ε₂₇₀＝11590[(mol/L)·cm]^-1。

(2)固定化酶活力测定：以固定化酶(湿重)代替酶液，按式(测定上清液酶活力即为固定化酶活力。

相对活性：

将固定化酶的活性与游离酶的活性之比定义为相对活性。

实验结果：

实验一共得到7个不同负载量的固定化锰过氧化物酶的样品，分别测定它们的活力，计算得到它们的相对活性。图2是相对活性与负载量的关系，当负载量为78mg酶/g载体时其相对活性达到最大值，其比活力是游离酶的94％，这个结果说明锰过氧化物酶在这个范围处于非常适合催化的状态。当负载量小于78mg酶/g载体时，固定化酶的活性逐渐随负载量的增加而增大，这主要是因为，酶的含量较低时，聚合物结构比较紧密，酶的催化活性不容易发挥出来，随着酶含量增加，聚合物的结构变的松散，酶与底物的接触机会增大，其相对活性也随之提高。当负载量大于78mg酶/g载体时，固定化酶的活性逐渐随负载量的增加而变小。一般来说交联反应都会使酶的构象变得僵硬，从而活性降低，本发明专利的共交联固定法能使酶的微环境得到改善，这与引入环糊精超分子结构单元有关，它使固定化酶的结构变的松散，同时还改善了内部的亲水性，此外支化程度高的交联剂还能提高酶的分散性，避免了酶的聚集，从而提高其催化活性。但是当负载量过大时，酶的聚集变得不可避免，所以其活性又会变小。

我们以负载量为78mg酶/g载体的样品为研究对象，测定固定化酶与游离酶溶液的储存稳定性，其结果如图3所示，以时间为零的起始状态的活性为100％，在4℃，pH＝7.0条件下经过28天的储存，游离酶溶液只残留49％的活性，固定化酶能残留84％的活性，所以在储存稳定性方面，固定化酶要明显优于游离酶。

附图说明

图1 交联剂的化学结构。

图2 固定化的锰过氧化物酶催化活性与其负载量的依赖关系。

图3 固定化与游离的锰过氧化物酶储存稳定性比较。