靶向hiv gp120和cd3的多特异性抗体
阅读说明：本技术 靶向hiv gp120和cd3的多特异性抗体 (Multispecific antibodies targeting HIV GP120 and CD3 ) 是由 T·西拉 J·戈德史密斯 C·S·佩斯 D·斯隆 H·斯蒂芬森 N·D·汤姆森 G·库克 于 2018-06-21 设计创作，主要内容包括：公开了结合HIV gp120和CD3的多特异性抗体(例如,双特异性抗体)。还公开了使用这些抗体治疗或预防HIV感染的方法。(Multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies) that bind HIV gp120 and CD3 are disclosed. Methods of using these antibodies to treat or prevent HIV infection are also disclosed.)
相关申请的交叉引用
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序列表
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技术领域
本公开涉及用于治疗和预防人免疫缺陷病毒(HIV)感染的抗体。特别地，本文提供了包括广泛中和抗HIV抗体的多特异性抗体，以及使用这些抗体以减少HIV复制以及治疗和预防HIV感染的方法。
背景技术
人免疫缺陷病毒(HIV)感染和相关疾病是全世界的主要公共卫生问题。目前批准的大多数针对HIV感染的疗法靶向病毒逆转录酶、蛋白酶和整合酶，但HIV对这些现有药物的抗性、长期毒性以及患者对日常给药方案的依从性不足已成为与这些疗法相关的问题。因此，重要的是发现和开发新的HIV药物。
WO2012/030904描述了源自HIV感染供体的记忆B细胞的人抗 HIV抗体，其能够抑制来自多个进化枝的HIV-1种类的感染。然而，由于免疫原性、药代动力学、抗原特异性、效应子功能和制造的问题，这些抗体的治疗用途受到限制。因此，本领域需要具有用于治疗用途的有利性质的新型抗HIV抗体。
发明内容
本公开特别地提供用于治疗或预防HIV的组合物和方法。更具体地，本文提供了靶向人免疫缺陷病毒(HIV)包膜(Env)糖蛋白GP120 (gp120)以及第二抗原(例如，分化簇3(CD3)；抗IgA受体(CD89)) 的多特异性抗体，及其用途。
在一个方面，本公开提供结合人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)包膜 (Env)糖蛋白gp120(gp120)和人CD3(例如，人CD3ε)的多特异性抗体。该抗体包含第一抗原结合结构域，其包含第一重链可变域(VH)和第一轻链可变域(VL)。第一抗原结合结构域结合gp120且包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第一VH-互补决定区(CDR)1；含有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的第一VH-CDR2；含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一VH-CDR3；含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的第一 VL-CDR1；含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的第一VL-CDR2；和含有SEQID NO:6的氨基酸序列的第一VL-CDR3。该抗体还包含结合人CD3(例如，人CD3ε)的第二抗原结合结构域。在某些实施方案中，抗gp120抗体结合包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列或由其组成的蛋白质。在一些情况下，抗gp120抗体结合包含SEQ ID NO： 38所示的氨基酸序列或由其组成的蛋白质。在某些情况下，抗gp120 抗体结合游离的HIV-1病毒。在一些情况下，抗gp120抗体结合HIV-1 感染的细胞。在一些情况下，抗gp120抗体结合游离的HIV-1病毒和 HIV-1感染的细胞两者。在某些情况下，抗gp120抗体结合至少两个不同的HIV-1株(例如，M组、N组、O组或P组)。在一个实施方案中，抗gp120抗体结合pWITO.c/2474(登录号JN944948和NIH AIDS Reagent Program目录号11739)。在另一个实施方案中，抗gp120 抗体结合pCH058.c/2960(登录号JN944940和NIH AIDS Reagent Program目录号700010058)。
在另一个方面，本公开提供了结合人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)包膜(Env)糖蛋白gp120(gp120)和IgA受体CD89的多特异性抗体。抗体包含含有第一重链可变域(VH)和第一轻链可变域(VL)的第一抗原结合结构域。第一抗原结合结构域结合gp120，并且包含含有SEQID NO：1的氨基酸序列的第一VH-互补决定区(CDR)1、含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的第一VH-CDR2、含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一VH-CDR3、含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的第一 VL-CDR1、含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的第一VL-CDR2和含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的第一VL-CDR3。该抗体还包含结合CD89(例如，人CD89/FCAR；UniProtKB-P24071)的第二抗原结合结构域。在某些实施方案中，抗gp120抗体结合包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列或由其组成的蛋白质。在一些情况下，抗gp120抗体结合包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列或由其组成的蛋白质。在一些情况下，抗gp120抗体结合游离的HIV-1病毒。在一些情况下，抗gp120抗体结合HIV-1感染的细胞。在一些情况下，抗gp120抗体结合游离的HIV-1病毒和HIV-1感染的细胞。在某些情况下，抗gp120 抗体结合至少两个不同的HIV-1株(例如，M组、N组、O组或P组)。在一个实施方案中，抗gp120抗体结合pWITO.c/2474(登录号 JN944948和NIH AIDS Reagent Program目录号11739)。在另一个实施方案中，抗gp120抗体结合pCH058.c/2960(登录号JN944940和NIH AIDS Reagent Program目录号700010058)。
在以上两个方面的一些实施方案中，第一VH包含与SEQ ID NO： 7至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91 ％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一VL包含与SEQ ID NO：8至少70％、至少75％、至少 80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在这些实施方案的某些情况下，SEQ ID NO：8的66、67、67A和67C位(Kabat编号)的一个或多个处的氨基酸未改变。在某些实施方案中，第一VL包含与SEQ ID NO：81至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一VL包含与SEQ ID NO：82至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94 ％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100 ％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一VL包含与SEQ ID NO：83至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96 ％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一VL包含与SEQ ID NO：84至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98 ％、至少99％或100％相同。在某些情况下，上述VH直接或通过***氨基酸(例如，G-S接头序列)与SEQ ID NO：56-65所示的氨基酸序列之一连接。在其他情况下，上述VH直接或通过***氨基酸(例如， G-S接头序列)与SEQ ID NO：66-75所示的氨基酸序列之一连接。在一些情况下，上述VH直接或通过***氨基酸(例如，G-S接头序列) 与具有SEQ IDNO：77中的0-10个氨基酸置换(例如，增加半衰期和 /或减少效应子功能的置换)的氨基酸序列连接。在某些实施方案中，上述VH直接或通过***氨基酸(例如，G-S接头序列)连接包含来自 IgG1(例如，人IgG1，例如，IgG1m3同种异型)的CH1结构域、CH2 结构域和CH3结构域及IgG3铰链区(例如，WO2017/096221中描述的“开放”IgG3铰链变体“IgG3 C-”)的氨基酸序列。
在以上两个方面的一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含具有与SEQ ID NO：9至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95 ％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含具有与SEQ ID NO：10至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含具有与SEQ ID NO：40至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95 ％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含具有与SEQ ID NO：78至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95 ％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含具有与SEQ ID NO：79至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95 ％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含具有与SEQ ID NO：80至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95 ％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列的轻链。
在以上两个方面的某些实施方式中，第一VH包含SEQ ID NO： 7的氨基酸序列和第一VL包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在其他实施方案中，第一VH包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列和第一VL 包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列。在其他实施方案中，第一VH 包含SEQID NO：7的氨基酸序列和第一VL包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列。在其他实施方式中，第一VH包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列和第一VL包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列。在其他实施方案中，第一VH包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列和第一VL包含 SEQ ID NO：84的氨基酸序列。在某些情况下，上述VH直接或通过***氨基酸(例如，G-S接头序列)与SEQ ID NO：56-65所示的氨基酸序列之一连接。在其他情况下，上述VH直接或通过***氨基酸(例如， G-S接头序列)与SEQ ID NO：66-75所示的氨基酸序列之一连接。在一些情况下，上述VH可直接或通过一个或多个中间氨基酸(例如G-S 接头序列)与具有SEQ ID NO：77中的0-10个氨基酸置换(例如，增加半衰期和/或减少效应子功能的置换)的氨基酸序列连接。在某些情况下，上述VH直接或通过一个或多个中间氨基酸(例如，G-S接头序列)与包含IgG1(例如，人IgG1，例如，IgG1m3同种异型)的CH1域、 CH2域和CH3域及IgG3铰链区(例如，WO2017/096221中描述的“开放”IgG3铰链变体“IgG3 C-”)的氨基酸序列连接。
在上述两个方面的一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的重链，并且包含具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的重链，并且包含具有SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的重链，并且包含具有SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的重链，并且包含具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含具有 SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的重链，并且包含具有SEQID NO： 80所示的氨基酸序列的轻链。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体是双特异性抗体。
在某些实施方案中，第二抗原结合结构域结合人CD3并包含第二VH和第二VL。第二VH包含含有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的第二VH-CDR1、含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的第二 VH-CDR2和含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的第二VH-CDR3。在一些实施方案中，第二VL包含含有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的第二VL-CDR1、含有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的第二VL-CDR2 和含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的第二VL-CDR3。
在某些实施方案中，第二抗原结合结构域结合人CD3并包含第二VH和第二VL，其中第二VH包含含有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的第二VH-CDR1、含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的第二 VH-CDR2和含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的第二VH-CDR3；和其中第二VL包含含有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的第二VL、含有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的第二VL-CDR2和含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的第二VL-CDR3。
在某些实施方案中，第二抗原结合结构域结合人CD89并包含第二VH和第二VL。第二VH包含含有SEQ ID NO：98的氨基酸序列的第二VH-CDR1、含有SEQ ID NO：99的氨基酸序列的第二 VH-CDR2和含有SEQ ID NO：100的氨基酸序列的第二VH-CDR3。在一些实施方案中，第二VL包含含有SEQ ID NO：103的氨基酸序列的第二VL-CDR1、含有SEQ ID NO：104的氨基酸序列的第二 VL-CDR2和含有SEQ ID NO：105的氨基酸序列的第二VL-CDR3。
在某些实施方案中，第二抗原结合结构域结合人CD89并包含第二VH和第二VL，其中第二VH包含含有SEQ ID NO：98的氨基酸序列的第二VH-CDR1、含有SEQ ID NO：99的氨基酸序列的第二 VH-CDR2和含有SEQ ID NO：100的氨基酸序列的第二VH-CDR3；且其中第二VL包含含有SEQ ID NO：103的氨基酸序列的第二 VL-CDR1、含有SEQ ID NO：104的氨基酸序列的第二VL-CDR2和含有SEQ ID NO：105的氨基酸序列的第二VL-CDR3。
在一些实施方案中，第二VH包含与SEQ ID NO：17至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92 ％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二VL包含与SEQ ID NO：18至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第二VH包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，并且第二VL包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第二VH包含与SEQ ID NO：96至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92 ％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二VL包含与SEQ ID NO：101至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94 ％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100 ％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第二VH包含SEQ ID NO：96所示的氨基酸序列，并且第二VL包含SEQ ID NO：101所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第二抗原结合结构域包含具有与SEQ ID NO：19至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96 ％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，第二抗原结合结构域包含具有与SEQ ID NO：20至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列的轻链。
在某些实施方案中，第二抗原结合结构域包含具有与SEQ ID NO：97至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96 ％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，第二抗原结合结构域包含具有与SEQ ID NO：102至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，抗体是κ-λ体、双亲和重靶向分子(DART)、“杵臼”结构抗体(knob-in-hole)、链交换工程化结构域抗体 (SEEDbody)、双特异性T细胞衔接器(BiTe)、CrossMab、Fcab、双体抗体(diabody)、串联双体抗体(TandAb)或
在某些实施方案中，第一抗原结合结构域直接或通过***氨基酸序列与选自人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4、人IgA1和人IgA2 的第一重链恒定区融合。在一些情况下，第一抗原结合结构域直接或通过***氨基酸序列与第一重链恒定区融合，其中该恒定区来自人 IgG1(例如，IgG1m3同种异型)，除了IgG1铰链区被IgG3铰链区(例如，WO2017/096221中描述的“开放”IgG3铰链变体“IgG3C-”)替代。在一些实施方案中，第二抗原结合结构域直接或通过***氨基酸序列与选自人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4、人IgA1和人IgA2的第二重链恒定区融合。在一些情况下，第二抗原结合结构域直接或通过***氨基酸序列与第二重链恒定区融合，其中该恒定区来自人 IgG1(例如，IgG1m3同种异型)，除了IgG1铰链区被IgG3铰链区(例如，WO2017/096221中描述的“开放”IgG3铰链变体“IgG3C-”)替代。
在具体的实施方案中，第一重链恒定区是人IgG1，和第二重链恒定区是人IgG1。
在一些实施方案中，第一抗原结合结构域直接或通过***氨基酸序列与作为人λ恒定区的第一轻链恒定区融合。在其他实施方案中，第二抗原结合结构域直接或通过***氨基酸序列与作为人λ恒定区的第二轻链恒定区融合。
在一些实施方案中，第一重链恒定区包括以下之一：F405L、 F405A、F405D、F405E、F405H、F405I、F405K、F405M、F405N、 F405Q、F405S、F405T、F405V、F405W或F405Y氨基酸突变且第二重链恒定区包含K409R氨基酸突变。在一种情况中，第一重链恒定区包含F405L氨基酸突变，和第二重链恒定区包含K409R氨基酸突变。在另一种情况中，第一重链恒定区包含F405A氨基酸突变，和第二重链恒定区包含K409R氨基酸突变。在另一情况中，第一重链恒定区包含F405D氨基酸突变，和第二重链恒定区包含K409R氨基酸突变。在另一情况中，第一重链恒定区包含F405E氨基酸突变，和第二重链恒定区包含K409R氨基酸突变。在另一情况中，第一重链恒定区包含F405H氨基酸突变，和第二重链恒定区包含K409R氨基酸突变。在另一情况中，第一重链恒定区包含F405I氨基酸突变，而第二重链恒定区包含K409R氨基酸突变。在另一情况中，第一重链恒定区包含F405K氨基酸突变，和第二重链恒定区包含K409R氨基酸突变。在另一情况中，第一重链恒定区包含F405M氨基酸突变，和第二重链恒定区包含K409R氨基酸突变。在另一情况中，第一重链恒定区包含F405N氨基酸突变，和第二重链恒定区包含K409R氨基酸突变。在另一情况中，第一重链恒定区包含F405Q氨基酸突变，和第二重链恒定区包含K409R氨基酸突变。在另一情况中，第一重链恒定区包含F405S氨基酸突变，和第二重链恒定区包含K409R氨基酸突变。在另一情况中，第一重链恒定区包含F405T氨基酸突变，和第二重链恒定区包含K409R氨基酸突变。在另一情况中，第一重链恒定区包含F405V氨基酸突变，和第二重链恒定区包含K409R氨基酸突变。在另一情况中，第一重链恒定区包含F405W氨基酸突变，和第二重链恒定区包含K409R氨基酸突变。在另一情况中，第一重链恒定区包含F405Y氨基酸突变，和第二重链恒定区包含K409R氨基酸突变。
在另一实施方案中，第一重链恒定区包含K409R氨基酸突变，和第二重链恒定区包含以下之一：F405L、F405A、F405D、F405E、 F405H、F405I、F405K、F405M、F405N、F405Q、F405S、F405T、 F405V、F405W或F405Y氨基酸突变。在一种情况中，第一重链恒定区包含K409R氨基酸突变，和第二重链恒定区包含F405L氨基酸突变。在另一情况中，第一重链恒定区包含K409R氨基酸突变，和第二重链恒定区包含F405A氨基酸突变。在一种情况中，第一重链恒定区包含K409R氨基酸突变，和第二重链恒定区包含F405D氨基酸突变。在一种情况中，第一重链恒定区包含K409R氨基酸突变，和第二重链恒定区包含F405E氨基酸突变。在一种情况中，第一重链恒定区包含K409R氨基酸突变，和第二重链恒定区包含F405H氨基酸突变。在一种情况中，第一重链恒定区包含K409R氨基酸突变，和第二重链恒定区包含F405I氨基酸突变。在一种情况中，第一重链恒定区包含K409R氨基酸突变，和第二重链恒定区包含F405K氨基酸突变。在一种情况中，第一重链恒定区包含K409R氨基酸突变，和第二重链恒定区包含F405M氨基酸突变。在一种情况中，第一重链恒定区包含K409R氨基酸突变，和第二重链恒定区包含F405N氨基酸突变。在一种情况中，第一重链恒定区包含K409R氨基酸突变，和第二重链恒定区包含F405Q氨基酸突变。在一种情况中，第一重链恒定区包含K409R氨基酸突变，和第二重链恒定区包含F405S氨基酸突变。在一种情况中，第一重链恒定区包含K409R氨基酸突变，和第二重链恒定区包含F405T氨基酸突变。在一种情况中，第一重链恒定区包含K409R氨基酸突变，和第二重链恒定区包含F405V氨基酸突变。在一种情况中，第一重链恒定区包含K409R氨基酸突变，和第二重链恒定区包含F405W氨基酸突变。在一种情况中，第一重链恒定区包含K409R氨基酸突变，和第二重链恒定区包含F405Y氨基酸突变。
在某些实施方案中，第一重链恒定区和第二重链恒定区的效应子功能被降低或消除(例如，相对于具有野生型IgG1 Fc的抗体的效应子功能)。
在一些实施例中，第一重链恒定区包含人IgG1重链恒定区，其包含N297A突变或N297Q突变，和/或第二重链恒定区包含人IgG1 重链恒定区，其包含N297A突变或N297Q突变。
在另一个方面，本公开提供结合gp120和人CD3的双特异性抗体。该双特异性抗体包含结合gp120的第一臂。第一臂包含第一重链，该第一重链包含含有作为F405L、F405A、F405D、F405E、F405H、F405I、F405K、F405M、F405N、F405Q、F405S中的一个F405T、 F405V、F405W或F405Y氨基酸突变中任一的第一突变或者K409R 突变的第一重链恒定区；和第一VH，其包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VH-CDR1、含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VH-CDR2包含和含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的VH-CDR3。在一种情况中，第一臂包含第一重链，该第一重链包含含有作为F405L 或K409R突变之一的第一突变的第一重链恒定区。第一臂还包含含有第一轻链恒定区的第一轻链；和第一VL，其包含含有SEQ ID NO： 4的氨基酸序列的VL-CDR1、含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的 VL-CDR2和含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的VL-CDR3。该双特异性抗体包含结合CD3(例如，人CD3(例如，人CD3ε))的第二臂。第二臂包含第二重链，该第二重链包含含有含有作为F405L、F405A、 F405D、F405E、F405H、F405I、F405K、F405M、F405N、F405Q、 F405S、F405T、F405V、F405W或F405Y氨基酸突变任一或者K409R 突变的第二突变的第二重链恒定区；和第二VH，其包含含有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VH-CDR1、含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的VH-CDR2和含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的VH-CDR3。在一种情况中，第二臂包含第二重链，该第二重链包含含有F405L或K409R突变之一的第二突变的第二重链恒定区。第二臂包含含有第二轻链恒定区的第二轻链；和第二VL，其包含含有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的VL-CDR1、含有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的 VL-CDR2和含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR3。第一突变和第二突变是不同的突变。
在另一个方面，本公开提供结合gp120和人CD89的双特异性抗体。该双特异性抗体包含结合gp120的第一臂。第一臂包含第一重链，该第一重链包含含有作为F405L、F405A、F405D、F405E、F405H、 F405I、F405K、F405M、F405N、F405Q、F405S、F405T、F405V、 F405W或F405Y氨基酸突变中任一个或者K409R突变的第一突变的第一重链恒定区；和第一VH，其包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VH-CDR1、含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VH-CDR2和含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的VH-CDR3。在一种情况中，第一臂包含第一重链，该第一重链包含含有作为F405L或K409R突变任一的第一突变的第一重链恒定区。第一臂还包含第一轻链，该第一轻链包含第一轻链恒定区；和第一VL，其包含含有SEQ ID NO：4 的氨基酸序列的VL-CDR1、含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的 VL-CDR2和含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的VL-CDR3。该双特异性抗体包含结合CD89(例如，人CD89)的第二臂。第二臂包含第二重链，第二重链包含含有作为F405L、F405A、F405D、F405E、F405H、 F405I、F405K、F405M、F405N、F405Q、F405S、F405T、F405V、 F405W或F405Y氨基酸突变中任一或者K409R突变的第二突变的第二重链恒定区；第二VH，其包含含有SEQ ID NO：98的氨基酸序列的VH-CDR1、含有SEQ ID NO：99的氨基酸序列的VH-CDR2和含有SEQ ID NO：100的氨基酸序列的VH-CDR3。在一种情况中，第二臂包含第二重链，该第二重链包含含有作为F405L或K409R突变任一的第二突变的第二重链恒定区。第二臂包含含有第二轻链恒定区的第二轻链；和第二VL，其包含含有SEQ ID NO：103的氨基酸序列的VL-CDR1、含有SEQ ID NO：104的氨基酸序列的VL-CDR2和含有SEQ ID NO：105的氨基酸序列的VL-CDR3。第一突变和第二突变是不同的突变。
在上述两个方面的某些实施方案中，抗gp120抗体臂结合包含或由SEQ ID NO：21所示氨基酸序列组成的蛋白质。在一些情况下，抗gp120抗体臂结合包含或由SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列组成的蛋白质。在一些情况下，抗gp120抗体臂结合游离的HIV-1病毒。在一些情况下，抗gp120抗体结合HIV-1感染的细胞。在一些情况下，抗gp120抗体臂结合游离的HIV-1病毒和HIV-1感染的细胞。在某些情况下，抗gp120抗体结合至少两个不同的HIV-1株(例如，M组、N 组、O组或P组)。在一个实施方案中，抗gp120抗体臂结合 pWITO.c/2474(登录号JN944948和NIH AIDS Reagent Program目录号11739)。在另一个实施方案中，抗gp120抗体臂结合pCH058.c/2960(登录号JN944940和NIH AIDS Reagent Program目录号700010058)。
在一些实施方案中，第一VH包含与SEQ ID NO：7至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92 ％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一VL包含与SEQ ID NO：8至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在这些实施方案的某些情况下，SEQ ID NO：8的 66、67、67A和67C位(Kabat编号)的一个或多个位置处的氨基酸未改变。在某些实施方案中，第一VL包含与SEQ ID NO：81至少70 ％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少 92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一VL包含与SEQ ID NO：82至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94 ％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100 ％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一VL包含与SEQ ID NO：83至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96 ％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一VL包含与SEQ ID NO：84至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98 ％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一些情况下，上述VH 直接或通过***氨基酸(例如，G-S接头序列)与具有SEQ ID NO：77 中的1-10个氨基酸置换(例如，增加半衰期和/或减少效应子功能的置换)的氨基酸序列连接。
在一些实施方案中，第一重链包含与SEQ ID NO：9至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92 ％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一轻链包含与SEQ ID NO：10至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一轻链包含与SEQ ID NO： 40至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少 91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一轻链包含与SEQ ID NO：78至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93 ％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少 99％或100％相同的氨基酸序列为。在一些实施方案中，第一轻链包含与SEQ ID NO：79至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95 ％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一轻链包含与SEQ ID NO：80至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97 ％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第二VH包含与SEQ ID NO：17至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92 ％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二VL包含与SEQ ID NO：18至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第二VH包含与SEQ ID NO：96至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92 ％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二VL包含与SEQ ID NO：101至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94 ％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100 ％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第二重链包含与SEQ ID NO：19至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92 ％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，第二轻链包含与SEQ ID NO：20至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第二重链包含与SEQ ID NO：97至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92 ％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，第二轻链包含与SEQ ID NO：102至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94 ％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第一VH包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列和第一VL包含SEQ IDNO：8的氨基酸序列，和/或第二VH包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列和第二VL包含SEQ IDNO：18的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第一VH包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列和第一VL包含SEQ IDNO：8的氨基酸序列，和/或第二VH包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列和第二VL包含SEQ IDNO：101的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，第一VH包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列和第一VL包含SEQID NO：81的氨基酸序列，和/或第二VH包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列和第二VL包含SEQID NO：18的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，第一VH包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列和第一VL包含SEQID NO：81的氨基酸序列，和/或第二VH包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列和第二VL包含SEQID NO：101的氨基酸序列。
在进一步的实施方案中，第一VH包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列和第一VL包含SEQID NO：82的氨基酸序列，和/或第二VH 包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列和第二VL包含SEQID NO：18 的氨基酸序列。
在进一步的实施方案中，第一VH包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列和第一VL包含SEQID NO：82的氨基酸序列，和/或第二VH 包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列和第二VL包含SEQID NO：101 的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，第一VH包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列和第一VL包含SEQID NO：83的氨基酸序列，和/或第二VH包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列和第二VL包含SEQID NO：18的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，第一VH包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列和第一VL包含SEQID NO：83的氨基酸序列，和/或第二VH包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列和第二VL包含SEQID NO：101的氨基酸序列。
在又一个实施方案中，第一VH包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列和第一VL包含SEQID NO：84的氨基酸序列，和/或第二VH包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列和第二VL包含SEQID NO：18的氨基酸序列。
在又一个实施方案中，第一VH包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列和第一VL包含SEQID NO：84的氨基酸序列，和/或第二VH包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列和第二VL包含SEQID NO：101的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，第一重链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列和第一轻链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，和/或第二重链包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列和第二轻链包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。
在又一个实施方案中，第一VH包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列和第一VL包含SEQID NO：84的氨基酸序列，和/或第二VH包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列和第二VL包含SEQID NO：101的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，第一重链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列和第一轻链包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列，和/或第二重链包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列和第二轻链包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，第一重链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列和第一轻链包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列，和/或第二重链包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列和第二轻链包含SEQ ID NO：102 的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，第一重链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列和第一轻链包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列，和/或第二重链包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列和第二轻链包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，第一重链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列和第一轻链包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列，和/或第二重链包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列和第二轻链包含SEQ ID NO：102 的氨基酸序列。
在又一个实施方案中，第一重链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列和第一轻链包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列，和/或第二重链包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列和第二轻链包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。
在又一个实施方案中，第一重链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列和第一轻链包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列，和/或第二重链包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列和第二轻链包含SEQ ID NO：102 的氨基酸序列。
在进一步的实施方案中，第一重链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列和第一轻链包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列，和/或第二重链包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列和第二轻链包含SEQ ID NO：20 的氨基酸序列。
在进一步的实施方案中，第一重链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列和第一轻链包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列，和/或第二重链包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列和第二轻链包含SEQ ID NO：102 的氨基酸序列。
在所有上述方面和实施方案的某些实施方式中，抗体进一步包含细胞毒性剂、放射同位素、治疗剂、抗病毒剂或可检测标记。
在进一步的方面，本公开提供包含编码以上公开的抗体的第一抗原结合结构域的第一轻链可变区或第一轻链的核酸分子的组合物。在另一个方面，本公开提供包含编码以上公开的抗体的第一抗原结合结构域的第一重链可变区或第一重链的核酸分子的组合物。在又一方面，本公开提供包含编码以上公开的抗体的第二抗原结合结构域的第一轻链可变区或第一轻链的核酸分子的组合物。在又一方面，本公开提供包含编码以上公开的抗体的第二抗原结合结构域的第二重链可变区或第二重链的核酸分子的组合物。
在另一个方面，本公开特征在于包含一种或多种上述核酸的宿主细胞。在某些情况下，宿主细胞包含双特异性抗体的所有四条链。在其他情况下，宿主细胞包含编码双特异性抗体的gp120结合臂的核酸。在其他情况下，宿主细胞包含编码双特异性抗体的CD3结合臂的核酸。在再其他的情况下，宿主细胞包含编码双特异性抗体的CD89结合臂的核酸。在一些实施方案中，宿主细胞选自大肠杆菌、假单胞菌、芽孢杆菌、链霉菌、酵母(例如，毕赤酵母、酵母属)、CHO、YB/20、 NS0、PER-C6、HEK-293T、NIH-3T3、HeLa、BHK、Hep G2、SP2/0、R1.1、B-W、L-M、COS 1、COS 7、BSC1、BSC40、BMT10细胞、植物细胞、昆虫细胞和组织培养中的人细胞。
在又一方面，特征是产生结合gp120和人CD3的抗体(或结合 gp120和人CD89的抗体)的方法。该方法包括在使得表达核酸分子并产生抗体的条件下培养上述宿主细胞。
在另一个方面，公开了检测样品中表达gp120和CD3(或CD89) 的细胞的方法。该方法包括使样品与本文所述的抗体接触。
在又一方面，本公开提供包含本文所述的抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在进一步的实施方案中，本公开特征在于包含本文所述的抗体及 a)检测试剂，b)gp120和/或CD3和/或CD89抗原，c)反映批准用于人施用的使用或销售的通告，或d)其组合的试剂盒。
还提供了在需要的人类受试者中治疗或预防人免疫缺陷病毒感染的方法。该方法包括向人类受试者施用治疗有效量的本文公开的抗体或药物组合物。在一些实施方案中，人免疫缺陷病毒感染是HIV-1 感染。在一些实施方案中，患者中的病毒具有N332 PNG阳性的Env。在某些实施方案中，HIV是进化枝B、G、A、AC或AE的。
在另一个方面，本公开特征在于结合gp120的抗体。该抗体包含 VH和VL。VH包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VH-CDR1、含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VH-CDR2、含有SEQ ID NO：3 的氨基酸序列的VH-CDR3。VL包含含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的VL-CDR1、含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的VL-CDR2和含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的VL-CDR3。另外，VL包含67A位 (Kabat编号)的酪氨酸、苯丙氨酸或苏氨酸，或者67位(Kabat编号) 的甘氨酸。
在某些实施方案中，抗gp120抗体结合包含或由SEQ ID NO：21 所示氨基酸序列组成的蛋白质。在一些情况下，抗gp120抗体结合包含或由SEQ ID NO：38所示氨基酸序列组成的蛋白质。在一些情况下，抗gp120抗体结合游离的HIV-1病毒。在一些情况下，抗gp120 抗体结合HIV-1感染的细胞。在一些情况下，抗gp120抗体结合游离的HIV-1病毒和HIV-1感染的细胞。在某些情况下，抗gp120抗体结合至少两种不同的HIV-1株(例如，M组、N组、O组或P组)。在一个实施方案中，抗gp120抗体结合pWITO.c/2474(登录号JN944948 和NIH AIDSReagent Program目录号11739)。在另一个实施方案中，抗gp120抗体结合pCH058.c/2960(登录号JN944940和NIH AIDS Reagent Program目录号700010058)。
在一些实施方案中，VH包含与SEQ ID NO：7至少70％、至少 75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH直接或通过***氨基酸序列(例如，G-S接头)与包含降低效应子功能和/或增加抗体的药代动力学半衰期的0-10(例如，1、2、3、4、5、6、7、 8、9或10)个氨基酸置换的人IgG1恒定区(例如，IgG1m3同种异型) 连接。在一些情况下，抗体具有来自IgG3抗体的铰链区(例如，WO 2017/096221中公开的“开放”IgG3C-铰链变体)及来自人IgG1抗体的 CH1、CH2和CH3区(例如，IgG1m3同种异型)。
在某些实施方案中，VL包含与SEQ ID NO：81、82、83或84 至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91 ％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重链包含与SEQ ID NO：9至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，轻链包含与SEQ ID NO：40、78、79或80 至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91 ％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO：40任一所示的氨基酸序列的轻链。
在另一个实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO：78任一所示的氨基酸序列的轻链。
在又一个实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO：79任一所示的氨基酸序列的轻链。
在另一个实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO：80任一所示的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，以上公开的抗体还包含细胞毒性剂、放射性同位素、治疗剂、抗病毒剂或可检测标记。
在另一个方面，本公开特征在于包含该方面的抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一个方面，本公开涉及编码该方面的抗体的一种或多种核酸。
在另一个方面，本公开提供了包含上述一种或多种核酸的一种或多种载体。
在又一方面，本公开特征在于包含上述一种或多种载体的宿主细胞。
在进一步的方面，本公开提供了用于产生抗gp120抗体的方法。该方法包括在表达一种或多种核酸和产生抗体的条件下培养上述宿主细胞。
还特征在于在需要的人类受试者中治疗或预防人免疫缺陷病毒感染的方法。该方法包括向人类受试者施用治疗有效量的该方面的抗体或药物组合物。在一些实施方案中，人免疫缺陷病毒感染是HIV-1 感染。在一些实施方案中，患者中的HIV具有N332 PNG阳性的Env。在某些实施方案中，HIV是进化枝B、G、A、AC或AE的。
在另一个方面，本公开特征在于结合gp120的抗体片段。该抗体片段包含VH和VL。VH包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的 VH-CDR1、含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VH-CDR2、含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的VH-CDR3。VL包含含有SEQ ID NO：4 的氨基酸序列的VL-CDR1、含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的 VL-CDR2和含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的VL-CDR3。另外， VL包含67A位(Kabat编号)的酪氨酸、苯丙氨酸或苏氨酸，或者67 位(Kabat编号)的甘氨酸。
在某些实施方案中，抗gp120抗体片段结合包含或由SEQ ID NO： 21所示氨基酸序列组成的蛋白质。在一些情况下，抗gp120抗体片段结合包含或由SEQ ID NO：38所示氨基酸序列组成的蛋白质。在一些情况下，抗gp120抗体片段结合游离的HIV-1病毒。在一些情况下，抗gp120抗体结合HIV-1感染的细胞。在一些情况下，抗gp120抗体片段结合游离的HIV-1病毒和HIV-1感染的细胞。在一些情况下，抗 gp120抗体会结合至少两种不同的HIV-1株(例如，M组、N组、O组或P组)。在一个实施方案中，抗gp120抗体片段结合pWITO.c/2474(登录号JN944948和NIH AIDS Reagent Program目录号11739)。在另一个实施方案中，抗gp120抗体片段结合pCH058.c/2960(登录号 JN944940和NIH AIDS Reagent Program目录号700010058)。
在一些实施方案中，VH包含与SEQ ID NO：7至少70％、至少 75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，VL包含与SEQ ID NO：81、82、83或84 至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91 ％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体片段是Fab、F(ab)2、Fv、scFv、sc(Fv)2 或双体抗体。
在一些实施方案中，上述抗体片段进一步包含细胞毒性剂、放射性同位素、治疗剂、抗病毒剂或可检测标记。
在另一个方面，本公开特征在于包含该方面的抗体片段和药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一个方面，本公开涉及编码该方面的抗体片段的一种或多种核酸。
在另一个方面，本公开提供了包含上述一种或多种核酸的一种或多种载体。
在又一方面，本公开特征在于包含上述一种或多种载体的宿主细胞。
在进一步的方面，本公开提供了产生抗gp120抗体片段的方法。该方法包括在表达一种或多种核酸和产生抗体片段的条件下培养上述宿主细胞。
在另一个方面，本公开特征在于在需要的人类受试者中治疗或预防HIV的方法。该方法包括对人类受试者施用治疗有效量的该方面的抗体片段或药物组合物。在一些实施方案中，人免疫缺陷病毒感染是 HIV-1感染。在一些实施方案中，患者中的HIV具有N332 PNG阳性的Env。在某些实施方案中，HIV是进化枝B、G、A、AC或AE的。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是在下面描述了示例性的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。在冲突的情况下，以本申请(包括定义)为准。材料、方法和实例仅是说明性的，而无意于进行限制。
从以下详细描述和从权利要求，本发明的其他特征和优点是清楚的。
具体实施方式
本文所述的多特异性抗体与人免疫缺陷病毒(HIV)包膜(Env)蛋白 gp120(gp120)和分化簇3(CD3)(例如，CD3ε)结合，且有效地杀死HIV 感染的细胞。例如，多特异性抗体是具有两个抗原结合臂的双特异性抗体，其中该双特异性抗体以一只臂结合HIV感染细胞上的抗原(例如，gp120)和以另一只臂结合T细胞上的抗原(例如CD3)，可以将T 细胞(例如CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)靶向于HIV感染的细胞，导致杀死HIV感染的细胞。结合CD3和gp120的双特异性抗体可以重定向CD8+和CD4+T细胞以杀死表达gp120的细胞(例如，HIV感染的细胞)。该T细胞杀死HIV感染的细胞而与其T细胞受体特异性无关。在一个实施方案中，双特异性抗体是抗gp120 X抗CD3
HIV-1是HIV的主要家族，且占全世界所有感染的95％。HIV-2 主要见于一些西非国家。
HIV病毒分为具体的组，M、N、O和P组，其中M是“主要”的组且造成全球范围内的大部分HIV/AIDS。根据它们的遗传序列，M 组进一步细分为在不同地理位置流行的亚型(也称为进化枝)。
M组“亚型”或“进化枝”是由遗传序列数据定义的HIV-1M组的亚型。M组亚型的实例包括亚型A-K。已知某些亚型具有更高毒力或对不同药物治疗有抗药性。还存在源自不同亚型病毒之间重组的“循环重组形式”或CRF，其各自赋予编号。例如，CRF12_BF是亚型B和 F之间的重组。亚型A在西非很常见。亚型B是欧洲、美洲、日本、泰国和澳大利亚的主要形式。亚型C是南部非洲、东部非洲、印度、尼泊尔和中国部分地区的主要形式。亚型D通常只在东部和中部非洲见到。亚型E从未鉴定为非重组体，其仅与亚型A重组为CRF01_AE。亚型F在非洲中部、南美和东欧发现。亚型G(和CRF02_AG)在非洲和中欧发现。亚型H限于中部非洲。亚型I最初用于描述现在记为 CRF04_cpx的株，其中cpx用于几种亚型的“复合”重组。亚型J主要见于北非、中非和西非，且加勒比亚型K限于刚果民主共和国和喀麦隆。这些亚型有时进一步分为子亚型，例如A1和A2或F1和F2。在 2015年，在古巴发现了与艾滋病的快速发展密切相关的CRF19株，一种亚型A、亚型D和亚型G与亚型D蛋白酶的重组体。
本公开特别地提供了靶向HIV感染细胞表面上的gp120多肽的中和抗体(例如，广泛中和Ab)。针对病毒包膜蛋白的中和抗体可通过阻断易感细胞的感染提供针对HIV-1暴露的适应性免疫防御。广泛的中和表明该抗体可以中和来自不同进化枝的HIV-1分离株。因此，本公开所涵盖的抗体具有跨进化枝结合活性。
gp120
包膜糖蛋白gp120(或gp120)是一种120kDa的糖蛋白，其是HIV 外层的部分。它本身作为由连接在一起三个gp120分子组成并通过 gp41蛋白锚定在膜上的病毒膜刺突(viral membrane spike)存在。gp120 对于病毒感染至关重要，因为它通过与细胞表面受体的相互作用促进HIV进入宿主细胞中。这些受体包括DC-SIGN、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和CD4受体。与辅助T细胞上的CD4结合诱导gp120和gp41 中构象变化级联的开始，其导致病毒与宿主细胞膜的融合。
gp120由HIV env基因编码。env基因编码约850个氨基酸的基因产物。主要env产物是蛋白gp160，其在内质网中被细胞蛋白酶弗林蛋白酶切割成gp120(约480个氨基酸)和gp41(约345个氨基酸)。
以下提供了HIV克隆WITO的示例性gp160多肽的氨基酸序列 (V3高变环加粗，和N332潜在N-连接糖基化位点加粗并加下划线)：
示例性gp120多肽的氨基酸序列提供如下：
以下提供了另一种示例性gp120多肽的氨基酸序列(参见 www.bioafrica.net/proteomics/ENV-GP120prot.html)：
非依赖性人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)分离株之间的基因组多样性，在较低程度上来自同一患者的连续分离株中，且甚至在单一患者分离株内的基因组多样性是HIV-1的众所周知的特征。尽管这种序列异质性分布在整个基因组中，但大多数异质性都位于env基因中。来自几种不同分离株的预测的氨基酸序列的比较表明，序列异质性簇集在表面糖蛋白gp120的五个可变区(命名为V1至V5)中。V3区，虽然只有35个氨基酸长，显示出相当大的序列变异性。有趣的是，尽管存在这种变异性，V3区包括介导与CD4+细胞的相互作用的决定子。 gp120变异性的增加导致病毒复制的较高水平，表明感染多样HIV-1 变体的个体中病毒适应性的提高。潜在N-连接糖基化位点(PNGS)的变异性也导致病毒适应性提高。PNGS允许长链碳水化合物与gp120 的高可变区结合。因此，env中PNGS的数量可能通过提供或多或少的对中和抗体的敏感性来影响病毒的适应性。
以下提供gp120 V3区的共有序列(Milich等，J Virol.,67(9): 5623-5634(1993))：
CTRPNNNTRKSIHIGPGRAFYTTGEIIGDIRQAHC(SEQ ID NO:22)。
抗gp120抗体
本公开特征在于抗gp120抗体。在某些实施方案中，这些抗体与细胞表面上表达的HIV-1抗原结合并消除或杀死感染的细胞。
在某些实施方案中，这些抗体是靶向HIV-1的中和抗体(例如，单克隆)。“中和抗体”是可以在体外中和HIV在宿主和/或在靶细胞中引发感染和/或使感染持久的能力的抗体。本公开提供了中和单克隆人抗体，其中抗体识别来自HIV的抗原，例如gp120多肽。在某些实施方案中，“中和抗体”可以以>1.5或>2.0的中和指数抑制HIV-1病毒 (例如SF162和/或JR-CSF)的进入(Kostrikis LG等J.Virol.,70(1): 445-458(1996))。
在一些实施方案中，这些抗体是靶向HIV-1的广泛中和抗体(例如，单克隆)。“广泛中和抗体”是指在中和测定中中和一种以上HIV-1 病毒种类(来自多样的进化枝和进化枝中的不同株)的抗体。广泛中和抗体可以中和至少2、3、4、5、6、7、8、9或更多种不同的HIV-1株，这些株属于相同或不同的进化枝。在特定的实施方案中，广泛中和抗体可以中和属于至少2、3、4、5或6个不同进化枝的多个HIV-1 种类。在某些实施方案中，抗体的抑制浓度可以小于约0.0001μg/ml，小于约0.001μg/ml，小于约0.01μg/ml，小于约0.1μg/ml，小于约0.5 μg/ml，小于约1.0μg/ml，小于约5μg/ml，小于约10μg/ml，小于约 25μg/ml，小于约50μg/ml或小于约100μg/ml以在中和测定中中和约50％的输入病毒。
在一个实施方案中，本公开的抗gp120抗体与在PCT申请公开号WO 2012/030904中描述为PGT-121LO6的抗体相关。下表1提供了PGT-121LO6抗体的相关序列信息。
表1
与PGT-121 LO6抗体高度相关的抗体(即PGT-122)的晶体结构和实验分析表明，PGT122也利用CDR之外的氨基酸残基以结合抗原(与 CDR一起)。例如，该抗体似乎在框架区中具有接触抗原的另外的区域(参见，例如，Experimental Validation for PGT121 andrelated antibodies:Sok等PLOS Pathogens,9,e1003754(2013))。已经确定了与Env病毒抗原结合的PGT122的高分辨率结构(参见，例如，Julien JP 等，Science，342，14777-14783(2013)和Pancera，M.等，Nature，514， 455-461(2014))。PGT121的结构在Julien JP等，PLOS Pathogens 9， e1003342(2013)和Mouquet H等，PNAS，109，E3268-E3277(2012) 中描述。PGT122的结构描述于Julien JP等，PLOS Pathogens 9，e1003342(2013)，PDB ID 4JY5中；和PGT123的结构在Julien JP等， PLOS Pathogens 9，e1003342(2013)中描述。PGT122和PGT123抗体与PGT121抗体密切相关，因此PGT122/Env结构以及对PGT121、 PGT122和PGT123结构的了解可用于对与Env结合的PGT121的结构进行非常精确的建模，并以高可信度预测参与与Env的结合的 PGT121的残基。以下提供了基于与PGT122和PGT122/Env结构的相似性预测的PGT121 LO6抗体接触gp120抗原的残基，以粗体显示框架残基(Kabat编号)：
VH(Kabat编号):
33、56、58、99、100、100A、100B、100C、100D、100E、100G、 100I、100J、100K、100L；和
VL(Kabat编号):
28、29、30、50、51、52、66、67、67A、67C、91、92、93、 94、95、95A、95B。
PGT-121 LO6抗体已显示与多种不同的抗原变体(例如，不同的病毒株)结合，其可以在除上面列出的那些以外的未知的氨基酸位置处接触抗体。不同的病毒株具有不同的Env(即，抗原)序列和不同的糖基化模式，且甚至单一Env序列可以具有异质的糖基化模式，从而需要广泛结合或中和抗体来识别不同HIV-1变体的Env蛋白或甚至相同Env蛋白上的不同糖基化模式。例如，PGT121的表位由Env V3 环组成，特别是位置N332处的N-连接聚糖。V3环是细胞嗜性和病毒进化枝的主要决定子。在多个进化枝的117种CCR5嗜性病毒中，在编码N332聚糖的病毒DNA序列中潜在N-连接糖基化(PNG)基序的存在与进化枝B、G、A、AC和AE的病毒中对于PGT121中和的易感性显著相关。从参加吉利德(Gilead)赞助的临床试验的患者中分离的50个进化枝B Env序列中，94％的带有N332 PNG基序的CCR5 嗜性Env易于被PGT121中和，相比之下，只有26％的非CCR5嗜性、 N332 PNG阳性的病毒易感(P<0.0001)。因此，Env进化枝、嗜性和 N332 PNG基序的存在的遗传确定高度预测对PGT121中和的易感性，并且可以用作预测对PGT121及其衍生物的中和的病毒易感性的标志物。
本公开提供了PGT-121LO6抗体的变体。在某些实施方案中，与 PGT-121LO6抗体相比，这些变体对gp120具有基本上相同或增加的结合亲和力。可以使用本领域已知的任何测定法，包括ELISA、SPR、 BLI或流式细胞术来测定结合亲和力。在某些实施方案中，与PGT-121 LO6抗体相比，这些变体在pH 6.0下对FcRn的结合亲和力增加。在一些实施方案中，相对于PGT-121LO6抗体，这些变体具有增加的 HIV-1中和。在某些实施方案中，与PGT-121LO6抗体相比，变体具有降低的免疫原性。在某些实施方案中，预测本公开的变体与Env蛋白的结合涉及以下残基(HIV Env HXB2编号)中或周围的Env区域： V3环(324-328，330)和相关的N332聚糖及V1-环(135-137)的一部分和相关的N137聚糖，残基415-417。用于Env结合的抗体互补位预测涉及以下区域中与抗原直接接触的残基(Kabat编号)：CDRH1(33)、 CDRH2(50、56、58)、CDRH3(99、100、100A、100B、100C、100D、 100E、100G、100I、100L)、CDRL1(28、29、30)、CDRL2(50、51、 52)、LFR3(66、67、67A、67B和67C)和CDRL3(93、94、95A、95B)。
PGT-121LO6重链可变域序列(具有Kabat编号)(SEQ ID NO: 126)
PGT-121LO6轻链可变域序列(具有Kabat编号；注意VL终止于 107位(V)；即G108不是VL的部分)(SEQ ID NO:127)
PGT-121 LO6抗体的一种示例性变体是PGT-121.60抗体，其相关序列信息在下表2中提供。
表2
示例性抗gp120抗体1
示例性抗gp120抗体1与PGT-121.60抗体相关。表3提供了示例性抗gp120抗体1(PGT121.60人IgG1 FEARLS/人λ)的相关氨基酸序列。
表3
抗gp120抗体可包含示例性抗gp120抗体1的重链CDR1、CDR2 和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方案中，CDR 基于Kabat定义来定义。在另一个实施方案中，CDR基于Chothia定义来定义。在特定的实施方案中，Chothia定义来自Discovery Studio，其使用Chothia和Lesk，J Mol Biol.196(4)：901-17(1987)和Morea等， Methods，20：267-279(2000)的定义。在另一具体实施方案中，Chothia 定义基于来自Abysis定义的Chothia。在另一实施方案中，CDR基于 IMGT定义来定义。在另一实施方案中，CDR基于Honegger定义来定义。在另一实施方案中，CDR基于接触定义来定义。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合包含或由SEQ ID NO：21所示氨基酸序列组成的蛋白质。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合包含或由SEQ ID NO：38所示氨基酸序列组成的蛋白质。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合游离的HIV-1病毒。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合HIV-1感染的细胞。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合游离的HIV-1病毒和HIV-1感染的细胞。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合至少两种不同的HIV-1株(例如， M组、N组、O组或P组)。在一个实施方案中，本公开的抗gp120 抗体结合pWITO.c/2474(登录号JN944948和NIH AIDS Reagent Program目录号11739)。在另一个实施方案中，本公开的抗gp120抗体结合pCH058.c/2960(登录号JN944940和NIH AIDS Reagent Program目录号700010058)。
在某些情况下，抗gp120抗体包含与示例性抗gp120抗体1的可变重链具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91 ％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗gp120抗体包含与示例性抗gp120抗体1的重链具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89 ％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99 ％或100％同一性的氨基酸序列。在某些情况下，抗gp120抗体包含与示例性抗gp120抗体1的可变轻链具有至少80％、85％、86％、87 ％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97 ％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些情况下，抗gp120 抗体包含与示例性抗gp120抗体1的轻链具有至少80％、85％、86 ％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96 ％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗gp120抗体包含与示例性抗gp120抗体1的可变重链和可变轻链具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗gp120抗体包含与示例性抗 gp120抗体1的重链具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或 100％同一性的氨基酸序列且包含与示例性抗gp120抗体的轻链1具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合包含或由SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列组成的蛋白质。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合包含SEQ ID NO：38所示氨基酸序列或由其组成的蛋白质。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合游离的HIV-1 病毒。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合HIV-1感染的细胞。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合游离的HIV-1病毒和 HIV-1感染的细胞。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合至少两种不同的HIV-1株(例如，M组、N组、O组或P组)。在一个实施方案中，本公开的抗gp120抗体结合pWITO.c/2474(登录号JN944948 和NIH AIDS Reagent Program目录号11739)。在另一个实施方案中，本公开的抗gp120抗体结合pCH058.c/2960(登录号JN944940和NIH AIDSReagent Program目录号700010058)。
在一些实施方案中，示例性抗gp120抗体1的可变重链与包含 CH1结构域和铰链区的重链恒定区连接。在一些实施方案中，示例性抗gp120抗体1的可变重链与包含CH3结构域的重链恒定区连接。在某些实施方案中，示例性抗gp120抗体1的可变重链与包含来自 IgG4的CH1结构域、铰链区和CH2结构域及CH3结构域(例如，例如IgG1)的重链恒定区连接。在某些实施方案中，示例性抗gp120抗体1的可变重链与包含来自IgG1(例如，人IgG1，例如，IgG1m3同种异型)的CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域及IgG3铰链区(例如，WO 2017/096221中命名为“IgG3 C-”的“开放”IgG3铰链变体(参见，例如，该PCT公开的图2A))的重链恒定区连接。该IgG3铰链变体预期表现出改善的Fab臂柔性和跨200A0距离(足以用于三聚体内相互作用(intra-trimeric interaction))的能力。在某些实施方案中，这种嵌合抗体在重链恒定区中包含一个或多个另外的突变，其增加了嵌合抗体的稳定性。在某些实施方案中，重链恒定区包括改变抗体的性质(例如，减少Fc受体结合、增加或减少抗体糖基化、减少与C1q的结合、增加半衰期、降低效应子功能)的置换。
在某些实施方案中，抗gp120抗体是IgG抗体。在一个实施方案中，该抗体是IgG1。在另一个实施方案中，抗体是IgG2。在一些实施方案中，抗体具有嵌合的重链恒定区(例如，具有IgG4的CH1、铰链和CH2区以及IgG1的CH3区)。
IgG抗体以各种同种异型和异同种异型(isoallotype)存在。在特定的实施方案中，本公开的抗体包括具有同种异型G1m1、nG1m2、 G1m3、G1m17,1、G1m17,1,2、G1m3,1或G1m17的IgG1重链。这些同种异型或异同种异型各自特征在于IgG1重链恒定区(Fc)中指定位置(EU编号)处的以下氨基酸残基：
G1m1:D356,L358；
nG1m1:E356,M358；
G1m3:R214,E356,M358,A431；
G1m17,1:K214,D356,L358,A431；
G1m17,1,2:K214,D356,L358,G431；
G1m3,1:R214,D356,L358,A431；和
G1m17:K214,E356,M358,A431。
在具体的实施方案中，示例性抗gp120抗体1的VH直接或通过***氨基酸序列(例如，G-S接头)与以下提供的野生型IgG1m3序列(代表性的同种异型决定残基以粗体表示)连接
在某些实施方案中，示例性抗gp120抗体1的VH(例如，与SEQ ID NO：7具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一性或具有0至5个(即，1、2、3、4或5个)氨基酸置换(例如，SEQ ID NO：7中的保守置换)的氨基酸序列)与具有SEQ ID NO：77中的1至10个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 个)氨基酸置换(例如，降低效应子功能和/或增加半衰期的置换)的突变 IgG1m3序列直接连接或通过***氨基酸序列(例如，G-S接头)连接。示例性氨基酸置换之后在本公开中描述。
在某些实施方案中，抗gp120抗体是人IgG1/人κ抗体。在一些实施方案中，本公开的抗体包含具有选自Km1、Km1,2或Km3的同种异型的κ轻链。这些同种异型各自特征在于IgG1轻链内指定位置 (EU编号)处的以下氨基酸残基：
Km1:V153,L191；
Km1,2:A153,L191；和
Km3:A153,V191。
在某些实施方案中，本公开的抗体包含IgG1κ轻链，其包含以下氨基酸序列之一，其中代表性的同种异型决定残基以粗体表示：
Km1:
Km1,2:
Km3:
在某些实施方案中，抗gp120抗体是人IgG1/人λ抗体。每个人类个体包含7到11种不同的λ轻链基因，其编码选自λ1、λ2、λ3、λ4、λ5、λ6和λ7的轻链。在特定实施方案中，本公开的抗体包含选自λ1、λ2、λ3、λ4、λ5、λ6和λ7的λ轻链。在特定的实施方案中，本文所述的抗体包含含有以下氨基酸序列之一的λ轻链，其中代表性的λ决定残基以粗体表示：
λ1:
λ2:
λ3:
λ7:
在具体的实施方案中，示例性抗gp120抗体1的VL(例如，与SEQ ID NO：8具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一性，或具有0至5个(即，1、2、3、4或5个)氨基酸置换(例如，SEQ ID NO：8中的保守置换)的氨基酸序列)与野生型人λ2序列(SEQ ID NO：89)直接连接或通过***氨基酸序列(例如， G-S接头)连接。在某些实施方案中，示例性抗gp120抗体1的VL与具有SEQ ID NO：89中的1至5个(即，1、2、3、4、5个)置换的突变人λ2序列直接连接或通过***氨基酸序列(例如，G-S接头)连接。
在特定的实施方案中，抗gp120抗体是人IgG1m3/人λ2抗体。
例如，可以通过制备和表达编码抗体氨基酸序列的核酸来制备如示例性抗gp120抗体1的抗体。
示例性抗gp120抗体2
另一示例性抗gp120抗体，示例性抗gp120抗体2，具有与示例性抗gp120抗体1相同的六个CDR。该抗体包含含有SEQ ID NO：7 所示的氨基酸序列或由其组成VH序列，及含有以下所示氨基酸序列或由其组成的VL序列：
在某些情况下，VL直接或通过***氨基酸序列(例如，G-S接头) 与人λ恒定区连接。
示例性抗gp120抗体2包含含有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列或由其组成的重链和含有以下所示氨基酸序列或由其组成的轻链：
在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合包含或由SEQ ID NO： 21所示氨基酸序列组成的蛋白质。在一些情况下，本公开的抗gp120 抗体结合包含或由SEQ ID NO：38所示氨基酸序列组成的蛋白质。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合游离的HIV-1病毒。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合HIV-1感染的细胞。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合游离的HIV-1病毒和HIV-1感染的细胞。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合至少两种不同的 HIV-1株(例如，M组、N组、O组或P组)。在一个实施方案中，本公开的抗gp120抗体结合pWITO.c/2474(登录号JN944948和NIH AIDS Reagent Program目录号11739)。在另一个实施方案中，本公开的抗gp120抗体结合pCH058.c/2960(登录号JN944940和NIH AIDS Reagent Program目录号700010058)。
在一些实施方案中，示例性抗gp120抗体2的可变重链(例如，与SEQ ID NO：7具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％同一性或具有0至5个(即，1、2、3、4或5个) 氨基酸置换(例如，SEQ ID NO：7中的保守置换)的氨基酸序列)与包含CH1结构域和铰链区的重链恒定区连接。在一些实施方案中，示例性抗gp120抗体2的可变重链(例如，与SEQ ID NO：7具有至少 80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性或具有0至5个(即，1、2、3、4或5个)氨基酸置换(例如，SEQ ID NO： 7中的保守置换)的氨基酸序列)与包含CH3结构域的重链恒定区连接。在某些实施方案中，示例性抗gp120抗体2的可变重链(例如，与SEQ ID NO：7具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％同一性或具有0至5个(即，1、2、3、4或5个) 氨基酸置换(例如，SEQ ID NO：7中的保守置换)的氨基酸序列)与包含来自IgG4的CH1结构域、铰链区和CH2结构域及CH3结构域(例如，来自IgG1)的重链恒定区连接。在某些实施方案中，示例性抗gp120 抗体1的可变重链与包含来自IgG1(例如，人IgG1，例如，IgG1m3 同种异型)的CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域及IgG3铰链区(例如，WO2017/096221中描述的“开放”IgG3铰链变体“IgG3 C-”)的重链恒定区连接。在某些实施方案中，这种嵌合抗体在重链恒定区中包含一个或多个另外的突变，其增加了嵌合抗体的稳定性。在某些实施方案中，重链恒定区包括改变抗体的性质(例如，减少Fc受体结合、增加或减少抗体糖基化、减少与C1q的结合、增加半衰期、降低效应子功能)的置换。
在某些实施方案中，抗gp120抗体是IgG抗体。在一个实施方案中，该抗体是IgG1。在另一个实施方案中，抗体是IgG2。在一些实施方案中，抗体具有嵌合的重链恒定区(例如，具有IgG4的CH1、铰链和CH2区以及IgG1的CH3区)。
在特定的实施方案中，本公开的抗体包括具有同种异型G1m1、 nG1m2、G1m3、G1m17,1、G1m17,1,2、G1m3,1或G1m17的IgG1 重链。
在某些实施方案中，抗gp120抗体是人IgG1/人κ抗体。在一些实施方案中，本公开的抗体包含具有选自Km1、Km1,2或Km3的同种异型的κ轻链。在某些实施方案中，抗gp120抗体是人IgG1/人λ抗体。在一些实施方案中，本公开的抗体包含选自λ1、λ2、λ3、λ4、λ5、λ6和λ7的轻链。
在一个特定的实施方案中，抗gp120抗体是人IgG1m3/人λ2抗体。
在一些实施方案中，示例性抗gp120抗体2的VH(例如，与SEQ ID NO：7具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一性，或具有0至5个(即，1、2、3、4或5个)氨基酸置换(例如，SEQ ID NO：7内的保守置换)的氨基酸序列)与野生型 IgG1m3序列(SEQ ID NO：77)直接与或通过***氨基酸序列(例如， G-S接头)连接。在某些实施方案中，示例性抗gp120抗体2的VH(例如，与SEQ ID NO：7具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97 ％、98％、99％或100％同一性，或具有0至5(即，1、2、3、4或 5)个氨基酸置换(例如，SEQID NO：7中的保守置换)的氨基酸序列) 与具有SEQ ID NO：77中的1至10个(例如，1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10个)氨基酸置换(例如，降低效应子功能和/或增加半衰期的置换)的突变IgG1m3序列直接连接或通过***氨基酸序列(例如G-S接头)连接。示例性氨基酸置换之后在本公开中描述。
在一些实施方案中，示例性抗gp120抗体2的VL(例如，与SEQ ID NO：81具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一性，或具有0至5个(即，1、2、3、4或5个)氨基酸置换(例如，SEQ ID NO：81中的保守置换)的氨基酸序列)与野生型人λ2序列(SEQ ID NO：89)直接连接或通过***氨基酸序列(例如， G-S接头)连接。在某些实施方案中，示例性抗gp120抗体2的VL(例如，与SEQ ID NO：81具有至少80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％同一性，或具有0至5(即，1、2、3、4或 5)个氨基酸置换(例如，SEQ ID NO：81中的保守置换)的氨基酸序列) 与具有SEQ ID NO：89中的1至5个(即，1、2、3、4、5个)置换的突变人λ2序列直接连接或通过***氨基酸序列(例如，G-S接头)连接。
示例性抗gp120抗体2可以作为单特异性抗体或多特异性抗体(例如，双特异性抗体)使用。本公开涵盖整个抗体或抗原结合片段(例如，Fab、F(ab)2、Fv、scFv、sc(Fv)2、双体抗体)。
如示例性抗gp120抗体2的抗体可以例如通过制备和表达编码抗体的氨基酸序列的核酸来制备。
示例性抗gp120抗体3
另一示例性抗gp120抗体，示例性抗gp120抗体3，具有与示例性抗gp120抗体1相同的六个CDR。该抗体包含含有SEQ ID NO：7 所示的氨基酸序列或由其组成VH序列，及含有以下所示氨基酸序列或由其组成的VL序列：
在一些情况下，VL直接或通过***氨基酸序列(例如，G-S接头) 与人λ恒定区连接。
示例性抗gp120抗体3包含含有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列或由其组成的重链和含有以下所示氨基酸序列或由其组成的轻链：
在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合包含或由SEQ ID NO： 21所示氨基酸序列组成的蛋白质。在一些情况下，本公开的抗gp120 抗体结合包含或由SEQ ID NO：38所示氨基酸序列组成的蛋白质。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合游离的HIV-1病毒。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合HIV-1感染的细胞。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合游离的HIV-1病毒和HIV-1感染的细胞。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合至少两种不同的 HIV-1株(例如，M组、N组、O组或P组)。在一个实施方案中，本公开的抗gp120抗体结合pWITO.c/2474(登录号JN944948和NIH AIDS Reagent Program目录号11739)。在另一个实施方案中，本公开的抗gp120抗体结合pCH058.c/2960(登录号JN944940和NIH AIDS Reagent Program目录号700010058)。
在一些实施方案中，示例性抗gp120抗体3的可变重链与包含 CH1结构域和铰链区的重链恒定区连接。在一些实施方案中，示例性抗gp120抗体3的可变重链与包含CH3结构域的重链恒定区连接。在某些实施方案中，示例性抗gp120抗体3的可变重链与包含来自 IgG4的CH1结构域、铰链区和CH2结构域及CH3结构域(例如来自IgG1)的重链恒定区连接。在某些实施方案中，示例性抗gp120 抗体1的可变重链与包含来自IgG1(例如，人IgG1，例如，IgG1m3 同种异型)的CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域及IgG3铰链区(例如，WO2017/096221中描述的“开放”IgG3铰链变体“IgG3 C-”)的重链恒定区连接。在某些实施方案中，这种嵌合抗体在重链恒定区中包含一个或多个另外的突变，其增加嵌合抗体的稳定性。在某些实施方案中，重链恒定区包括改变抗体的性质(例如，减少Fc受体结合、增加或减少抗体糖基化、减少与C1q的结合、增加半衰期、降低效应子功能)的置换。
在某些实施方案中，抗gp120抗体是IgG抗体。在一个实施方案中，该抗体是IgG1。在另一个实施方案中，抗体是IgG2。在一些实施方案中，抗体具有嵌合的重链恒定区(例如，具有IgG4的CH1、铰链和CH2区以及IgG1的CH3区)。
在特定的实施方案中，本公开的抗体包括具有同种异型G1m1、 nG1m2、G1m3、G1m17,1、G1m17,1,2、G1m3,1或G1m17的IgG1 重链。
在某些实施方案中，抗gp120抗体是人IgG1/人κ抗体。在一些实施方案中，本公开的抗体包含具有选自Km1、Km1,2或Km3的同种异型的κ轻链。在某些实施方案中，抗gp120抗体是人IgG1/人λ抗体。在一些实施方案中，本公开的抗体包含选自λ1、λ2、λ3、λ4、λ5、λ6和λ7的轻链。
在特定的实施方案中，抗gp120抗体是人IgG1m3/人λ2抗体。
在一些实施方案中，示例性抗gp120抗体3的VH(例如，与SEQ ID NO：7具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一性，或具有0至5个(即，1、2、3、4或5个)氨基酸置换(例如，SEQ ID NO：7内的保守置换)的氨基酸序列)与野生型 IgG1m3序列(SEQ ID NO：77)直接连接或通过***氨基酸序列(例如， G-S接头)连接。在某些实施方案中，示例性抗gp120抗体3的VH(例如，与SEQ ID NO：7具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97 ％、98％、99％或100％同一性，或具有0至5(即，1、2、3、4或 5)个氨基酸置换(例如，SEQ ID NO：7中的保守置换)氨基酸序列) 与具有SEQ ID NO：77中的1至10个(例如，1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10个)氨基酸置换(例如，以降低效应子功能和/或延长半衰期) 的突变IgG1m3序列直接连接或通过***氨基酸序列(例如G-S接头) 连接。示例性氨基酸置换之后在本公开中描述。
在一些实施方案中，示例性抗gp120抗体3的VL(例如，与SEQ ID NO：82具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一性，或具有0至5个(即，1、2、3、4或5个)氨基酸置换(例如，SEQ ID NO：82中的保守置换)的氨基酸序列)与野生型人λ2序列(SEQ ID NO：89)直接连接或通过***氨基酸序列(例如， G-S接头)连接。在某些实施方案中，示例性抗gp120抗体3的VL(例如，与SEQ ID NO：82具有至少80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％同一性，或具有0至5(即，1、2、3、4或 5)个氨基酸置换(例如，SEQ ID NO：82中的保守置换)的氨基酸序列) 与具有SEQ ID NO：89中的1至5个(即，1、2、3、4、5个)置换的突变人λ2序列直接连接或通过***氨基酸序列(例如，G-S接头)连接。
示例性抗gp120抗体3可作为单特异性抗体或多特异性抗体(例如，双特异性抗体)使用。本公开涵盖整个抗体或抗原结合片段(例如， Fab、F(ab)2、Fv、scFv、sc(Fv)2、双体抗体)。
例如，可以通过制备和表达编码抗体氨基酸序列的核酸来制备诸如示例性抗gp120抗体3的抗体。
示例性抗gp120抗体4
另一示例性抗gp120抗体，示例性抗gp120抗体4，具有与示例性抗gp120抗体1相同的六个CDR。该抗体包含含有SEQ ID NO：7 所示的氨基酸序列或由其组成VH序列，及含有以下所示氨基酸序列或由其组成的VL序列：
在某些情况下，VL直接或通过***氨基酸序列(例如，G-S接头) 与人λ恒定区连接。
示例性抗gp120抗体4包含含有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列或由其组成的重链和含有以下所示氨基酸序列或由其组成的轻链：
在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合包含或由SEQ ID NO： 21所示氨基酸序列组成的蛋白质。在一些情况下，本公开的抗gp120 抗体结合包含或由SEQ ID NO：38所示氨基酸序列组成的蛋白质。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合游离的HIV-1病毒。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合HIV-1感染的细胞。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合游离的HIV-1病毒和HIV-1感染的细胞。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合至少两种不同的 HIV-1株(例如，M组、N组、O组或P组)。在一个实施方案中，本公开的抗gp120抗体结合pWITO.c/2474(登录号JN944948和NIH AIDS Reagent Program目录号11739)。在另一个实施方案中，本公开的抗gp120抗体结合pCH058.c/2960(登录号JN944940和NIH AIDS Reagent Program目录号700010058)。
在一些实施方案中，示例性抗gp120抗体4的可变重链与包含 CH1结构域和铰链区的重链恒定区连接。在一些实施方案中，示例性抗gp120抗体4的可变重链与包含CH3结构域的重链恒定区连接。在某些实施方案中，示例性抗gp120抗体4的可变重链与包含来自 IgG4的CH1结构域、铰链区和CH2结构域及CH3结构域(例如来自IgG1)的重链恒定区连接。在某些实施方案中，示例性抗gp120 抗体1的可变重链与包含来自IgG1(例如，人IgG1，例如，IgG1m3 同种异型)的CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域及IgG3铰链区(例如，WO2017/096221中描述的“开放”IgG3铰链变体“IgG3 C-”)的重链恒定区连接。在某些实施方案中，这样的嵌合抗体在重链恒定区中包含一个或多个另外的突变，其增加嵌合抗体的稳定性。在某些实施方案中，重链恒定区包括改变抗体的性质(例如，减少Fc受体结合、增加或减少抗体糖基化、减少与C1q的结合、增加半衰期、降低效应子功能)的置换。
在某些实施方案中，抗gp120抗体是IgG抗体。在一个实施方案中，该抗体是IgG1。在另一个实施方案中，抗体是IgG2。在一些实施方案中，抗体具有嵌合的重链恒定区(例如，具有IgG4的CH1、铰链和CH2区以及IgG1的CH3区)。
在特定的实施方案中，本公开的抗体包括具有同种异型G1m1、nG1m2、G1m3、G1m17,1、G1m17,1,2、G1m3,1或G1m17的IgG1 重链。
在某些实施方案中，抗gp120抗体是人IgG1/人κ抗体。在一些实施方案中，本公开的抗体包含具有选自Km1、Km1,2或Km3的同种异型的κ轻链。在某些实施方案中，抗gp120抗体是人IgG1/人λ抗体。在一些实施方案中，本公开的抗体包含选自λ1、λ2、λ3、λ4、λ5、λ6和λ7的λ轻链。
在一些实施方案中，示例性抗gp120抗体4的VH(例如，与SEQ ID NO：7具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一性，或具有0至5个(即，1、2、3、4或5个)氨基酸置换(例如，SEQ ID NO：7内的保守置换)的氨基酸序列)与野生型 IgG1m3序列(SEQ ID NO：77)直接连接与或通过***氨基酸序列(例如，G-S接头)连接。在某些实施方案中，示例性抗gp120抗体4的 VH(例如，与SEQ ID NO：7具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，或具有0至5(即1、2、3、4 或5)个氨基酸置换(例如，SEQID NO：7中的保守置换)的氨基酸序列)与具有SEQ ID NO：77中的1至10(例如，1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10)个氨基酸置换(例如，以降低效应子功能和/或增加半衰期) 的突变IgG1m3序列直接连接或通过***氨基酸序列(例如G-S接头) 连接。示例性氨基酸置换之后在本公开中描述。
在一些实施方案中，示例性抗gp120抗体4的VL(例如，与SEQ ID NO：83具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％的同一性，或具有0至5个(即，1、2、3、4或5个)氨基酸置换(例如，SEQ ID NO：83中的保守置换)的氨基酸序列)与野生型人λ2序列(SEQ ID NO：89)直接连接或通过***氨基酸序列(例如， G-S接头)连接。在某些实施方案中，示例性抗gp120抗体4的VL(例如，与SEQ ID NO：83具有至少80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％同一性，或具有0至5(即，1、2、3、4或 5)个氨基酸置换(例如，SEQ ID NO：83中的保守置换)的氨基酸序列) 与在SEQ ID NO：89内具有1至5个(即，1、2、3、4、5个)置换的突变人λ2序列直接连接或通过***氨基酸序列(例如G-S接头)连接。
在特定的实施方案中，抗gp120抗体是人IgG1m3/人λ2抗体。
示例性抗gp120抗体4可以作为单特异性抗体或多特异性抗体 (例如，双特异性抗体)使用。可以使用完整抗体或抗原结合片段(例如， Fab、F(ab)2、Fv、scFv、sc(Fv)2、双体抗体)。
例如，可以通过制备并表达编码抗体的氨基酸序列的核酸来制备诸如示例性抗gp120抗体4的抗体。
示例性抗gp120抗体5
另一示例性抗gp120抗体，示例性抗gp120抗体5，具有与示例性抗gp120抗体1相同的六个CDR。该抗体包含含有SEQ ID NO：7 所示的氨基酸序列或由其组成VH序列，及含有以下所示氨基酸序列或由其组成的VL序列：
在一些情况下，VL直接或通过***氨基酸序列(例如，G-S接头) 与人λ恒定区连接。
示例性抗gp120抗体5包含含有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列或由其组成的重链和含有以下所示氨基酸序列或由其组成的轻链
在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合包含或由SEQ ID NO： 21所示氨基酸序列组成的蛋白质。在一些情况下，本公开的抗gp120 抗体结合包含或由SEQ ID NO：38所示氨基酸序列组成的蛋白质。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合游离的HIV-1病毒。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合HIV-1感染的细胞。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合游离的HIV-1病毒和HIV-1感染的细胞。在一些情况下，本公开的抗gp120抗体结合至少两种不同的 HIV-1株(例如，M组、N组、O组或P组)。在一个实施方案中，本公开的抗gp120抗体结合pWITO.c/2474(登录号JN944948和NIH AIDS Reagent Program目录号11739)。在另一个实施方案中，本公开的抗gp120抗体结合pCH058.c/2960(登录号JN944940和NIH AIDS Reagent Program目录号700010058)。
在一些实施方案中，示例性抗gp120抗体5的可变重链与包含 CH1结构域和铰链区的重链恒定区连接。在一些实施方案中，示例性抗gp120抗体5的可变重链与包含CH3结构域的重链恒定区连接。在某些实施方案中，示例性抗gp120抗体5的可变重链与包含来自 IgG4的CH1结构域、铰链区和CH2结构域及CH3结构域(例如来自IgG1)的重链恒定区连接。在某些实施方案中，示例性抗gp120 抗体1的可变重链与包含来自IgG1的CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域(例如，人IgG1，例如，IgG1m3同种异型)及IgG3铰链区 (例如，WO2017/096221中描述的“开放”IgG3铰链变体“IgG3 C-”)的重链恒定区连接。在某些实施方案中，这样的嵌合抗体在重链恒定区中包含一个或多个另外的突变，其增加嵌合抗体的稳定性。在某些实施方案中，重链恒定区包括改变抗体的性质(例如，减少Fc受体结合、增加或减少抗体糖基化、减少与C1q的结合、增加半衰期、降低效应子功能)的置换。
在某些实施方案中，抗gp120抗体是IgG抗体。在一个实施方案中，该抗体是IgG1。在另一个实施方案中，抗体是IgG2。在一些实施方案中，抗体具有嵌合的重链恒定区(例如，具有IgG4的CH1、铰链和CH2区以及IgG1的CH3区)。
在特定的实施方案中，本公开的抗体包括具有同种异型G1m1、 nG1m2、G1m3、G1m17,1、G1m17,1,2、G1m3,1或G1m17的IgG1 重链。
在某些实施方案中，抗gp120抗体是人IgG1/人κ抗体。在一些实施方案中，本公开的抗体包含具有选自Km1、Km1,2或Km3的同种异型的κ轻链。在某些实施方案中，抗gp120抗体是人IgG1/人λ抗体。在一些实施方案中，本公开的抗体包含选自λ1、λ2、λ3、λ4、λ5、λ6和λ7的λ轻链。
在一些实施方案中，示例性抗gp120抗体5的VH(例如，与SEQ ID NO：7具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一性，或具有0至5个(即，1、2、3、4或5个)氨基酸置换(例如，SEQ ID NO：7内的保守置换)的氨基酸序列)与野生型 IgG1m3序列(SEQ ID NO：77)直接连接或通过***氨基酸序列(例如， G-S接头)连接。在某些实施方案中，示例性抗gp120抗体5的VH(例如，与SEQ ID NO：7具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97 ％、98％、99％或100％同一性，或具有0至5(即，1、2、3、4或 5)个氨基酸置换(例如，SEQ ID NO：7中的保守置换)的氨基酸序列) 与具有SEQ ID NO：77中的1至10个(例如，1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10)氨基酸置换(例如，以降低效应子功能和/或延长半衰期)的突变IgG1m3序列直接连接或通过***氨基酸序列(例如G-S接头)连接。示例性氨基酸置换之后在本公开中描述。
在一些实施方案中，示例性抗gp120抗体5的VL(例如，与SEQ ID NO：84具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一性，或具有0至5个(即，1、2、3、4或5)个氨基酸置换(例如，SEQ ID NO：84中的保守置换)的氨基酸序列)与野生型人λ2序列(SEQ ID NO：89)直接连接或通过***氨基酸序列(例如， G-S接头)连接。在某些实施方案中，示例性抗gp120抗体5的VL(例如，与SEQ ID NO：84具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，或具有0至5(即，1、2、3、4或 5)个氨基酸置换(例如，SEQ ID NO：84中的保守置换)的氨基酸序列) 与在SEQ ID NO：89内具有1至5个(即，1、2、3、4、5个)置换的突变人λ2序列直接连接或通过***氨基酸序列(例如G-S接头)连接。
在特定的实施方案中，抗gp120抗体是人IgG1m3/人λ2抗体。
示例性抗gp120抗体5可作为单特异性抗体或多特异性抗体(例如，双特异性抗体)使用。本公开涵盖整个抗体或抗原结合片段(例如， Fab、F(ab)2、Fv、scFv、sc(Fv)2、双体抗体)。
诸如示例性抗gp120抗体5的抗体可以例如通过制备并表达编码抗体的氨基酸序列的核酸来制备。
CD3
分化簇(CD3)是多聚体蛋白质复合物，其由四个不同的多肽链组成：epsilon(ε)、gamma(γ)、delta(δ)和zeta(ζ)，它们组装并作为三对二聚体(εγ、εδ、ζζ)发挥功能。CD3蛋白具有N末端胞外区、跨膜结构域和免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)位于其中的胞质尾。CD3ε、γ和δ的细胞外结构域包含免疫球蛋白样结构域，且因此被认为是免疫球蛋白超家族的部分。CD3/T细胞共受体有助于激活CD8+T细胞以及CD4+T细胞。
人CD3ε的氨基酸序列可以在UNiProtKB-P07766中找到，并在下面提供(信号序列带有下划线)：
人CD3δ的氨基酸序列可以在UNiProtKB-P04234找到，并在下面提供(信号序列加下划线)：
结合人CD3的抗体是本领域众所周知的(参见，例如，Kuhn& Weiner，Immunotherapy，8(8)：889-906(2016)；WO 2015/104346)。 OKT3(Muromab)，一种针对CD3ε的抗CD3抗体，已批准在临床上用于人体中以在实体器官移植中诱导免疫抑制，从而预防和治疗排斥反应(Norman，Therapeutic Drug Monitoring，17，615-620(1995))。Teplizumab，也称为hOKT3γ1(Ala-Ala)和MGA031，是通过将OKT3 的互补决定区移植到人IgG1骨架中而开发的人源化IgG1抗体。将两个点突变引入其Fc部分中降低了与FcR的结合。Otelixizumab (ChAglyCD3、TRX4、GSK2136525)源自大鼠抗体YTH12.5。该人源化IgG1在γ1Fc部分中带有单一突变以避免糖基化并因此抑制FcR 结合。Visilizumab(Nuvion，HuM291)是通过其Fc区中的两个点突变使其非促有丝***的人源化IgG2抗体。Foralumab(28F11-AE； NI-0401)是完全人的抗CD3 mAb；这种人IgG1的Fc部分发生突变以使得mAb在体外是非FcR结合的，并且在保持CD3/TCR调节和T 细胞耗竭的同时在体内仅表现出少量细胞因子释放。
抗CD3抗体的非限制性实例还在US 2016/0333095A1中公开。
在某些实施方案中，本公开的抗CD3抗体结合人CD3。在一些情况下，本公开的抗CD3抗体结合人CD3ε。在其他实施方案中，本公开的抗CD3抗体结合人CD3δ。
示例性抗CD3抗体1
表4中提供了示例性抗CD3抗体1的相关序列信息。
表4
抗CD3抗体可以包括示例性抗CD3抗体1的重链CDR1、CDR2 和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方案中，CDR 基于Kabat定义来定义。在另一个实施方案中，CDR基于Chothia定义来定义。在另一个实施方案中，CDR基于IMGT定义来定义。在另一个实施方案中，CDR基于Honegger定义来定义。在另一个实施方案中，CDR基于来自Abysis定义的Chothia定义。在另一个实施方案中，CDR基于Chothia/AbM CDR来定义。在另一个实施方案中， CDR基于接触定义来定义。例如，这些CDR可以使用AbYsis数据库(www.bioinf.org.uk/abysis/sequence_input/key_annotation/ key_annotation.cgi)确定。
在某些情况下，抗CD3抗体包含与示例性抗CD3抗体1的可变重链具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD3抗体包含与示例性抗CD3 抗体1的重链具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90 ％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100 ％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，抗CD3抗体包含与示例性抗CD3抗体1的可变轻链具有至少80％、85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，抗CD3抗体包含与示例性抗CD3抗体1的轻链具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CD3 抗体包含与示例性抗CD3抗体1的可变重链和可变轻链具有至少80 ％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94 ％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD3抗体包含与示例性抗CD3抗体1的重链具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92 ％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，且包含与示例性抗CD3抗体1的轻链具有至少80％、 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，示例性抗CD3抗体1的可变重链与包含CH1 结构域和铰链区的重链恒定区连接。在一些实施方案中，示例性抗 CD3抗体1的可变重链与包含CH3结构域的重链恒定区连接。在某些实施方案中，示例性抗CD3抗体1的可变重链与包含来自IgG4的CH1结构域、铰链区和CH2结构域及CH3结构域(例如来自IgG1) 的重链恒定区连接。在某些实施方案中，示例性抗gp120抗体1的可变重链与包含来自IgG1(例如，人IgG1，例如，IgG1m3同种异型)的 CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域及IgG3铰链区(例如， WO2017/096221中描述的“开放”IgG3铰链变体“IgG3 C-”)的重链恒定区连接。在某些实施方案中，这样的嵌合抗体在重链恒定区中包含一个或多个另外的突变，其增加嵌合抗体的稳定性。在某些实施方案中，重链恒定区包括改变抗体的性质(例如，减少Fc受体结合、增加或减少抗体糖基化、减少与C1q的结合、增加半衰期、降低效应子功能) 的置换。
在某些实施方案中，抗CD3抗体是IgG抗体。在一个实施方案中，该抗体是IgG1。在另一个实施方案中，抗体是IgG2。在一些实施方案中，抗体具有嵌合的重链恒定区(例如，具有IgG4的CH1、铰链和CH2区以及IgG1的CH3区)。
在特定的实施方案中，本公开的抗体包括具有同种异型G1m1、 nG1m2、G1m3、G1m17,1、G1m17,1,2、G1m3,1或G1m17的IgG1 重链。
在具体的实施方案中，示例性抗CD3抗体1的VH与野生型 IgG1m3 Fc(SEQ ID NO：77)连接。在某些情况下，示例性抗CD3抗体1的VH与具有SEQ ID NO:77中的1至10个(例如，1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10个)氨基酸置换(例如，降低效应子功能和/或增加半衰期)的突变IgG1m3序列连接。示例性的氨基酸置换描述如下。
在具体的实施方案中，示例性抗CD3抗体1的VL与人λ2序列 (SEQ ID NO：89)连接。在某些情况下，抗CD3抗体1的VL与具有 SEQ ID NO：89中的1至10个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10个)氨基酸置换的突变的人λ2序列连接。此类氨基酸置换描述如下。
在某些实施方案中，抗CD3抗体是人IgG1/人λ抗体。
例如，可以通过制备和表达编码抗体的氨基酸序列的核酸来制备诸如示例性抗CD3抗体1的抗体。
CD89
也称为IgA受体的Fc片段(FCAR)的CD89(分化簇89)是跨膜受体FcαRI。FcαRI结合免疫球蛋白A(IgA)抗体的重链恒定区。FcαRI 在骨髓谱系细胞(包括中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞)的细胞表面上表达。
以下提供了来自UniProtKB-P24071的人CD89的氨基酸序列：
结合人CD89的抗体是本领域众所周知的(参见，例如，Fishwild 等，NatureBiotechnol.，14(7)：845-851(1996)；Duval等，J.Virol.， 82(9)：4671-4674(2008)；US2003/0082643)。在一些实施方案中，抗 CD89抗体是14.1、7.4或8.2之一(也分别称为14A8、7F12和8D2)。这些抗体或其变体中的任何一种可用于本文公开的多特异性抗体中。
在某些实施方案中，本公开的抗CD89抗体或本文公开的多特异性抗体与包含SEQID NO：95所示氨基酸序列或由其组成的多肽结合。
示例性抗CD89抗体1
下表提供了示例性抗CD89抗体1的相关序列信息。
抗CD89抗体可以包括示例性抗CD89抗体1的重链CDR1、CDR2 和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方案中，基于Kabat定义来定义CDR。在另一个实施方案中，基于Chothia定义来定义CDR。在另一个实施方案中，基于IMGT定义来定义CDR。在另一个实施方案中，基于Honegger定义来定义CDR。在另一个实施方案中，基于来自Abysis定义的Chothia定义CDR。在另一个实施方案中，基于Chothia/AbM CDR定义CDR。在另一个实施方案中，基于接触定义来定义CDR。例如，可以使用AbYsis数据库 (www.bioinf.org.uk/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotatio n.cgi)确定这些CDR。
在某些情况下，抗CD89抗体包含与示例性抗CD89抗体1的可变重链具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91 ％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD89抗体包含与示例性抗CD89抗体1的重链具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89 ％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99 ％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，抗CD89抗体包含与示例性抗CD89抗体1的轻链具有至少80％、85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些情况下，抗CD89 抗体包含与示例性抗CD89抗体1轻链具有至少80％、85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CD89抗体包含与示例性抗CD89抗体1的可变重链和可变轻链具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD89抗体包含与示例性抗CD89抗体1的重链具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，且包含与示例性抗CD89抗体1的轻链具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93 ％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，示例性抗CD89抗体1的可变重链与包含 CH1结构域和铰链区的重链恒定区连接。在一些实施方案中，示例性抗CD89抗体1的可变重链与包含CH3结构域的重链恒定区连接。在某些实施方案中，示例性抗CD89抗体1的可变重链与包含来自IgG4的CH1结构域、铰链区和CH2结构域及CH3结构域(例如来自IgG1) 的重链恒定区连接。在某些实施方案中，示例性抗CD89抗体1的可变重链与包含来自IgG1(例如，人IgG1，例如，IgG1m3同种异型)的 CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域及IgG3铰链区(例如， WO2017/096221中描述的“开放”IgG3铰链变体“IgG3 C-”)的重链恒定区连接。在某些实施方案中，这种嵌合抗体在重链恒定区中包含一个或多个另外的突变，其增加嵌合抗体的稳定性。在某些实施方案中，重链恒定区包括改变抗体的性质(例如，减少Fc受体结合、增加或减少抗体糖基化、减少与C1q的结合、增加半衰期、降低效应子功能) 的置换。
在某些实施方案中，抗CD89抗体是IgG抗体。在一个实施方案中，该抗体是IgG1。在另一个实施方案中，抗体是IgG2。在一些实施方案中，抗体具有嵌合重链恒定区(例如，具有IgG4的CH1、铰链和CH2区及IgG1的CH3区)。
在特定的实施方案中，本公开的抗体包括具有同种异型G1m1、 nG1m2、G1m3、G1m17,1、G1m17,1,2、G1m3,1或G1m17的IgG1 重链。
在具体的实施方案中，示例性抗CD89抗体1的VH与野生型 IgG1m3 Fc(SEQ ID NO：77)连接。在某些情况下，示例性抗CD89 抗体1的VH与具有SEQ ID NO：77中的1至10个(例如，1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸置换(例如，以降低效应子功能和/ 或增加半衰期)的突变IgG1m3序列连接。示例性的氨基酸置换描述如下。
在具体的实施方案中，示例性抗CD89抗体1的VL与人λ2序列 (SEQ ID NO：89)连接。在某些情况下，示例性抗CD89抗体1的VL 与具有SEQ ID NO：89中的1至10个(例如，1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10个)氨基酸置换的突变人λ2序列连接。此类氨基酸置换描述如下。
在某些实施方案中，抗CD89抗体是人IgG1/人λ抗体。
例如，可以通过制备和表达编码抗体的氨基酸序列的核酸来制备诸如示例性抗CD89抗体1的抗体。
多特异性抗体
在另一个方面，本公开特征在于多特异性抗体。多特异性抗体是结合两个或更多个不同表位的抗体(例如，双特异性抗体、三价抗体、四价抗体)。上述抗gp120和抗CD3抗体或者抗gp120和抗CD89可以作为多特异性抗体的部分包括。多特异性抗体可具有对于未被多特异性抗体的抗gp120或抗CD3(或抗CD89)抗体结合位点结合的至少一种其他抗原或一种其他表位的结合位点。抗gp120/抗CD3多特异性抗体或抗gp120/抗CD89多特异性抗体可包含二聚化结构域和三个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个)抗原结合位点。示例性的二聚化结构域包含Fc区(或由其组成)。抗-gp120/抗-CD3多特异性抗体或抗-gp120/抗-CD89多特异性抗体可包含三个至约八个(即三、四、五、六、七、八个)抗原结合位点(或由其组成)。多特异性抗体任选地包含至少一个多肽链(例如，两个多肽链、三个多肽链)，其中所述多肽链包含三个或更多个可变域。例如，多肽链可包含，例如， VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc或VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-VD3-(X3)n-Fc，其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，VD3是第三可变域，Fc 是Fc区的多肽链，X1、X2和X3代表氨基酸或肽间隔区，且n为0 或1。在某些情况下，可变域各自可以是scFv。多特异性抗体可以通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达容易地产生。
双特异性抗体
在一个方面，多特异性抗体是双特异性抗体。双特异性抗体是对两个不同表位具有结合特异性的抗体。双特异性抗体有两个“臂”。双特异性抗体的一个臂结合一个表位，和另一臂结合另一个表位。在一个实施方案中，双特异性抗体的一个臂结合第一抗原，而双特异性抗体的另一臂结合第二抗原。在另一个实施方案中，双特异性抗体的两个臂结合相同抗原的两个不同表位。
在一个方面，本公开特征在于特异性地结合gp120并特异性地结合第二抗原(例如，白细胞上的触发分子，如T细胞受体分子(例如， CD3)，或IgG的Fc受体(FcγR)，如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、 FcγRIII(CD16)或CD89)，从而将细胞防御机制集中和定位到感染的细胞上的双特异性抗体。
在特定的实施方案中，双特异性抗体的一个臂特异性结合gp120，而另一个臂特异性结合CD3(例如，人CD3(例如，人CD3ε、人CD3δ))。在另一特定的实施方案中，双特异性抗体的一个臂特异性结合gp120，而另一臂特异性结合CD89(例如人CD89)。在某些实施方案中，结合 gp120的双特异性抗体的臂包含示例性抗gp120抗体1的六个CDR。在一些情况下，根据Kabat定义CDR。在其他实施方案中，根据Chothia 定义CDR。在再其他的实施方案中，根据IMGT定义来定义CDR。在再其他的实施方案中，根据Honegger定义来定义CDR。在某些实施方案中，结合gp120的双特异性抗体的臂包含与示例性抗gp120抗体1的VH(SEQ ID NO：7)至少75％、80％、85％、86％、87％、88 ％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98 ％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合gp120 的双特异性抗体的臂包含与示例性抗gp120抗体1的VL(SEQ ID NO：8)至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合gp120的双特异性抗体的臂包含分别与示例性抗gp120抗体1的VH(SEQ ID NO：7)和VL (SEQ ID NO：8)至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或 100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合gp120的双特异性抗体的臂包含分别与示例性抗gp120抗体2的VH(SEQ ID NO：7) 和VL(SEQ ID NO：81)至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合gp120的双特异性抗体的臂包含分别与示例性抗gp120抗体3的VH(SEQ IDNO：7)和VL(SEQ ID NO：82)至少75％、80％、85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合gp120 的双特异性抗体的臂包含分别与示例性抗gp120抗体4的VH(SEQ ID NO：7)和VL(SEQ ID NO：83)至少75％、80％、85％、86％、87 ％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97 ％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合gp120的双特异性抗体的臂包含分别与示例性抗gp120抗体5的 VH(SEQ ID NO是：7)和VL(SEQ ID NO：84)至少75％、80％、85 ％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95 ％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合gp120的双特异性抗体的臂包含与示例性抗gp120抗体1的重链(SEQ ID NO：9)至少75％、80％、85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合gp120 的双特异性抗体的臂包含与示例性抗gp120抗体的轻链(SEQ ID NO： 10)至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合gp120的双特异性抗体的臂包含分别与示例性抗gp120抗体1的重链(SEQ ID NO：9)和轻链(SEQ ID NO：10)至少75％、80％、与85％、86％、87％、88％、89％、90 ％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100 ％相同的氨基酸序列。在某些情况下，结合gp120的双特异性抗体的臂包含分别与示例性抗gp120抗体2的重链(SEQ ID NO：9)和轻链 (SEQ ID NO：40)至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或 100％相同的氨基酸序列。在某些情况下，结合gp120的双特异性抗体的臂包含分别与示例性抗gp120抗体3的重链(SEQID NO：9)和轻链(SEQ ID NO：78)具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％相同的氨基酸序列。在某些情况下，结合gp120的双特异性抗体的臂包含分别与示例性抗gp120抗体4的重链(SEQ ID NO：9)和轻链(SEQ ID NO：79)至少75％、80％、85％、86％、87％、88 ％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98 ％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些情况下，结合gp120的双特异性抗体的臂包含分别与示例性抗gp120抗体5的重链(SEQ ID NO：9)和轻链(SEQ ID NO：80)至少75％、80％、与85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，结合gp120的双特异性抗体的臂包含SEQ ID NO：7和SEQ ID NO： 8的氨基酸序列。在另一个实施方案中，结合gp120的双特异性抗体的臂包含SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：81的氨基酸序列。在另一个实施方案中，结合gp120的双特异性抗体的臂包含SEQ ID NO：7和 SEQ ID NO：82的氨基酸序列。在又一个实施方案中，结合gp120的双特异性抗体的臂包含SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：83的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，结合gp120的双特异性抗体的臂包含SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：84的氨基酸序列。在一个特定的实施方案中，结合gp120的双特异性抗体的臂包含SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在另一个特定的实施方案中，结合gp120 的双特异性抗体的臂包含SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：40的氨基酸序列。在又一个特定的实施方案中，结合gp120的双特异性抗体的臂包含SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：78的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，结合gp120的双特异性抗体的臂包含SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：79的氨基酸序列。在另一个实施方案中，结合gp120的双特异性抗体的臂包含SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：80的氨基酸序列。在一些情况下，结合gp120的双特异性抗体的臂结合包含或由SEQ ID NO：21所示氨基酸序列组成的蛋白质。在一些情况下，结合gp120的双特异性抗体的臂结合包含或由SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列组成的蛋白质。在一些情况下，结合gp120的双特异性抗体的臂结合游离的HIV-1病毒。在一些情况下，结合gp120的双特异性抗体的臂结合受HIV-1感染的细胞。在一些情况下，结合gp120的双特异性抗体的臂结合游离的HIV-1病毒和HIV-1感染的细胞。在一些情况下，结合gp120的双特异性抗体的臂结合至少两种HIV-1株(例如，M组、 N组、O组或P组)。在一个实施方案中，结合gp120的双特异性抗体的臂结合pWITO.c/2474(登录号JN944948和NIH AIDS Reagent Program目录号11739)。在另一个实施方案中，结合gp120的双特异性抗体的臂结合pCH058.c/2960(登录号JN944940和NIH AIDS Reagent Program目录号700010058)。
在某些实施方案中，结合人CD3的双特异性抗体的臂包含示例性抗人CD3抗体1的六个CDR。在一些情况下，CDR根据Kabat定义。在其他实施方案中，根据Chothia定义CDR。在再其他的实施方案中，根据IMGT定义来定义CDR。在再其他的实施方案中，根据 Honegger定义来定义CDR。在某些实施方案中，结合人CD3的双特异性抗体的臂包含与示例性抗CD3抗体1的VH(SEQ ID NO：17)至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92 ％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合人CD3的双特异性抗体的臂包含与示例性抗CD3抗体1的VL(SEQ ID NO：18)至少75％、80％、 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合人CD3的双特异性抗体的臂包含分别与示例性抗人CD3抗体1的VH(SEQ ID NO：17)和VL(SEQ ID NO：18)至少 75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合人CD3的双特异性抗体的臂包含与示例性抗人CD3抗体1的重链(SEQ ID NO：19)至少75％、80％、85 ％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95 ％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合CD3的双特异性抗体的臂包含与示例性抗人CD3抗体1的轻链(SEQ IDNO：20)至少75％、80％、85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合人 CD3的双特异性抗体的臂包含分别与示例性抗人CD3抗体1的重链 (SEQ ID NO：19)和轻链(SEQ IDNO：20)至少75％、80％、85％、 86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在特定的实施方案中，结合人CD3的双特异性抗体的臂包含SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的氨基酸序列。在另一个特定的实施方案中，结合人CD3 的双特异性抗体的臂包含SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合人CD3的双特异性抗体的臂结合人CD3ε。
在某些实施方案中，结合人CD89的双特异性抗体的臂包含示例性抗人CD89抗体1的六个CDR。在一些情况下，CD是根据Kabat 定的。在其他实施方案中，根据Chothia定义CDR。在再其他的实施方案中，根据IMGT定义来定义CDR。在再其他的实施方案中，根据Honegger定义来定义CDR。在某些实施方案中，结合人CD89的双特异性抗体的臂包含与示例性抗CD89抗体1的VH(SEQ ID NO： 96)至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合人CD89的双特异性抗体的臂包含与示例性抗CD89抗体1的VL(SEQ ID NO：101)至少75％、80 ％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94 ％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合人CD89的双特异性抗体的臂包含分别与示例性抗人CD89抗体1的VH(SEQ ID NO：96)和VL(SEQ ID NO：101) 至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92 ％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合人CD89的双特异性抗体的臂包含与示例性抗人类CD89抗体1的重链(SEQ ID NO：97)至少75％、 80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合CD89的双特异性抗体的臂包含与示例性抗人CD89抗体1的轻链(SEQ ID NO：102)至少75％、80％、85％、86 ％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96 ％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合人CD89的双特异性抗体的臂包含分别与示例性抗人类CD89 抗体1的重链(SEQ ID NO：97)和轻链(SEQ ID NO：102)至少75％、 80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在特定的实施方案中，结合人CD89的双特异性抗体的臂包含SEQ ID NO：96和SEQ IDNO：101的氨基酸序列。在另一个特定的实施方案中，结合人CD89的双特异性抗体的臂包含SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：102的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合人CD89的双特异性抗体的臂结合人CD89。
在某些实施方案中，双特异性抗体的一个臂包含结合gp120的scFv。在某些实施方案中，双特异性抗体的一个臂包含结合人CD3 的scFv。在某些实施方案中，双特异性抗体的一个臂包含结合人CD89 的scFv。在某些实施方案中，双特异性抗体可包括嵌合抗体或人源化抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体可包含F(ab′)2片段。
在一个方面，本公开的双特异性抗体结合gp120和人CD3(例如， CD3ε、CD3δ)且可以实现HIV-1感染细胞的杀灭。在一种情况中，这种结合gp120的双特异性抗体包含SEQ IDNO：1的VH-CDR1、SEQ ID NO：2的VH-CDR2、SEQ ID NO：3的VH-CDR3、SEQ ID NO： 4的VL-CDR1、SEQ ID NO：5的VL-CDR2和SEQ ID NO：6的 VL-CDR3。在一种情况中，这种结合人CD3的双特异性抗体包含SEQ ID NO：11的VH-CDR1、SEQ ID NO：12的VH-CDR2、SEQ ID NO： 13的VH-CDR3、SEQ ID NO：14的VL-CDR1、SEQ ID NO：15的 VL-CDR2和SEQ ID NO：16的VL-CDR3。在另一情况中，结合gp120 和人CD3的双特异性抗体在其gp120结合臂上包含：SEQ ID NO：1的VH-CDR1、SEQ ID NO：2的VH-CDR2、SEQ ID NO：3的 VH-CDR3、SEQ ID NO：4的VL-CDR1、SEQID NO：5的VL-CDR2 和SEQ ID NO：6的VL-CDR3；并且在其人CD3结合臂上包含：SEQ ID NO：11的VH-CDR1、SEQ ID NO：12的VH-CDR2、SEQ ID NO： 13的VH-CDR3、SEQ ID NO：14的VL-CDR1、SEQ ID NO：15的 VL-CDR2和SEQ ID NO：16的VL-CDR3。
在另一情况中，这种双特异性抗体在其gp120结合臂上包含含有与SEQ ID NO：7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％或至少98％相同的氨基酸序列的VH。在另一情况中，这种双特异性抗体在其gp120结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10)个置换、***和/或删除外与SEQ ID NO：7 相同的氨基酸序列的VH。在另一情况中，这种双特异性抗体在其 gp120结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10)个置换外与SEQ ID NO：7相同的氨基酸序列的VH。在另一情况中，这种双特异性抗体在其gp120结合臂上包含具有与SEQ ID NO： 8、81、82、83或84至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％或至少98％相同的氨基酸序列的VL。在另一情况下，这种双特异性抗体在其gp120结合臂上包含具有除了1至10(即，1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10)置换、***和/或删除以外与SEQ ID NO： 8、81、82、83或84相同的氨基酸序列的VL。在另一情况中，这种双特异性抗体在其gp120结合臂上包含具有除了1至10(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个置换外与SEQID NO：8、81、82、83或 84相同的氨基酸序列的VL。在另一情况中，这种双特异性抗体在其gp120结合臂上包含具有与SEQ ID NO：9至少90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％或至少98％相同的氨基酸序列的重链。在另一情况中，这种双特异性抗体在其gp120结合臂上包含除了1至 10(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个置换、***和/或删除外与SEQ IDNO：9相同的氨基酸序列的重链。在另一情况中，这种双特异性抗体在其gp120结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10)个置换外与SEQ ID NO：9相同的氨基酸序列的重链。在另一情况中，这种双特异性抗体在其gp120结合臂上包含具有与 SEQ ID NO：10、40、78、79或80至少90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％或至少98％相同的氨基酸序列的轻链。在另一种情况下，这种双特异性抗体在其gp120结合臂上包含具有除1至 10(即，1、2、3、4、4、5、6、7、8、9、10)个置换、***和/或删除之外与SEQ ID NO：10、40、78、79或80相同的氨基酸序列的轻链。在另一情况中，这种双特异性抗体在其gp120结合臂上包含除了1至 10(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个置换外与SEQ ID NO： 10、40、78、79或80相同的氨基酸序列的轻链。
在另一情况中，这种双特异性抗体在其人CD3结合臂上包含具有与SEQ ID NO：17至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％或至少98％相同的氨基酸序列的VH。在另一情况中，这种双特异性抗体在其人CD3结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10)个置换、***和/或删除外与SEQ ID NO：17 相同的氨基酸序列的VH。在另一情况中，这种双特异性抗体在其人 CD3结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个置换外具有与SEQ ID NO：17相同的氨基酸序列的VH。在另一情况中，这种双特异性抗体在其人CD3结合臂上包含具有与SEQ ID NO：18至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或至少98％相同的氨基酸序列的VL。在另一情况中，这种双特异性抗体在其人CD3结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10)个置换、***和/或删除外具有与SEQ ID NO：18相同的氨基酸序列的VL。在另一情况中，这种双特异性抗体在其人CD3结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个置换外具有与SEQ ID NO：18相同的氨基酸序列的VL。在另一情况中，这种双特异性抗体在其人CD3结合臂上包含具有与SEQ IDNO：19 至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或至少98 ％相同的氨基酸序列的重链。在另一情况中，这种双特异性抗体在其人CD3结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10)个置换、***和/或删除外具有与SEQ ID NO：19相同的氨基酸序列的重链。在另一情况中，这种双特异性抗体在其人CD3结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个置换外具有与SEQ ID NO：19相同的氨基酸序列的重链。在另一情况中，这种双特异性抗体在其人CD3结合臂上包含具有与SEQ ID NO：20至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或至少98％相同的氨基酸序列的轻链。在另一情况中，这种双特异性抗体在其人 CD3结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10) 个置换、***和/或删除外具有与SEQ ID NO：20相同的氨基酸序列的轻链。在另一情况中，这种双特异性抗体在其人CD3结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个置换外具有与SEQ IDNO：20相同的氨基酸序列的轻链。
在一个方面，本公开的双特异性抗体结合gp120和人CD89且可以实现HIV-1感染细胞的杀灭。CD89是主要在嗜中性粒细胞上表达的IgA受体，且因此这种双特异性抗体增强嗜中性粒细胞的募集以杀伤HIV感染的细胞。在一种情况中，结合gp120的这种双特异性抗体包含SEQ ID NO：1的VH-CDR1、SEQ ID NO：2的VH-CDR2、SEQ ID NO：3的VH-CDR3、SEQ ID NO：4的VL-CDR1、SEQ ID NO： 5的VL-CDR2和SEQ ID NO：6的VL-CDR3。在一种情况中，结合人CD89的这种双特异性抗体包含SEQ ID NO：98的VH-CDR1、SEQ ID NO：99的VH-CDR2、SEQ IDNO：100的VH-CDR3、SEQ ID NO： 103的VL-CDR1、SEQ ID NO：104的VL-CDR2和SEQ ID NO：105的VL-CDR3。在另一情况中，结合gp120和人CD89的双特异性抗体在其gp120结合臂上包含SEQ ID NO：1的VH-CDR1、SEQ ID NO： 2的VH-CDR2、SEQ ID NO：3的VH-CDR3、SEQ ID NO：4的VL-CDR1、SEQ ID NO：5的VL-CDR2和SEQ ID NO：6的VL-CDR3；且在其人CD89结合臂上包含：SEQ ID NO：98的VH-CDR1、SEQ ID NO：99的VH-CDR2、SEQ ID NO：100的VH-CDR3、SEQ ID NO：103的VL-CDR1、SEQ ID NO：104的VL-CDR2和SEQ ID NO：105 的VL-CDR3。
在另一情况中，这种双特异性抗体在其gp120结合臂上包含具有与SEQ ID NO：7至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96 ％、97％或至少98％相同的氨基酸序列的VH。在另一情况中，这种双特异性抗体在其gp120结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10)个置换、***和/或删除外具有与SEQ ID NO：7 相同的氨基酸序列的VH。在另一情况中，这种双特异性抗体在其 gp120结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10)个置换外具有与SEQ ID NO：7相同的氨基酸序列的VH。在另一情况中，这种双特异性抗体在其gp120结合臂上包含具有与SEQ ID NO：8、81、82、83或84具有至少90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％或至少98％相同的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，这种双特异性抗体在其gp120结合臂上包含除了1至10(即，1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10)个置换、***和/或删除外具有与SEQ ID NO：8、81、82、83或84相同的氨基酸序列的VL。在另一情况中，这种双特异性抗体在其gp120结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10)个置换外具有与SEQ ID NO：8、81、82、83 或84相同的氨基酸序列的VL。在另一情况中，这种双特异性抗体在其gp120结合臂上包含具有与SEQ ID NO：9至少90％、91％、92 ％、93％、94％、95％、96％、97％或至少98％相同的氨基酸序列的重链。在另一情况中，这种双特异性抗体在其gp120结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个置换、***和/或删除外具有与SEQ ID NO：9相同的氨基酸序列的重链。在另一情况中，这种双特异性抗体在其gp120结合臂上包含除了1至10(即，1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10)个置换外具有与SEQ ID NO：9相同的氨基酸序列的重链。在另一情况中，这种双特异性抗体在其gp120结合臂上包含具有与SEQID NO：10、40、78、79或80至少90％、91 ％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或至少98％相同的氨基酸序列的轻链。在另一种情况下，这种双特异性抗体在其gp120结合臂上包含除1至10(即，1、2、3、4、4、5、6、7、8、9、10)个置换、***和/或删除外具有与SEQ ID NO：10、40、78、79或80相同的氨基酸序列的轻链。在另一情况中，这种双特异性抗体在其gp120结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个置换外具有与SEQ ID NO：10、40、78、79或80相同的氨基酸序列的轻链。
在另一情况中，这种双特异性抗体在其人CD89结合臂上包含具有与SEQ ID NO：96具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95 ％、96％、97％或至少98％相同的氨基酸序列的VH。在另一情况中，这种双特异性抗体在其人CD89结合臂上包含除了1至10(即，1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10)个置换、***和/或删除外具有与SEQ ID NO： 96相同的氨基酸序列的VH。在另一情况中，这种双特异性抗体在其人CD89结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10)个置换外具有与SEQ ID NO：96相同的氨基酸序列的VH。在另一情况中，这种双特异性抗体在其人CD89结合臂上包含具有与SEQ ID NO：101具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％或至少98％相同的氨基酸序列的VL。在另一情况中，这种双特异性抗体在其人CD89结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10)个置换、***和/或删除外具有与SEQ ID NO：101 相同的氨基酸序列的VL。在另一情况中，这种双特异性抗体在其人CD89结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10)个置换外具有与SEQ IDNO：101相同的氨基酸序列的VL。在另一情况中，这种双特异性抗体在其人CD89结合臂上包含具有与SEQ ID NO：97至少90％，91％，92％，93％，94％，95％96％，97％或至少98％相同的氨基酸序列的重链。在另一个实例中，这种双特异性抗体在其人CD89结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10)个置换、***和/或删除外具有与SEQ ID NO：97相同的氨基酸序列的重链。在另一情况中，这种双特异性抗体在其人CD89 结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个置换外具有与SEQ ID NO：97相同的氨基酸序列的重链。在另一情况中，这种双特异性抗体在其人CD89结合臂上包含具有与SEQ ID NO：102具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％或至少98％相同的氨基酸序列的轻链。在另一情况中，这种双特异性抗体在其人CD89结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10)个置换、***和/或删除外具有与SEQ ID NO：102 相同的氨基酸序列的轻链。在另一情况中，这种双特异性抗体在其人 CD89结合臂上包含除了1至10(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10)个置换外具有与SEQ ID NO：102相同的氨基酸序列的轻链。
在某些实施方案中，双特异性抗体具有来自人IgG1抗体的Fc结构域，其中具有0-10个氨基酸置换。Fc结构域包含来自双特异性抗体的一个组分(例如，gp120结合部分)的一个“分支”(铰链-CH2-CH3) 和来自双特异性抗体的第二组分(例如，CD3-或CD89-结合部分)的另一“分支”。置换可以在一个或两个“分支”中。在某些实施方案中，Fc 结构域在一个或两个“分支”中具有一个或多个(1、2、3、4或5个)以下突变(EU编号)：N297A或N297Q、L234F、L235E、D265A或P331S。
如本文所公开的结合gp120和CD3或结合gp120和CD89的双特异性抗体可以通过化学连接两个不同的单克隆抗体或通过融合两种杂交瘤细胞系以产生杂合杂交瘤来制备。可以使用的其他双特异性抗体技术平台包括，例如，Kλ抗体、SMIP、DNL、Covx体、肽抗体、链交换工程化结构域抗体(SEEDbodies)、dAb、双体抗体、Affibodies、 Fynomers、KunitzDomains、TandAbs、纳米抗体、Albu-dabs、DARTs、 DVD-IG、scFv-Igs、SVD-Igs、dAb-Igs、Knobs-in-Holes、BiTe平台、
在一个实施方案中，本公开的双特异性抗体分子包含具有两个臂的单个抗体，所述两个臂包含不同的抗原结合区，一个臂对第一抗原如gp120具有特异性和第二臂对第二抗原如人CD3或人CD89具有特异性。在另一个实施方案中，本公开的双特异性抗体分子包含具有对第一抗原例如gp120具有特异性的一个抗原结合区或臂和对第二抗原如人CD3或人CD89具有特异性的第二抗原结合区或臂的单一抗体。在又一个实施方案中，本公开的双特异性抗体分子包含具有对第一抗原如gp120的第一特异性和对第二抗原如人CD3或人CD89的第二特异性的单链抗体，例如，经由通过额外的肽接头串联连接的两个scFv。在进一步的实施方案中，本公开的双特异性抗体分子包括双可变域抗体(DVD-Ig)，其中每个轻链和重链包含通过短肽连接的两个串联的可变域(Wu等，Generation and Characterization ofa Dual Variable Domain Immunoglobulin(DVD-IgTM)Molecule,Antibody Engineering,Springer Berlin Heidelberg(2010))。在一些实施方案中，双特异性抗体是化学连接的双特异性(Fab')2片段。在其他实施方案中，双特异性抗体包含 Tandab(即，两个单链双体抗体的融合体，从而产生具有针对每个靶抗原的两个结合位点的四价双特异性抗体)。在某些实施方案中，双特异性抗体是柔性体(flexibody)，其是scFv与双体抗体的组合，从而产生多价分子。在又一个实施方案中，双特异性抗体包含基于蛋白激酶(Protein Kinase)A中的“二聚化和对接结构域”的“对接和锁定(dock and lock)”分子，其在应用于Fab时，可以产生由连接到不同Fab片段的两个相同Fab片段组成的三价双特异性结合蛋白。在另一种情况下，本公开的双特异性抗体包含“蝎形分子(Scorpion molecule)”，其包含例如与人Fab臂的两个末端融合的两个scFv。在又一个实施方案中，本公开的双特异性抗体包括双体抗体。
双特异性抗体的示例性类别包括但不限于具有互补CH3结构域以促使异二聚化的IgG样分子；IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的部分融合；Fc融合分子，其中单链Fv 分子或稳定的双体抗体与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合；Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起；重组IgG样双重靶向分子，其中分子的两侧各包含至少两个不同抗体的Fab片段或Fab片段的部分；基于scFv和基于双体抗体的及重链抗体(例如，域抗体、纳米抗体)，其中不同的单链Fv分子或不同的双体抗体或不同的重链抗体(例如域抗体、纳米抗体)彼此融合或与另一蛋白质或载体分子融合。
Fab融合双特异性抗体的例子包括但不限于F(ab)2 (Medarex/AMGEN)、Dual-Action或Bis-Fab(Genentech)、 Dock-and-Lock(DNL)(ImmunoMedics)、双价双特异性(Biotecnol)和 Fab-Fv(UCB-Celltech)。
基于scFv、基于双体抗体的和结构域抗体的实例包括但不限于双特异性T细胞衔接体(BITE)(Micromet)、串联双体抗体(Tandab) (Affimed)、双亲和重靶向技术(DART)(MacroGenics)、单链双体抗体 (Academic)、TCR样抗体(AIT，ReceptorLogics)、人血清白蛋白ScFv 融合体(Merrimack)和COMBODY(Epigen Biotech)、双重靶向纳米抗体(Ablynx)和双重靶向仅重链域抗体。
Duobodies
本公开的双特异性抗体可以是结合gp120和第二抗原(例如，人 CD3，例如人CD3ε或人CD3δ；人CD89)的
在某些实施方案中，如上所述的结合gp120的第一抗原结合结构域包含人IgG1重链恒定区，其包含选自F405L、F405A、F405D、F405E、 F405H、F405I、F405K、F405M、F405N、F405Q、F405S、F405T、 F405V、F405W和F405Y的突变，以及如上所述的结合人CD3(或人CD89)的第二抗原结合结构域包含含有K409R突变的人IgG1重链恒定区。
在一个实施方案中，如上所述的结合gp120的第一抗原结合结构域包含含有F405L突变的人IgG1重链恒定区，和如上所述的结合人 CD3的第二抗原结合结构域包含含有K409R突变的人IgG1重链恒定区。
在其他实施方案中，如上所述的结合gp120的第一抗原结合结构域包含含有K409R突变的人IgG1重链恒定区，和如上所述的结合人 CD3(或人CD89)的第二抗原结合结构域包含人IgG1重链恒定区，其包含选自F405L、F405A、F405D、F405E、F405H、F405I、F405K、F405M、F405N、F405Q、F405S、F405T、F405V、F405W和F405Y 的突变。
在一个实施方案中，如上所述的结合gp120的第一抗原结合结构域包含含有K409R突变的人IgG1重链恒定区，和如上所述的结合人 CD3(或人CD89)的第二抗原结合结构域包含含有F405L突变的人 IgG1重链恒定区。
在一个实施方案中，
在一个实施方案中，
在一个实施方案中，抗gp120 x CD3
在一个实施方案中，
在一个实施方案中，
在一个实施方案中，gp120 X CD3
在一个实施方案中，gp120 X CD89
在一个实施方案中，gp120 X CD3
在一个实施方案中，gp120 X CD89
在一个具体的实施方案中，gp120 X CD3
在一个具体的实施方案中，gp120 X CD89
在另一个具体的实施方案中，gp120 X CD3
在另一个具体的实施方案中，gp120 X CD89
在另一个具体的实施方案中，gp120 X CD3
在另一个具体的实施方案中，gp120 X CD89
在另一个具体的实施方案中，gp120 X CD3
在另一个具体的实施方案中，gp120 X CD89
在另一个具体的实施方案中，gp120 X CD3
在另一个具体的实施方案中，gp120 X CD89
在特定的实施方案中，抗体去岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体包含一个或多个标签。在某些实施方案中，一个或多个标签包括抗生物素蛋白标签。
Fc修饰
在某些实施方案中，与IgG1m3氨基酸序列(即，SEQ ID NO：77) 相比，本公开的抗体(例如，
在某些实施方案中，一个或多个修饰选自以下Fc氨基酸置换(EU 编号)或其组合：L234F；L235E；G236A；S239D；F243L；D265E； D265A；S267E；H268F；R292P；N297Q；N297A；S298A；S324T； I332E；S239D；A330L；L234F；L235E；P331S；F243L；Y300L； V305I；P396L；S298A；E333A；K334A；E345R；L235V；F243L； R292P；Y300L；P396L；M428L；E430G；N434S；G236A、S267E、 H268F、S324T和I332E；G236A、S239D和I332E；S239D、A330L、 I332E；L234F、L235E和P331S；F243L、R292P、Y300L、V305I和 P396L；G236A、H268F、S324T和I332E；S239D、H268F、S324T 和I332E；S298A、E333A和K334A；L235V、F243L、R292P、Y300L 和P396L；S239D、I332E；S239D、S298A和I332E；G236A、S239D、 I332E、M428L和N434S；G236A、S239D、A330L、I332E、M428L 和N434S；S239D、I332E、G236A和A330L；M428L和N4343S； M428L、N434S；G236A、S239D、A330L和I332E；及G236A和I332E。在某些实施方案中，一个或多个修饰选自：N297A、D265A、L234F、 L235E、N297Q和P331S。在某些实施方案中，一个或多个修饰是 N297A或D265A。在某些实施方案中，一个或多个修饰是L234F和 L235E。在某些实施方案中，一个或多个修饰是L234F、L234E和 D265A。在某些实施方案中，一个或多个修饰是L234F、L234E和 N297Q。在某些实施方案中，一个或多个修饰是L234F、L235E和 P331S。在某些实施方案中，一个或多个修饰是D265A和N297Q。在某些实施方案中，一个或多个修饰是L234F、L235E、D265A、N297Q 和P331S。
减少Fc受体结合的突变包括，例如，N297A；N297Q；D265A； L234F/L235E；L234F/L235E/N297Q；L234F/L235E/P331S； D265A/N297Q；和L234F/L235E/D265A/N297Q/P331S(全部EU编号)。在某些实施方案中，本文公开的抗体(例如，Duobodies)包含L234F和 L235E突变。在某些实施方案中，本文公开的抗体(例如，Duobodies) 包含L234F、L235E和D265A突变。在某些实施方案中，本文公开的抗体(例如，Duobodies)包含L234F、L235E和D265A突变。在某些实施方案中，本文公开的抗体(例如，Duobodies)包含N297A或 N297Q突变。在某些实施方案中，本文公开的抗体(例如，Duobodies) 包含N297A或N297Q突变以及L234F、L235E和D265A突变。在某些实施方案中，一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸置换引入 Fc区中以改变抗体的效应子功能。例如，这些置换位于选自氨基酸残基234、235、236、237、265、297、318、320和322的位置(根据EU 编号)。这些位置可以用不同的氨基酸残基替换以使得抗体对效应物配体(例如，Fc受体或补体的C1组分)具有改变的(例如，降低的)亲和力，但保留了亲本抗体的抗原结合能力。在某些实施方案中，本文公开的抗体(例如，Duobodies)包含E233P、L234V、L235A和G236A突变(EU编号)。在一些实施方案中，抗体包含A327G、A330S和P331S 突变(EU编号)。在一些实施方案中，抗体包含K322A突变(EU编号)。在一些实施方案中，抗体包含E318A、K320A和K322A(EU编号)突变。在某些实施方案中，抗体包含L235E(EU编号)突变。
增加抗体半衰期的突变是本领域已知的。在一个实施方案中，本文描述的抗体(例如，
在特定的实施方案中，抗体(例如，
通过降低或消除效应子功能，CD3 X gp120多特异性/双特异性抗体(i)确保由双特异性分子结合的T细胞(其包括未感染HIV的T细胞) 不被先天效应细胞(例如，NK细胞、巨噬细胞)杀死；和(ii)通过不与先天效应细胞上的FcγRs结合或减少与其的结合，还确保在没有靶细胞的情况下T细胞不被激活。在没有靶细胞的情况下T细胞的激活导致细胞因子反应，且不可耐受。双特异性分子与先天效应细胞上的 FcγRs的结合导致T细胞上CD3分子的簇集，从而导致非抗原依赖性的T细胞激活。
缀合抗体
本文公开的任何抗体可以是与各种分子结合的缀合抗体，这些分子包括大分子物质，如聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、用PEG修饰的聚乙烯亚胺(PEI-PEG)、聚谷氨酸(PGA)(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺 (HPMA)共聚物)、透明质酸、放射性物质(例如90Y、131I、125I、35S、3H、121In、99Tc)、荧光物质(例如，荧光素和若丹明)、发光物质(例如，鲁米诺)、半抗原、酶(例如，葡萄糖氧化酶)、金属螯合物、生物素、抗生物素蛋白和药物。
可以通过对本文所述的抗体或其较低分子量形式进行化学修饰来制备上述缀合抗体。修饰抗体的方法是本领域众所周知的(例如， US 5,057,313和US 5,156,840)。
核酸
本公开特征还在于包含编码结合gp120和人CD3抗原或结合gp120和CD89抗原的本文所述多核苷酸抗体的核苷酸序列的多核苷酸、包含此类多核苷酸的载体以及包含此类多核苷酸或表达载体的宿主细胞(例如，哺乳动物细胞、酵母、大肠杆菌)。本文提供了包含编码本文提供的任何抗体的核苷酸序列的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸序列的载体，例如，用于在宿主细胞，例如哺乳动物细胞中有效表达的表达载体。
在一个方面，本公开提供了包含编码结合gp120的抗体(例如，示例性抗gp120抗体2；示例性抗gp120抗体3；示例性抗gp120抗体4；示例性抗gp120抗体5)的VH、VL或VH和VL的核苷酸序列的多核苷酸。
在另一个方面，本公开提供了包含编码结合gp120和人CD3多肽并且包含本文所述的氨基酸序列的抗体的核苷酸序列的多核苷酸。
在另一个方面，本公开提供了包含编码结合gp120和人CD89多肽并包含本文所述的氨基酸序列的抗体的核苷酸序列的多核苷酸。
在另一个方面，本公开提供了编码根据本发明的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸或核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子编码本申请的抗体轻链(或其片段)或者抗体轻链(或其片段)或者两者。在其他实施方案中，核酸是DNA、cDNA或mRNA。在一些其他实施方案中，核酸分子进行密码子优化以增强在宿主细胞中的表达。
在另一个方面，本文提供了包含编码本文所述抗体的CDR、轻链或重链的核苷酸序列的多核苷酸。多核苷酸可包含编码轻链或轻链可变域的核苷酸序列，所述轻链或轻链可变域包含本文所述抗体的VL CDR(参见，例如，以上表格)。多核苷酸可包含编码重链或重链可变域的核苷酸序列，所述重链或重链可变域包含本文所述抗体的VH CDR(参见，例如，以上表格)。在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸编码具有包含分别SEQ ID NO：4、5和6或分别SEQ ID NO： 14、15和16中所示氨基酸序列的VL-CDR的可变轻链或轻链。在另一个实施方案中，本文所述的多核苷酸编码具有包含分别SEQ ID NO：1、2和3或分别SEQ ID NO：11、12和13中所示的氨基酸序列的VH-CDR的可变重链或重链。在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸编码包含SEQ ID NO：8、18或101所示氨基酸序列的VL 结构域。在另一个实施方案中，本文所述的多核苷酸编码包含SEQ ID NO：7、17或96所示氨基酸序列的VH结构域。在又一个实施方案中，本文所述的多核苷酸编码包含SEQ ID NO：10、20或102所示的氨基酸序列的轻链。在另一个实施方案中，本文所述的多核苷酸编码包含SEQ ID NO：9、19或97所示氨基酸序列的重链。
本公开还包括编码抗gp120和抗CD3(或抗CD89)抗体的多核苷酸，其例如通过密码子优化、异源信号序列替换和消除mRNA不稳定元件而优化。产生优化的核酸的方法可以通过采用例如美国专利 No.5,965,726；6,174,666；6,291,664；6,414,132；和6,794,498中描述的方法来进行。
载体和宿主细胞
本公开还包括包含本文公开的核酸的载体。载体可以是任何类型，例如重组载体，如表达载体。载体包括但不限于质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)以及源自噬菌体或者植物或动物(包括人类)病毒的载体。载体可以包含被提议的宿主细胞识别的复制起点，并且在表达载体的情况下，包含可以被宿主细胞识别的启动子和其他调控区域。在特定的实施方案中，载体包含与启动子可操作地连接的编码本公开的抗体的多核苷酸和任选地另外的调控元件。某些载体能够在它们引入的宿主中自主复制(例如，具有细菌复制起点的载体可以在细菌中复制)。其他载体可以在引入宿主中后整合到宿主的基因组中，且从而与宿主基因组一起复制。载体包括但不限于适用于重组产生本文公开的抗体的那些。
载体的选择取决于遵循的重组过程和使用的宿主。尤其可以通过磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染胺转染或电穿孔来将载体引入宿主细胞中。载体可以自主复制或可以与它们已经整合到其中的染色体一起复制。在某些实施方案中，载体包含一种或多种选择标记。标记的选择可以取决于所选择的宿主细胞。这些包括但不限于卡那霉素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、博莱霉素、来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因(HSV-TK)和来自小鼠的二氢叶酸还原酶基因(dhfr)。本公开还涵盖了包含与编码可用于分离抗体的蛋白质或肽的一个或多个核酸分子可操作地连接的编码本文所述抗体的一个或多个核酸分子的载体。这些蛋白质或肽包括但不限于谷胱甘肽 -S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、金属结合聚组氨酸、绿色荧光蛋白、荧光素酶和β-半乳糖苷酶。
在特定实施方案中，所使用的载体是pcDNATM 3.1+ (ThermoFisher，MA)。
本公开还提供了包含本文所述的核酸或载体的宿主细胞。可以使用多种宿主细胞中的任一种。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌。在另一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、BHK细胞、 NSO细胞或鲍氏黑素瘤细胞。人宿主细胞的实例尤其是HeLa、911、 AT1080、A549、293和HEK293T细胞。
术语“核酸分子”是指核苷酸的聚合形式，并且包括RNA、cDNA、基因组DNA的有义和反义链，以及上述的合成形式和混合聚合物。如本文所用，术语“核酸分子”可以与术语“多核苷酸”互换。在一些实施方案中，核苷酸是指核糖核苷酸、脱氧核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式及其组合。该术语还包括但不限于DNA的单链和双链形式。另外，例如cDNA或mRNA的多核苷酸可以包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸键连接在一起的天然存在的核苷酸和修饰的核苷酸中任一或二者。如本领域技术人员容易理解的，核酸分子可以化学或生物化学地修饰或可以包含非天然或衍生的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标记、甲基化、一个或多个天然存在的核苷酸用类似物取代、核苷酸间修饰如不带电连接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯，氨基甲酸酯等)、带电连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、侧接部分(例如，多肽)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷基化剂和修饰的键(例如，α异头核酸等)。上述术语还旨在包括任何拓扑构象，包括单链、双链、部分双链体、三链体、发夹、环状和挂锁构象。除非另有说明，否则提及核酸序列包括其互补序列。因此，对具有特定序列的核酸分子的引用应理解为包括其互补链及其互补序列。该术语还包括密码子优化的核酸。
术语“可操作地连接”是指通常物理连接的并且彼此处于功能关系中的两个或更多个核酸序列元件。例如，如果启动子能够启动或调节编码序列的转录或表达，则启动子可操作地与编码序列连接，在这种情况下，编码序列应理解为在该启动子的“控制下”。
如本文所用，“置换”表示一个或多个氨基酸或核苷酸分别被不同的氨基酸或核苷酸替代。
“分离的”核酸是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常包含该核酸分子的细胞中所包含的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或位于不同于其天然染色***置的染色***置处。“编码抗体或其片段的分离的核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单一载体或单独载体中的此类核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。
如本文所用，术语“载体(vector)”是指能够增殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及并入其被引入其中的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体适合于递送本申请的核酸分子或多核苷酸。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为表达载体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和从其衍生的后代(与传代次数无关)。后代可能与亲代细胞在核酸内容上不完全相同，而是可能包含突变。具有与在原始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代包括在本文中。
本文使用的术语多核苷酸“变体”是通常在一个或多个置换、缺失、添加和/或***中与本文具体公开的多核苷酸不同的多核苷酸。这样的变体可以是天然存在的，或者可以是合成产生的，例如，通过修饰本发明的一个或多个多核苷酸序列并如本文所述和/或使用本领域众所周知的多种技术中的任何一种来评估编码的多肽的一种或多种生物学活性。
本文使用的术语多肽“变体”是通常在一个或多个置换、缺失、添加和/或***中与本文具体公开的多肽不同的多肽。这样的变体可以是天然存在的，或者可以是合成产生的，例如，通过修饰一个或多个本发明的上述多肽序列并如本文所述和/或使用本领域众所周知的多种技术中的任何一种评估多肽的一种或多种生物学活性。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包括变体1、变体2、变体3和/或变体 4。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包括变体1。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包括变体2。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包括变体3。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包括变体4。
术语“变体”还可指包含一个或多个核苷酸或氨基酸突变的任何天然存在或工程化的分子。在一个实施方案中，该分子是抗体。例如，体细胞变体可包括作为相同B细胞谱系的部分或衍生自相同B细胞谱系的所有相关天然存在的抗体。工程化变体可以包括对抗体进行的所有单突变或组合突变。
产生抗体的方法
结合gp120的单特异性抗体和结合gp120和人CD3(例如，人CD3ε或人CD3δ)的双特异性抗体可以通过本领域已知用于抗体合成的任何方法来产生，例如，通过化学合成或通过重组表达技术。
制备单特异性抗体的方法是本领域众所周知的。制备双特异性抗体的方法描述于例如美国专利No.5,731,168；5,807,706；5,821,333；和美国申请公开No.2003/020734和2002/0155537中。例如，在WO 02/096948和WO 00/44788中描述了双特异性四价抗体及其制备方法，两者的公开内容通过引用整体并入本文。另外，与制备双特异性抗体有关的其他出版物包括WO 91/00360，WO 92/08802， WO92/05793和WO 93/17715；Tutt等，J.Immunol.147：60-69(1991)；美国专利No.4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819 和9,212,230；和Kostelny等，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。
在一个实施方案中，本公开的双特异性抗体是 Duobodies可以通过例如在国际公开号WO 2008/119353，WO 2011/131746，WO 2011/147986和WO 2013/060867，Labrijn AF等 PNAS,110(13):5145-5150(2013),Gramer等,mAbs,5(6):962-973(2013),和Labrijn等,Nature Protocols,9(10):2450-2463(2014)中描述的
对于平台，每种单特异性抗体包括在CH3域中具有单一点突变的重链恒定区。这些点突变允许得到的双特异性抗体中CH3 结构域之间的相互作用比没有该突变的任一单特异性抗体中CH3结构域之间的相互作用更强。每个单特异性抗体中的单一点突变可以在重链恒定区的CH3结构域中的残基366、368、370、399、405、407 或409(EU编号)处(参见WO 2011/131746)。此外，单一点突变在一种单特异性抗体中相对于另一种单特异性抗***于不同残基处。例如，一种单特异性抗体可包含突变F405L(EU编号；残基405处的苯丙氨酸至亮氨酸突变)，或F405A、F405D、F405E、F405H、F405I、 F405K、F405M、F405N、F405Q、F405S、F405T、F405V、F405W 和F405Y突变的一种，而另一单特异性抗体可包含突变K409R(EU 编号；残基409处的赖氨酸至精氨酸突变)。单特异性抗体的重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型(例如，人IgG1同种型)，并且通过
制备双特异性抗体的另一种示例性方法是通过杵-臼结构抗体 (knobs-into-holes)技术(Ridgway等，Protein Eng.，9：617-621(1996)； WO 2006/028936)。在这一技术中通过突变所选择的形成IgG中CH3 结构域的界面的氨基酸来减少Ig重链的错配问题，这是制备双特异性抗体的主要缺陷。在CH3结构域内两个重链直接相互作用的位置处，具有小侧链的氨基酸(臼)引入一个重链的序列中，而具有大侧链 (杵)的氨基酸引入另一重链的对应的相互作用残基位置中。在一些情况下，本公开的抗体具有免疫球蛋白链，其中CH3结构域通过突变在两个多肽之间的界面处相互作用的所选氨基酸而被修饰，从而优先形成双特异性抗体。双特异性抗体可以由相同亚类或不同亚类的免疫球蛋白链组成。在一种情况中，结合gp120和CD3的双特异性抗体在“杵链”中包含T366W(EU编号)突变，而在“臼链”中包含T366S、 L368A、Y407V(EU编号)突变。在某些实施方案中，例如，通过将 Y349C突变引入“杵链”中和将E356C突变或S354C突变引入“臼链”中，在CH3结构域之间引入另外的链间二硫桥。在某些实施方案中， R409D、K370E突变引入“杵链”中，和D399K、E357K突变引入“臼链”中。在其他实施方案中，Y349C、T366W突变引入一条链中，和 E356C、T366S、L368A、Y407V突变引入对应链中。在一些实施例中，Y349C、T366W突变引入一条链中，和S354C、T366S、L368A、 Y407V突变引入对应链中。在一些实施方案中，Y349C、T366W突变引入一条链中，而S354C、T366S、L368A、Y407V突变引入对应链中。在再其他的实施方式中，Y349C、T366W突变引入一条链中，而S354C、T366S、L368A、Y407V突变引入对应链中(全部EU编号)。
制备双特异性抗体的另一种示例性方法是通过使用双特异性T 细胞衔接体
制备双特异性抗体的另一种示例性方法是通过使用双亲和重靶向(DART)平台。该技术是基于Holliger等(PNAS,90:6444-6448(1993)) 的双体抗体形式，并进一步改善了稳定性和VH和VL链的最佳配对 (Johnson等，J Mol.Biol.，399：436-449(2010)；Sung等JClin Invest.， 125(11)：4077-4090(2015))。
制备双特异性抗体的又一个示例性方法是通过使用三功能杂交抗体平台-
制备双特异性抗体的进一步的示例性方法是通过使用
制备双特异性抗体的又一种方法是CrossMab技术。CrossMab是由两个全长抗体的一半构成的嵌合抗体。为了正确的链配对，它结合了两种技术：(i)杵臼结构，其有利于两个重链之间的正确配对；和(ii)两个Fab之一的重链和轻链之间的交换以引入避免轻链错配对的不对称性。参见，Ridgway等，Protein Eng.，9：617-621(1996)；Schaefer 等，PNAS，108：11187-11192(2011)。CrossMab可以组合两个或更多个抗原结合结构域，以靶向两个或更多个靶标或向一个靶标引入双价性，例如2：1格式。
本公开的多特异性抗体可以在细菌或真核细胞中产生。抗体也可以在真核细胞中产生，例如转化的细胞系(例如，CHO、293E、293T、 COS、NIH3T3)。另外，抗体(例如，scFv)可以在酵母细胞如毕赤酵母 (参见，例如，Powers等，J Immunol Methods.251：123-35(2001))、汉逊酵母或酵母属中表达。在一个实施方案中，本文所述的双特异性抗体在CHO细胞系中产生。为了产生目的抗体，构建了编码抗体的多核苷酸，引入表达载体中，和然后在合适的宿主细胞中表达。使用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞和回收抗体。
如果抗体在细菌细胞(例如大肠杆菌)中表达，则表达载体应具有允许载体在细菌细胞中扩增的特征。另外，当使用大肠杆菌如JM109、 DH5α、HB101或XL1-Blue作为宿主时，载体必须具有可以在大肠杆菌中有效表达的启动子，例如lacZ启动子(Ward等，341：544-546 (1989))、araB启动子(Better等，Science，240：1041-1043(1988))或 T7启动子。这类载体的实例包括，例如，M13系列载体、pUC系列载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script、pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpress系统”(QIAGEN)、pEGFP和pET(当使用该表达载体时，宿主优选是表达T7 RNA聚合酶的BL21)。表达载体可以包含用于抗体分泌的信号序列。为了在大肠杆菌的周质中产生，可以使用pelB 信号序列(Lei等，J.Bacteriol.，169：4379(1987))作为用于抗体分泌的信号序列。对于细菌表达，可使用氯化钙法或电穿孔法将表达载体引入细菌细胞中。
如果抗体在动物细胞如CHO、COS和NIH3T3细胞中表达，表达载体包括在这些细胞中表达所需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan等，Nature，277：108(1979))、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等，Nucleic Acids Res.，18：5322(1990))或CMV 启动子。除了编码免疫球蛋白或其结构域的核酸序列外，重组表达载体还可以携带另外的序列，如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起点)和选择标记基因。选择标记基因有助于选择载体已引入其中的宿主细胞(参见，例如，美国专利号4,399,216、4,634,665和 5,179,017)。例如，通常选择标记基因赋予载体已引入其中的宿主细胞对诸如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的药物的抗性。具有选择标记的载体的实例包括pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和 pOP13。
在一个实施方案中，抗体在哺乳动物细胞中产生。用于表达抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括dhfr- CHO细胞，如Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77： 4216-4220中所述的，其与DHFR选择标记一起使用，例如，如Kaufman 和Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中所述的)、人胚肾293细胞(例如，293、293E，293T)、COS细胞、NIH3T3细胞、淋巴细胞系，例如，NS0骨髓瘤细胞和SP2细胞，以及来自转基因动物(例如，转基因哺乳动物)的细胞。例如，细胞是乳腺上皮细胞。
在用于抗体表达的示例性系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码本公开双特异性抗体的抗体重链和轻链的重组表达载体引入dhfr- CHO细胞中。在具体的实施方案中，dhfr-CHO细胞是DG44细胞系的细胞，如DG44i(参见，例如，Derouaz等，Biochem BiophysRes Commun.，340(4)：1069-77(2006))。在重组表达载体中，抗体重链和轻链基因各自与增强子/启动子调控元件(例如，源自SV40、CMV、腺病毒等，如CMV增强子/AdMLP启动子调控元件或SV40增强子 /AdMLP启动子调控元件)可操作地连接以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其允许使用甲氨蝶呤选择/扩增来选择被载体转染的CHO细胞。选择的转化体宿主细胞进行培养以允许抗体重链和轻链的表达，并且抗体从培养基回收。
多特异性抗体也可以由转基因动物产生。例如，美国专利No. 5,849,992描述了在转基因哺乳动物的乳腺中表达抗体的方法。构建包括乳特异性启动子及编码目的抗体和用于分泌的信号序列的核酸的转基因。由这样的转基因哺乳动物的雌性产生的乳汁包括其中分泌的目标抗体。抗体可以从乳汁纯化，或对于某些应用，直接使用。还提供了包含本文所述的一种或多种核酸的动物。
可以从宿主细胞内部或外部(如培养基)分离本公开的多特异性抗体，并纯化为基本上纯的和同质的抗体。通常用于抗体纯化的分离和纯化的方法可以用于抗体的分离和纯化，并且不限于任何特定方法。可以通过适当地选择和组合例如柱色谱、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦、透析和重结晶来分离和纯化抗体。色谱法包括例如亲和色谱、离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤、反相色谱和吸附色谱(Strategies for Protein Purification and Characterization:ALaboratory Course Manual. Ed Daniel R.Marshak等,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1996)。色谱分析可以使用液相色谱如HPLC和FPLC进行。用于亲和色谱的柱包括蛋白A柱和蛋白G柱。使用蛋白A柱的色谱柱实例包括Hyper D、POROS和Sepharose FF(GEHealthcare Biosciences)。本公开还包括使用这些纯化方法高度纯化的抗体。
药物组合物
本公开还包括药物组合物，其包含本文所述的抗体或编码本文所述的抗体的多核苷酸以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。在某些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的抗体或多核苷酸。
根据本公开，本领域技术人员知道各种药学上可接受的稀释剂、载体和赋形剂，以及制备和使用药物组合物的技术。说明性药物组合物和药学上可接受的稀释剂、载体和赋形剂也在Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(Lippincott,Williams& Wilkins 2003)中描述。在特定的实施方案中，每种载体、稀释剂或赋形剂在与药物组合物的其他成分相容并且对受试者无害的意义上是“可接受的”。通常，药学上可接受的载体是pH缓冲水溶液。可以用作药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的材料的一些例子包括：无菌水；缓冲液，例如，磷酸盐缓冲盐水；糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；黄芪粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，例如丙二醇；多元醇类，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及药物制剂中使用的其他非毒性的相容性物质。组合物中也可以存在润湿剂、乳化剂和润滑剂，例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。
药物组合物的配制和递送方法通常根据所治疗的部位和疾病进行调整。示例性制剂包括但不限于适合于肠胃外施用的那些，例如静脉内、动脉内、肌内或皮下施用，包括包封在胶束、脂质体或药物释放胶囊(活性剂并入为缓释而设计生物相容性涂层内)中的制剂；可摄食的制剂；局部使用的制剂，例如乳膏、软膏和凝胶；以及其他制剂，例如吸入剂、气雾剂和喷雾剂。
治疗方法
本公开提供了用于在需要的受试者(例如，人类受试者)中治疗或预防HIV感染或相关疾病或病症的方法，包括向有需要的受试者提供有效量的本文所述的抗体或编码抗体的多核苷酸。如本文所用，术语“有效量”在对受试者施用疗法的情况中是指达到期望的预防或治疗效果的疗法的量。多核苷酸可以存在于载体，例如病毒载体中。在特定的实施方案中，相关的疾病或病症是由HIV感染引起的。在特定的实施方案中，它是获得性免疫缺陷综合症(AIDS)。在特定实施方案中，所述受试者是病毒学抑制的HIV感染的哺乳动物，而在其他实施方案中，所述受试者是未治疗的HIV感染的哺乳动物。在某些实施方案中，未治疗的受试者的病毒载量在103至105拷贝/ml之间，并且在某些实施方案中，病毒学抑制的受试者的病毒载量＜50拷贝/ml。在特定的实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人。在某些实施方案中，受试者诊断有HIV(如HIV-1或HIV-2)感染或相关疾病或病症(如AIDS)，或被认为有发生HIV(如HIV-1或HIV-2)感染或相关疾病或病症(例如，AIDS)的风险。具有HIV相关疾病或病症的风险的受试者包括与感染者接触或以其他方式暴露于HIV的患者。预防剂的施用可以在 HIV相关疾病或病症的特征性症状出现之前进行，使得疾病或病症被预防或可选地延迟其发展。
还提供了用于防止或抑制受试者(例如人类受试者)中HIV病毒滴度、病毒复制、病毒增殖或HIV病毒DNA、HIV前病毒DNA或HIV 病毒蛋白的量增加的方法。在一个实施方案中，该方法包括向需要的受试者提供有效地防止受试者中一种或多种HIV株或分离株的HIV 滴度、病毒复制或HIV蛋白量的增加的本文所述的抗体或编码该抗体的多核苷酸。在某些实施方案中，该方法还包括在受试者被提供本公开抗体之前和之后的一个或更多个时间点测量HIV病毒或原病毒 DNA或蛋白质的量。用于测定受试者中HIV病毒或前病毒DNA或蛋白质的量的方法和生物标志物是本领域已知的并且是可获得的，并且例如在Siliciano,J.D.等,Curr Opin.HIV AIDS,5(6):491-7(2010)和 Rouzioux,C.等,Curr Opin HIV AIDS,8(3):170-5(2013)中描述。
本文所述的
在某些方面，本公开的抗体可以用于例如抑制某些病毒如本文所述的HIV分离株、预防性抑制或防止某些病毒如本文所述的HIV分离株的感染、检测样品中的某些病毒如本文所述的HIV分离株、抑制某些病毒如本文所述的HIV分离株、诊断某些病毒如本文所述的HIV 分离株的方法。
为了体内治疗哺乳动物受试者，例如人，该受试者可以给予或提供包含本文所述的多特异性抗体的药物组合物。当用于体内治疗时，本文所述的抗体通常以治疗有效量(即，消除或减少患者的病毒负荷和/或病毒库)的量施用或提供给患者。按照已知方法，例如但不限于静脉内施用(例如，浓注或通过一段时间内的连续输注)、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径将抗体施用或提供给哺乳动物受试者，例如人。抗体可以在靶细胞部位(在可能的情况下)肠胃外或静脉内施用。在一个实施方案中，通过静脉内途径向受试者施用抗体。在另一个实施方案中，通过皮下途径向受试者施用抗体。在特定的实施方案中，将本公开的药物组合物全身、肠胃外或局部施用于受试者。
在某些实施方案中，本公开提供一种用于治疗HIV感染的方法，包括向需要患者施用治疗有效量的本文公开的抗体。
联合疗法
在某些实施方案中，提供了一种用于在具有感染或处于感染风险中的人中治疗或预防HIV感染的方法，该方法包括与治疗有效量的一种或多种(例如，一种、二种、三种、一种或二种或者一到三种)其他治疗剂组合对人施用治疗有效量的本文公开的抗体或其药物组合物。在一个实施方案中，提供了一种用于在患有感染或处于感染风险中的人中治疗HIV感染的方法，其包括与有效量的一种或多种(例如，一种、二种、三种、一种或二种或者一到三种)其他治疗剂组合向人施用治疗有效量的本文公开的抗体或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，提供了包含与一种或多种(例如，一种、两种、三种、一种或两种或者一种至三种)另外的治疗剂组合的本文公开的抗体或其药物组合物，及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
在某些实施方案中，本公开提供的用于治疗HIV感染的方法包括与治疗有效量的一种或多种适用于治疗HIV感染的其他治疗剂组合向需要的患者施用治疗有效量的本文公开的抗体或其药物组合物。
在某些实施方案中，本文公开的抗体或其药物组合物与一种、两种、三种、四种或更多种另外的治疗剂组合。在某些实施方案中，本文公开的抗体或其药物组合物与两种另外的治疗剂组合。在其他实施方案中，本文公开的抗体或其药物组合物与三种另外的治疗剂组合。在进一步的实施方案中，本文公开的抗体或其药物组合物与四种另外的治疗剂组合。该一种、两种、三种、四种或更多种其他治疗剂可以是选自相同治疗剂类别的不同治疗剂，和/或它们可以选自不同的治疗剂类别。
在某些实施方案中，本文公开的抗体与一种或多种另外的治疗剂一起施用。本文公开的抗体与一种或多种另外的治疗剂的共同施用通常是指同时或依次施用本文公开的化合物和一种或多种另外的治疗剂，以使得治疗有效量的本文公开的抗体和一种或更多其他治疗剂均存在于患者体内。当顺序施用时，该组合可以两次或更多次施用。
共同施用包括在单位剂量的一种或多种其他治疗剂的施用之前或之后施用单位剂量的本文公开的抗体。例如，本文公开的抗体可以在一种或多种另外的治疗剂的施用的几秒钟、几分钟或几小时之内施用。在一些实施方案中，首先施用单位剂量的本文公开的抗体，然后在数秒或数分钟内施用单位剂量的一种或多种另外的治疗剂。或者，首先施用单位剂量的一种或多种另外的治疗剂，然后在数秒或数分钟内施用单位剂量的本文公开的抗体。在其他实施方案中，首先施用单位剂量的本文公开的抗体，然后在数小时(例如，1-12小时)后施用单位剂量的一种或多种另外的治疗剂。在再其他的实施方案中，首先施用单位剂量的一种或多种另外的治疗剂，然后在数小时(例如1-12小时)后施用单位剂量的本文公开的抗体。
在某些实施方案中，本文公开的抗体与一种或多种另外的治疗剂在单一剂型中组合以同时施用于患者，例如作为用于口服的固体剂型。
在某些实施方案中，本公开的抗体被配制为液体，其可以任选地包含用于治疗HIV的另外的治疗剂。在某些实施方案中，液体可以包含用于治疗HIV的另一种活性成分，例如HIV蛋白酶抑制剂、HIV 非核苷或非核苷酸逆转录酶抑制剂、HIV核苷或核苷酸逆转录酶抑制剂、HIV整合酶抑制剂、HIV非催化位点(或变构)整合酶抑制剂、药代动力学增强剂及其组合。
在某些实施方案中，这样的制剂适合于每天一次给药。在以上实施方案中，另外的治疗剂可以是抗HIV剂。在一些情况下，另外的治疗剂可以是HIV蛋白酶抑制剂、HIV非核苷或非核苷酸逆转录酶抑制剂、HIV核苷或核苷酸逆转录酶抑制剂、HIV整合酶抑制剂、HIV非催化位点(或变构)整合酶抑制剂、HIV进入抑制剂、HIV成熟抑制剂、潜伏逆转剂、靶向HIV衣壳的化合物、基于免疫的疗法、磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3K)抑制剂、HIV抗体、双特异性抗体和“抗体样”治疗性蛋白质、HIV p17基质蛋白抑制剂、IL-13拮抗剂、肽基-脯氨酰顺反异构酶A调节剂、蛋白质二硫键异构酶抑制剂、补体C5a受体拮抗剂、 DNA甲基转移酶抑制剂、HIVvif基因调节剂、Vif二聚化拮抗剂、 HIV-1病毒感染因子抑制剂、TAT蛋白抑制剂、HIV-1Nef调节剂、 Hck酪氨酸激酶调节剂、混合谱系激酶3(MLK-3)抑制剂、HIV-1剪接抑制剂、Rev蛋白抑制剂、整联蛋白拮抗剂、核蛋白抑制剂、剪接因子调节剂、含COMM域蛋白1调节剂、HIV核糖核酸酶H抑制剂、逆细胞周期蛋白(retrocyclin)调节剂、CDK-9抑制剂、树状ICAM-3捕获非整联蛋白1抑制剂、HIV GAG蛋白抑制剂、HIV POL蛋白抑制剂、补体因子H调节剂、泛素连接酶抑制剂、脱氧胞苷激酶抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、前蛋白转化酶PC9刺激剂、ATP 依赖性RNA解旋酶DDX3X抑制剂、逆转录酶引发复合物抑制剂、 G6PD和NADH-氧化酶抑制剂、药代动力学增强剂、HIV基因治疗、 HIV疫苗及其组合。
在一些实施方案中，另外的治疗剂选自用于HIV的组合药物、用于治疗HIV的其他药物、HIV蛋白酶抑制剂、HIV逆转录酶抑制剂、 HIV整合酶抑制剂、HIV非催化位点(或变构)整合酶抑制剂、HIV进入(融合)抑制剂、HIV成熟抑制剂、潜伏逆转剂、衣壳抑制剂、基于免疫的疗法、PI3K抑制剂、HIV抗体和双特异性抗体以及“抗体样”治疗性蛋白质，及其组合。
可以与本公开的抗体一起使用的组合药物的实例包括
可以与本公开的抗体组合用于治疗HIV的其他药物的例子包括：乙酰吗喃、阿拉泊韦、BanLec、去铁酮、Gamimune、美登科法林、纳曲酮、Prolastin、REP 9、RPI-MN、VSSP、H1viral、SB-728-T、1,5- 二咖啡酰奎宁酸、rHIV7-shl-TAR-CCR5RZ、AAV-eCD4-Ig基因治疗、 MazF基因治疗、BlockAide、ABX-464、AG-1105、APH-0812、BIT-225、 CYT-107、HGTV-43、HPH-116、HS-10234、IMO-3100、IND-02、 MK-1376、MK-8507、MK-8591、NOV-205、PA-1050040(PA-040)、 PGN-007、SCY-635、SB-9200、SCB-719、TR-452、TEV-90110、 TEV-90112、TEV-90111、TEV-90113、RN-18、Immuglo和VIR-576。
可以与本公开的抗体组合的HIV蛋白酶抑制剂的实例包括氨普那韦、阿扎那韦、布雷卡那韦、达那那韦、磷普仑那韦、磷普仑那韦钙、茚地那韦、硫酸茚地那韦、洛匹那韦、奈非那韦、奈非那韦甲磺酸盐、利托那韦、沙奎那韦、沙奎那韦甲磺酸盐、tipranavir、DG-17、TMB-657(PPL-100)、T-169、BL-008和TMC-310911。
可以与本公开抗体组合的HIV核苷或非核苷酸逆转录酶抑制剂的例子包括dapivirine、地拉韦啶、地拉韦啶甲磺酸盐、多拉维林、依法韦仑、etravirine、香菇多糖、奈韦拉平、利匹韦林、ACC-007、 AIC-292、KM-023和VM-1500。
可以与本公开抗体结合的HIV核苷或核苷酸逆转录酶抑制剂的实例包括阿德福韦、阿德福韦酯、阿夫伏定、恩曲他滨、替诺福韦、替诺福韦艾拉酚胺、替诺福韦艾拉酚胺富马酸盐、替诺福韦艾拉酚胺半富马酸盐、替诺福韦酯、富马酸替诺福韦酯、替诺福韦酯半富马酸盐、
可以与本公开的抗体组合的HIV整合酶抑制剂的例子包括 elvitegravir、姜黄素、姜黄素衍生物、癸二酸、癸二酸衍生物、3,5- 二咖啡酰奎尼酸、3,5-二咖啡酰奎尼酸、金精三羧酸、金精三羧酸的衍生物、咖啡酸苯乙酯、咖啡酸苯乙酯的衍生物、酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)、酪氨酸磷酸化抑制剂衍生物、槲皮素、槲皮素衍生物、雷特格韦、度鲁特韦、JTK-351、bictegravir、AVX-15567、cabotegravir(长效注射剂)、二酮喹啉4-1衍生物、整合酶LEDGF抑制剂、ledgins、 M-522、M-532、NSC-310217、NSC-371056、NSC-48240、NSC-642710、 NSC-699171、NSC-699172、NSC-699173、NSC-699174、芪二磺酸、 T-169和cabotegravir。
可以与本公开抗体组合的HIV非催化位点或变构整合酶抑制剂 (NCINI)的实例包括CX-05045、CX-05168和CX-14442。
可以与本公开的抗体组合的HIV进入(融合)抑制剂的实例包括 cenicriviroc、CCR5抑制剂、gp41抑制剂、CD4附着抑制剂、gp120 抑制剂和CXCR4抑制剂。
可以与本公开的抗体组合的CCR5抑制剂的例子包括阿帕韦洛韦、vicriviroc、maraviroc、cenicriviroc、PRO-140、adaptavir(RAP-101)、 nifeviroc(TD-0232)、抗GP120/CD4或CCR5双特异性抗体、B-07、 MB-66、多肽C25P、TD-0680和vMIP(Haimipu)。
可以与本公开抗体结合的gp41抑制剂的例子包括阿布韦肽、恩夫韦肽、BMS-986197、恩夫韦肽生物制剂、恩夫韦肽生物类似药、 HIV-1融合抑制剂(P26-Bapc)、ITV-1、ITV-2、ITV-3、ITV-4、PIE-12 三聚体和西夫韦肽。
可与本公开的抗体组合的CD4附着抑制剂的实例包括依巴珠单抗和CADA类似物。
可以与本公开的抗体结合的gp120抑制剂的实例包括Radha-108 (receptol)3B3-PE38，BanLec、基于膨润土的纳米药物、fostemsavir tromethamine、IQP-0831和BMS-663068
可以与本公开的抗体组合的CXCR4抑制剂的实例包括普乐沙福、ALT-1188、N15肽和vMIP(Haimipu)。
可以与本公开的抗体组合的HIV成熟抑制剂的例子包括 BMS-955176和GSK-2838232。
可以与本公开的抗体结合的潜伏逆转剂的例子包括组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂、蛋白酶体抑制剂如velcade、蛋白激酶C(PKC) 激活剂、Smyd2抑制剂、BET-布罗莫结构域4(BRD4)抑制剂、离子霉素、PMA、SAHA(巯基异羟肟酸或亚磺酰基、苯胺和异羟肟酸)、NIZ-985、IL-15、JQ1、双硫仑、两性霉素B和泛素抑制剂(例如拉格唑类似物和GSK-343)。HDAC抑制剂的实例包括罗米地辛、伏立诺他和帕诺比司他。PKC激活剂的例子包括吲哚美坦、prostratin、丁香酚B和DAG内酯。
可与本公开的抗体组合的衣壳抑制剂的实例包括衣壳聚合抑制剂或衣壳破坏化合物、HIV核衣壳p7(NCp7)抑制剂如偶氮二甲酰胺、 HIV p24衣壳蛋白抑制剂、AVI-621、AVI-101、AVI-201、AVI-301 和AVI-CAN1-15系列。
可以与本公开的抗体组合的基于免疫的疗法的例子包括toll-样受体调节剂，例如TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、 TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13；程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)调节剂；程序化死亡配体1(PD-L1)调节剂；IL-15激动剂；DermaVir；白介素7；plaquenil(羟氯喹)；proleukin(阿地白介素， IL-2)；干扰素α；干扰素α-2b；干扰素α-n3；聚乙二醇化干扰素α；干扰素γ；羟基脲；霉酚酸(MPA)及其酯衍生物霉酚酸酯(MMF)；利巴韦林；rintatolimod、聚合物聚乙烯亚胺(PEI)；gepon；rintatolimod； IL-12；WF-10；VGV-1；MOR-22；BMS-936559；CYT-107、白介素 15/Fc融合蛋白、normferon、聚乙二醇化干扰素α-2a、聚乙二醇化干扰素α-2b、重组白介素15、RPI-MN、GS-9620和IR-103。
可以与本公开的抗体组合的PI3K抑制剂的实例包括艾达拉西布 (idelalisib)、阿贝利西布(alpelisib)、布帕利西布(buparlisib)、CAI乳清酸、copanlisib、duvelisib、gedatolisib、neratinib、panulisib、periposine、 pictilisib、pilaralisib、puquitinib甲磺酸盐、rigosertib、rigosertib钠、 sonolisib、taselisib、AMG-319、AZD-8186、BAY-1082439、CLR-1401、 CLR-457、CUDC-907、DS-7423、EN-3342、GSK-2126458、 GSK-2269577、GSK-2636771、INC-040093、LY-3023414、MLN-1117、 PQR-309、RG-7666、RP-6530、RV-1729、SAR-245409、SAR-260301、 SF-1126、TGR-1202、UCB-5857、VS-5584、XL-765和ZSTK-474。
可以与本公开的抗体组合的整联蛋白α-4/β-7拮抗剂的实例包括 PTG-100、TRK-170、阿卜鲁单抗(abrilumab)、依特鲁珠单抗 (etrolizumab)、卡洛格斯特甲基(carotegrast methyl)和维多珠单抗 (vedolizumab)。
可与本公开抗体组合的HIV抗体、双特异性抗体和“抗体样”治疗性蛋白质的例子包括
可与本公开的抗体组合的药代动力学增强剂的实例包括可比司他和利托那韦。
可与本公开的抗体组合的其他治疗剂的实例包括在WO 2004/096286(GileadSciences)、WO 2006/015261(Gilead Sciences)、 WO 2006/110157(Gilead Sciences)、WO2012/003497(Gilead Sciences)、WO 2012/003498(Gilead Sciences)、WO 2012/145728(Gilead Sciences)、WO 2013/006738(Gilead Sciences)、WO 2013/159064(GileadSciences)、WO 2014/100323(Gilead Sciences)、 US 2013/0165489(University ofPennsylvania)、US 2014/0221378 (Japan Tobacco)、US 2014/0221380(Japan Tobacco)、WO 2009/062285 (Boehringer Ingelheim)、WO 2010/130034(Boehringer Ingelheim)、WO2013/006792(Pharma Resources)、US 20140221356(Gilead Sciences)、 US 20100143301(Gilead Sciences)和WO 2013/091096(Boehringer Ingelheim)中公开的化合物。
可以与本公开抗体组合的HIV疫苗的例子包括肽疫苗、重组亚基蛋白疫苗、活载体疫苗、DNA疫苗、CD4衍生肽疫苗、疫苗组合、 rgp120(AIDSVAX)、ALVAC HIV(vCP1521)/AIDSVAX B/E(gp120) (RV144)、单体gp120 HIV-1C亚型疫苗、Remune、ITV-1、Contre Vir、Ad5-ENVA-48、DCVax-001(CDX-2401)、Vacc-4x、Vacc-C5、VAC-3S、多进化枝DNA重组腺病毒5(rAd5)、Pennvax-G、Pennvax-GP、 HIV-TriMix-mRNA疫苗、HIV-LAMP-vax、Ad35、Ad35-GRIN、NAcGM3/VSSP ISA-51、聚-ICLC佐剂疫苗、TatImmune、 GTU-multiHIV(FIT-06)、gp140[Δ]V2.TV1+MF-59,rVSVIN HIV-1 gag 疫苗、SeV-Gag疫苗、AT-20、DNK-4、ad35-Grin/ENV、TBC-M4、 HIVAX、HIVAX-2、NYVAC-HIV-PT1、NYVAC-HIV-PT4、 DNA-HIV-PT123、rAAV1-PG9DP、GOVX-B11、GOVX-B21、 TVI-HIV-1、Ad-4(Ad4-env进化枝C+Ad4-mGag)、EN41-UGR7C、 EN41-FPA2、PreVaxTat、AE-H、MYM-V101、CombiHIVvac、ADVAX、 MYM-V201、MVA-CMDR、DNA-Ad5gag/pol/nef/nev(HVTN5 05)、 MVGTG-17401、ETV-01、CDX-1401、rcAD26.MOS1.HIV-Env、Ad26.Mod.HIV疫苗、AGS-004、AVX-101、AVX-201、PEP-6409、 SAV-001、ThV-01、TL-01、TUTI-16、VGX-3300、IHV-001和病毒样颗粒疫苗如假病毒颗粒疫苗、CombiVICHvac、LFn-p24 B/C融合疫苗、基于GTU的DNA疫苗、HIV gag/pol/nef/env DNA疫苗、抗TAT HIV疫苗、结合多肽疫苗、树突状细胞疫苗、基于gag的DNA疫苗、 GI-2010、gp41 HIV-1疫苗、HIV疫苗(PIKA佐剂)、Ii-key/MHC II类表位杂合肽疫苗、ITV-2、ITV-3、ITV-4、LIPO-5、多进化枝Env疫苗、MVA疫苗、Pennvax-GP、pp71缺陷HCMV载体HIV gag疫苗、重组肽疫苗(HIV感染)、NCI、rgp160HIV疫苗、RNActive HIV疫苗、 SCB-703、Tat Oyi疫苗、TBC-M4、治疗性HIV疫苗、UBI HIVgp120、 Vacc-4x+罗米地辛、变体gp120多肽疫苗、rAd5 gag-pol env A/B/C疫苗。
可与本公开的抗体组合的用于节育的治疗剂(避孕药)包括醋酸环丙孕酮、去氧孕烯、地诺孕素、屈螺酮、戊酸***、乙炔***、炔诺醇、依托孕烯、左亚叶酸、左炔诺孕酮、炔雌烯醇、乙酸甲羟孕酮、美雌醇、米非司酮、米索前列醇、醋酸诺美孕酮、诺孕曲明、炔诺酮、异炔诺酮、诺孕酯、奥美昔芬、醋酸segestersone、醋酸乌利司他及其任何组合。
在特定的实施方案中，本文公开的抗体或其药学上可接受的盐与一种、两种、三种、四种或更多种选自
在具体的实施方案中，本文公开的抗体或其药物组合物与逆转录酶的HIV核苷或核苷酸抑制剂和逆转录酶的HIV非核苷抑制剂组合。在另一具体的实施方案中，本文公开的抗体或其药物组合物与逆转录酶的HIV核苷或核苷酸抑制剂和HIV蛋白酶抑制化合物组合。在另外的实施方案中，本文公开的抗体或其药物组合物与逆转录酶的HIV 核苷或核苷酸抑制剂、逆转录酶的HIV非核苷抑制剂和药代动力学增强剂组合。在某些实施方案中，本文公开的抗体或其药物组合物与至少一种逆转录酶的HIV核苷抑制剂、整合酶抑制剂和药代动力学增强剂组合。在另一个实施方案中，本文公开的抗体或其药物组合物与两种逆转录酶的HIV核苷或核苷酸抑制剂组合。
在特定的实施方案中，本文公开的抗体或其药物组合物与硫酸阿巴卡韦、替诺福韦、替诺福韦酯、富马酸替诺福韦酯、替诺福韦酯半富马酸酯、替诺福韦艾拉酚胺或替诺福韦艾拉酚胺半富马酸盐组合。
在特定的实施方案中，本文公开的抗体或其药物组合物与替诺福韦、替诺福韦酯、富马酸替诺福韦酯、替诺福韦艾拉酚胺或替诺福韦艾拉酚胺半富马酸盐组合。
在特定的实施方案中，本文公开的抗体或其药物组合物与选自硫酸阿巴卡韦、替诺福韦、替诺福韦酯、富马酸替诺福韦酯、替诺福韦艾拉酚胺和替诺福韦艾拉酚胺半富马酸盐的第一另外的治疗剂及选自恩曲他滨和拉米夫定的第二另外的治疗剂组合。
在特定的实施方案中，本文公开的抗体或其药物组合物与选自替诺福韦、替诺福韦酯、富马酸替诺福韦酯、替诺福韦艾拉酚胺和替诺福韦艾拉酚胺半富马酸盐的第一另外的治疗剂以及第二另外治疗剂组合，其中第二另外的治疗剂是恩曲他滨。
在另一特定的实施方案中，本文公开的抗体或其药物组合物与醋酸环丙孕酮、去氧孕烯、地诺孕素、屈螺酮、戊酸***、乙炔***、炔诺醇、依托孕烯、左亚叶酸、左炔诺孕酮、炔雌烯醇、醋酸甲羟孕酮、美雌醇、米非司酮、米索前列醇、醋酸诺美孕酮、诺孕曲明、炔诺酮、异炔诺酮、诺孕酯、奥美昔芬、醋酸segestersone、醋酸乌利司他及其任何组合的第一另外的治疗剂(避孕药)组合。
试剂盒
本公开还涵盖包含一种或多种本文所述抗体或其缀合物的试剂盒。在一种情况中，本文提供了一种药物包装或试剂盒，其包括一个或多个填充有本文所述的药物组合物的一种或多种成分，例如本文提供的一种或多种抗体的容器。在一些情况下，试剂盒包含本文所述的药物组合物。在一个实施方案中，提供了包含与一种或多种(例如，一种、两种、三种、一种或两种或者一种至三种)其他治疗剂(例如上述那些)组合的本文公开的抗体或其药物组合物的试剂盒。可选地，与此类容器相关联的可以是用于规范药品或生物制品的生产、使用或销售的机构所规定形式的通知，该通知反映了该机构对于制造、使用或销售用于人类施用的批准。
实施例
提供以下实施例以更好地说明所要求保护的发明，并且不应将其解释为限制本发明的范围。就提及特定材料的方面而言，其仅出于说明的目的，并不旨在限制本发明。本领域技术人员可以开发等同的手段或反应物而无需创造性的能力并且不脱离本发明的范围。
实施例1:病毒中和活性
PGT121是一种高效的中和抗体，具有广泛的HIV亚型B分离株覆盖率(IC50为0.03μg/ml，广度为80％)。使用两种不同的已发布检测方法检查PGT121及其变体的中和的效力(以IC50或IC95测量) 和广度(测试的组的中和分离株的百分比)：
i)基于CEM-NKr-CCR5-LucR报告细胞系的分析(Li等2005.J Vir 79(16)：10108-10125)，其适用于筛选针对假型的和具有复制能力的HIV分离株的抗体；和
ii)Monogram HIV PhenoSense中和测定法(Monogram Biosciences)，其使用用目标HIV Env变体假型化的荧光素酶报告病毒 (Richman等2003.PNAS 100(7)：4144-4149)。
在基于报告细胞系的CEM-NKr-CCR5-LucR中和分析(一种多周期病毒复制测定)(Spenlehauer等2001.Virology, doi:10.1006/viro.2000.0780)中，抗体针对五种具有复制能力的临床分离株的组进行筛选，包括实验室适应的HIV-1BaL株和从患者血浆样品扩增的亚型B分离株93HT593、92US657、92US712和92US727(NIH AIDS Reagent Program)。
对于测试的五种病毒，观察到几种变体PGT-121抗体的中和效能与PGT-121(在本文中也称为PGT-121LO6)相当，表明与PGT-121 相比，这些抗体中存在的修饰对抗原识别和结合的决定子影响极小 (对于CEM-NKr-CCR5-Luc细胞，下表5)。与PGT121相比，其他变体(例如PGT121.60和PGT121.61)表现出对这种有限病毒的组的中和效能提高了2-3倍。
表5:PGT121和选择的变体针对HIV-1株BaL、HT593、US657、 US712和US727的中和活性，如使用基于CEM.NKr.CCR5.LucR的分析观察的。数据表示为2-3个重复的平均值
在Monogram中和分析中，Env(gp160)编码区从分离自HIV+ ART原始病毒血症患者的血浆病毒RNA扩增并克隆到表达载体中，使得维持患者血浆样品中存在的病毒准种分布。然后将表达载体用于产生表达患者来源的Env蛋白的HIV-1伪病毒群。生成两个进化枝B 临床分离株的组用于Monogram中和分析：第1组(Monogram临床分离株组)包含来自Monogram库集合的63个分离株，并包括33种或更多种CCR5-嗜性病毒、15种或更多种CXCR4-嗜性(X4)和15种或更多种双重混合(DM)嗜性病毒；第2组(Gilead临床分离株组)包含从来自参加临床试验的未接受过ART治疗的HIV患者的ART前基线血浆样品分离的142种亚型B病毒，且包括113种CCR5嗜性(R5)病毒、 28种双重或混合嗜性(DM)病毒和一种CXCR4嗜性(X4)病毒。考虑到 HIV-1 Env在患者分离株之间、在进化枝之间以及在进化枝内表现出显著的多样性，PGT121和变体的中和活性也使用来自Monogram库集合的病毒的组针对代表非B进化枝的病毒进行了谱分析。 Monogram HIV PhenoSense中和分析用于对大的患者分离株集合进行谱分析，从而能够更严格地对PGT121和生成的变体的广度和效力两者进行谱分析。结果示于表6-9中。结果表明，PGT121的变体(如 PGT121.60)针对所选择病毒显示出增强的中和活性。
表6:PGT121和PGT121.60针对亚型B病毒的中和活性(IC50)
表7:PGT121和PGT121.60针对亚型B病毒的中和效力(IC50)
表8:PGT121和选择的变体针对92种亚型B病毒的中和效力和覆盖率
表9:PGT121和PGT121.60针对多进化枝病毒的中和活性
这些实验证明Fc增强的PGT121在X4嗜性HIV中和方面的出乎意料的改善。除了CD4之外，HIV可以利用两种共受体进入T细胞-CXCR4或CCR5。共受体结合由Env介导，其是本文所述的广泛中和抗体的靶标。因此，具有不同序列的不同HIV株优先使用CXCR4 (称为X4-嗜性)、CCR5(称为R5-嗜性)或两者(称为X4/R5或双重嗜性)。显示R5和X4两种嗜性(称为Dual-Mixed或DM)的病毒池可包含R5、X4和/或双重嗜性病毒株的混合物。PGT121通常显示出对X4分离株的低敏感性(低效力和广度)，而优先中和R5嗜性病毒。向PGT121中加入Fc突变DEAL+LS(PGT121.56)特异性地增强其对DM和X4嗜性病毒的中和活性(中值IC50增强2倍，和对于至少一个分离株最多增强约20倍)。尽管一些PGT121 Fab变体(例如PGT121.13和PGT121.22)表现出对R5 DM和X4病毒的中和效力降低，但带有DEAL+LS Fc突变的几种工程化PGT121 Fab变体，包括带有WT Fab的PGT121.56，中和DM和X4病毒的效力与 R5病毒相比更高(P<0.0001)(数据未显示)。这是非常出乎意料的，因为据认为HIV中和仅由Fab结构域(而不是Fc结构域)介导。在R5分离株中，约46％的测试分离株中观察到中和增强2到3倍。DEAL+LS突变存在于本公开的某些抗体及其片段中。引入PGT121.56 的其他修饰进一步改善了所选择变体(例如，PGT121.60)的中和活性。
覆盖广度计算为以IC95<15μg/ml中和的病毒的百分比。效力通过计算IC95<15μg/ml的病毒中的中值IC95值来确定。当针对包括总共89个进化枝B分离株的两个HIV-1分离株的组进行测试时，与 PGT121相比，本公开的抗体显示出中和活性没有损失(数据未显示)。某些抗体的效力与PGT121几乎相同，中和广度略有提高。中和谱分析也用作抗体相对于PGT-121识别和结合来自广泛的HIV-1临床分离株的多样Env抗原的能力的替代评估。来自各种抗体的谱分析的数据显示，中和效力降低的抗体也表现出降低的ADCC活性(数据未显示)，表明抗体的中和活性和ADCC活性之间呈正相关，并支持使用中和广度作为ADCC广度评估的替代。
实施例2:免疫原性研究
三种方法用于评估免疫原性并指导工程化以消除PGT121中的免疫原性基序。使用计算机模拟预测工具来鉴别PGT121抗体中潜在免疫原性风险的位点，并也指导工程化工作以提高可加工性(例如，去除糖基化位点、改善低pH值维持稳定性)，同时防止引入新的T细胞表位。基于该分析，在本公开的抗体中进行框架区的修饰以降低免疫原性，这具有低的影响功能活性的风险。另外，为了进一步鉴定本公开的一种抗体的可变域内潜在免疫原性基序，采用了离体人T细胞活化测定法，EpiScreenTM(Antitope,Ltd.,Cambridge,UK)。在50个健康供体(其代表多种HLA单倍型)中响应于源自抗体的重叠的15氨基酸的肽及KLH(匙孔血蓝蛋白，阳性对照)诱导的CD4+T细胞反应使用H-胸苷掺入分析来评估以测量T细胞增殖。该测定使得能够在一级抗体序列中定位特定的T细胞表位以指导抗体工程。它还提供了测试抗体的T细胞表位相对免疫原性的分级(数据未显示)。
为了评估所选抗体变体的临床免疫原性风险，使用EpiScreenTM时程T细胞分析(Antitope,Ltd.,Cambridge,UK)来测量由完整抗体诱导的T细胞活化。如所述的(Baker和Jones 2007.Curr.Opin.Drug Discov.Devel.10:219-227)进行全分子测定。因此，该测定不仅考虑T 细胞表位含量，还考虑了天然IgG的加工。与计算机模拟和肽扫描分析不同，全分子离体T细胞活化分析可以评估给定抗体的相对临床风险，且在某些情况下可以如所述的(Baker和Jones 2007Curr.Opin. Drug Discov.Devel.10:219-227)用于预测临床免疫原性率。
许多临床阶段抗体在该测定法中运行，且在该测定法中显示几乎没有或没有临床免疫原性的抗体具有接近或低于10％的评分，而显示高临床免疫原性的抗体(如阿仑单抗和英夫利昔单抗)的评分在25 ％至40％的范围内(Baker和Jones 2007.Curr.Opin.DrugDiscov. Devel.10:219-227)。与PGT121 WT(即PGT-121LO6)相比， PGT121.42、PGT121.60、PGT121.61和PGT121.65显示出降低的供体反应率，支持这些变体的临床免疫原性风险降低(数据未显示)。
实施例3:FcRn结合
新生儿Fc受体(FcRn)是已显示在调节人和临床前物种中IgG 分子的药代动力学中起主要作用的Fc受体。内吞后，在酸性pH(<6.5) 下，FcRn以高亲和力结合IgG的Fc部分。FcRn结合的IgG循环回到细胞外空间，其中在生理pH下，IgG结合亲和力降低且IgG释放回到循环中。未被FcRn途径挽救的游离IgG在溶酶体中降解为内源氨基酸。在pH 6.0/7.0下IgG与FcRn的相对结合亲和力特征已成为对于IgG体内半衰期分级的确定的相关因素且是药代动力学优化的设计特征。
测定了在不同pH下抗体与各种抗体变体的FcRn的结合。96孔 Maxisorp平板涂覆100ul的5μg/ml FcRn。平板在4℃下孵育过夜，然后在用0.05％Tween 20洗涤缓冲液洗涤3次后在室温下用4％脱脂乳封闭2小时。在室温下，平板与一抗的3倍系列稀释液孵育1小时。然后平板洗涤3次，并加入在4％脱脂乳中稀释的100μL Fab- 抗人Fab-HRP或山羊抗人IgG-HRP二抗。然后平板在室温下孵育50 分钟，洗涤3次，和加入100μL新鲜的TMB底物。平板在轻轻摇动的平台上显影3分钟。平板用100μL 1M HCl淬灭，短暂振摇，在 Spectrummax m5平板阅读仪上A450下读取。
相对于PGT-121，在与FcRn相互作用的IgG Fc部分中包含LS 突变的本公开抗体显示在pH 6.0下FcRn结合的显著改善，而在中性 pH 7.0下对结合的影响较小，如通过对于人FcRn的pH 7.0/6.0比率表示的。改善的结合归因于LS突变的存在，并且据预测相对于 PGT-121提供延长的人体中半衰期。数据示于表10中。
表10:PGT121和变体的人FcRn结合数据
该数据显示PGT121.60和61相对于PGT121.56或PGT121.42的显著改善。PGT121.56是具有DEAL+LS Fc的WT Fab。这表明 PGT121.60和61中的Fab突变改善了FcRn结合。PGT121.64和 PGT121.65没有显示出这种改善，表明这两个变异体中的Fab修饰实际上可减少FcRn结合。
实施例4:体内分析
分析了PGT121和来自本申请的几种抗体以表征其基本药代动力学特征，从而确保存在于本公开抗体中的Fab/Fc修饰增强而不显著干扰PGT121固有的药代动力学性能。在两只雄性原始食蟹猴(n＝2) 中单次静脉内(IV)1.0mg/kg剂量后，对PGT121和本公开的几种其他抗体的体内处置进行表征。从猴子收集血清样品，并使用生物分析方法(本文所述)进行分析以通过非房室药代动力学分析(NCA)确定血清浓度-时间曲线和平均血清药代动力学参数。
在单独的研究中，在三只雄性原始食蟹猴(n＝3)中单次静脉内10.0mg/kg剂量后，对PGT121、PGT121 LS和新批次的PGT121.42 和PGT121.60的固有药代动力学行为进行表征。收集血清样品并使用生物分析方法(本文所述)进行分析以通过非房室药代动力学分析(NCA)确定血清浓度-时间曲线和平均血清药代动力学参数。 PGT121、PGT121.42、PGT121.43、PGT121.60和PGT121.61的平均血清药代动力学参数由浓度-时间分布的非房室药代动力学分析确定并在表11中描绘。相对于PGT121，体内测试的本公开的所有抗体具有相当或改善的药代动力学(如本文所定义)。
表11:原始食蟹猴(n＝2)中PGT121和变体在IV施用(1mg/kg)后的药代动力学参数
从浓度-时间分布的非房室药代动力学分析确定了PGT121、 PGT121 LS、PGT121.42和PGT121.60的平均血清药代动力学参数，并在表12中描绘。
表12:原始食蟹猴(n＝3)中PGT121、PGT121 LS、PGT121.42,和 PGT121.60在IV施用(10mg/kg)后的药代动力学参数
相对于PGT121，在体内测试的本公开的所有抗体具有相当或改善的药代动力学(如本文所定义)。与PGT121相比，PGT121.60对测试病毒显示增强的效力(数据未显示)。PGT121变体(如PGT121.60、 PGT121.64和PGT121.65)在所有测试的病毒分离株中显示出提高的效力(数据未显示)。这表明进行的修饰(可能对CDR外的抗原接触残基进行的修饰)改善中和效力。与PGT121相比，PGT121.60显示出增强的对代表B和非B亚型的病毒的中和活性(数据未显示)。
实施例5:评估gp120 X CD3 Duobody杀伤HIV感染细胞的能力
示例性gp120 X CD3的杀伤活性(以下提供了
表13:示例性gp120 X CD3
总之，示例性gp120 X CD3
方法
通过PBMC效应细胞的感染细胞杀伤
使用原代静止HIV感染的CD4+T细胞作为靶细胞和自体PBMC 作为效应细胞，对示例性gp120 X CD3
通过流式细胞术测定HIV感染靶细胞的杀伤。共培养期结束时，细胞用PBS洗涤2次，用100μL Live/Dead Aqua(在PBS中1/1000 稀释)染色10分钟直到染料通过加入100μLFACS缓冲液(PBS+2 ％FBS)灭活。细胞然后用FACS缓冲液洗涤，并与抗CD4-PE/Cy7 mAb(在FACS缓冲液中1/50稀释)孵育20分钟，然后用FACS缓冲液洗涤3次，并用100μL Cytofix/Cytoperm固定和渗透10分钟。然后将细胞用PermWash洗涤一次，并与抗p24-PE mAb在FACS缓冲液+10％PermWash中孵育25分钟。最后，细胞用FACS缓冲液洗涤3次，重悬于120μL FACS缓冲液中，并在LSR Fortessa或X20 FACS(BD Biosciences，San Jose，CA)上获得流式细胞分析数据和使用FlowJo软件(TreeStar)进行分析。
数据分析
在通过PBMC杀死感染的原代CD4+T细胞时，通过流式细胞术采用了以下门控策略对HIV感染靶细胞进行计数：基于前向和侧向散射选择淋巴细胞，和通过Live/Dead Aqua的阴性染色选择活淋巴细胞。然后选择代表接种的CD4+T细胞的PKH67阴性活淋巴细胞，并将HIV感染的细胞鉴定为p24 Gag+,CD4低(由于HIV介导的CD4下调)细胞。HIV感染百分率为通过HIV感染的(p24 Gag+,CD4低阳性的)接种(PKH67阴性)CD4+T细胞的百分比表示。
示例性gp120 X CD3
100-((处理孔中的％HIV感染靶细胞/未处理孔中的％HIV感染靶细胞)*100)。
示例性gp120 X CD3
公式1:
其中Y＝％杀伤,X＝抗体浓度,底部＝不存在抗体时的反应, 和顶部＝最大反应。
表观Emax<40％的剂量-反应曲线，EC50值报告为>100μg/mL 且Emax绝对值≤0％赋值为0％。
实施例6:评估抗gp120抗体变体
在加速应激条件(25℃,40℃)下，PGT-121.60轻链可变域的59位的天冬氨酸发生异构化为IsoAsp。Asp59形成HIV Env N332结合基序的部分，且对gp120与PGT-121.60的结合至关重要，从而导致抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)的损失。药物产品的冻干可减轻这种化学倾向性。
PGT-121.60选择为
所有四个变体具有以下提供的相同重链氨基酸序列：
变体1具有SEQ ID NO：40中所示的轻链序列。变体2具有SEQ ID NO：78中所示的轻链序列。变体3具有SEQ ID NO：79中所示的轻链序列。变体4具有SEQ ID NO：80所示的轻链序列。
结合研究
测定了上述各种变体抗体与gp120 HIV ENV蛋白的结合。384孔 Maxisorp平板涂覆25μl的5μg/ml gp120。平板在40℃下孵育过夜。用PBS 0.05％Tween 20洗涤缓冲液洗涤平板4次，并在室温下以600 rpm振摇用75μl PBS 5％BSA封闭1小时。在室温下以600rpm振摇将平板与三倍系列稀释的一抗一起孵育1小时。然后平板用PBS 0.05％Tween20洗涤4次，并将25μl山羊抗人IgG(H+L)HRP二抗在PBS 1％BSA中稀释和在室温下以600rpm振摇孵育40分钟。平板用PBS 0.05％Tween20洗涤4次和加入25μl新鲜的TMB底物。平板在600rpm振摇下显影90秒，然后用25μl 1M HCl淬灭。平板在Spectramax m5平板阅读仪上于A450下读取。
相对于PGT-121.60，在框架***环的天冬氨酸异构化位点包含突变的本公开的变体抗体具有改善和降低的与gp120的结合。序列活性关系分析显示对于残基59处维持天冬氨酸的明显和强烈的偏好。甘氨酸在残基59处耐受，而谷氨酰胺、谷氨酸和天冬酰胺对抗体结合 gp120的能力产生负面影响。在残基60处，对于所引入氨基酸的较大体积侧基是耐受的。数据示于下表14。
表14:PGT121.60和变体的gp120结合数据
分子
WITO EC50(nM)
PGT121.60(DS)
0.36
变体2(DS->DF)
0.15
变体4(DS->GS)
0.84
变体5(DS->GF)
0.91
变体6(DS->ES)
21
变体7(DS->NS)
59
变体1(DS->DY)
0.05
变体3(DS->DT)
0.20
变体8(DS->QS)
1.37
变体9(DS->EY)
19
变体10(DS->ET)
18
(在上表中，分子旁边的字母对应于轻链59位和60位(Kabat编号)的氨基酸。突变的残基被加粗。)
该数据显示，变体2、变体1和变体3相对于PGT121.60和其他变体的gp120结合的改善表明天冬氨酸异构化位点突变可影响与 gp120的结合。这些变体用DEAL+LS Fc(即具有S239D、I332E、 G236A、A330L、M428L和N434S突变(“DEALLS”)的Fc)测试。
效力研究
选择PGT-121.60ADCC分析，因为它包括表达HT593的靶细胞系，并且已知HT593对PGT-121.60中的isoAsp倾向性(liability)是敏感的。基于ADCC报告细胞的分析测量PGT-121.60诱导活化T细胞核因子(NFAT)介导的荧光素酶表达的能力作为ADCC活性的替代量度。在该分析中，表达FcγRIIIa受体(V158)和NFAT调节的荧光素酶的Jurkat细胞与表达gp120的人胚肾(HEK)细胞在浓度提高的PGT-121.60参考标准品、对照和样品存在下孵育。PGT-121.60结合HEK细胞表面上的gp120，从而有效地交联在Jurkat细胞上的 FcγRIIIa并通过NFAT激活荧光素酶基因表达。相对发光单位(RLU) 相对于PGT-121.60浓度作图，并使用平行线分析程序确定对照和样品相对于参考标准品的效力。作为第一参考标准(RS)，PGT-121.60 赋予100％的相对效力(RP)值。
PGT-121.60变体(即，变体1、变体2、变体3和变体4)的样品稀释至0.5mg/mL的中间浓度，并通过紫外分光光度法确认蛋白质浓度(280nm的最大吸光度–320nm吸光度)。随后将中间浓度稀释至0.6ng/mL-4.96μg/mL的初始浓度范围。然后根据上述ADCC测定法测试样品(对照，25℃，4周)，不同的是针对其相应的对照 (指定为100％RP)而非PGT-121.60参考标准对热应激样品进行定量。
通过在25℃下孵育4周，PGT.121.60变体(变体1、变体2、变体3和变体4)的样品经受热应激。它们然后在基于PGT.121.60 ADCC报告细胞的分析中与其相应的未处理对照(2-8℃下保存)进行测试。结果示于表15。
表15:热应激PGT-121.60和isoAsp变体的ADCC活性
a.PGT-121.60仅测试一次，且结果与历史数据一致。
结果表明，虽然热处理的PGT-121.60的活性降低(RP为65％)，但变体2、变体3、变体4和变体1的ADCC活性(分别96％、104 ％、95％和100％)未受25℃下4周处理的影响。
实施例7:评估HIV中和活性
在实施例1中所述的(i)基于CEM-NKr-CCR5-LucR报告细胞系的分析和ii)Monogram HIV PhenoSense中和分析(Monogram Biosciences)中检查抗体的HIV-1中和的效力(以IC50或IC95测量) 和广度(测试的组中的中和分离株的％)。
在基于CEM-NKr-CCR5-LucR报告细胞系的中和分析中，抗体针对一组40个进化枝B的具有复制能力的HIV-1分离株和克隆进行检查。
变体1-4的中和效力与PGT-121.60相似(每个变体与PGT-121.60 相比的Student’s配对T检验P值≥0.372)。与PGT-121.60相比，变体的IC50值的几何平均倍数变化范围从变体1的1.035到变体2的 1.539，表明消除PGT-121.60中的异天冬氨酸倾向性的突变不显著影响PGT-121.60的HIV中和活性。对于所测试的40种病毒中的1种(病毒8339)，完全消除了变体1-4的中和活性。结果显示在表16中。
表16:使用基于CEM.NKr.CCR5.LucR的分析的中和活性。数据代表2次重复的平均值。
a.na是指“不适用”
在Monogram HIV PhenoSense中和分析中，变体1-3的HIV中和活性以具有FEAR/FEAL Fc的双特异性形式针对Gilead临床分离株的组(n＝142种病毒)进行评估。当以FEAR/FEAL双特异性形式评估时，变体1-3的效力与PGT-121.60DEAL+LS相比降低了4.1到5.3 倍(表17)。结合基于CEM.NKr.CCR5.LucR的分析的结果(其中变体以DEAL+LS形式评估)，结果表明双特异性形式，而非消除PGT-121.60中的异天冬氨酸倾向性的突变，损害HIV中和活性4至5倍。
表17.使用Monogram HIV PhenoSense中和分析的中和活性。数据代表单一实验。
a.na是指“不适用”
实施例8:T细胞激活
CD3+T细胞与表达目标抗原的靶细胞通过CD3-双特异性抗体的连接导致T细胞激活。在不存在抗原阳性靶细胞的情况下，对于CD3 双特异性抗体通常看不到T细胞激活。T细胞激活对抗原阳性靶细胞存在的这种依赖性可以防止全体T细胞激活并限制与全体T细胞激活相关的不良事件，例如细胞因子释放综合征。
为了评估gp120 X CD3仅在两种抗原均存在的情况下激活T细胞的能力，我们将从非HIV感染供体(n＝2)和HIV感染供体(n＝2)分离的原代PBMC与gp120 XCD3
gp120 X CD3 Duobody变体1(表18和19)和gp120 X CD3 Duobody变体2(表20和21)两者诱导原代CD4 T细胞和CD8 T上 T细胞激活标志物CD69和CD25的剂量依赖性上调。还观察到PD-1 的微小上调。没有观察到Ki67的上调。来自非HIV感染和HIV感染的供体的T细胞反应相似。激活标志物的上调依赖于gp120 X CD3 Duobody与两种抗原的结合，因为激活标志物的上调仅在感染对 gp120 x CD3 Duobody杀伤敏感的HIV-1病毒(7552)的 CEM-NKr-CCR5-LucR CD4 T细胞存在的情况下才观察到。当效应细胞与感染对gp120 X CD3Duobody杀伤具有抗性的HIV病毒(THRO) 的CEM-NKr-CCR5-LucR CD4 T细胞或未感染的CEM-NKr-CCR5-LucR CD4 T细胞共培养时，未观察到激活标志物的上调。无论CEM-NKr-CCR5-LucR CD4 T细胞是否感染对gp120 x CD3
表18:gp120 x CD3 Duobody变体1CD4 T细胞激活
表19:gp120 x CD3 Duobody变体1CD8 T细胞激活。
表20:gp120 x CD3 Duobody变体2CD4 T细胞激活。
表21:gp120 x CD3 Duobody变体2CD8 T细胞激活。
表22:PGT-121.60CD4 T细胞激活。
表23:PGT-121.60CD8 T细胞激活。
方法
gp120 X CD3 Duobody诱导的T细胞激活标志物的上调通过在 37℃下共培养1x104个通过Ficol paque从获自非HIV感染(n＝2) 和HIV感染供体(n＝2)的leukopak分离的人原代T细胞与1x 105个CEM-NKr-CCR5-LucR CD4 T细胞24小时来评估，该 CEM-NKr-CCR5-LucR CD4 T细胞(i)感染对gp120 x CD3
使用GraphPad Prism(La Jolla,CA)软件从通过三参数非线性回归拟合的剂量反应曲线(公式1)获得表达每种激活标志物的CD4和 CD8 T细胞的最大分数(Emax)以及产生50％Emax的浓度(EC50)。
公式1:
其中Y＝％激活,X＝抗体浓度,底部＝不存在抗体时的反应, 和顶部＝最大反应。
对于T细胞激活的Emax高于基线(无抗体对照孔)<5％的剂量 -反应曲线，EC50值报告为>100μg/mL(测试的最大浓度)。
实施例9:HIV感染的CEM-NKr-CCR5-LucR CD4 T细胞使用 PBMC效应细胞的杀伤。
针对4种主要的HIV-1分离株或分子克隆评估杀伤活性。使用来自2位健康供体的PBMC效应细胞评估每种病毒，结果显示在表24 中。gp120 X CD3
除了杀伤比PGT-121.60和PGT-121显著更多的感染细胞(Emax) 外，gp120 X CD3Duobodies(示例性变体1和2；中值EC50，0.042 ug/mL)在杀伤感染的细胞方面比PGT-121(中值EC50，>100ug/mL； Mann-Whitney，P<0.0001)效力更高，并倾向于比PGT-121.60(中值EC50，>100ug/mL；Mann-Whitney，P＝0.1157)更高效。
PGT-121.60(中值18％)和PGT-121(中值0％)之间的感染细胞杀伤效力(Emax)的差异是统计学显著的(Mann Whitney，P＝ 0.018)。此外，PGT-121.60倾向于比PGT-121更有效(P＝0.128)。结果表明，与PGT-121.60(效应子增强的IgG1 mAb)或PGT-121(IgG1 mAb)相比，CD3双特异性抗体显示出提高的HIV感染细胞杀伤。
表24:HIV-感染的CEM-NKr-CCR5-LucR CD4 T细胞的杀伤。
方法
CEM-NKr-CCR5-LucR CD4 T细胞在包含20μg/mL DEAE葡聚糖的R10+1+1(RMPI加10％FBS，1％青霉素/链霉素，1％HEPES) 培养基中感染HIV-1分离株92US657、1489、8398和7552，并在37℃下孵育4小时。接种后四小时，CEM-NKr-CCR5-LucR CD4 T细胞用 R10+1+1稀释3x，并培养48-72小时以允许从头表达HIV Env。感染的CEM-NKr-CCR5-LucR CD4 T细胞洗涤3次以去除游离病毒，以2 x 104个细胞/孔接种在白色96孔板中，并与7个浓度的gp120 XCD3
从gp120 x CD3 Duobody或PGT-121.60处理的孔的RLU测定 gp120 x CD3
100-((处理孔中HIV感染靶细胞的RLU/未处理孔中HIV感染靶细胞的RLU)*100)。
使用GraphPad Prism(La Jolla,CA)软件从通过三参数非线性回归拟合的剂量-反应曲线(公式1)获得杀伤的感染细胞的最大分数 (Emax)以及产生50％杀伤的浓度(IC50)。
公式1:
其中Y＝％杀伤,X＝抗体浓度,底部＝不存在抗体时的反应, 和顶部＝最大反应。
对于感染细胞杀伤表观Emax<10％的剂量响应曲线，IC50值报告为>100μg/mL，绝对值≤0％的Emax赋值为0％。
实施例10:HIV-感染的原代CD4 T细胞使用扁桃体来源的单核细胞的杀伤
cART抑制的、HIV感染受试者中潜伏HIV感染细胞的主要储库位于***中。在体外杀伤试验中使用从HIV-1血清阴性扁桃体分离的单核细胞作为效应细胞及HIV-1感染的原代CD4 T细胞作为靶细胞检查抗体利用淋巴样组织中存在的效应细胞的能力。由于无法获得扁桃体供体的自体PBMC，因此使用异源的原代CD4 T细胞作为靶细胞和PBMC效应细胞的来源。
表25和表26显示了来自单个供体的扁桃体来源的单核细胞 (TDMC)、来自两个供体的外周血单核细胞(PBMC)以及感染两种HIV-1病毒(CHO58和92US727)的靶细胞的结果。TDMC和PBMC 通过示例性的gp120 x CD3 Duobody和由变体1或变体2组成的 Duobody介导对HIV感染的CD4 T细胞的强烈杀伤，Emax和IC50 浓度范围对于TDMC分别为66％-82.6％和0.013-0.053μg/mL，且Emax和IC50浓度范围对于PBMC分别为62％-84％和0.001-0.024 ug/mL。相反，只有PBMC，而非TDMC，能够利用PGT121.60(或阴性对照Duobody，帕利珠单抗xCD3)来介导HIV感染的CD4 T 细胞的杀伤。
表25:使用扁桃体来源的和外周血来源的单核效应细胞杀伤的 HIV感染细胞的最大百分比。
表26:使用扁桃体来源的和外周血来源的单核效应细胞杀伤 HIV感染细胞的效力(IC50)。
方法
使用原代静止HIV感染的CD4+T细胞作为靶细胞及外周血来源的单核细胞和扁桃体来源的单核细胞作为效应细胞，在体外对gp120 X CD3
原代CD4+T细胞以1200×g用50-100ng p24/百万细胞的 spinfection进行感染2个小时，并在37℃下具有30U/mL IL-2(Roche 目录号11011456001)的RPMI培养基(补充10％FBS和1％青霉素/ 链霉素)中培养5天。静置5天以允许从头抗原表达后，将转染的 CD4+T细胞培养物洗涤3次以除去游离病毒，以2x 105细胞/孔接种在96孔板中，并在人血清IgG(终浓度5mg/mL)存在下与10倍系列稀释的7个浓度的gp120 X CD3
通过流式细胞术测定HIV感染的靶细胞的杀伤。共培养期结束时，将细胞用PBS洗涤2X，用100μL Live/Dead Aqua(在PBS中1/1000稀释)染色10分钟直到加入100μL FACS缓冲液(PBS+2％ FBS)使染料失活。然后用FACS缓冲液洗涤细胞，并与抗CD4-PE/Cy7 mAb(在FACS缓冲液中1/50稀释)孵育20分钟，然后用FACS缓冲液洗涤3次，并用100μL Cytofix/Cytoperm固定和渗透10分钟。然后将细胞用PermWash洗涤一次，并与抗p24-PE mAb在FACS缓冲液+10％PermWash中孵育25分钟。最后，将细胞用FACS缓冲液洗涤3次，重悬于120μLFACS缓冲液中，并在LSR Fortessa或X20 FACS(BD Biosciences，San Jose，CA)上获取流式细胞分析数据，并使用FlowJo软件(TreeStar)进行分析。
在通过PBMC和TDMC的原代感染CD4+T细胞的杀伤中，通过流式细胞分析采用了以下门控策略对HIV感染的靶细胞进行计数：淋巴细胞基于前向和侧向散射选择，和活淋巴细胞通过Live/Dead Aqua 阴性染色选择。然后选择代表接种的CD4+T细胞的PKH67阴性活淋巴细胞，并将HIV感染的细胞鉴定为p24 Gag+,CD4低(由于HIV介导的CD4下调)细胞。HIV感染百分率表示为HIV感染的接种(PKH67 阴性)CD4+T细胞(p24 Gag+,CD4低阳性)的百分比。
将PGT-121.60处理的孔中HIV感染靶细胞的百分比与未处理孔(仅用人血清IgG处理，每96孔板n＝2-10)中的HIV感染靶细胞的平均百分比进行比较。使用以下公式计算HIV感染靶细胞的杀伤百分比：
100-((处理孔中的％HIV感染靶细胞/未处理孔中的％HIV感染靶细胞)*100)。
使用GraphPad Prism(La Jolla，CA)软件，从通过三参数非线性回归(公式1)拟合的剂量-反应曲线获得被PGT-121.60杀伤的感染细胞的最大分数(Emax)和给出50％杀伤的浓度(IC50)。
公式1:
其中Y＝％杀伤,X＝抗体浓度,底部＝不存在抗体时的反应, 和顶部＝最大反应。
对于感染细胞杀伤表观Emax<40％的剂量反应曲线，IC50值报告为>10μg/mL，且绝对值≤0％的Emax赋值为0％。
实施例11:HIV感染的CD4 T细胞通过T细胞亚群的杀伤
为了研究哪些T细胞亚群能够介导gp120 x CD3 Duobody依赖的 HIV感染细胞杀伤，我们评估了分离的T细胞亚群，即记忆CD8 T 细胞、幼稚CD4 T细胞、记忆CD4 T细胞、效应记忆CD4 T细胞和γΔT细胞，介导HIV感染CD4 T细胞的杀伤的能力。
表27中显示的结果表明，所检查的所有T细胞亚群(即记忆CD8 T细胞、幼稚CD4 T细胞、记忆CD4 T细胞、效应物记忆CD4 T细胞和γΔT细胞)能够利用示例性gp120 x CD3gp120 x CD3
表27:通过照各种T细胞亚群的HIV感染细胞杀伤的Emax(％) 和效力(IC50)。
方法
使用实施例5中所述的通过PBMC效应细胞的感染细胞杀伤，对通过T细胞亚群的gp120 X CD3
表28:T细胞亚群分离试剂盒
实施例11:人血小板结合
为了评估与人血小板的结合，进行了基于流式细胞术的血小板结合测定并与PGT-121.60进行比较。从3位人类健康供体的全血制备富含血小板的血浆(PRP)样品，并用浓度为1000μg/ml或250μg/ml 的测试品进行处理。靶向单克隆抗体帕利珠单抗(Pali)及其衍生Duobody(Pali x CD3的RSV融合蛋白被用作非抗HIV Env对照抗体。
表29中显示的结果表明，在来自3个供体的样品中1000μg/ml PGT-121.60与人血小板结合的MFI相对于染色背景增加40-100倍，而gp120 X CD3 Duobody变体的MFI在相同样品中增加15-50倍。当在结合测定中测试品以250μg/ml测试时，血小板染色MFI与 PGT-121.60相比降低4-7倍，且对于变体降低1-3倍。非抗HIV Env 对照抗体Pali和Pali X CD3的MFI在两种测试浓度下均处于背景水平。与PGT-121.60相比，变体显示出较低的人血小板结合活性。 Duobody变体的平均结合MFI在1000μg/ml浓度下为PGT-121.60的 35-47％(表30)。
表29:相对于染色背景的人血小板结合MFI的倍数增加。
表30:gp120 X CD3 Duobody变体和PGT-121.60与人血小板的结合的比较
方法
从人全血样品中制备富血小板血浆(PRP)样品。简而言之，全血样品在室温下以170xg不刹车离心15分钟。离心后，从每个样品的顶层收集PRP，然后在改良的HT(mHT)缓冲液(10mM HEPES， 137mM NaCl，2.8mM KCl，1mM MgCl2、12mM NaHCO3、0.4mM Na2HPO4、0.35％BSA，5.5mM葡萄糖，pH 7.4)中稀释5倍。稀释的测试抗体(50μL)添加到等体积的PRP样品中，并在室温下孵育 45分钟。孵育结束时，加入等体积的BD FACS染色缓冲液(磷酸盐缓冲盐水，含2％胎牛血清)，并将测定板在室温下以2000xg离心5 分钟。吸出上清液，将洗涤的PRP样品重悬于mHT缓冲液中，并在 4℃下用PE抗CD61、FITC抗CD41和APC抗人IgG二抗染色30分钟。染色后，将PRP样品用BD FACS缓冲液洗涤并重悬于125μL BD FACS染色缓冲液中，并使用BD LSRFortessaTM细胞分析仪(BD Biosciences，San Jose，CA)和FlowJo软件(TreeStar，Ashland，OR) 通过流式细胞术进行分析。
将血小板群体定义为PE抗CD41和FITC抗CD61双重阳性FACS 事件。定量血小板群体的APC抗人IgG的平均荧光强度(MFI)值。然后计算每个测试品的MFI相对于染色背景(通过仅APC抗人IgG 二抗测定)的倍数增加。为了比较gp120 X CD3 Duobody变体与 PGT-121.60的血小板结合活性，计算了每个样品中1000μg/ml下每个Duobody变体相对于PGT-121.60的MFI百分比。
其他实施方案
尽管已经结合本发明的详细描述描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在所附权利要求的范围内。
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