阅读说明：本技术 一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法 (Preparation method of 6, 7, 8-trihydroxy coumarin ) 是由 李笃信 赵磊 张健 朱雪雪 于 2019-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种6,7,8-三羟基香豆素的制备方法,该方法包括：(1)以秦皮苷或/和秦皮素为起始原料,将所述原料加入第一溶液中使其溶解,获得原料液；(2)动物粪菌制作载体：在无菌条件下收集动物的新鲜粪便,加入生理盐水匀浆,离心后取上清液；(3)厌氧培养：将所述上清液加入到营养肉汤中,厌氧恒温培养后,加入所述原料液,再加入厌氧培养液,厌氧恒温培养,获得第一培养液；(4)产物的提取：萃取所述第一培养液,合并萃取液后减压回收；(5)产物的纯化：利用制备液相色谱进行纯化。本发明转化率可达98.0％以上,步骤简单、速度快,对环境友好,适合工业化生产。(The invention discloses a preparation method of 6, 7, 8-trihydroxy coumarin, which comprises the following steps: (1) taking aesculin or/and aesculin as starting raw materials, and adding the raw materials into the first solution to dissolve the raw materials to obtain a raw material solution; (2) preparing a carrier by using animal dung bacteria: collecting fresh feces of animals under aseptic condition, adding normal saline to homogenate, centrifuging and taking supernatant; (3) anaerobic culture: adding the supernatant into nutrient broth, carrying out anaerobic constant-temperature culture, adding the raw material solution, adding an anaerobic culture solution, and carrying out anaerobic constant-temperature culture to obtain a first culture solution; (4) and (3) extraction of a product: extracting the first culture solution, combining the extract solutions, and recovering under reduced pressure; (5) and (3) purifying a product: purification was performed by preparative liquid chromatography. The invention has the advantages of high conversion rate of over 98.0 percent, simple steps, high speed, environmental protection and suitability for industrial production.)

一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法

技术领域

本发明属于微生物转化技术领域，具体涉及一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法。

背景技术

秦皮素和秦皮苷，香豆素类化合物，是中药秦皮的有效成分，秦皮素是秦皮苷的水解产物。Bruno M.Bizzarri等人以秦皮素为底物，2-碘酰基苯甲酸为氧化剂，反应生成6，7，8-三羟基香豆素，生成的产物较秦皮素有更强的抗氧化性和抑菌活性。但该种合成方法具有副产物多，反应终点不易控制，产物不易分离的缺点。因此，有必要研究一种新型的一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法。

微生物转化研究始于20世纪，旨在利用细菌、真菌或其它微生物与外源性底物共培养，得到有价值的产物，其中发挥主要作用的是微生物产生的酶。中药中含有多种复杂的有效成分，每一类成分都发挥了重要的作用，但是传统中药研究已不能满足人民日益增长的用药需求，因此，将中药与微生物转化相结合，有助于更好地提炼和转化其中的有效成分。

发明内容

本发明目的是提供一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法，解决上述问题。

本发明的技术方案是：一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法，该方法包括：(1)以秦皮苷或/和秦皮素为起始原料，将所述原料加入第一溶液中使其溶解，获得原料液；

(2)动物粪菌制作载体：在无菌条件下收集动物的新鲜粪便，加入生理盐水匀浆，离心后取上清液；

(3)厌氧培养：将所述上清液加入到营养肉汤中，厌氧恒温培养后，加入所述原料液，再加入厌氧培养液，厌氧恒温培养，获得第一培养液；

(4)产物的提取：萃取所述第一培养液，合并萃取液后减压回收；

(5)产物的纯化：利用制备液相色谱进行纯化。

进一步的，步骤(1)中所述第一溶液为生理盐水、磷酸盐缓冲液、碳酸缓冲液、Tris缓冲液或者水。

进一步的，步骤(2)中所述粪便为大鼠、小鼠、兔子、豚鼠或人类的粪便，优选为大鼠粪便。

进一步的，步骤(3)中所述营养肉汤的成分为蛋白胨、牛肉浸粉，所述营养肉汤成分可以为任意一种或两种成分的组合。

进一步的，步骤(3)中所述厌氧的条件为CO2、N2、Ar或He氛围，所述培养的时间为2-10d。

进一步的，步骤(3)中所述厌氧培养液的成分为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸铵、氯化钙、硫酸镁、刃天青、L-半胱氨酸、L-抗坏血酸；所述厌氧培养液的加入量是所述营养肉汤体积的0.2-5倍。

进一步的，步骤(4)中所述萃取的溶剂为乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、二氯甲烷或正己烷，萃取剂的量为0.5-2倍，次数为1至3次。

进一步的，步骤(5)中的分离使用硅胶、C8柱、C18柱中的任意一种。

本发明提供了一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法，优点为：解决了现有6，7，8三羟基香豆素生产工艺复杂、效率低的的难题，具有操作步骤简单、转化效率高、转化率可达98.0％以上、速度快，对环境友好，适合工业化生产的特点。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为本发明在实施方式中秦皮苷和秦皮素的微生物转化示意图，其中，(A)为秦皮苷，(B)为秦皮素，(C)为6，7，8-三羟基香豆素；

图2为本发明在实施例2中时间对产物6，7，8-三羟基香豆素转化率得影响的示意图，其中，1为秦皮素，2为6，7，8-三羟基香豆素；

图3为本发明在实施例3中时间对产物6，7，8-三羟基香豆素转化率得影响的示意图，其中，1为秦皮苷，2为秦皮素，3为6，7，8-三羟基香豆素。

具体实施方式

本发明提供了一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法，包括步骤：

(1)秦皮苷或/和秦皮素为起始原料：加入生理盐水或其它溶液使其溶解；

(2)动物粪菌为载体：在无菌条件下收集动物的新鲜粪便，可以为大鼠、小鼠、人类或者其它动物的粪便，优选大鼠粪便，加入生理盐水匀浆，离心后取上清液，离心速度为2000-4000r/min，时间为5-10min；

(3)厌氧培养：将上述上清液加入到营养肉汤中，CO₂、N₂或其它无氧条件36.0-38.0℃恒温培养12-36h，加入原料，再加入0.5-1.0倍体积的厌氧培养液，厌氧恒温培养；

(4)产物的提取：萃取上述培养液，萃取溶剂可用乙酸乙酯、正丁醇或其它与水不互溶的有机溶剂，优选乙酸乙酯，萃取1至3次，合并萃取液后减压回收；

(5)产物的纯化：用硅胶、ODS或其它填料进行分离，优选硅胶或ODS。

其微生物转化过程如图1。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。

此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1

本实施案例按如下步骤展示一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法

1.原料准备

精密称取秦皮素50.0mg，0.83mL DMSO助溶后4.17mL生理盐水溶解。

2.营养肉汤和厌氧培养液的配置

取18.0g营养肉汤和9.5g厌氧培养液，分别加入1000mL去离子水，溶解后封口，120℃高压蒸汽灭菌15min。

3.不同粪便的收集和体外培养

在超净工作台上收集6只SD雄性大鼠的新鲜粪便共5.0g，加入25.0mL 的无菌生理盐水后匀浆，取上清液25mL加入到提前灭好菌的100mL营养肉汤中，混匀，放入37℃的恒温培养箱CO₂厌氧培养24h，使菌充分生长。用相同的方法收集小鼠、人类、豚鼠、兔子的粪便后体外培养

4.秦皮素的粪菌转化

将5mL原料和50mL厌氧培养液加入到培养了24h的100mL粪菌液中，37℃厌氧培养7d，HPLC监测反应。

表1

请参阅表1，表1为本发明实施例1中不同的物种粪便对6，7，8-三羟基香豆素转化率的影响；如表1所示，各物种粪便对6，7，8-三羟基香豆素转化率影响为：小鼠>人>大鼠>豚鼠>兔子。

实施例2

本实施案例按如下步骤展示一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法：

1.原料准备

精密称取秦皮素50.0mg，0.83mL DMSO助溶后4.17mL生理盐水溶解。

2.营养肉汤和厌氧培养液的配置

取18.0g营养肉汤和9.5g厌氧培养液，分别加入1000mL去离子水，溶解后封口，120℃高压蒸汽灭菌15min。

3.大鼠粪菌的体外培养

在超净工作台上收集6只SD雄性大鼠的新鲜粪便共5.0g，加入25.0mL 的无菌生理盐水后匀浆，取上清液25mL加入到提前灭好菌的100mL营养肉汤中，混匀，放入37℃的恒温培养箱CO₂厌氧培养24h，使菌充分生长。

4.秦皮素的粪菌转化

将5mL原料和50mL厌氧培养液加入到培养了24h的100mL粪菌液中，37℃厌氧培养7d，HPLC监测反应。

如图2所示，代谢产物从第二天开始产生，第三天转化率达17.21％，第五天转化率为42.79％，第七天转化率为100％。

5.代谢产物的分离制备

用1倍体积量的乙酸乙酯萃取上述培养液，重复三次，合并萃取液后减压回收，5mL50％的甲醇溶解，0.22μm滤膜过滤，制备液相分离。

6.代谢产物的鉴定

代谢产物15mg用DMSO-d6溶解后，1H-NMR(600MHz)、13C-NMR(151 MHz)分析。代谢产物1mg溶解于2mL 50％色谱甲醇中，LC-MS分析。

转化产物为黄色粉末状固体，易溶于乙酸乙酯、二甲基亚砜，微溶于甲醇，最大吸收为334nm。1H-NMR(600MHz,dmso)，δ:7.82(1H,d,J＝9.42, 3H),6.55(1H,s,5H),6.14(1H,d,J＝9.42,4H)；13C-NMR(151MHz,dmso)，δ:160.69(C,C-2),145.02(C,C-4),143.01(C,C-6),139.18(C,C-7),138.10 (C,C-8a),132.92(C,C-8),111.45(C,C-3),110.31(C,C-4a),103.16(C, C-5)；ESI-MS，m/z:193.9。通过以上信息可确定转化产物为6，7，8-三羟基香豆素。

实施例3

本实施案例按如下步骤展示一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法：

1.原料准备

精密称取秦皮苷50.0mg，0.83mL DMSO助溶后4.17mL生理盐水溶解。

2.营养肉汤和厌氧培养液的配置

取18.0g营养肉汤和9.5g厌氧培养液，分别加入1000mL去离子水，溶解后封口，120℃高压蒸汽灭菌15min。

3.大鼠粪菌的体外培养

在超净工作台上收集6只SD雄性大鼠的新鲜粪便共5.0g，加入25.0mL 的无菌生理盐水后匀浆，取上清液25mL加入到提前灭好菌的营养肉汤100 mL，混匀，放入37℃的恒温培养箱CO₂厌氧培养24h，使菌充分生长。

4.秦皮苷的粪菌转化

将5mL原料和50mL厌氧培养液加入到培养24h的100mL粪菌液中，37℃厌氧培养10d，HPLC监测反应。

如图3所示，第二天秦皮苷完全转化成秦皮素，代谢产物从第二天开始产生，第十天转化率为100％。

5.代谢产物的分离制备

用1倍体积量的正丁醇萃取上述培养液，重复三次，合并萃取液后减压回收，石油醚：乙酸乙酯＝1：1硅胶柱分离。

综上所述，本发明所述的一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法，操作简单，产率高，对环境更友好，适合工业化生产。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。