阅读说明：本技术 靶向flt3的嵌合抗原受体 (Chimeric antigen receptor targeting FLT3 ) 是由 B.J.萨素 D.E.德特林 C.A.索默 Y.A.杨 M.M.哈姆策 于 2018-05-31 设计创作，主要内容包括：本文提供特异性结合于Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)的抗体；特异性结合于FLT3的嵌合抗原受体(CAR)；以及表达此类CAR的工程化免疫细胞(例如FLT3特异性CAR-T细胞)。本发明还提供所述抗体、CAR和工程化免疫细胞的制造。本发明还提供所述抗体、CAR和工程化免疫细胞例如用于治疗与表达FLT3的恶性细胞相关的病状(例如,癌症)的用途。(Provided herein are antibodies that specifically bind to Fms-like tyrosine kinase 3(FLT 3); a Chimeric Antigen Receptor (CAR) that specifically binds to FLT 3; and engineered immune cells expressing such CARs (e.g., FLT 3-specific CAR-T cells). The invention also provides for the manufacture of the antibodies, CARs, and engineered immune cells. The invention also provides uses of the antibodies, CARs, and engineered immune cells, for example, for treating a condition associated with a malignant cell that expresses FLT3 (e.g., cancer).)

靶向FLT3的嵌合抗原受体

相关申请的交叉参考

本申请案要求2017年6月2日提交的美国临时申请第62/514,634号的优先权，其内容以全文引用的方式并入本文中。

均公开FLT3特异性抗体的2017年6月2日提交的美国临时申请第62/514,574号；和2018年4月20日提交的美国临时申请第62/660,908号；以及2018年5月31日提交的标题为“对FLT3具有特异性的抗体和其用途”的PCT申请以全文引用的方式并入本文中。

序列表的参考

本申请经由EFS-Web电子申请并包括呈.txt格式的电子提交的序列表。所述.txt文档含有2018年5月24日创建的标题为“ALGN_010_01WO_SeqList_ST25.txt”且大小呈238KB的序列表。这一.txt文档中所含的序列表为本说明书的一部分并以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本文提供Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)特异性抗体；特异性结合于FLT3的嵌合抗原受体(CAR)(FLT3 CAR)；编码FLT3 CAR的聚核苷酸；以及包含FLT3特异性CAR的工程化免疫细胞(例如FLT3特异性CAR-T细胞)。本发明进一步涉及对免疫细胞进行工程化以表达FLT3特异性CAR的方法；以及使用FLT3特异性抗体和FLT3特异性CAR-T细胞来治疗与FLT3(例如，表达FLT3的恶性细胞)相关的病状的方法。

背景技术

显示经基因修饰以识别恶性疾病相关抗原的免疫细胞的过继转移有希望作为治疗癌症的新型方法(参见例如，Brenner等人,《免疫学新见(Current Opinion inImmunology)》,22(2):251-257(2010)；Rosenberg等人,《自然综述：癌症(Nature ReviewsCancer)》,8(4):299-308(2008))。T细胞可经基因修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，其为由抗原识别部分和T细胞活化域构成的一种融合蛋白(参见例如，Eshhar等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,90(2):720-724(1993)；和Sadelain等人,《免疫学新见(Curr.Opin.Immunol)》,21(2):215-223(2009))。

FLT3为急性骨髓性白血病(AML)靶抗原，在与健康细胞相比时，其过表达于AML患者胚细胞上，且表达于大多数患者细胞上(Carow等人,1996年2月2日《血液(Blood)》:87(3)；Birg等人1992年11月《血液》:80(10))。FLT3为AML患者中经常突变的基因，并且突变与不良预后相关(Abu-Duhier等人《英国血液学杂志(Br J Haematol.)》2000年10月；111(1):190-5；Yamamoto等人2001年4月15日；《血液》:97(8))。小分子FLT3抑制剂已在临床试验中显示出活性；然而，归因于获得性抗性，应答通常较为短暂。其它激酶抑制剂仅治疗一定百分比的表达FLT3的突变形式的患者，突显出对改进型疗法的迫切需要。

因此，需要对癌症，并且确切地说，涉及FLT3的异常表达的恶性疾病的替代性治疗。本文提供解决这一需要的方法和组合物。

发明内容

本文提供特异性结合于Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)的抗体或其抗原结合片段；特异性结合于FLT3的嵌合抗原受体(CAR)；以及表达所述CAR的工程化免疫细胞(例如FLT3特异性CAR-T细胞)。还提供所述抗体、CAR和免疫细胞的制造。进一步提供所述抗体、CAR和工程化免疫细胞例如用于治疗与表达FLT3的恶性细胞相关的病状(例如，癌症)的用途。在一个方面，本文提供特异性结合于FLT3的分离抗体，其中所述抗体包含重链可变(VH)区，其具有表2中所列的部分VH序列中的任一个；和/或轻链可变(VL)区，其具有表2中所列的部分VL序列中的任一个。

在另一态样中，本文提供一种特异性结合于FLT3的分离抗体，其中所述抗体包含(a)重链可变(VH)区，其包含表3中所列的互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3序列；和/或(b)轻链可变(VL)区，其包含表3中所列的CDR1、CDR2和CDR3序列。

本文还提供结合于FLT3的嵌合抗原受体(CAR)。已证明，T细胞中FLT3特异性CAR的表达会在与FLT3接触后有效地活化T细胞。本文所提供的FLT3特异性CAR结合人类FLT3并在与表达FLT3的细胞接触后展现细胞毒活性。

因此，在另一方面，本文提供一种FLT3特异性嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外配体结合域、第一跨膜域和胞内信号传导域，其中所述胞外域包含结合于FLT3的胞外域的单链可变片段(ScFv)。在一些实施例中，本文提供FLT3 CAR，其包含胞外配体结合域、第一跨膜域和胞内信号传导域，其中所述胞外域包含结合于FLT3靶向物的特定域的scFv，例如，结合于SEQ ID NO:199(域1)、SEQ ID NO:200(域2)、SEQ ID NO:201(域3)、SEQ ID NO:254(域2-3)、SEQ ID NO:202(域4)或SEQ ID NO:203(域5)、SEQ ID NO:254(域2-3)或SEQ ID NO:202(域4)。

在一些实施例中，FLT3特异性CAR包含包括ScFv的胞外域，其中所述ScFv结合于FLT3靶向物的域4(SEQ ID NO:202)。

在一些实施例中，FLT3特异性CAR包含包括ScFv的胞外域，其中所述ScFv结合于FLT3靶向物的域2(SEQ ID NO:200)。

FLT3特异性CAR的胞外域包含scFv，其中所述scFv包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，所述VH和VL区各自包含对FLT3具有特异性的三个互补决定区(CDR)。

在一些实施例中，VH区包含(i)VH互补决定区1(CDR1)，其具有SEQ ID NO:37、38、39、43、44、45、49、50、54、55、56、60、61、62、66、67、68、72、73、74、78、79、80、84、85、86、90、91、92、96、97、98、102、103、104、108、109、110、114、115、116、120、121、122、126、127、128、132、133、134、138、139、140、294、295、296、300、301、305、306、307、311、312、316、317或318中所示的氨基酸序列；(ii)VH互补决定区2(CDR2)，其具有SEQ ID NO:40、41、46、47、51、52、57、58、63、64、69、70、75、76、81、82、87、88、93、94、99、100、105、106、111、112、117、118、123、124、129、130、135、136、141、142、297、298、302、303、308、309、313、314、319、320或322中所示的氨基酸序列；和(iii)VH互补决定区3(CDR3)，其具有SEQ ID NO:42、48、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、299、304、310、315或321中所示的氨基酸序列；和/或VL区包含(i)VL互补决定区1(CDR1)，其具有SEQ ID NO:144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、323、326、328、331、336、338、340、343、345、348或350中所示的氨基酸序列；(ii)VL互补决定区2(CDR2)，其具有SEQID NO:145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、324、329、332、334、341或346中所示的氨基酸序列；和(iii)VL互补决定区3(CDR3)，其具有SEQ ID NO:146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、325、327、330、333、335、337、339、342、344、347或349中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，提供包含ScFv的FLT3特异性CAR，其中所述ScFv包含具有SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291或293中所示的序列的VH区。

在一些实施例中，提供包含ScFV的FLT3特异性CAR，其中所述scFv包含具有SEQ IDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290或292中所示的序列的VL区。

在一些实施例中，提供包含ScFV的FLT3特异性CAR，所述scFv包含VH区和VL区，其中所述VH区具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291或293中所示的序列；并且所述VL区具有SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290或292中所示的序列。

在一些实施例中，VH区包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291或293中所示的序列，或在未处于CDR中的残基中具有一个或若干个保守性氨基酸取代的其变异体；和/或VL区包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290或292中所示的氨基酸序列，或在未处于CDR中的氨基酸中具有一个或若干个氨基酸取代的其变异体。

在一些实施例中，VH区包含VH CDR1，其包含SEQ ID NO:90、91或92中所示的氨基酸序列；VH CDR2，其包含SEQ ID NO:93或94中所示的氨基酸序列；和VH CDR3，其包含SEQID NO:95中所示的氨基酸序列；并且轻链可变(VL)区包含以下CDR：VL CDR1，其包含SEQ IDNO:171中所示的氨基酸序列；VL CDR2，其包含SEQ ID NO:172中所示的氨基酸序列；和VLCDR3，其包含SEQ ID NO:173中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，VH区包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列，并且VL区包含SEQID NO:19中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，VH区包含VH CDR1，其包含SEQ ID NO:43、44或45中所示的氨基酸序列；VH CDR2，其包含SEQ ID NO:46或47中所示的氨基酸序列；和VH CDR3，其包含SEQID NO:48中所示的氨基酸序列；并且轻链可变(VL)区包含以下CDR：VL CDR1，其包含SEQ IDNO:147中所示的氨基酸序列；VL CDR2，其包含SEQ ID NO:148中所示的氨基酸序列；和VLCDR3，其包含SEQ ID NO:149中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，VH区包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列，并且VL区包含SEQID NO:3中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，VH区包含VH CDR1，其包含SEQ ID NO:49、44或50中所示的氨基酸序列；VH CDR2，其包含SEQ ID NO:51或52中所示的氨基酸序列；和VH CDR3，其包含SEQID NO:53中所示的氨基酸序列；并且轻链可变(VL)区包含以下CDR：VL CDR1，其包含SEQ IDNO:150中所示的氨基酸序列；VL CDR2，其包含SEQ ID NO:151中所示的氨基酸序列；和VLCDR3，其包含SEQ ID NO:152中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，VH区包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列，并且VL区包含SEQID NO:5中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，VH区包含VH CDR1，其包含SEQ ID NO:60、61或62中所示的氨基酸序列；VH CDR2，其包含SEQ ID NO:63或64中所示的氨基酸序列；和VH CDR3，其包含SEQID NO:65中所示的氨基酸序列；并且轻链可变(VL)区包含以下CDR：VL CDR1，其包含SEQ IDNO:156中所示的氨基酸序列；VL CDR2，其包含SEQ ID NO:157中所示的氨基酸序列；和VLCDR3，其包含SEQ ID NO:158中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，VH区包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列，并且VL区包含SEQID NO:9中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，每个CDR根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义与Chothia定义的组合、AbM定义或CDR的接触定义(contact definition)来定义。

在一些实施例中，胞内信号传导域包含CD3ζ信号传导域。在一些实施例中，胞内信号传导域包含4-1BB域。在一些实施例中，FLT3特异性CAR包含第二胞内信号传导域。在一些实施例中，第二胞内信号传导域包含4-1BB域。

在一些实施例中，本文中所公开的FLT3特异性CAR可包含处于胞外配体结合域和第一跨膜域之间的茎域(stalk domain)。在一些实施例中，茎域选自由以下组成的群组：CD8α铰链、IgG1铰链和FcγRIIIα铰链。在一些实施例中，茎域为人类CD8α铰链、人类IgG1铰链或人类FcγRIIIα铰链。

在一些实施例中，本文中所公开的FLT3特异性CAR可包含对一个或多个单克隆抗体具有特异性的一个或多个表位。在一些实施例中，对单克隆抗体具有特异性的表位为CD20表位。在一些实施例中，CD20表位包含SEQ ID NO:229或SEQ ID NO:230中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，FLT3特异性CAR包含SEQ ID NO:235、236、237或242中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，FLT3特异性CAR包含SEQ ID NO:235中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，FLT3特异性CAR包含SEQ ID NO:236中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，第一跨膜域包含CD8α链跨膜域。

在一些实施例中，FLT3特异性CAR可包含对FLT3不具有特异性的另一胞外配体结合域。

在一些实施例中，一个或多个胞外配体结合域、第一跨膜域和一个或多个胞内信号传导域处于单一多肽上。

在一些实施例中，CAR可包含第二跨膜域，其中第一跨膜域和一个或多个胞外配体结合域处于第一多肽上，并且其中所述第二跨膜域和一个或多个胞内信号传导域处于第二多肽上。在一个示例性实施例中，第一跨膜域包含来自高亲和力IgE受体(FcεRI)的α链的跨膜域，并且第二跨膜域包含来自FcεRI的γ或β链的跨膜域。

在一些实施例中，所述CAR可包含第三多肽，所述多肽包含与来自共刺激分子的胞内信号传导域融合的第三跨膜域，其中所述第三跨膜域包含来自FcεRI的γ或β链的跨膜域。

在另一方面，本文提供一种分离聚核苷酸，其包含编码本文所述的FLT3特异性CAR的核酸序列。

在另一方面，本文提供一种表达载体，其包含编码本文所述的FLT3特异性CAR的聚核苷酸。

在另一方面，本文提供一种工程化免疫细胞，其在其细胞表面膜处表达本文所述的FLT3特异性CAR。在一些实施例中，工程化免疫细胞可包含对FLT3不具有特异性的另一CAR。在一些实施例中，工程化免疫细胞可包含编码***多肽的聚核苷酸。在一些实施例中，***多肽为RQR8。

在一些实施例中，工程化免疫细胞衍生自炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助T淋巴细胞。

在一些实施例中，工程化免疫细胞可包含中断一个或多个内源基因，其中所述内源基因编码TCRα、TCRβ、CD52、糖皮质激素受体(GR)、脱氧胞苷激酶(dCK)或免疫检查点蛋白，如程序性死亡-1(PD-1)。

在一些实施例中，工程化免疫细胞由健康供体获得。在一些实施例中，工程化免疫细胞由罹患疾病或病症的个体获得。

在另一方面，本文提供一种供用作药剂的工程化免疫细胞，其在其细胞表面膜处表达本文所述的FLT3特异性CAR。在另一方面，本文提供一种供用作药剂的FLT3特异性抗体。在一些实施例中，包含表达FLT3特异性CAR的免疫细胞或FLT3特异性抗体的药剂供用于FLT3相关疾病或病症的治疗中。在一个实施例中，FLT3相关疾病或病症为造血源癌症，如淋巴瘤或白血病。在一些实施例中，癌症选自由以下组成的群组：多发性骨髓瘤、恶性浆细胞赘瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)、结节性淋巴细胞为主型霍奇金氏淋巴瘤、卡勒氏病(Kahler’s disease)和骨髓瘤病、浆细胞白血病、浆细胞瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性骨髓白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性骨髓白血病(CML)、滤泡性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、边缘区淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、前体B成淋巴细胞性淋巴瘤、骨髓白血病、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、小细胞淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、原发纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、结内边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、富T细胞/组织细胞大B细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性皮肤弥漫性大B细胞淋巴瘤(腿型)、老年人EBV阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤、与炎症相关的弥漫性大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、出现于HHV8相关多中心型卡斯尔曼病(multicentricCastleman disease)中的大B细胞淋巴瘤、具有介于弥漫性大B细胞淋巴瘤与伯基特淋巴瘤之间的特征的未分类的B细胞淋巴瘤、具有介于弥漫性大B细胞淋巴瘤和经典霍奇金氏淋巴瘤之间的特征的未分类的B细胞淋巴瘤以及其它造血细胞相关癌症，例如，ALL或AML。

在一个方面，本文提供包含表达本文所述的FLT特异性CAR的工程化免疫细胞的细胞群，其中(ii)所述细胞群包含百分比大于20％、30％或40％的干细胞记忆和中心记忆细胞，和/或(iii)所述细胞群实现百分比大于10％、20％、30％或40％的表达FLT3细胞的裂解。

在另一方面，本文提供一种对表达本文所述的FLT3特异性CAR中的任一种的免疫细胞进行工程化的方法，所述方法包含：提供免疫细胞；并将编码所述FLT3特异性CAR的至少一种聚核苷酸引入所述细胞中；由此使所述免疫细胞表达所述FLT3特异性CAR。

在一些实施例中，所述方法包含提供免疫细胞；将编码所述FLT3特异性CAR的至少一种聚核苷酸引入所述细胞中；并引入编码对FLT3不具有特异性的CAR的至少一种聚核苷酸。

在另一方面，本文提供一种治疗患有FLT3相关疾病或病症的受试者的方法，所述方法包含：提供在表面表达如本文所述的FLT3特异性CAR的免疫细胞；并向所述受试者给予所述免疫细胞。本发明还提供治疗患有FLT3相关疾病或病症的受试者的方法，所述方法包含提供本文所述的FLT3特异性抗体，并向所述受试者给予所述抗体。

在一些实施例中，本文提供一种医药组合物，其包含表达如本文所述的FLT3特异性CAR的工程化免疫细胞。在其它实施例中，本发明提供以下医药组合物，其包含本文所述的FLT3特异性抗体中的任一种。

在另一方面，本文提供一种治疗受试者中的与表达FLT3的恶性细胞相关的病状的方法，其包含向有需要的受试者给予有效量的医药组合物，所述医药组合物包含如本文所述的工程化免疫细胞或如本文所述的FLT3特异性抗体。在一些实施例中，所述病状为癌症。在一些实施例中，癌症为造血源癌症，如淋巴瘤或白血病。在一些实施例中，癌症选自由以下组成的群组：多发性骨髓瘤、恶性浆细胞赘瘤、霍奇金氏淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主型霍奇金氏淋巴瘤、卡勒氏病和骨髓瘤病、浆细胞白血病、浆细胞瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性骨髓白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性骨髓白血病(CML)、滤泡性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、前体B成淋巴细胞性淋巴瘤、骨髓白血病、华氏巨球蛋白血症、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、小细胞淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、原发纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、结内边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、富T细胞/组织细胞大B细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性皮肤弥漫性大B细胞淋巴瘤(腿型)、老年人EBV阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤、与炎症相关的弥漫性大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、出现于HHV8相关多中心型卡斯尔曼病中的大B细胞淋巴瘤、具有介于弥漫性大B细胞淋巴瘤与伯基特淋巴瘤之间的特征的未分类的B细胞淋巴瘤、具有介于弥漫性大B细胞淋巴瘤和经典霍奇金氏淋巴瘤之间的特征的未分类的B细胞淋巴瘤以及其它造血细胞相关癌症，例如，ALL或AML。

在另一方面，本文提供一种抑制具有表达FLT3的恶性细胞的受试者的肿瘤生长或进展的方法，其包含向有需要的受试者给予有效量的医药组合物，所述医药组合物包含如本文所述的工程化免疫细胞或如本文所述的FLT3特异性抗体向受试者。

在另一方面，本文提供一种抑制受试者的表达FLT3的恶性细胞的转移的方法，其包含向有需要的受试者给予有效量的医药组合物，所述医药组合物包含如本文所述的工程化免疫细胞或如本文所述的FLT3特异性抗体向受试者。

在另一方面，本文提供一种诱导具有表达FLT3的恶性细胞的受试者的肿瘤消退的方法，其包含向有需要的受试者给予有效量的医药组合物，所述医药组合物包含如本文所述的工程化免疫细胞或如本文所述的FLT3特异性抗体向受试者。

在一些实施例中，以上方法中的任一种进一步包含给予一种或多种其它治疗剂，例如单克隆抗体和/或化学治疗剂。在一些实施例中，单克隆抗体可为例如结合于检查点抑制剂的抗体，例如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。在一些实施例中，以上方法中的任一种进一步包含向受试者给予受体酪氨酸激酶抑制剂、mTOR抑制剂、表观遗传调节剂、蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂(如来那度胺(lenalidomide))、刺猬抑制剂(Hedgehog inhibitor)或异柠檬酸脱氢酶(IDH)抑制剂。

附图说明

图1显示代表性FACS图，其展现相对于未经转导的对照，伴随P3A1 CAR构建体的活化T细胞的高效转导；以及呈表达CAR的T细胞的百分比和平均荧光强度(MFI)的所有构建体的转导效率。

图2显示通过流式细胞术评定的伴随多种CAR构建体转导的T细胞中的活化标记物CD25和4-1BB的表达。

图3显示如通过CD62L和/或CD45RO标记物的表达的流式细胞术分析所测定，培养结束时的CAR-T细胞的表型。

图4显示长期杀伤测定的总体实验设计，以及在第6天测量呈扩增倍数和细胞毒活性(裂解百分比)的不同CAR-T细胞对重复暴露于靶细胞的应答。

图5显示使用人类AML的原位小鼠模型的两种剂量下的表达P3A1或P3E10构建体的CAR-T细胞的抗肿瘤活性。显示不同时间点处的量化为总通量(光子数/秒)的生物发光信号。

图6显示在细胞表面处表达包含CD20表位的FLT3特异性CAR的T细胞对由抗CD20抗体利妥昔单抗(rituximab)诱发的补体依赖细胞毒性(CDC)的敏感性。

图7显示用表达CD20表位的抗小鼠FLT3 CAR T细胞处理并随后给予利妥昔单抗的小鼠中的内源性骨髓祖细胞的恢复。

具体实施方式

在一个方面中，本文中所公开的本发明提供嵌合抗原受体(CAR)和包含特异性结合于FLT3(例如，人类FLT3)的CAR的免疫细胞(例如CAR-T细胞)。本发明还提供编码这些CAR的聚核苷酸；包含表达这些CAR的免疫细胞的组合物；以及制造和使用这些CAR和表达CAR的免疫细胞的方法。本发明还提供使用如本文所述的FLT3特异性CAR和表达这些CAR的免疫细胞治疗受试者的与经FLT3介导的病理学相关的病状，如由表达FLT3的恶性细胞介导的癌症的方法。

在一个方面，本文中所公开的本发明提供特异性结合于FLT3(例如，人类FLT3)的抗体。本发明还提供包含这些抗体的组合物和使用这些抗体的方法。举例而言，本文提供使用这些抗体治疗受试者的与经FLT3介导的病理学相关的病状，如癌症的方法。

一般技术

除非另外指明，否则本发明的实践将采用在所属领域技术范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在以下文献中得到充分解释，如《分子克隆：实验指南(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》,第二版(Sambrook等人，1989)冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编,1984)；《(分子生物学方法(Methods in Molecular Biology))》,胡马纳出版社(Humana Press)；《细胞生物学：实验室笔记(Cell Biology:A Laboratory Notebook)》(J.E.Cellis编,1998)学术出版社(Academic Press)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编,1987)；《细胞和组织培养物的介绍(Introduction to Cell and Tissue Culture)》(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)普雷纳姆出版社(Plenum Press)；《细胞和组织培养物：实验室程序(Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures)》(A.Doyle、J.B.Griffiths和D.G.Newell编,1993-1998)约翰威立父子出版公司(J.Wiley and Sons)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社公司)；《实验免疫学手册(Handbook ofExperimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987)；《现代分子生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编,1987)；《PCR：聚合酶链反应(PCR:The Polymerase ChainReaction)》,(Mullis等人编,1994)；《免疫学最新方案(Current Protocols inImmunology)》(J.E.Coligan等人编,1991)；《精编分子生物学方案(Short Protocols inMolecular Biology)》(约翰威立父子出版公司,1999)；《免疫生物学(Immunobiology)》(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；《抗体(Antibodies)》(P.Finch,1997)；《抗体：实用方法(Antibodies:a practical approach)》(D.Catty.编,IRL出版社,1988-1989)；《单克隆抗体：实用方法(Monoclonal antibodies:a practical approach)》(P.Shepherd和C.Dean编,牛津大学出版社(Oxford University Press),2000)；《使用抗体：实验室手册(Usingantibodies:a laboratory manual)》(E.Harlow和D.Lane(冷泉港实验室出版社,1999)；《抗体(The Antibodies)》(M.Zanetti和J.D.Capra编,哈伍德学术出版社(HarwoodAcademic Publishers),1995)。

定义

如本文所用，术语“胞外配体结合域”是指能够结合配体或能够与细胞表面分子相互作用的多肽。举例而言，胞外配体结合域可经选择以识别充当与特定疾病病况相关的靶细胞上的细胞表面标记物的配体。

术语“茎域”或“铰链域”在本文中可互换使用，其是指用以连接跨膜域与胞外配体结合域的任何多肽。确切地说，茎域用于为胞外配体结合域提供更多的柔性和可接近性。

术语“胞内信号传导域”是指转导效应信号功能信号并引导细胞执行特有功能的蛋白质的部分。

如本文所用，“共刺激分子”是指与共刺激配体特异性结合，从而介导通过细胞的共刺激应答，如(但不限于)增殖的免疫细胞(例如T细胞)上的同源结合配偶体。共刺激分子包括(但不限于)MHC I类分子、BTLA和铎(Toll)配体受体。共刺激分子的实例包括CD27、CD28、CD8、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等。

“共刺激配体”是指特异性结合T细胞上的同源共刺激信号分子，从而提供除通过例如结合TCR/CD3复合物与负载肽的MHC分子提供的主要信号之外介导T细胞应答(包括(但不限于)增殖活化、分化等)的信号的抗原呈递细胞上的分子。共刺激配体可包括(但不限于)CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导的共刺激配体(ICOS-L)、胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、结合铎配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体还尤其涵盖与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的抗体，如(但不限于)CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体。

“抗体”为能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合于靶向物，如碳水化合物、聚核苷酸、脂质、多肽等的免疫球蛋白分子。如本文所用，所述术语不仅涵盖完整多克隆或单克隆抗体，并且还涵盖其片段(如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv)、单链(scFv)和域抗体(包括例如鲨鱼和骆抗体)，和包含抗体的融合蛋白，以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。抗体包括任何类别的抗体，如IgG、IgA、IgE、IgD或IgM(或其子类)，并且抗体不必属于任何特定类别。取决于其重链的恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可指配于不同类别。存在五种主要的免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，并且这些类别中有几类可以进一步分成子类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同的免疫球蛋白类别的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ及μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构及三维构造为熟知的。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部分”是指完整抗体的保持特异性结合于给定抗原(例如，FLT3)的能力的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可由完整抗体的片段执行。术语抗体的“抗原结合片段”中所涵盖的结合片段的实例包括Fab；Fab'；F(ab')₂；由VH和CH1域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH域组成的Fv片段；单域抗体(dAb)片段(Ward等人,《自然(Nature)》341:544-546,1989)和分离互补决定区(CDR)。

“特异性结合”于靶向物(例如，FLT3蛋白)的抗体、抗原结合片段、抗体结合物或多肽为所属领域中很好理解的术语，并且测定所述特异性结合的方法也为所属领域中熟知的。如果分子与特定细胞或物质的反应或缔合比其与替代性细胞或物质更频繁、更快速，持续时间更长和/或亲和力更大，那么称其展现“特异性结合”。如果抗体与靶向物的结合比其与其它物质的结合亲和性、亲合力更大、更容易和/或持续时间更长，那么抗体“特异性结合”于靶向物。举例来说，“特异性结合”于FLT3表位的抗体为一种与这一FLT3表位的结合比其与其它FLT3表位或非FLT3表位的结合亲和性、亲合力更大、更容易及/或持续时间更长的抗体。通过阅读此定义还应理解，例如特异结合于第一靶向物的抗体(或部分或表位)可或可未特异性结合于第二靶向物。因此，“特异性结合”未必要求(尽管其可包括)排他性的结合。一般来讲，但不一定，提及结合意指特异性结合。

抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，其呈单独或组合形式。如所属领域中已知，重链和轻链的可变区各由四个框架区(FR)组成，所述四个框架区通过三个又称为高变区的互补决定区(CDR)连接。每条链中的CDR通过FR紧密地保持在一起，并且与来自另一条链的CDR一起促进形成抗体的抗原结合位点。关于CDR的确定，存在至少两种技术：(1)基于交叉物种序列变异性的方法(即，Kabat等人《免疫学关注的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,(第5版,1991,马里兰州贝塞斯达美国国家卫生研究院(National Institutes of Health,Bethesda MD)))；和(2)基于抗原-抗体复合物的结晶学研究的方法(Al-Lazikani等人,1997,《分子生物学杂志(J.Molec.Biol.)》273:927-948)。如本文所用，CDR可指通过任一方法或通过两种方法的组合定义的CDR。

可变域的“CDR”为根据Kabat、Chothia、Kabat与Chothia的组合、AbM、接触的定义和/或构型定义或所属领域中熟知的CDR测定的任何方法鉴别的可变区中的氨基酸残基。抗体CDR可鉴别为高变区，其最初由Kabat等人定义。参加例如，Kabat等人,1992,《免疫学关注的蛋白质的序列》,第5版,美国国家卫生研究院公共卫生服务部,华盛顿D.C.。CDR的位置还可鉴别为结构性环结构，其最初由科西亚等人描述。参加例如，Chothia等人,《自然》342:877-883,1989。CDR鉴别的其它方法包括“AbM定义”，其为Kabat与Chothia之间的折衷方法，并使用牛津分子AbM抗体建模软件(Oxford Molecular’s AbM antibody modelingsoftware)(现为)衍生；或基于所观察到的抗原接触的CDR的“接触定义”，其阐述于MacCallum等人,《分子生物学杂志》,262:732-745,1996中。在本文中称为CDR的“构型定义”的另一方法中，CDR的位置可鉴别为为抗原结合提供焓贡献的残基。参加例如，Makabe等人,《生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)》,283:1156-1166,2008，另外，其它CDR界限定义可以不精确地遵循以上方法之一，但仍将与Kabat CDR的至少一部分重叠，但其可根据特定残基或残基群组或甚至整个CDR不会显著影响抗原结合的预测或实验发现缩短或伸长。如本文所用，CDR可指由所属领域中已知的任何方法(包括方法的组合)定义的CDR。本文所用的方法可利用根据这些方法中的任一种定义的CDR。对于含有多于一个CDR的任何给定实施例，CDR可根据Kabat、Chothia、延伸、AbM、接触和/或构型定义中的任一种定义。

如本文所用，“单克隆抗体”是指自大体上均质的抗体群获得的抗体，即构成所述群的别抗体除了可以少量存在的可能天然存在的突变之外为相同的。单克隆抗体针对单一抗原位点具有高度特异性。此外，相对于通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表示如从大体上均质的抗体群获得的抗体的特征，并且不视为需要通过任何特定方法产生抗体。举例而言，根据本发明使用的单克隆抗体可通过由Kohler及Milstein,1975,《自然》256:495首先描述的融合瘤方法制得，或可通过如美国专利第4,816,567号中所述的重组DNA方法制得。单克隆抗体还可从使用例如McCafferty等人,1990,《自然》348:552-554中所述的技术产生的噬菌体库分离。

如本文所用，“人类化”抗体是指非人类(例如鼠类)抗体的形式，其为含有衍生自非人类免疫球蛋白的极小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)。在一个方面，人类化抗体为人类免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自接受体的互补决定区(CDR)的残基经具有所需特异性、亲和力和能力的非人类物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基置换。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应非人类残基置换。此外，人类化抗体可包含未发现于接受体抗体或输入的CDR或框架序列中，但被包括以进一步改进和优化抗体性能的残基。一般来说，人类化抗体将包含大体上所有的至少一个并且通常两个可变域，其中所有或大体上所有的CDR区对应于非人类免疫球蛋白的CDR区并且所有或大体上所有的FR区为人类免疫球蛋白共有序列的FR区。人类化抗体最优还将包含免疫球蛋白恒定区或域(Fc)的至少一部分，通常是人类免疫球蛋白的至少一部分。具有如WO 99/58572中所述修饰的Fc区的抗体为优选的。人类化抗体的其它形式具有一个或多个CDR(CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2或CDR H3)，其相对于初始抗体变化，又称为“衍生自”来自初始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。

如本文所用，“人类抗体”意指氨基酸序列对应于由人类产生的抗体的氨基酸序列，和/或已使用所属领域的技术人员已知的或本文中所公开的制造人类抗体的技术中的任一种制造的抗体。人类抗体的这一定义包括包含至少一个人类重链多肽或至少一个人类轻链多肽的抗体。一个此类实例为包含鼠类轻链和人类重链多肽的抗体。所述抗体可以使用所属领域中已知的各种技术产生。在一个实施例中，人类抗体选自噬菌体库，其中所述噬菌体库表达人类抗体(Vaughan等人,《自然-生物技术(Nature Biotechnology)》,14:309-314,1996；Sheets等人,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)(美国)95:6157-6162,1998；Hoogenboom和Winter,《分子生物学杂志》,227:381,1991；Marks等人,《分子生物学杂志》,222:581,1991)。人类抗体也可通过其中人类免疫球蛋白基因座已以转基因方式引入而代替内源性基因座的动物的免疫作用制得，例如内源性免疫球蛋白基因已部分或完全地失活的小鼠。这一方法描述于美国专利第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号和第5,661,016号中。或者，人类抗体可通过使人类B淋巴细胞永生化来制备，其产生针对靶抗原的抗体(所述B淋巴细胞可从个体或从cDNA的单细胞克隆回收或可已体外免疫)。参加例如，Cole等人《单克隆抗体和癌症疗法(MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy)》,Alan R.Liss,第77页,1985；Boerner等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》,147(1):86-95,1991；和美国专利第5,750,373号。

术语“嵌合抗体”意指其中可变区序列衍生自一种物种并且恒定区序列衍生自另一物种的抗体，如其中可变区序列衍生自小鼠抗体并且恒定区序列衍生自人类抗体的抗体。

“单价抗体”每分子(例如，IgG或Fab)包含一个抗原结合位点。在一些情况下，单价抗体可具有多于一个抗原结合位点，但所述结合位点来自不同抗原。

“二价抗体”每分子(例如，IgG)包含两个抗原结合位点。在一些情况下，两个结合位点具有相同的抗原特异性。然而，二价抗体可为双特异性的。

本发明抗体可使用所属领域中熟知的技术，例如重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或所述的组合或所属领域中容易知晓的其它技术产生(参见例如Jayasena,S.D.,《临床化学(Clin.Chem.)》,45:1628-50,1999和Fellouse,F.A.等人,《分子生物学杂志》,373(4):924-40,2007)。

如所属领域中已知，如在本文中可互换使用的“聚核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的链并包括DNA和RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶并入链中的任何底物。聚核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和其类似物。如果存在，那么可在链组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可以间杂有非核苷酸组分。可以在聚合后如通过与标记组分结合而进一步修饰聚核苷酸。其它类型的修饰包括例如“盖”，一个或多个天然存在的核苷酸由类似物取代；核苷酸间修饰，如具有不带电键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和具有带电键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰，含有侧接部分、如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰，具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰，含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的修饰，含有烷基化剂的修饰，具有经过修饰的键(例如α异头核酸等)的修饰，以及聚核苷酸的未经修饰形式。此外，通常存在于糖中的任何羟基可例如被膦酸酯基、磷酸酯基置换，被标准保护基保护，或活化以制备与另外核苷酸的另外键联，或可结合于固体支撑物。5'和3'末端OH可为经磷酸化或经1至20个碳原子的胺或有机封端基团部分而取代。其它羟基也可以衍生成标准保护基。聚核苷酸还可以含有所属领域中通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟基-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-或β-异头糖、差向异构糖(如***糖、木糖或来苏糖)、哌喃醣、呋喃糖、景天庚糖、非环状类似物和无碱基核苷类似物(如甲基核糖苷)。一个或多个磷酸二酯键可被替代性连接基团置换。这些替代性连接基团包括(但不限于)，其中磷酸酯被P(O)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酸酯”)、(O)NR₂(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH₂(“甲缩醛”)置换的实施例，其中每个R或R'独立地为H或经取代或未经取代的烷基(1-20C)，其任选地含有醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳醛基。聚核苷酸中所有的键不需要都一致。前面描述适用于本文提及的所有聚核苷酸，包括RNA和DNA。

如所属领域中已知，抗体的“恒定区”是指抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区，其呈单独或组合形式。

如本文所用，“大体上纯”是指纯度为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或甚至至少99％(亦即，不含污染物)的物质。

“宿主细胞”包括可为或已为供并入聚核苷酸***物的一种或多种载体的接受体的个别细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单一宿主细胞的子代，并且子代可能由于自然、偶然或故意的突变而未必与初始母体细胞完全相同(在形态或基因组DNA互补序列方面)。宿主细胞包括用本发明的一种或多种聚核苷酸体内转染的细胞。

如所属领域中已知，术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区。“Fc区”可以是天然序列Fc区或变异Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的界限可有所变化，但人类IgG重链Fc区通常界定为从Cys226位置或从Pro230处的氨基酸残基伸延到其羧基末端。残基在Fc区中的编号是Kabat中的EU索引的编号。Kabat等人,《免疫学关注的蛋白质的序列》第5版，马里兰州贝塞斯达美国国家卫生研究院公共卫生服务部,1991。免疫球蛋白的Fc区一般包含两个恒定区，CH2和CH3。

如所属领域中所用，“Fc受体”和“FcR”描述结合于抗体的Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人类FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII子类的受体，包括这些受体的等位基因变异体和交替剪接形式在内的FcR。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，两者具有相似的氨基酸序列，主要是在其细胞质域上不同。FcR综述于Ravetch和Kinet,《免疫学年鉴(Ann.Rev.Immunol.)》,9:457-92,1991；Capel等人,《免疫方法(Immunomethods)》,4:25-34,1994；和de Haas等人,《实验室与临床医学杂志(J.Lab.Clin.Med.)》,126:330-41,1995中。“FcR”还包括新生儿受体，FcRn，其负责将母体IgG传输到胎儿(Guyer等人,《免疫学杂志》,117:587,1976；和Kim等人,《免疫学杂志》,24:249,1994)。

如本文所用，关于抗体，术语“竞争”意指第一抗体或其抗原结合片段(或部分)以与第二抗体或其抗原结合部分的结合足够相似的方式结合于表位，使得在第二抗体存在下，与不存在第二抗体下的第一抗体的结合相比，第一抗体与其同源表位结合的结果可检测地降低。其中第二抗体与其表位的结合在第一抗体存在下也可侦测地降低的替代方案可(但不一定)如此。即，第一抗体可抑制第二抗体与其表位的结合，而第二抗体无需抑制第一抗体与其对应表位的结合。然而，在每种抗体可侦测地抑制另一抗体与其同源表位或配体的结合的情况下，无论程度是否相同、更高或更小，均称所述抗体彼此“交叉竞争”结合其一个或多个对应表位。竞争和交叉竞争抗体均由本发明所涵盖。无关于发生此类竞争或交叉竞争的机制(例如，位阻、构型变化或结合于共同表位或其部分)熟练技术人员将基于本文中提供的传授内容了解，此类竞争和/或交叉竞争抗体均被涵盖并可适用于本文中所公开的方法。

如本文所用，“自体”意指用于治疗患者的细胞、细胞系或细胞群源自所述患者。

如本文所用，“同种异体”意指用于治疗患者的细胞或细胞群并非源自所述患者而是源自供体。

如本文所用，“治疗”是一种用于获得有益或所期望的临床结果的方法。出于本发明目的，有益或所期望的临床结果包括(但不限于)以下中的一种或多种：减轻赘生性或癌细胞的增殖(或对其加以破坏)；抑制赘生性细胞转移；缩小或降低表达FLT3的肿瘤的尺寸；缓解FLT3相关疾病(例如，癌症)；减少由FLT3相关疾病(例如，癌症)产生的症状；增加患有FLT3相关疾病(例如，癌症)的患者的生活质量；降低治疗FLT3相关疾病(例如，癌症)所需的其它药疗的剂量；延迟FLT3相关疾病(例如，癌症)的进展；治愈FLT3相关疾病(例如，癌症)；和/或延长患有FLT3相关疾病(例如，癌症)的患者的存活期。

“减轻”意指相较于未给予FLT3特异性CAR或FLT3特异性CAR-T细胞，减少或改善一种或多种症状。“减轻”还包括缩短或减少症状的持续时间。

如本文所用，药物、化合物或医药组合物的“有效剂量”或“有效量”为足以影响任何一种或多种有益或所期望的结果的量。对于预防性用途，有益或所期望的结果包括消除或减少风险；减轻严重程度；或延迟疾病发作，包括所述疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、疾病罹患期间存在的其併发症和中间病理表型。对于治疗用途，有益或所期望的结果包括包括以下临床结果，如减少多种FLT3相关疾病或病状(如多发性骨髓瘤)的一种或多种症状的发生或对其加以减轻；降低治疗所述疾病所需的其它药疗的剂量；促进另一药疗的作用；和/或延迟患者的FLT3相关疾病的进展。有效剂量可以在一次或多次给药中给予。出于本发明的目的，药物、化合物或医药组合物的有效剂量为足以直接或间接实现预防性或治疗性治疗的量。如临床情形下所理解，药物、化合物或医药组合物的有效剂量可或可不与另一药物、化合物或医药组合物结合实现。因此，在给予一种或多种治疗剂的情形下可以考虑“有效剂量”，并且如果结合一种或多种其它药剂可以实现或实现了令人期望的结果，那么可以将单种药剂视为以有效量给予。

“个体”、“患者”或“受试者”在本文中可互换使用并为哺乳动物。哺乳动物包括(但不限于)人类、猴、猪、其它耕畜、竞技动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、啮齿动物，包括小鼠、大鼠、天竺鼠等。受试者为哺乳动物并在本文中可互换使用。在一些实施例中，受试者为人类。在一些实施例中，受试者为非人类灵长类动物。在一些实施例中，受试者为人类或猴，例如，食蟹猕猴。

如本文所用，“载体”意指构建体，其能够递送,并且在一些实施例中，表达宿主细胞中的一种或多种相关基因或序列。载体的实例包括(但不限于)病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘质体或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体、囊封在脂质体中的DNA或RNA表达载体和某些真核细胞，如生产细胞。

如本文所用，“表达控制序列”意指引导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以为启动子，如组成性或诱导性启动子，或强化子。表达控制序列可操作地连接于有待转录的核酸序列。

如本文所用，“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括当与活性成分合并时，使所述成分保持生物活性并不与受试者的免疫系统反应的任何物质。实例包括(但不限于)标准医药载体中的任一种，如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(如油/水乳液)和不同类型的润湿剂。用于气雾或肠胃外给药的示例性稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)或普通(0.9％)生理盐水。包含此类载体的组合物通过熟知常规方法调配(参见例如《雷明顿医药科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)》,第18版,A.Gennaro编,宾夕法尼亚州伊斯顿马克出版公司(Mack Publishing Co.,Easton,PA),1990；和《雷明顿：科学和药学实践(Remington,The Science and Practice of Pharmacy)》第21版马克出版公司,2005)。

如本文所用，术语“k_on”是指CAR的抗体或ScFv与抗原缔合的速率常数。

如本文所用，术语“k_off”是指CAR的抗体或ScFv从抗体/抗原复合物解离的速率常数。

如本文所用，术语“K_D”是指抗体-抗原相互作用或ScFv-抗原相互作用的平衡解离常数。

本文中提到“约”一定值或参数包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施例。举例来说，提到“约X”的描述包括“X”的描述。数字范围包括定义范围的数字。

应理解，不管在何处以语言“包含”在本文中描述实施例，还提供关于“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的另外类似实施例。

在按照马库什群组(Markush group)或替代方案的其它分组描述本发明的方面或实施例的情况下，本发明不仅涵盖整体列举的整个群组，还独立地涵盖所述群组的每个成员和主组的所有可能的子组，以及不存在群组成员中的一或多个的主组。本发明还设想明确排除一个或多个所主张的发明的任何群组成员。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在矛盾的情况下，将以本说明书，包括定义为准。在整个本说明书和权利要求书中，词语“包含(comprise)”或如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变化形式应理解为意味着包括所述整数或整数群但不排除任何其它整数或整数群。除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。

本文描述示例性方法和物质，但与本文所述的那些类似或等效的方法和物质可用于实施或测试本发明。材料、方法和实例仅具有说明性而并不意图加以限制。

FLT3抗体

本发明提供结合于FLT3[例如人类FLT3(例如，登录号：NP_004110或SEQ ID NO:198)]并且特征在于以下特征中的任何一种或多种的抗体：(a)治疗、预防、减轻受试者的与表达FLT3的恶性细胞相关的病状(例如，癌症，如AML)的一种或多种症状；(b)抑制受试者(患有表达FLT3的恶性肿瘤)的肿瘤生长或进展；(c)抑制受试者(具有一种或多种表达FLT3的恶性细胞)的表达FLT3的癌(恶性)细胞的转移；(d)诱导表达FLT3的肿瘤消退(例如，长期消退)；(e)发挥表达FLT3的恶性细胞的细胞毒活性；(f)阻断FLT3与其它尚有待鉴别的因子的相互作用；和/或(g)诱导杀伤或抑制附近的非表达FLT3的恶性细胞的生长的旁观者效应。

在一个方面，提供一种特异性结合于FLT3的分离抗体，其中所述抗体包含(a)重链可变(VH)区，其包含(i)VH互补决定区1(CDR1)，其包含37、38、39、43、44、45、49、50、54、55、56、60、61、62、66、67、68、72、73、74、78、79、80、84、85、86、90、91、92、96、97、98、102、103、104、108、109、110、114、115、116、120、121、122、126、127、128、132、133、134、138、139、140、246或247中所示的序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:40、41、46、47、51、52、57、58、63、64、69、70、75、76、81、82、87、88、93、94、99、100、105、106、111、112、117、118、123、124、129、130、135、136、141、142、248、249、251、252、253或255中所示的序列；和(iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:42、48、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、245、250或254中所示的序列；和/或轻链可变(VL)区，其包含(i)VL CDR1，其包含SEQ IDNO:144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、257、261、263、265、268、270、273或275中所示的序列；(ii)VL CDR2包含SEQ ID NO:145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、259、266或271中所示的序列；及(iii)VL CDR3包含SEQ ID NO:146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、256、258、260、262、264、267、269、272或274中所示的序列。

在另一方面，提供一种特异性结合于FLT3的分离抗体，其中所述抗体包含：VH区，其包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291或293中所示的序列；和/或VL区，其包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290或292中所示的序列。

在一些实施例中，提供一种特异性结合于FLT3的分离抗体，其中所述抗体包含：VH区，其包含SEQ ID NO:275、289或291中所示的序列；和/或VL区，其包含SEQ ID NO:274、288或290中所示的序列。

在一些实施例中，提供一种具有如表2中所列的部分轻链序列中的任一种和/或如表2中所列的部分重链序列中的任一种的抗体。

在一些实施例中，本文所述的抗体包含恒定区。在一些实施例中，本文所述的抗体具有人类IgG1、IgG2或IgG2Δa、IgG3或IgG4子类。在一些实施例中，本文所述的抗体包含糖基化恒定区。在一些实施例中，本文所述的抗体包含具有降低的与一种或多种人类Fcγ受体的结合亲和力的恒定区。

本文中提供的抗体可涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fc等)、嵌合抗体、单链(ScFv)和/或人类化抗体。抗体可为鼠类、大鼠、人类或任何其它来源(包括嵌合或人类化抗体)。

FLT3特异性CAR和其制造方法

本文提供结合于FLT3(例如，人类FLT3(例如，SEQ ID NO:198)或登录号：NP_004110)的CAR。本文中提供的FLT3特异性CAR包括单链CAR和多链CAR。CAR具有以非MHC受限方式，采用单克隆抗体的抗原结合特性朝向FLT3再导向T细胞特异性和反应性的能力。非MHC受限抗原识别为表达CAR的T细胞提供与抗原处理无关的识别抗原的能力，由此绕过肿瘤逃逸的主要机制。

在一些实施例中，本文中提供的CAR包含胞外配体结合域(例如，单链可变片段(scFv))、跨膜域和胞内信号传导域。在一些实施例中，胞外配体结合域、跨膜域和胞内信号传导域处于一种多肽中，即，单链中。本文还提供多链CAR和多肽。在一些实施例中，多链CAR包含：第一多肽，其包含跨膜域和至少一个胞外配体结合域；和第二多肽，其包含跨膜域和至少一个胞内信号传导域，其中所述多肽组装在一起以形成多链CAR。

在一些实施例中，FLT3特异性多链CAR是基于高亲和力IgE受体(FcεRI)。肥大细胞和嗜碱性细胞上表达的FcεRI触发过敏性反应。FcεRI为由单一α次单元、单一β次单元和两个二硫键连接的γ次单元构成的四聚复合物。α次单元含有IgE结合域。β和γ次单元含有介导信号转导的ITAM。在一些实施例中，FcRα链的胞外域缺失并经FLT3特异性胞外配体结合域置换。在一些实施例中，多链FLT3特异性CAR包含特异性结合于FLT3的scFv、CD8α铰链和FcRβ链的ITAM。在一些实施例中，CAR可或可不包含FcRγ链。

在一些实施例中，胞外配体结合域包含scFv，其包含通过柔性接头连接的靶抗原特异性单克隆抗体的轻链可变(VL)区和重链可变(VH)区。利用通过使用短连接肽连接轻和/或重链可变区来得到单链可变区片段(Bird等人,《科学(Science)》242:423-426,1988)。连接肽的一个实例为具有氨基酸序列(GGGGS)₃(SEQ ID NO:232)的GS接头，其一个可变区的羧基末端和另一可变区的氨基末端之间桥接大约3.5nm。已设计和使用其它序列的接头(Bird等人，1988，见上文)。一般来说，接头可为例如由约20或更少个氨基酸残基构成的短、柔性多肽。接头可转而经修饰以起其它作用，如附接药物或附接固体载体。单链变异体可以重组或合成方式产生。针对ScFv的合成产生，可使用自动化合成器。针对scFv的重组产生，可将含有编码scFv的聚核苷酸的适合质粒引入适合的宿主细胞(真核，如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞；或原核，如大肠杆菌)中。编码相关ScFv的聚核苷酸可通过常规操作，如聚核苷酸的接合来得到。所得ScFv可使用所属领域中已知的标准蛋白质纯化技术分离。

FLT3胞外域由5个免疫球蛋白域构成，其中域5最接近细胞膜，并且域1最远(呈线性方式；Verstraete,2011年7月7日；《血液》:118(1))。五个FLT3胞外域的序列列于下表1中。

表1

域2-3包含域2和域3的序列(SEQ ID NO:254)。

在一些实施例中，本文所述的FLT3特异性CAR的胞外配体结合域结合于FLT3胞外域的域1、2、3、4或5。

在一些实施例中，本文所述的FLT3特异性CAR的胞外配体结合域结合于FLT3胞外域的域1。

在一些实施例中，本文所述的FLT3特异性CAR的胞外配体结合域结合于FLT3胞外域的域2。

在一些实施例中，本文所述的FLT3特异性CAR的胞外配体结合域结合于FLT3胞外域的域3。

在一些实施例中，本文所述的FLT3特异性CAR的胞外配体结合域结合于FLT3胞外域的域4。

在一些实施例中，本文所述的FLT3特异性CAR的胞外配体结合域结合于FLT3胞外域的域5。

在一些实施例中，本文所述的FLT3特异性CAR的胞外配体结合域结合于FLT3胞外域的域2-3。

在一些实施例中，本文所述的FLT3特异性CAR的胞外配体结合域结合于FLT3胞外域的域2-3或4。

在另一方面，提供一种特异性结合于FLT3的CAR，其中所述CAR包含包括以下的胞外配体结合域：VH区，其具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291或293中所示的序列；和/或VL区，其具有SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290或292中所示的序列。在一些实施例中，VH和VL通过柔性接头连接在一起。在一些实施例中，柔性接头包含SEQ IDNO:232中所示的氨基酸序列。

在另一方面，提供一种FLT3特异性嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外配体结合域、第一跨膜域和胞内信号传导域，其中所述胞外域包含单链Fv片段(ScFv)，其包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中所述VH区包含(i)VH互补决定区1(CDR1)，其具有SEQ IDNO:37、38、39、43、44、45、49、50、54、55、56、60、61、62、66、67、68、72、73、74、78、79、80、84、85、86、90、91、92、96、97、98、102、103、104、108、109、110、114、115、116、120、121、122、126、127、128、132、133、134、138、139、140、294、295、296、300、301、305、306、307、311、312、316、317或318中所示的氨基酸序列；(ii)VH互补决定区2(CDR2)，其具有SEQ ID NO:40、41、46、47、51、52、57、58、63、64、69、70、75、76、81、82、87、88、93、94、99、100、105、106、111、112、117、118、123、124、129、130、135、136、141、142、297、298、302、303、308、309、313、314、319、320或322中所示的氨基酸序列；和(iii)VH互补决定区3(CDR3)，其具有SEQ ID NO:42、48、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、299、304、310、315或321中所示的氨基酸序列。

在另一方面，提供一种FLT3特异性嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外配体结合域、第一跨膜域和胞内信号传导域，其中所述胞外域包含单链Fv片段(ScFv)，其包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中所述VL区包含(i)VL互补决定区1(CDR1)，其具有SEQ IDNO:144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、323、326、328、331、336、338、340、343、345、348或350中所示的氨基酸序列；(ii)VL互补决定区2(CDR2)，其具有SEQ ID NO:145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、324、329、332、334、341或346中所示的氨基酸序列；和(iii)VL互补决定区3(CDR3)，其具有SEQ ID NO:146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、325、327、330、333、335、337、339、342、344、347或349中所示的氨基酸序列。

在另一方面，提供一种FLT3特异性嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外配体结合域、第一跨膜域和胞内信号传导域，其中所述胞外域包含单链Fv片段(ScFv)，其包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中(a)所述VH区包含(i)VH互补决定区1(CDR1)，其具有SEQ IDNO:37、38、39、43、44、45、49、50、54、55、56、60、61、62、66、67、68、72、73、74、78、79、80、84、85、86、90、91、92、96、97、98、102、103、104、108、109、110、114、115、116、120、121、122、126、127、128、132、133、134、138、139、140、294、295、296、300、301、305、306、307、311、312、316、317或318中所示的氨基酸序列；(ii)VH互补决定区2(CDR2)，其具有SEQ ID NO:40、41、46、47、51、52、57、58、63、64、69、70、75、76、81、82,87、88、93、94、99、100、105、106、111、112、117、118、123、124、129、130、135、136、141、142、297、298、302、303、308、309、313、314、319、320或322中所示的氨基酸序列；和(iii)VH互补决定区3(CDR3)，其具有SEQ ID NO:42、48、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、299、304、310、315或321中所示的氨基酸序列；并且(b)所述VL区包含(i)VL互补决定区1(CDR1)，其具有SEQ ID NO:144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、323、326、328、331、336、338、340、343、345、348或350中所示的氨基酸序列；(ii)VL互补决定区2(CDR2)，其具有SEQ ID NO:145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、324、329、332、334、341或346中所示的氨基酸序列；和(iii)VL互补决定区3(CDR3)，其具有SEQ ID NO:146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、325、327、330、333、335、337、339、342、344、347或349中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，本发明CAR包含具有如表2中所列的部分轻链序列中的任一个和/或如表2中所列的部分重链序列中的任一个的胞外配体结合域。

在表2中，带下划线的序列为根据Kabat的CDR序列，并且呈粗体的序列为根据Chothia的CDR序列，除了P4F6、P4C7、P3A1、P5A3、P9B5、P9F1、P1B4、P1B11、P7H3、P3E10、P1A5、P5F7、P4H11、P15F7、P12B6、P8B6、P14G2和P7F9的重链CDR2序列，其中Chothia CDR序列带下划线并且Kabat CDR序列呈粗体。

表2

本文亦提供针对FLT3的抗体的抗原结合域的CDR部分或针对FLT3的CAR的胞外配体结合域的CDR部分(包括Chothia、Kabat CDR和CDR接触区)。CDR区的测定在所属领域技术中为熟知的。应理解，在一些实施例中，CDR可为Kabat和Chothia CDR的组合(又称为“组合CR”或“延伸CDR”)。在一些实施例中，CDR为Kabat CDR。在其它实施例中，CDR为ChothiaCDR。换句话说，在伴随多于一个CDR的实施例中，CDR可为Kabat、Chothia、组合CDR或其组合中的任一个。表3提供本文中提供的CDR序列的实例。

表3

本发明涵盖表2中所示的本发明的CAR和多肽的修饰，包括具有不会显著影响其特性的修饰的功能等效CAR和具有增强或降低活性和/或亲和力的变异体。例如，氨基酸序列可经突变以获得具有与FLT3的所需结合亲和力的抗体。多肽的修饰为所属领域中的常规操作并且无需在本文中详细描述。经修饰的多肽的实例包括伴随氨基酸残基的保守性取代、不会显著不利地改变功能活性或成熟化(增强)多肽对其配体的亲和力的氨基酸的一个或多个缺失或添加、或使用化学类似物的多肽。

氨基酸序列***包括从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的长度范围内的氨基和/或羧基端融合，以及序列内部***单个或多个氨基酸残基。末端***的实例包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体或与表位标签融合的抗体。抗体分子的其它***型变异体包括增加血液循环中的抗体的半衰期的酶或多肽与抗体的N或C端的融合。

取代型变异体使抗体分子中的至少一个氨基酸残基被去除，并使不同残基***其位置。用于取代诱变的最相关的位点包括高变区，但是还涵盖FR更改。保守性取代显示于表4中的标题“保守性取代”下。如果所述取代引起生物活性变化，那么可引入表4中命名为“示例性取代”或如下文关于氨基酸类别进一步描述的更多显著变化并筛选产物。

表4：氨基酸取代

在一些实施例中，本文提供一种包含胞外配体结合域的CAR，所述胞外配体结合域结合于FLT3并与本文所述的CAR，包括包含胞外域的CAR竞争结合于FLT3，所述胞外域包含：P4F6、P4C7、P3A1、P5A3、P9B5、P9F1、P1B4、P1B11、P7H3、P3E10、P1A5、P5F7、P4H11、P15F7、P12B6、P8B6、P14G2、P7F9、P08B06EE、P04A04、P01A05、P08B03、P5F7g、P10A02g、P10A04g、P10A05g、P10A07g、P10B03g、P10B06g、P5F7g2、P5F7g3及P5F7g4。

在一些实施例中，本文提供一种特异性结合于FLT3的CAR，其中所述CAR包含包括SEQ ID NO:4中所示的序列的VH区；和/或包括SEQ ID NO:3中所示的序列的VL区。在一些实施例中，本文提供一种特异性结合于FLT3的CAR，其中所述CAR包含包括SEQ ID NO:6中所示的序列的VH区；和/或包括SEQ ID NO:5中所示的序列的VL区。在一些实施例中，本文提供一种特异性结合于FLT3的CAR，其中所述CAR包含包括SEQ ID NO:10中所示的序列的VH区；和/或包括SEQ ID NO:9中所示的序列的VL区。在一些实施例中，本文提供一种特异性结合于FLT3的CAR，其中所述CAR包含包括SEQ ID NO:20中所示的序列的VH区；和/或包括SEQ IDNO:19中所示的序列的VL区。

在一些实施例中，本发明还提供包含针对基于CDR接触区的FLT3抗体的抗体的CDR部分的CAR。CDR接触区为充分显示抗体对抗原的特异性的抗体的区。一般来说，CDR接触区包括CDR和经限定来维持适当环结构以供抗体结合特异性抗原的维尼尔区域(Vernierzone)中的残基位置。参加例如，Makabe等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》,283:1156-1166,2007。CDR接触区的测定在所属领域技术中为熟知的。

如本文所述的FLT3特异性CAR的配体结合域与FLT3(如人类FLT3(例如，SEQ IDNO:198))的结合亲和力(K_D)可为例如约0.1至约1000nM，例如约0.5nM至约500nM之间或例如1nM至约250nM之间。在一些实施例中，结合亲和力为约以下中的任一个：1000nm、750nm、500nm、400nm、300nm、250nm、200nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、45nM、40nM、35nM、30nM、25nM、20nM、19nm、18nm、17nm、16nm、15nM、10nM、8nM、7.5nM、7nM、6.5nM、6nM、5.5nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.3nM或0.1nM。

在一些实施例中，如本文所述的FLT3特异性CAR的配体结合域与FLT3的结合亲和力(K_D)为约10nM至约100nM、约10nM至约90nM、约10nM至约80nM、约20nM至约70nM、约25nM至约75nM或约40nM至约110nM。在一个实施例中，本段落中所述的ScFv的结合亲和力是针对人类FLT3。

在一些实施例中，如本文所述的FLT3特异性CAR的配体结合域的ScFv与人类FLT3的胞外域的域4的结合亲和力(K_D)为约1nM至约100nM、约10nM至约100nM、约20nM至约100nM、约25nM至约105nM、约40nM至约80nM、约40nM至约100nM或约50nM至约100nM。

在一些实施例中，如本文所述的FLT3特异性CAR的配体结合域的ScFv与人类FLT3的胞外域的域2-3的结合亲和力(K_D)为约5nM至30nM、约5nM至约25nM、约10nM至约30nM、约10nM至约40nM或约10nM至约25nM。

在一示例性实施例中，ScFv的K_D如实例1中所公开进行测量。

在一些实施例中，所述结合亲和力小于约以下中的任一种：1000nm、900nm、800nm、250nM、200nM、100nM、50nM、30nM、20nM、10nM、7.5nM、7nM、6.5nM、6nM、5nM。

单克隆抗体特异性表位

在一些实施例中，本文中所公开的FLT3特异性CAR中的任一种的胞外域可包含对单克隆抗体具有特异性(即，通过单克隆抗体特异性识别)的一个或多个表位。这些表位在本文中也被称为mAb特异性表位。在这些实施例中，胞外域包含特异性结合于FLT3的VH和VL多肽和结合于一个或多个单克隆抗体(mAb)的一个或多个表位。包含mAb特异性表位的CAR可为单链或多链的。

在本文所述的CAR的胞外域中包括对单克隆抗体具有特异性的表位使得可分选和耗竭表达CAR的工程化免疫细胞。在一些实施例中，这一特征还促进恢复通过给予表达CAR的工程化免疫细胞耗竭的表达FLT3的内源性细胞。

因此，在一些实施例中，本发明涉及一种分选和/或耗竭赋予包含mAb特异性表位的CAR的工程化免疫细胞的方法；和一种促进表达FLT3的内源性细胞，如骨髓祖细胞的恢复的方法。

数种表位-单克隆抗体偶联可用于产生包含单克隆抗体特异性表位的CAR；确切地说，已批准用于医学用途的那些表位，如作为非限制性实例的CD20表位/利妥昔单抗。

在一些实施例中，对表位具有特异性的单克隆抗体可与细胞毒性药物结合。此外可通过使用其上有补体系统的一种或多种移植组分的工程化抗体来促进CDC细胞毒性。在一些实施例中，CAR-T细胞的活化可通过使用识别表位的抗体耗竭细胞来调节。

此外，本发明涵盖分选赋予表达一种或多种mAb特异性表位的FLT3特异性CAR的工程化免疫细胞的方法和治疗方法，其中赋予这些CAR的工程化免疫细胞的活化通过使用靶向所述CAR的外配体结合域的抗体耗竭细胞来调节。

包含通过单克隆抗体特异性识别的一个或多个表位的CAR公开在WO2016/120216中，其以全文引用的方式并入本文中。表位可选自所属领域中已知的任何数量的表位。在一些实施例中，表位可为批准用于医学用途的单克隆抗体的靶向物，例如(但不限于)通过利妥昔单抗识别的CD20表位。在一些实施例中，表位包含SEQ ID NO:229中所示的氨基酸序列。

CPYSNPSLC(SEQ ID NO:229)

在一些实施例中，表位可位于scFv与CAR的铰链之间。在一些实施例中，通过接头分隔的相同表位的两个实例可用于CAR中。例如，包含通过接头分隔的SEQ ID NO:229中所示出的表位的2个拷贝的多肽，如GSGGGGSCPYSNPSLCSGGGGSCPYSNPSLCSGGGGS(SEQ ID NO:230)中所示，可用于CAR中，位于轻链可变区和铰链之间。

在一些实施例中，CAR的胞外结合结构域包含VH和VL多肽，并且一个或多个mAb特异性表位可具有不同结构，其取决于表位***位置和接头的使用。例如，包含mAb特异性表位的FLT3特异性CAR的胞外结合域可具有以下结构之一：

V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位1-(L)_x-；

V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位1-(L)_x-表位2-(L)_x-；

V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位1-(L)_x-表位2-(L)_x-表位3-(L)_x-；

(L)_x-表位1-(L)_x-V₁-L₁-V₂；

(L)_x-表位1-(L)_x-表位2-(L)_x-V₁-L₁-V₂；

表位1-(L)_x-表位2-(L)_x-表位3-(L)_x-V₁-L₁-V₂；

(L)_x-表位1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位2-(L)_x；

(L)_x-表位1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位2-(L)_x-表位3-(L)_x-；

(L)_x-表位1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位2-(L)_x-表位3-(L)_x-表位4-(L)_x-；

(L)_x-表位1-(L)_x-表位2-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位3-(L)_x-；

(L)_x-表位1-(L)_x-表位2-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位3-(L)_x-表位4-(L)_x-；

V₁-(L)_x-表位1-(L)_x-V₂；

V₁-(L)_x-表位1-(L)_x-V₂-(L)_x-表位2-(L)_x；

V₁-(L)_x-表位1-(L)_x-V₂-(L)_x-表位2-(L)_x-表位3-(L)_x；

V₁-(L)_x-表位1-(L)_x-V₂-(L)_x-表位2-(L)_x-表位3-(L)_x-表位4-(L)_x；

(L)_x-表位1-(L)_x-V₁-(L)_x-表位2-(L)_x-V₂；或，

(L)_x-表位1-(L)_x-V₁-(L)_x-表位2-(L)_x-V₂-(L)_x-表位3-(L)_x；

其中，

V₁为V_L并且V₂为V_H或V₁为V_H并且V₂为V_L；

L₁为适合于将V_H链连接于V_L链的接头；

L为包含甘氨酸和丝氨酸残基的接头，并且胞外结合域中的L在每次出现时可与相同胞外结合域出现的其它L相同或不同，例如SGGGG、GGGGS或SGGGGS，并且，

x为0或1并且x在每次出现时与其他相互独立选择；并且，

表位1、表位2、表位3和表位4为mAb特异性表位并且可为相同或不同的。在一些实施例中，表位1、表位2和表位4为具有SEQ ID NO:229的氨基酸序列的mAb特异性表位，并且表位3为具有SEQ ID NO:231的氨基酸序列的mAb特异性表位。

在一些实施例中，CAR的胞外结合域包含以下序列

V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位1-(L)_x-表位2-(L)_x-；或，

(L)_x-表位1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位2-(L)_x-表位3-(L)_x-表位4-(L)_x-，其中V₁、V₂、L₁、L、x和表位1、表位2、表位3和表位4如上文所定义。

在一些实施例中，本文中所公开的FLT3特异性CAR中的任一种可包含选自以下的一个或多个mAb特异性表位：CD52表位、CD20表位、CD3表位、CD41表位、CD25表位、CD30表位、EGFR表位、TNFα表位、VEGF表位、补体蛋白C5表位、CD11a表位、CD33表位、α-4整合素表位、IgE Fc区表位、RSV蛋白F表位、IL-6受体表位、HER2受体表位、整合素α₄β₇表位、B细胞活化因子(BAFF)表位、IL-1β表位、RANKL表位、CTLA4表位、CD34表位、IL-12表位和/或IL-23表位。

在一些实施例中，本文中所公开的FLT3特异性CAR可包含选自由以下特异性识别的一个或多个mAb特异性表位：阿仑单抗(alemtuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)、莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3)、托西莫单抗(tositumomab)、阿昔单抗(abciximab)、巴利昔单抗(basiliximab)、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、西妥昔单抗(cetuximab)、英利昔单抗(infliximab)、利妥昔单抗、贝伐单抗(bevacizumab)、培塞利珠单抗(certolizumab pegol)、达利珠单抗(daclizumab)、艾库组单抗(eculizumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、那他珠单抗(natalizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、兰比珠单抗(ranibizumab)、托西利单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、维多珠单抗(vedolizumab)、阿达木单抗(adalimumab)、贝利单抗(belimumab)、卡那单抗(canakinumab)、地诺单抗(denosumab)、戈利木单抗(golimumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、帕尼单抗(panitumumab)、QBEND-10或优特克单抗(ustekinumab)。

在一些实施例中，FLT3特异性CAR包含选自表5中所公开的表位的一个或多个mAb特异性表位：

表5：可用于本发明的FLT3特异性CAR的胞外结合域中的mAb特异性表位，如模拟表位和具有其相应mAb的表位的实例

根据本发明的CAR的胞内信号传导域负责胞外配体结合域结合于靶向物引起免疫细胞的活化和免疫应答之后的细胞内信号传导。胞内信号传导域可活化其中表达CAR的免疫细胞的正常效应功能中的至少一种。例如，T细胞的效应功能可为细胞溶解活性或辅助活性(包括细胞因子的分泌)。

在一些实施例中，供用于CAR中的胞内信号传导域可为例如(但不限于)T细胞受体和在抗原受体结合后协调作用以发起信号转导的共受体的细胞质序列，以及具有相同功能性能力的这些序列的任何衍生物或变异体和任何合成序列。胞内信号传导结构域包含两个不同类别的细胞质信号传导序列：发起抗原依赖性一级活化的序列和以非抗原依赖性方式起作用，以提供二级或共刺激信号的序列。初级细胞质信号传导序列可包含信号传导基序，其已知为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。ITAM为充当syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点的各种受体的胞质内尾中发现的经明确界定的信号传导基元。本发明中所用的ITAM的实例可以非限制性实例形式包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的ITAM。在一些实施例中，CAR的胞内信号传导域可包含CD3ζ信号传导域，其具有与SEQ.ID NO:210中所示的氨基酸序列有至少约70％，例如至少80％或至少90％、95％、97％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明的CAR的胞内信号传导域包含共刺激分子的域。

在一些实施例中，本发明的CAR的胞内信号传导域包含选自由41BB(基因库：AAA53133.)和CD28(NP_006130.1)的片段组成的群组的共刺激分子的一部分。在一些实施例中，本发明的CAR的胞内信号传导域包含氨基酸序列，其包含与SEQ.ID NO:209和SEQ.IDNO:213中所示的氨基酸序列至少约70％，例如至少80％或至少90％、95％、97％或99％序列一致性。在一些实施例中，本发明的CAR的胞内信号传导域包含氨基酸序列，其包含与SEQ.ID NO:209和SEQ.ID NO:214中所示的氨基酸序列至少约70％，例如至少80％或至少90％、95％、97％或99％序列一致性。

CAR在细胞的表面膜上表达。因此，CAR可包含跨膜域。本文中所公开的CAR的适合跨膜域具有以下能力：(a)在细胞，例如免疫细胞，如(但不限于)淋巴细胞或自然杀伤(NK)细胞的表面处表达，和(b)与配体结合域和胞内信号传导域相互作用以引导免疫细胞对预定靶细胞的细胞应答。跨膜域可衍生自天然或合成来源。所述跨膜域可衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。作为非限制性实例，跨膜多肽可为T细胞受体的亚单位(如α、β、γ或δ)、构成CD3复合物、IL-2受体p55(a链)、p75(β链)或γ链、Fc受体(确切地说，Fcγ受体III)的亚单位链或CD蛋白质的多肽。或者，跨膜域可为合成的并可主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施例中，所述跨膜域衍生自人类CD8α链(例如，NP_001139345.1)。

跨膜域通过茎域(也被称为铰链域)连接于胞外配体结合域。茎域可包含多达300个氨基酸，例如10至100个氨基酸或25至50个氨基酸。茎区可衍生自天然存在的分子的全部或部分，如CD8、CD4或CD28的胞外区的全部或部分或抗体恒定区的全部或部分。或者，茎域可为对应于天然存在的茎序列的合成序列或可为整个合成的茎序列。在一些实施例中，所述茎域为人类CD8α链(例如，NP_001139345.1)的一部分。在另一具体实施例中，所述跨膜和铰链域包含人类CD8α链的一部分，例如，其包含与选自由SEQ ID NO:206和208组成的群组的氨基酸序列至少70％、或至少80％、或至少90％、95％、97％或99％序列一致性。在一些实施例中，本文所述的FLT3特异性CAR的茎域包含CD8α铰链、IgG1铰链或FcγRIIIα铰链。在一些实施例中，茎域包含人类CD8α铰链、人类IgG1铰链或人类FcγRIIIα铰链。在一些实施例中，本文中所公开的CAR可包含特异性结合FLT3的胞外配体结合域、CD8α人类铰链和跨膜域、CD3ζ信号传导域和4-1BB信号传导域。

表6提供可用于本文中所公开的CAR中的域的示例性序列。

表6：CAR组分的示例性序列

通常在癌细胞中观察到靶抗原的下调或突变，从而产生抗原损失逃逸变异体。因此，为了抵消肿瘤逃逸并使免疫细胞对靶向物更具特异性，FLT3特异性CAR可包含一个或多个另外的胞外配体结合域，以同时与靶向物中的不同元件结合，由此增强免疫细胞活化和功能。在一些实施例中，胞外配体结合域可以串联地置于相同跨膜多肽上，并且任选地，可通过接头分隔。在一些实施例中，所述不同胞外配体结合域可置于构成CAR的不同跨膜多肽上。在一些实施例中，本发明涉及CAR群，每个CAR包含不同胞外配体结合域。确切地说，本发明涉及一种对免疫细胞进行工程化的方法，其包含提供免疫细胞，并在所述细胞表面处表达CAR群，每个CAR包含不同胞外配体结合域。在另一个具体实施例中，本发明涉及一种对免疫细胞进行工程化的方法，其包含提供免疫细胞，并将编码多肽的聚核苷酸引入所述细胞中，所述多肽构成每一种包含不同胞外配体结合域的CAR群。CAR群意指至少两个、三个、四个、五个、六个或更多个CAR，每一种包含不同胞外配体结合域。根据本发明的不同胞外配体结合域可例如同时结合靶向物中的不同元件，从而增强免疫细胞活化和功能。本发明还涉及一种分离免疫细胞，其包含每一种包含不同胞外配体结合域的CAR群。

在另一方面，本文提供编码本文所述的CAR和多肽中的任一种的聚核苷酸。聚核苷酸可通过所属领域中已知的程序来制造和表达。

在另一方面，本文提供包含本发明的细胞中的任一种的组合物(如医药组合物)。在一些实施例中，组合物包含包括编码本文所述的CAR中的任一种的聚核苷酸的细胞。在又其它实施例中，组合物包含以下SEQ ID NO:245和SEQ ID NO:246中所示的聚核苷酸中的任一种或两种：

P3E10重链可变区

CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCAGGCAGCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCGGCACATTCTCTAGCTACGCCATCCAGTGGGTGCGGCAGGCACCAGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGAGGAATCGTGGGAAGCTGGGGCCTGGCAAACTACGCCCAGAAGTTTCAGGGCAGAGTGACCATCACCACCGATAAGTCTACAAGCACCGCCTATATGGAGCTGTCCTCTCTGAGGTCCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCCACCTCCGCCTTCGGCGAGCTGGCATCTTGGGGACAGGGCACACTGGTGACCGTGAGCTCC(SEQ ID NO:245)

P3E10轻链可变区

GAGATCGTGCTGACACAGAGCCCAGGCACCCTGTCCCTGTCTCCAGGAGAGAGGGCCACACTGTCCTGTAGGGCCAGCCAGTCCGTGCCTTCTAGCCAGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCCAGACTGCTGATCTATGACGCCTCCTCTAGAGCCACAGGCATCCCAGATAGGTTCTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTTACACTGACCATCTCCAGGCTGGAGCCCGAGGATTTCGCCGTGTACTATTGCCAGCAGTACGGCAGCTCCCCTCTGACATTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGG(SEQ ID NO:246)

在又其它实施例中，组合物包含以下SEQ ID NO:247和SEQ ID NO:248中所示的聚核苷酸中的任一种或两种：

P3A1重链可变区

CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGTCTTGCAAGGCCAGCGGCGGCACATTCTCTAGCTACGATATCTCTTGGGTGAGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAGTGGATGGGAGGAATCATCCCCGTGAGCGGAAGGGCAAACTACGCACAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCATCACCACAGACAAGTCCACATCTACCGCCTATATGGAGCTGTCCTCTCTGAGAAGCGAGGATACAGCCGTGTACTATTGCGCCAGAGTGAGGCCTACCTACTGGCCACTGGACTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGTGAGCTCC(SEQ ID NO:247)

P3A1轻链可变区

GACATCCAGATGACCCAGTCCCCATCTAGCCTGAGCGCCTCCGTGGGCGATAGAGTGACAATCACCTGTAGGGCCTCTCAGAGCATCTCCTCTTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCAGCAAGCTCCCTGCAGTCCGGAGTGCCATCTCGGTTCTCCGGCTCTGGCAGCGGCACAGACTTTACACTGACCATCTCTAGCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTATTGCCAGCAGTCCTATTCTACACCACTGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAG(SEQ ID NO:248)。

在又其它实施例中，组合物包含以下SEQ ID NO:249和SEQ ID NO:250中所示的聚核苷酸中的任一种或两种：

P9B5重链可变区

GAGGTGCAGCTGCTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGCTCTCTGAGACTGAGCTGCGCAGCATCCGGCTTCATCTTTGCCTCTTACGCAATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGAGCGAGATCAGCTCCTCTGGCGGCAGCACCACATATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGCTTCACAATCAGCCGGGACAACTCTAAGAATACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCCAGAGATAGAGTGATGGCCGGCCTGGGCTATGACCCATTTGATTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGTGAGCTCC(SEQID NO:249)

P9B5轻链可变区

CAGAGCGTGCTGACCCAGCCACCTTCCGCCTCTGGAACACCCGGCCAGAGGGTGACCATCAGCTGTTCCGGCTCTAGCTCCAACATCGGCTCCAATTACGTGTATTGGTACCAGCAGCTGCCCGGCACAGCCCCTAAGCTGCTGATCTACAGAAACAATCAGAGGCCATCTGGCGTGCCCGACCGCTTCTCTGGCAGCAAGTCCGGCACCTCTGCCAGCCTGGCAATCAGCGGACTGCGGTCCGAGGACGAGGCCGATTACTATTGCGCAGCATGGGACGATTCCCTGTCTGGAGTGGTGTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGACCGTGCTG(SEQ ID NO:250)。

在又其它实施例中，组合物包含以下SEQ ID NO:251和SEQ ID NO:252中所示的聚核苷酸中的任一种或两种：

P4C7重链可变区

CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCTGGCAGCTCCGTGAAGGTGTCTTGCAAGGCCAGCGGCGGCACATTCTCTAGCTACACCATCTCCTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAGTGGATGGGAGGAATCATCCCAGCCTTCGGCATCGCCAACTACGCCCAGAAGTTTCAGGGCCGCGTGACAATCACCGCCGACAAGTCCACATCTACCGCCTATATGGAGCTGTCCTCTCTGCGGAGCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCGCCAAGGGCGGCAGCTACTCCCTGGACTATTTTGATATCTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGTGAGCTCC(SEQ ID NO:251)

P4C7轻链可变区

GAGATCGTGCTGACACAGTCCCCTGGCACCCTGTCTCTGAGCCCAGGCGAGAGGGCCACACTGTCCTGTAGGGCATCTCAGTACGTGTCCGCCTCTCTGCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGGCCCCAAGACTGCTGATCTACGGAGCATCCACAAGAGCCACCGGCATCCCCGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCTCTGGAACCGACTTCACCCTGACCATCTCTAGACTGGAGCCTGAGGACTTCGCCGTGTACTATTGCCAGCAGTATGCCAGGTCTAGCACATTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAG(SEQ ID NO:252)

本文中进一步描述表达载体和聚核苷酸组合物的给予。

在另一方面，本文提供一种制造本文所述的聚核苷酸中的任一种的方法。

本发明还涵盖与任何此类序列互补的聚核苷酸。聚核苷酸可为单链(编码或反义链)或双链，并且可为DNA(基因组、cDNA或合成DNA)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子，其含有内含子并以一对一方式对应于DNA分子；和mRNA分子，其不含内含子。另外的编码或非编码序列可(但不一定)存在于本发明的聚核苷酸中，并且聚核苷酸可(但不一定)连接于其它分子和/或支撑物。

聚核苷酸可包含天然序列(即，编码抗体或其部分的内源性序列)或可包含此类序列的变异体。聚核苷酸变异体含有一个或多个取代、添加、缺失和/或***，使得相对于天然免疫反应性分子，经编码的多肽的免疫反应性不会下降。对经编码的多肽的免疫反应性的影响可一般如本文所述进行评定。变异体通常展现与编码天然抗体或其部分的聚核苷酸序列有至少约70％一致性、或至少约80％一致性、或甚至至少约90％或95％一致性。

当如下文所述比对最大对应性时，如果两个序列中的核苷酸或氨基酸的序列为相同的，那么两个聚核苷酸或多肽序列被称为“相同的”。两个序列之间的比较通常通过在比较窗内比较序列以鉴别和比较局部区的序列类似性来进行。如本文所用，“比较窗”是指至少约20个、通常30至约75个或40至约50个邻接位置的区段，其中在两个序列经最优比对之后，序列可以与具有相同数目的邻接位置的参考序列相比较。

用于比较的序列的最优比对可以使用默认参数，使用生物信息学软件的Lasergene套件中的Megalign程序(威斯康星州麦迪逊DNASTAR公司(DNASTAR,Inc.,Madison,WI))来执行。这个程序实施在以下参考文献中所述的几种比对流程：Dayhoff,M.O.,1978,《蛋白质演变的模型——用于检测远距关系的基质(Amodel of evolutionarychange in proteins-Matrices for detecting distant relationships)》。在Dayhoff,M.O.(编)《(Atlas of Protein Sequence and Structure)》,华盛顿哥伦比亚特区美国国家生物医学研究基金会(National Biomedical Research Foundation,Washington DC)第5卷,增刊3,第345-358页；Hein J.,1990,《比对和系统发生的统一方法(Unified Approachto Alignment and Phylogenes)》第626-645页《酶学方法(Methods in Enzymology)》第183卷,加利福尼亚州圣地亚哥学术出版社公司；Higgins,D.G.和Sharp,P.M.,1989,CABIOS5:151-153；Myers,E.W.和Muller W.,1988,CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.,1971,《组合理论(Comb.Theor.)》11:105；Santou,N.,Nes,M.,1987,《分子生物学与进化(Mol.Biol.Evol.)》4:406-425；Sneath,P.H.A.和Sokal,R.R.,1973,《数值分类——数值分类的原理和实践(Numerical Taxonomy the Principles and Practice of NumericalTaxonomy)》,加利福尼亚州旧金山弗里曼出版社(Freeman Press,San Francisco,CA)；Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.,1983,《美国国家科学院院刊》80:726-730。

通常，“序列一致性的百分比”是通过在至少20个位置的比较窗内比较两个经最优比对的序列测定，其中出于两个序列的最优比对，相较于参考序列(其不包含添加或缺失)，比较窗中聚核苷酸或多肽序列的部分可包含20百分比或更小，通常5至15百分比或10至12百分比的添加或缺失(即，空位)。百分比是通过测定两个序列中均出现的相同核酸碱基或氨基酸残基所处的位置的数目得到匹配位置数，所述匹配位置数除以参考序列的位置的总数(即窗大小)，并使结果乘以100得到序列一致性的百分比来计算。

另外或替代地，变异体可大体上与天然基因或其部分或补体同源。此类聚核苷酸变异体能够在适当严格条件下杂交至编码天然抗体的天然存在的DNA序列(或互补序列)。

适合的“适当严格条件”包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA的溶液(pH 8.0)中预洗涤；在50℃-65℃下，5×SSC杂交隔夜；继之以伴随含有0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC中的每一种，在65℃下洗涤两次持续20分钟。

如本文所用，“高度严格条件”或“高严格度条件”为以下条件：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，在50℃下；(2)在杂交期间在42℃下采用变性剂，如甲酰胺，例如，伴随0.1％牛血清白蛋白/0.1％聚蔗糖(Ficoll)/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲剂(pH 6.5)的50％(v/v)甲酰胺，以及750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠；或(3)在42℃下采用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×丹哈特氏溶液(Denhardt’ssolution)、经声波处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，伴随在0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中在42℃下并在50％甲酰胺中在55℃下洗涤，继之以在55℃下由含有EDTA的0.1×SSC组成的高严格度洗液。熟练技术人员将认识到如何根据需要调整温度、离子强度等以适应如探针长度等的因素。

所属领域的一般技术人员应了解，如本文所述，由于遗传密码的简并性，存在多种编码多肽的核苷酸序列。这些聚核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列携有最小同源性。然而，本发明特别涵盖归因于密码子使用的差异而变化的聚核苷酸。此外，包含本文所提供的聚核苷酸序列的基因的等位基因在本发明的范围内。等位基因是由于核苷酸的一个或多个突变(如缺失、添加和/或取代)而改变的内源基因。所得mRNA和蛋白质可(但不一定)具有改变的结构或功能。等位基因可使用标准技术(如杂交、扩增和/或数据库序列比较)来鉴别。

可使用化学合成、重组方法或PCR获得本发明的聚核苷酸。化学聚核苷酸合成的方法所属领域中熟知的并且无需在本文中详细描述。所属领域的技术人员可使用本文中所提供的序列和商用DNA合成器来制造所需DNA序列。

为了使用重组方法制备聚核苷酸，可将包含所需序列的聚核苷酸***适合载体中，并可转而将载体引入适合宿主细胞中进行复制和扩增，如本文进一步所论述。聚核苷酸可以所属领域中已知的任何手段***宿主细胞中。通过利用直接摄取、内吞作用、转染、F-配对或电穿孔引入外源聚核苷酸来对细胞进行转化。引入之后，可将外源聚核苷酸以非整合载体(如质粒)形式维持在细胞中或整合于宿主细胞基因组中。因此扩增的聚核苷酸可通过所属领域中熟知的方法从宿主细胞分离。参加例如，Sambrook等人,1989。

或者，PCR允许DNA序列再现。PCR技术为所属领域中熟知的并描述于第号美国专利第4,683,195号、第4,800,159号、第4,754,065号和第4,683,202号以及《PCR：聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》,Mullis等人编,波士顿博客豪斯出版社(Birkauswer Press,Boston),1994。

RNA可通过在适宜载体中使用分离DNA并将其***适合宿主细胞中来获得。当细胞复制并将DNA转录于RNA中时，随后可使用所属领域的技术人员熟知的方法分离RNA，如萨布鲁克等人，1989(见上文)中所阐述。

适合克隆载体可根据标准技术构建或可选自所属领域中可用的大量克隆载体。尽管可根据意图使用的宿主细胞改变所选克隆载体，但适用克隆载体一般将具有自体复制能力，可具有特定限制性核酸内切酶的单一靶向物和/或可携带针对可用于选择含有载体的克隆的标记物的基因。适合实例包括质粒和细菌性病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如，pBS SK+)和其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA、和穿梭载体(如pSA3和pAT28)。这些和多种其它克隆载体可自商业供应商(如伯乐(BioRad)、斯拉塔津(Strategene)和英杰(Invitrogen))购得。

表达载体一般为含有根据本发明的聚核苷酸的可复制的聚核苷酸构建体。这暗示表达载体在宿主细胞中作为游离基因或作为染色体DNA的组成部分必须为可复制的。适合表达载体包括(但不限于)质粒、病毒载体(包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒)、粘质粒、和PCT公开第WO 87/04462号中所公开的一种或多种表达载体。载体组分可大体上包括(但不限于)以下中的一种或多种：信号序列；复制起点；一个或多个标记基因；适合转录控制元件(如启动子、强化子和终止子)。对于表达(即，转译)，还通常需要一个或多个转译控制原件，如核糖体结合位点、转译起始位点和终止密码子。

可通过多种适宜手段中的任一种将含有相关聚核苷酸的载体引入宿主细胞中，所述手段包括电穿孔；采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染；微弹轰击；脂质体转染；和感染(例如，其中载体为如牛痘病毒的感染因子)。引入载体或聚核苷酸的选择将通常取决于宿主细胞的特征。

编码本文中所公开的FLT3特异性CAR的聚核苷酸可存在于表达盒或表达载体(例如，用于引入细菌性宿主细胞中的质粒；或用于转染昆虫宿主细胞的病毒载体，如杆状病毒载体；或用于转染哺乳动物宿主细胞的质粒或病毒载体，如慢病毒)中。在一些实施例中，聚核苷酸或载体可包括编码核糖体跳跃序列的核酸序列，例如(但不限于)编码2A肽的序列。经鉴别在微小核糖核酸病毒的***病毒亚群中的2A肽使得核糖体从一个密码子“跳跃”到下一个密码子而不会在密码子所编码的两个氨基酸之间形成肽键(参见(Donnelly和Elliott 2001；Atkins,Wills等人2007；Doronina,Wu等人2008))。“密码子”意指于mRNA上(或于DNA分子的有义链上)通过核糖体转译为一个氨基酸残基的三个核苷酸。因此，当多肽由符合读框的2A寡肽序列分隔时，两个多肽可由mRNA中单一、连续的开放阅读框合成。所述核糖体跳跃机制为所属领域中所熟知的并且已知由数种载体使用用于表达由单一信使RNA所编码的若干蛋白质。

为将跨膜多肽引导到宿主细胞的分泌通路中，在一些实施例中，将分泌信号序列(也称为前导序列、前原序列或前序列)提供于聚核苷酸序列或载体序列中。分泌信号序列可操作地连接于跨膜核酸序列，即，这两个序列结合于正确阅读框中并经定位以将新合成的多肽引导到宿主细胞的分泌通路中。分泌信号序列通常位于编码相关多肽的核酸序列的5'，但某些分泌信号序列可位于相关核酸序列中的其他位置(参见例如Welch等人，美国专利第5,037,743号；Holland等人，美国专利第5,143,830号)。在一些实施例中，信号肽包含SEQ ID NO:204或215中所示的氨基酸序列。所属领域的技术人员应认识到，鉴于遗传密码的简并性，这些聚核苷酸分子中可能存在相当多的序列变异。在一些实施例中，本发明的核酸序列经密码子优化以在哺乳动物细胞中表达，例如在灵长类动物(例如人类或猴)细胞中表达。密码子优化是指在相关序列中一般在给定物种的高度表达基因中罕见的密码子由一般在所述物种的高度表达基因中常见的密码子交换，当密码子交换时，所述密码子编码氨基酸。

对免疫细胞进行工程化的方法

本文中提供制备用于免疫疗法中的免疫细胞的方法。在一些实施例中，所述方法包含获得免疫细胞，将根据本发明的CAR引入免疫细胞中，并使细胞扩增。在一些实施例中，本发明涉及一种对免疫细胞进行工程化的方法，其包含：提供细胞，并在所述细胞表面处表达至少一种如上文所述的CAR。对免疫细胞进行工程化的方法描述在例如PCT专利申请公开第WO/2014/039523号、第WO/2014/184741号、第WO/2014/191128号、第WO/2014/184744号和第WO/2014/184143号，所述申请中的每一个以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，所述方法包含：用至少一种编码如上文所述的CAR的聚核苷酸转染细胞；并在细胞中表达聚核苷酸。

对免疫细胞进行工程化之前，可经由多种非限制性方法由受试者获得细胞来源。细胞可由多种非限制性来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、***组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施例中，可使用任何数目的所属领域的技术人员可获得的并已知的T细胞系。在一些实施例中，细胞可衍生自健康供体或患有疾病或病症的供体，例如，诊断患有癌症的个体或诊断患有感染的个体。在一些实施例中，细胞可为展现不同表型特征的混合细胞群的部分。

在一些实施例中，针对在细胞中稳定表达，使聚核苷酸存在于慢病毒载体中。

在一些实施例中，所述方法还进一步包含通过干扰或使表达例如(但不限于)TCR的组分、免疫抑制剂的靶向物的至少一种基因、HLA基因和/或例如PDCD1或CTLA-4的免疫检查点蛋白失活来基因修饰细胞的步骤。干扰或使基因失活意指相关基因不以功能蛋白形式表达。在一些实施例中，受干扰或失活的基因选自由例如(但不限于)以下组成的群组：TCRα、TCRβ、CD52、糖皮质激素受体(GR)、脱氧胞苷激酶(DCK)、PD-1和CTLA-4。在一些实施例中，所述方法包含通过将能够通过选择性DNA裂解使基因选择性地失活的罕见切割核酸内切酶引入细胞中而使一种或多种基因失活。在一些实施例中，所述罕见切割核酸内切酶可为例如转录活化因子样效应子核酸酶(TALE-核酸酶)或Cas9核酸内切酶。

在一些实施例中，伴随罕见切割核酸内切酶使用另外的催化域以增强其使靶基因失活的能力。例如，另外的催化域可为DNA末端加工酶。DNA末端加工酶的非限制性实例包括5-3'核酸外切酶、3-5'核酸外切酶、5-3'碱性核酸外切酶、5'瓣状核酸内切酶、解螺旋酶、磷酸酶、水解酶和非模板依赖性DNA聚合酶。所述催化域的非限制性实例包含选自由以下组成的群组的蛋白域或所述蛋白域的催化活性衍生物：hExoI(EXO1_HUMAN),酵母ExoI(EXO1_YEAST)、大肠杆菌ExoI,人类TREX2、小鼠TREX1、人类TREX1、牛TREX1、大鼠TREX1、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)人类DNA2、酵母DNA2(DNA2_YEAST)。在一些实施例中，另外的催化域可具有3'-5'-核酸外切酶活性，并且在一些实施例中，另外的催化域为TREX，例如，TREX2催化域(WO2012/058458)。在一些实施例中，所述催化域由单链TREX多肽编码。另外的催化域可与核酸酶融合蛋白或嵌合蛋白融合。在一些实施例中，使用例如肽接头融合另外的催化域。

在一些实施例中，所述方法进一步包含将外源核酸引入细胞中的步骤，所述核酸包含与靶核酸序列的一部分同源的至少一个序列，使得在靶核酸序列和外源核酸之间发生同源重组。在一些实施例中，所述外源核酸包含分别与靶核酸序列的区5'和3'同源的第一部分和第二部分。外源核酸亦可包含位于第一部分与第二部分之间的第三部分，其不与靶核酸序列的区5'和3'同源。在靶核酸序列裂解之后，在靶核酸序列与外源核酸之间刺激同源重组事件。在一些实施例中，可在供体基质中使用至少约50bp、超过约100bp或超过约200bp的同源序列。外源核酸可呈例如(但不限于)约200bp至约6000bp、例如约1000bp至约2000bp。共有核酸同源性位于侧接断裂位点的上游和下游的区，并且待引入的核酸序列位于两个臂之间。

在一些实施例中，核酸依次包含针对所述裂解的上游的序列的第一同源区；使选自由以下组成的群组的靶基因失活的序列：TCRα、TCRβ、CD52、糖皮质激素受体(GR)、脱氧胞苷激酶(DCK)和免疫检查点蛋白，，如程序性死亡-1(PD-1)；和针对所述裂解的下游的序列的第二同源区。聚核苷酸引入步骤可与引入或表达罕见切割核酸内切酶同时、在其之前或之后进行。视其中已发生断裂事件的靶核酸序列的位置而定，所述外源核酸可用于敲除基因，例如当外源核酸位于基因的开放阅读框中时，或用于引入新的相关序列或基因。通过使用所述外源核酸进行的序列***可用于通过校正或置换基因(作为非限制性实例的等位基因交换)来修饰现有靶基因；或用于上调或下调靶基因的表达(作为非限制性实例的启动子交换)、靶基因校正或置换。在一些实施例中，选自由TCRα、TCRβ、CD52、GR、DCK和免疫检查点蛋白组成的群组的基因的失活可在经特异性TALE-核酸酶靶向的精确基因组位置处进行，其中所述特异性TALE-核酸酶催化裂解，并且其中外源核酸依次包含至少一个同源区和使选自由TCRα、TCRβ、CD52、GR、DCK、免疫检查点蛋白组成的群组的一个靶基因失活的序列，所述序列通过同源重组得到整合。在一些实施例中，若干基因可通过分别使用若干TALE-核酸酶，并且确切地说，靶向一个确定基因和针对特异性基因失活的若干特异性聚核苷酸而依次或同时失活。

在一些实施例中，所述方法包含使一个或多个选自由以下组成的群组的另外基因失活：TCRα、TCRβ、CD52、GR、DCK和免疫检查点蛋白。在一些实施例中，基因失活可通过以下来完成：将至少一种罕见切割核酸内切酶引入细胞中，使得罕见切割核酸内切酶特异性地催化细胞基因组的靶序列的裂解；并且任选地，将外源核酸引入细胞中，所述外源核酸依次包含针对裂解的上游的序列的第一同源区、***于细胞的基因组中的序列和针对裂解的下游的序列的第二同源区；其中引入的外源核酸使基因失活并整合编码至少一种相关重组蛋白的至少一个外源多核苷酸序列。在一些实施例中，外源聚核苷酸序列被整合于编码蛋白质的选自由以下组成的群组的基因中：TCRα、TCRβ、CD52、GR、DCK和免疫检查点蛋白。

在另一方面，基因修饰细胞的步骤可包含：通过使表达免疫抑制剂的靶向物的至少一个基因失活来修饰T细胞；并且任选地在免疫抑制剂存在下使细胞扩增。免疫抑制剂为通过若干作用机制中的一种抑制免疫功能的药剂。免疫抑制剂可削弱免疫应答的程度和/或剧烈度。免疫抑制剂的非限制性实例包括钙调神经磷酸酶抑制剂、雷帕霉素的靶向物、白介素-2α链阻断剂、单磷酸肌苷脱氢酶的抑制剂、二氢叶酸还原酶的抑制剂、皮质类固醇和免疫抑制抗代谢物。一些细胞毒性免疫抑制剂通过抑制DNA合成来起作用。其它免疫抑制剂可经由T细胞的活化或通过抑制辅助细胞的活化来起作用。根据本发明的方法允许通过使T细胞中的免疫抑制剂的靶向物失活来赋予用于免疫疗法的T细胞免疫抑制抗性。作为非限制性实例，免疫抑制剂的靶向物可为免疫抑制剂的受体，如(但不限于)CD52、糖皮质激素受体(GR)、FKBP家族基因成员和亲环素家族基因成员。

在一些实施例中，所述方法的基因修饰涉及在所提供的待工程化的细胞中表达罕见切割核酸内切酶，使得罕见切割核酸内切酶特异性地催化一个靶基因中的裂解，从而使靶基因失活。在一些实施例中，对细胞进行工程化的方法包含以下步骤中的至少一个：如由细胞培养物或由血液样品提供T细胞；选择T细胞中表达免疫抑制剂的靶向物的基因；将罕见切割核酸内切酶引入T细胞中，所述核酸内切酶能够通过DNA裂解，例如，通过使编码免疫抑制剂的靶向物的基因双链断裂来选择性地失活；并且任选地在免疫抑制剂的存在下，使细胞扩增。

在一些实施例中，所述方法包含：如由细胞培养物或由血液样品提供T细胞；选择T细胞中的基因，其中所述基因表达免疫抑制剂的靶向物；用编码罕见切割核酸内切酶的核酸转染T细胞，所述核酸内切酶能够通过DNA裂解，例如通过双链断裂，使编码免疫抑制剂的靶向物的基因选择性地失活；并将罕见切割核酸内切酶表达于T细胞中；并且任选地在免疫抑制剂的存在下，使细胞扩增。

在一些实施例中，罕见切割核酸内切酶特异性地靶向CD52或GR。在一些实施例中，选用于失活的基因编码CD52，并且免疫抑制治疗包含靶向CD52抗原的人类化抗体。在一些实施例中，选用于失活的基因编码GR，并且免疫抑制治疗包含如***(dexamethasone)的皮质类固醇。在一些实施例中，选用于失活的基因为FKBP家族基因成员或其变异体，并且免疫抑制治疗包含FK506，其也称为他克莫司(Tacrolimus)或藤霉素(fujimycin)。在一些实施例中，FKBP家族基因成员为FKBP12或其变异体。在一些实施例中，选用于失活的基因为亲环素家族基因成员或其变异体，并且免疫抑制治疗包含环孢灵。

在一些实施例中，罕见切割核酸内切酶可为例如，大范围核酸酶、锌指核酸酶或TALE-核酸酶(TALEN)。在一些实施例中，罕见切割核酸内切酶为TALE-核酸酶。

本文还提供适用于免疫疗法的对T细胞进行工程化的方法，其中所述方法包含：通过使至少免疫检查点蛋白失活来基因修饰T细胞。在一些实施例中，免疫检查点蛋白为例如PD-1和/或CTLA-4。在一些实施例中，基因修饰细胞的方法包含：通过使至少一个免疫检查点蛋白失活来修饰T细胞；并且使所述细胞扩增。免疫检查点蛋白包括(但不限于)程序性死亡1(PD-1，也称为PDCD1或CD279，登录号：NM_005018)、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4，也称为CD152，基因库登录号AF414120.1)、LAG3(也称为CD223，登录号：NM—002286.5)、Tim3(也称为HAVCR2，基因库登录号：JX049979.1)、BTLA(也称为CD272，登录号：NM—181780.3)、BY55(也称为CD160，基因库登录号：CR541888.1)、TIGIT(也称为VSTM3，登录号：NM—173799)、B7H5(也称为C10orf54，小鼠vista基因的同源物，登录号：NM—022153.1)、LAIR1(也称为CD305，基因库登录号：CR542051.1)、SIGLEC10(基因库登录号：AY358337.1)、2B4(也称为CD244，登录号：NM—001166664.1)，其直接抑制免疫细胞。例如，CTLA-4为某些CD4和CD8 T细胞上表达的细胞表面蛋白；当通过其配体(B7-1和B7-2)接合于抗原呈递细胞时，T细胞活化和效应功能受到抑制。

在一些实施例中，对细胞进行工程化的所述方法包含以下步骤中的至少一种：如由细胞培养物或由血液样品提供T细胞；将罕见切割核酸内切酶引入T细胞中，所述核酸内切酶能够通过DNA裂解，例如通过双链断裂，使编码免疫检查点蛋白的一个基因选择性地失活；并使细胞扩增。在一些实施例中，所述方法包含：如由细胞培养物或由血液样品提供T细胞；用编码罕见切割核酸内切酶的核酸转染所述T细胞，所述核酸内切酶能够通过DNA裂解，例如通过双链断裂，使编码免疫检查点蛋白的基因选择性地失活；将罕见切割核酸内切酶表达于T细胞中；使细胞扩增。在一些实施例中，罕见切割核酸内切酶特异性地靶向选自由以下组成的群组的基因：PD-1、CTLA-4、LAG3、Tim3、BTLA、BY55、TIGIT、B7H5、LAIR1、SIGLEC10、2B4、TCRα和TCRβ。在一些实施例中，罕见切割核酸内切酶可为大范围核酸酶、锌指核酸酶或TALE-核酸酶。在一些实施例中，罕见切割核酸内切酶为TALE-核酸酶。

在一些实施例中，本发明可尤其适用于同种异体免疫疗法。在此类实施例中，细胞可通过一种包含以下的方法来修饰：使T细胞中的编码T细胞受体(TCR)的组分的至少一个基因失活；并使T细胞扩增。在一些实施例中，所述方法的基因修饰依赖于在所提供的待工程化的细胞中表达罕见切割核酸内切酶，使得罕见切割核酸内切酶特异性地催化一个靶基因中的裂解，从而使靶基因失活。在一些实施例中，对细胞进行工程化的所述方法包含以下步骤中的至少一种：如由细胞培养物或由血液样品提供T细胞；将罕见切割核酸内切酶引入T细胞中，所述核酸内切酶能够通过DNA裂解，例如通过双链断裂，使编码T细胞受体(TCR)的组分的至少一个基因选择性地失活；并使细胞扩增。

在一些实施例中，所述方法包含：如由细胞培养物或由血液样品提供T细胞；用编码罕见切割核酸内切酶的核酸转染所述T细胞，所述核酸内切酶能够通过DNA裂解，例如通过双链断裂，使编码T细胞受体(TCR)的组分的至少一个基因选择性地失活；将罕见切割核酸内切酶表达于T细胞中；分选经转化的T细胞，其在细胞表面上不表达TCR；并使细胞扩增。

在一些实施例中，罕见切割核酸内切酶可为大范围核酸酶、锌指核酸酶或TALE-核酸酶。在一些实施例中，罕见切割核酸内切酶为TALE-核酸酶。在一些实施例中，TALE-核酸酶识别并裂解编码TCRα或TCRβ的序列。在一些实施例中，TALE-核酸酶包含选自SEQ ID NO:219、220、221、222、223、224、225或226中所示的氨基酸序列的多肽序列。

TALE-核酸酶多肽序列：

重复TRAC_T01-L

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重复CD52_T02-R

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在另一方面，基因修饰细胞的另一step可为使缺乏TCRα的T细胞扩增的方法，其包含将pTα(也称为前TCRα)或其功能变异体引入T细胞中，并使所述细胞任选地经由CD3复合物的刺激扩增。在一些实施例中，所述方法包含：a)用编码pTα的至少一个片段的核酸转染细胞以支持CD3表面表达；b)使所述pTα表达于细胞中；和c)使细胞任选地经由CD3复合物的刺激扩增。

还提供制备用于免疫疗法的T细胞的方法，其包含用于使T细胞扩增的方法的步骤。在一些实施例中，pTα聚核苷酸序列可随机或通过同源重组引入。在一些实施例中，***可与TCRα基因的失活相关。

可使用pTα的不同功能变异体。肽的“功能变异体”是指大体上类似于完整肽的分子或其片段。pTα或其功能变异体的“片段”是指分子的任何子组，即，比全长pTα要短的肽。在一些实施例中，pTα或功能变异体可为例如全长pTα或C端截短的pTα形式。C端截短的pTα在C末端缺乏一个或多个残基。作为非限制性实例，C端截短的pTα形式从蛋白质的C端缺乏18、48、62、78、92、110或114个残基。肽的氨基酸序列变异体可通过编码所述肽的DNA的突变制备。所述功能变异体包括例如氨基酸序列中的残基的缺失或***或取代。还可进行缺失、***和取代的任何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有所需活性，确切地说，修复功能性CD3复合物。在一示例性实施例中，将至少一种突变引入如上文所述的不同pTα形式以影响二聚。作为非限制性实例，突变残基可为至少人类pTα蛋白质的W46R、D22A、K24A、R102A或R117A，或使用CLUSTALW方法在pTα家族或同系物成员上比对位置。例如，如上文所述的pTα或其变异体包含突变残基W46R或突变残基D22A、K24A、R102A和R117A。在一些实施例中，所述pTα或变异体还与信号转导域，如呈非限制性实例的CD28、OX40、ICOS、CD27、CD137(4-1BB)和CD8融合。如上文所述的pTα或变异体的胞外域可与TCRα蛋白质的片段，确切地说，TCRα的跨膜和胞内域融合。pTα变异体也可与TCRα的胞内域融合。

在一些实施例中，pTα形式可与胞外配体结合域融合。在一些实施例中，pTα或其功能变异体与单链抗体片段(scFv)融合，其包含通过柔性接头连接的靶抗原特异性单克隆抗体的轻和重可变片段。

术语“缺乏TCRα的T细胞”是指缺乏功能性TCRα链的表达的分离T细胞。这可通过不同手段，作为非限制性实例，通过对T细胞进行工程化，使得其不在细胞表面上表达任何功能性TCRα；或通过对T细胞进行工程化，使得其在表面上产生极少功能性TCRα链；或通过对T细胞进行工程化以表达TCRα链的突变或截短形式来完成。缺乏TCRα的细胞可不再经由CD3复合物扩增。因此，为了解决这一问题并允许缺乏TCRα的细胞增殖，将pTα或其功能变异体引入细胞中，由此修复功能性CD3复合物。在一些实施例中，所述方法进一步包含将罕见切割核酸内切酶引入所述T细胞中，所述核酸内切酶能够通过DNA裂解使编码T细胞受体(TCR)的一种组分的一个基因选择性地失活。在一些实施例中，罕见切割核酸内切酶为TALE-核酸酶。

在一些实施例中，编码根据本发明的多肽的聚核苷酸可为mRNA，其例如通过电穿孔直接引入细胞中。在一些实施例中，可使用cytoPulse技术来瞬时渗透活细胞以将物质递送到细胞中。可调整参数以便确定高转染效率和极低死亡率的条件。

本文还提供转染T细胞的方法。在一些实施例中，所述方法包含：使T细胞与RNA接触并向T细胞施加捷变脉冲序列，其以下由组成：(a)电压范围为每厘米约2250至3000V的电脉冲；(b)0.1ms的脉冲宽度；(c)步骤(a)和(b)的电脉冲之间的脉冲间隔为约0.2至10ms；(d)电压范围为约2250至3000V的电脉冲，脉冲宽度为约100ms并且步骤(b)的电脉冲与步骤(c)的第一电脉冲之间的脉冲间隔为约100ms；和(e)电压为约325V的四个电脉冲，脉冲宽度为约0.2ms并且4个电脉冲中的每一个之间的脉冲间隔为2ms。在一些实施例中，转染T细胞的方法包含使T细胞与RNA接触并向T细胞施加捷变脉冲序列，其包含：(a)电压为每厘米约2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000V的电脉冲；(b)脉冲宽度为0.1ms；(c)并且步骤(a)和(b)的电脉冲之间的脉冲间隔为约0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10ms；(d)电压范围为约2250、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000V的电脉冲，伴随脉冲宽度为100ms并且步骤(b)的电脉冲与步骤(c)的第一电脉冲之间的脉冲间隔为100ms；和(e)电压为约325V的4个电脉冲，伴随脉冲宽度为约0.2ms并且4个电脉冲中的每一个之间的脉冲间隔为约2ms。在本申请中公开包括在上文所述的数值范围内的任何值。电穿孔培养基可为所述领域中已知的任何合适培养基。在一些实施例中，电穿孔培养基的电导率在跨约0.01至约1.0毫西门子范围内。

在一些实施例中，作为非限制性实例，RNA编码罕见切割核酸内切酶、罕见切割核酸内切酶的一个单体(如半TALE-核酸酶)、CAR、多链嵌合抗原受体的至少一种组分、pTα或其功能变异体、外源核酸和/或一个另外的催化域。

工程化免疫细胞

本发明还提供包含本文所述的CAR聚核苷酸中的任一种的工程化免疫细胞。在一些实施例中，可经由质粒载体将CAR引入免疫细胞中作为转基因。在一些实施例中，质粒载体也可含有例如选择标记物，其提供对接受载体的细胞的鉴别和/或选择。

在将编码CAR多肽的聚核苷酸引入细胞中之后，可在细胞中原位合成CAR多肽。或者，CAR多肽可以在胞外产生，并随后将其引入细胞中。将聚核苷酸构建体引入细胞中的方法为所属领域中已知的。在一些实施例中，可使用稳定转化方法来将聚核苷酸构建体整合到细胞的基因组中。在其它实施例中，可使用瞬时转化方法来瞬时表达聚核苷酸构建体和未整合到细胞的基因组中的聚核苷酸构建体。在其它实施例中，可使用病毒介导方法。可通过任何合适手段，，如重组病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒)、脂质体等将聚核苷酸引入细胞中。瞬时转化方法包括例如(但不限于)微注射、电穿孔或粒子轰击。聚核苷酸可包括于载体中，如质粒载体或病毒载体中。

本文还提供由本文中提供的对细胞进行工程化的上述方法获得的分离细胞和细胞系。在一些实施例中，分离细胞包含至少一个如上文所述的CAR。在一些实施例中，分离细胞包含CAR群，每个CAR包含不同胞外配体结合域。

本文还提供根据上文所述的方法中的任一种获得的分离免疫细胞。能够表达异质DNA的任何免疫细胞均可用于表达相关CAR的目的。在一些实施例中，用于表达本文所述的CAR中的任一种的免疫细胞为T细胞。在一些实施例中，用于表达CAR的免疫细胞可衍生自例如(但不限于)干细胞。所述干细胞可为成体干细胞、非人类胚胎干细胞、更确切地说，非人类干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。代表性人类干细胞为CD34+细胞。

在一些实施例中，在其细胞表面膜表达本发明的FLT3特异性CAR的工程化免疫细胞包含百分比大于10％、20％、30％、40％、50％或60％的干细胞记忆和中心记忆细胞。在一些实施例中，在其细胞表面膜表达本发明的FLT3特异性CAR的工程化免疫细胞包含百分比为约10％至约60％、约10％至约50％、约10％至约40％、约15％至约50％、约15％至约40％、约20％至约60％或约20％至约70％的干细胞记忆和中心记忆细胞。

在一些实施例中，如实例2d中所公开测量干细胞记忆和中心记忆细胞的百分比。

用于表达本文所述的CAR中的任一种的免疫细胞还可为树突状细胞、杀手树突状细胞、肥大细胞、NK细胞、B细胞或选自由以下组成的群组的T细胞：炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助T淋巴细胞。在一些实施例中，细胞可衍生自由CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的群组。

在一个实施例中，免疫细胞为表达本文所述的CAR中的任一种的炎性T淋巴细胞。在一个实施例中，免疫细胞为表达本文所述的CAR中的任一种的细胞毒性T淋巴细胞。在一个实施例中，免疫细胞为表达本文所述的CAR中的任一种的调节性T淋巴细胞。在一个实施例中，免疫细胞为表达本文所述的CAR中的任一种的辅助T淋巴细胞。

本文还提供根据上述方法中的任一种由转化的T细胞获得的细胞系。本文还提供对免疫抑制治疗具有抗性的修饰细胞。在一些实施例中，根据本发明的分离细胞包含编码CAR的聚核苷酸。

本发明的免疫细胞可在T细胞的基因修饰之前或之后，使用如例如(但不限于)美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开第20060121005号中一般所述的方法进行活化和扩增。T细胞可体外或体内扩增。通常，可例如通过与刺激T细胞表面上的CD3 TCR复合物和共刺激分子以形成T细胞的活化信号的试剂接触来扩增本发明T细胞。例如，如钙离子载体A23187、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)或促有丝***凝集素样植物血凝素(PHA)的化学物质可用于形成T细胞的活化信号。

在一些实施例中，可通过与例如固定于表面的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体接触，或通过与结合钙离子载体的蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓抑素)接触来体外刺激T细胞群。对于T细胞表面上的辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，在适于刺激T细胞增殖的条件下，T细胞群可以接触抗CD3抗体和抗CD28抗体。适合于T细胞培养的条件包括可含有增殖和存活力所需的因子的适宜培养基(例如，最小必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 5(龙沙(Lonza)))，所述因子包括血清(例如，胎牛血清或人类血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-2、IL-15、TGFp和TNF或熟练技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括(但不限于)表面活性剂、血浆蛋白剂(plasmanate)和还原剂，如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1和X-Vivo 20、优化剂(Optimizer)以及添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或限定组的激素，和/或足够用于T细胞生长和扩增的量的一种或多种细胞因子。抗生素(例如青霉素和链霉素)仅包括于实验培养物中，不包括于待输注到受试者中的细胞培养物中。靶细胞维持在支持生长所需的条件下，例如适当温度(例如37℃)和气氛(例如空气加5％CO₂)。已暴露于不同刺激次数的T细胞可展现出不同特征。

在一些实施例中，本发明细胞可通过与组织或细胞共培养来扩增。在细胞给予受试者之后，细胞还可以在体内，例如在受试者的血液中扩增。

在一些实施例中，根据本发明的分离细胞包含一种失活基因，其选自由以下组成的群组：CD52、GR、PD1、CTLA-4、LAG3、Tim3、BTLA、BY55、TIGIT、B7H5、LAIR1、SIGLEC10、2B4、HLA、TCRα和TCRβ；和/或表达CAR、多链CAR和/或pTα转基因。在一些实施例中，分离细胞包括编码构成多链CAR的多肽的聚核苷酸。在一些实施例中，根据本发明的分离细胞包含两种失活基因，其选自由以下组成的群组：CD52和GR、CD52和TCRα、CDR52和TCRβ、GR和TCRα、GR和TCRβ、TCRα和TCRβ、PD-1和TCRα、PD-1和TCRβ、CTLA-4和TCRα、CTLA-4和TCRβ、LAG3和TCRα、LAG3和TCRβ、Tim3和TCRα、Tim3和TCRβ、BTLA和TCRα、BTLA和TCRβ、BY55和TCRα、BY55和TCRβ、TIGIT和TCRα、TIGIT和TCRβ、B7H5和TCRα、B7H5和TCRβ、LAIR1和TCRα、LAIR1和TCRβ、SIGLEC10和TCRα、SIGLEC10和TCRβ、2B4和TCRα、2B4和TCRβ；和/或表达CAR、多链CAR和pTα转基因。

在一些实施例中，通过使TCRα基因和/或TCRβ基因失活，使TCR在根据本发明的细胞中呈现为非功能性的。在一些实施例中，提供一种获得源自个体的修饰细胞的方法，其中所述细胞可不依赖于主要组织相容性复合体(MHC)信号传导通路增殖。易于通过这一方法获得的可不依赖于MHC信号传导通路增殖的修饰细胞涵盖于本发明范围中。本文中所公开的修饰细胞可用于治疗需要对抗宿主抗移植物(HvG)排斥反应和移植物抗宿主疾病(GvHD)的个体；因此，在本发明范围内，是一种治疗需要对抗宿主抗移植物(HvG)排斥反应和移植物抗宿主疾病(GvHD)的个体的方法，其包含通过将有效量的修饰细胞给予所述个体来治疗所述个体，所述修饰细胞包含失活的TCRα和/或TCRβ基因。

在一些实施例中，免疫细胞经工程化而对一种或多种化疗药物具有抗性。所述化疗药物可为例如，嘌呤核苷酸类似物(PNA)，由此使得免疫细胞适用于进行结合过继免疫治疗和化疗的癌症治疗。示例性PNA包括例如氯法拉滨(clofarabine)、氟达拉滨(fludarabine)和阿糖胞苷，其呈单独或组合形式。PNA是通过脱氧胞苷激酶(dCK)代谢成单、二和三磷酸酯PNA。其三磷酸酯形式与ATP竞争DNA合成，充当促细胞凋亡剂，并为参与三核苷酸制造的核糖核苷酸还原酶(RNR)的有效抑制剂。本文提供包含失活dCK基因的FLT3特异性CAR-T细胞。在一些实施例中，通过例如mRNA的电穿孔，使用编码针对dCK基因的特异性TAL-核酸酶的聚核苷酸，通过转染T细胞来得到dCK基因敲除细胞。dCK基因敲除FLT3特异性CAR-T细胞对PNA，包括例如氯法拉滨和/或氟达拉滨，具有抗性，并维持T细胞对表达FLT3的细胞的细胞毒活性。

在一些实施例中，本发明的分离细胞或细胞系可包含pTα或其功能变异体。在一些实施例中，分离细胞或细胞系可通过使TCRα基因失活而进一步经基因修饰。

在一些实施例中，CAR-T细胞包含编码***多肽的聚核苷酸，如RQR8。参加例如，WO2013153391A，其以全文引用的方式并入本文中。在包含聚核苷酸的CAR-T细胞中，***多肽在CAR-T细胞的表面处表达。在一些实施例中，***多肽包含SEQ ID NO:227中所示的氨基酸序列。

CPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV(SEQ IDNO:227)。

***多肽还可包含处于氨基末端的信号肽。在一些实施例中，***多肽包含SEQID NO:228中所示的氨基酸序列。

MGTSLLCWMALCLLGADHADACPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV(SEQ ID NO:228)。

当***多肽在CAR-T细胞的表面处表达时，利妥昔单抗与多肽的利妥昔单抗表位的结合引起细胞裂解。在细胞表面处表达的每个多肽可结合多于一个利妥昔单抗分子。多肽的每个利妥昔单抗表位可结合单独的利妥昔单抗分子。FLT3特异性CAR-T细胞的删除可在体内进行，例如通过向受试者给予利妥昔单抗。删除转移细胞的决定可能由受试者中侦测到的可归因于转移细胞的不合需要的影响，如当侦测到不可接受的水准的毒性时而产生。

在一些实施例中，在给予患者后，在细胞表面处表达本文所述的FLT3特异性CAR中的任一种的工程化免疫细胞可减少、杀伤或裂解患者的表达FLT3的内源性细胞。在一个实施例中，通过表达本文所述的FLT3特异性CAR中的任一种的工程化免疫细胞实现的表达FLT3的内源性细胞或表达FLT3的细胞系的细胞的减少或裂解百分比为至少约或大于10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一个实施例中，通过表达本文所述的FLT3特异性CAR中的任一种的工程化免疫细胞实现的表达FLT3的内源性细胞或表达FLT3的细胞系的细胞的减少或裂解百分比为约5％至约95％、约10％至约95％、约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约10％至约60％、约10％至约50％、约10％至约40％、约20％至约90％、约20％至约80％、约20％至约70％、约20％至约60％、约20％至约50％、约25％至约75％或约25％至约60％。在一个实施例中，表达FLT3的内源性细胞为表达FLT3的内源性骨髓细胞。

在一个实施例中，通过在细胞表面膜处表达本发明的FLT3特异性CAR的工程化免疫细胞实现的靶细胞，例如表达FLT3的细胞系的减少或裂解百分比可使用实例2e中所公开的测定来测量。

分选CAR阳性免疫细胞的方法

在一个方面，提供用于对免疫细胞群进行体外分选的方法，其中免疫细胞群的子组包含表达FLT3特异性CAR中的任一种的工程化免疫细胞，所述FLT3特异性CAR包含对本文所述的单克隆抗体具有特异性的表位。所述方法包含使免疫细胞群与对表位具有特异性的单克隆抗体接触，并选择结合于单克隆抗体的免疫细胞以获得富含表达FLT3特异性CAR的工程化免疫细胞的细胞群。

在一些实施例中，对所述表位具有特异性的所述单克隆抗体任选地结合于荧光团。在这一实施例中，选择结合于单克隆抗体的细胞的步骤可通过荧光激活细胞分选术(FACS)进行。在一些实施例中，对所述表位具有特异性的所述单克隆抗体任选地结合于磁粒。在这一实施例中，选择结合于单克隆抗体的细胞的步骤可通过磁激活细胞分选术(MACS)进行。

在一些实施例中，CAR的胞外结合域包含SEQ ID NO:262的mAb特异性表位。在一些实施例中，CAR的胞外结合域包含SEQ ID NO:262的mAb特异性表位，并且用于接触免疫细胞群的抗体为QBEND-10。

在一些实施例中，CAR的胞外结合域包含SEQ ID NO:229的mAb特异性表位。在一些实施例中，CAR的胞外结合域包含SEQ ID NO:229的mAb特异性表位，并且用于接触免疫细胞群的抗体为利妥昔单抗。

在一些实施例中，当使用上文所述的用于对免疫细胞进行体外分选的方法时获得的表达FLT3 CAR的免疫细胞群包含至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％表达FLT3 CAR的免疫细胞。在一些实施例中，当使用上文所述的用于对表达CAR的免疫细胞进行体外分选的方法时获得的表达FLT3 CAR的免疫细胞群包含至少85％表达FLT3 CAR的免疫细胞。

在一些实施例中，如所属领域的技术人员常规地意识到，体外分选方法中所用的mAb先前结合于负载物(如柱)或珠粒上。在一些实施例中，表达CAR的免疫细胞为T细胞。

根据本发明，向接受体给予的细胞可自源群在体外富集。扩增源群的方法为所属领域中熟知的，并可包括选择表达抗原(如CD34抗原)的细胞，使用密度离心、免疫磁珠纯化、亲和色谱法和荧光激活细胞分选的组合，均为所属领域的技术人员已知的。

流式细胞术普遍用于所属领域中并为所属领域的一般技术人员所熟知的分选和量化细胞群中的特定细胞类型的方法。一般来说，流式细胞术为一种主要通过光学手段对细胞的组分或结构特征进行定量的方法。由于不同细胞类型可通过对结构特征定量来区分，因此流式细胞术和细胞分选可用于对混合物中的不同表型的细胞进行计数和分选。

流式细胞测量分析涉及两个基本步骤：1)用一种或多种经标记的标记物标记所选细胞类型，和2)测定相对于群中的细胞总数的标记细胞数。

标记细胞类型的主要方法为通过使标记抗体结合于经特定细胞类型表达的标记物来进行。抗体直接标记有荧光化合物或使用例如，识别第一抗体的经荧光标记的第二抗体间接标记。

在一些实施例中，用于对表达CAR的免疫细胞进行分选的方法为磁激活细胞分选(MACS)。

磁激活细胞分选(MACS)为一种取决于细胞群表面抗原(CD分子)，通过使用超顺磁纳米粒子和柱分离多种细胞群的方法。其采取数个简单步骤即获得纯细胞群。单细胞悬浮液中的细胞磁标记有微珠。将样品施加于由铁磁性球体构成的柱，其覆盖有允许快速和平缓分离细胞的细胞友好型涂层。未经标记的细胞会通过而经磁标记的细胞保留在柱中。流过物可收集作为未经标记的细胞部分。短暂的洗涤步骤之后，从分隔件去除所述柱，并使经磁标记的细胞从柱洗脱。

在一些实施例中，对表达CAR的免疫细胞进行分选的方法中所用的mAb选自阿仑单抗、替伊莫单抗、莫罗单抗-CD3、托西莫单抗、阿昔单抗、巴利昔单抗、本妥昔单抗、西妥昔单抗、英利昔单抗、利妥昔单抗、贝伐单抗、培塞利珠单抗、达利珠单抗、艾库组单抗、依法利珠单抗、吉妥珠单抗、那他珠单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、兰比珠单抗、托西利单抗、曲妥珠单抗、维多珠单抗、阿达木单抗、贝利单抗、卡那单抗、地诺单抗、戈利木单抗、伊匹单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、QBEND-10或优特克单抗。在一些实施例中，所述mAb为利妥昔单抗。在另一实施例中，所述mAb为QBEND-10。

治疗应用

表达FLT3特异性CAR的由上文所述的方法获得的分离细胞或源自所述分离细胞的细胞系可用作药剂。同样，本文中所公开的FLT 3特异性抗体可用作药剂。在一些实施例中，此类药剂可用于治疗FLT3相关疾病或病状。在一些实施例中，FLT3相关疾病或病状包含表达FLT3的恶性细胞，例如癌症。在一些实施例中，癌症为造血源癌症，如淋巴瘤或白血病。在一些实施例中，癌症为多发性骨髓瘤、恶性浆细胞赘瘤、霍奇金氏淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主型霍奇金氏淋巴瘤、卡勒氏病和骨髓瘤病、浆细胞白血病、浆细胞瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性骨髓白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性骨髓白血病(CML)、滤泡性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、前体B成淋巴细胞性淋巴瘤、骨髓白血病、华氏巨球蛋白血症、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、小细胞淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、原发纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、结内边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、富T细胞/组织细胞大B细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性皮肤弥漫性大B细胞淋巴瘤(腿型)、老年人EBV阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤、与炎症相关的弥漫性大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、出现于HHV8相关多中心型卡斯尔曼病中的大B细胞淋巴瘤、具有介于弥漫性大B细胞淋巴瘤与伯基特淋巴瘤之间的特征的未分类的B细胞淋巴瘤、具有介于弥漫性大B细胞淋巴瘤和经典霍奇金氏淋巴瘤之间的特征的未分类的B细胞淋巴瘤或其它造血细胞相关癌症。在一示例性实施例中，癌症为AML。在一示例性实施例中，癌症为ALL。

在一些实施例中，根据本发明的分离细胞或衍生自分离细胞的细胞系或抗体可用于制造用于治疗有需要的受试者的癌症的药剂中。

本文还提供治疗受试者的方法。在一些实施例中，所述方法包含向有需要的受试者提供本发明免疫细胞。在一些实施例中，所述方法包含向有需要的受试者给予本发明的经转化的免疫细胞的步骤。在一些实施例中，所述方法包含向有需要的受试者给予本发明抗体。

在一些实施例中，本发明T细胞可经历稳健体内T细胞扩增并可存留延长的时间量。

本发明的治疗方法可进行减轻、治愈或预防。本发明方法可为自体免疫疗法的一部分或同种异体免疫疗法治疗的一部分。本发明尤其适用于同种异体免疫疗法。来自供体的T细胞可使用标准方案转化成非同种异体反应性细胞，并按需再现，由此产生可向一个或若干个受试者给予的CAR-T细胞。所述CAR-T细胞疗法可以“现成的”治疗产品形式得到。

可以与所公开的方法一起使用的细胞描述在前一章节中。治疗可用于治疗诊断患有例如癌症的受试者。可经治疗的癌症包括例如(但不限于)涉及B淋巴细胞的癌症，包括上文所列的癌症中的任一种。待用本发明的CAR和CAR-T细胞治疗的癌症类型包括(但不限于)某些白血病或淋巴恶性疾病。还包括成人肿瘤/癌症和小儿肿瘤/癌症。在一些实施例中，治疗可与一种或多种对抗癌症的疗法组合，所述疗法选自抗体疗法、化疗、细胞因子疗法、树突状细胞疗法、基因疗法、激素疗法、激光疗法和放疗的群组。

在一些实施例中，可向经历免疫抑制治疗的受试者给予治疗。实际上，本发明一般依赖于细胞或细胞群，其已归因于编码所述免疫抑制剂的受体的基因失活而对至少一种免疫抑制剂具有抗性。在这一方面，免疫抑制治疗应在受试者中辅助选择和扩增根据本发明的T细胞。根据本发明的细胞或细胞群的给予可以任何适宜方式，包括通过气雾吸入、注射、注入、输注、植入或移植来进行。可向受试者皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌肉内、通过静脉内或***内注射或腹膜内给予本文所述的组合物。在一些实施例中，通过静脉内注射来给予本发明的细胞组合物。

在一些实施例中，给予细胞或细胞群可包含每千克体重给予例如约10⁴至约10⁹个细胞，包括那些范围内的细胞数量的所有整数值。在一些实施例中，给予细胞或细胞群可包含每千克体重给予例如约10⁵至10⁶个细胞，包括那些范围内的细胞数量的所有整数值。可以一个或多个剂量给予细胞或细胞群。在一些实施例中，所述有效量的细胞可以单一剂量给予。在一些实施例中，所述有效量的细胞可在一段时间内以多于一个剂量给予。给药的时间安排在管理医师的判断中并取决于受试者的临床病状。细胞或细胞群可由任何来源，如血库或供体获得。尽管个体需求会有所改变，但针对特定疾病或病状的给定细胞类型的有效量的最佳范围的确定在所属领域的技术范围中。有效量意指提供治疗或预防益处的量。所给予的剂量将取决于接受体的年龄、健康状况和重量、同时进行的治疗的种类(如果存在)、治疗频率和所需作用的性质。在一些实施例中，有效量的细胞或包含所述细胞的组合物肠胃外给予。在一些实施例中，给药可为静脉内给药。在一些实施例中，给药可通过在肿瘤中注射直接进行。

在本发明的一些实施例中，结合(例如，之前、同时或之后)任何数目的相关治疗模态向个体给予细胞，所述模态包括(但不限于)使用药剂的治疗，如单克隆抗体疗法、CCR2拮抗剂(例如，INC-8761)、抗病毒疗法、西多福韦(cidofovir)和白介素-2、阿糖胞苷(也称为ARA-C)或那他珠单抗治疗(针对MS患者)或依法利珠单抗治疗(针对牛皮癣患者)或针对PML患者的其它治疗。在一些实施例中，结合以下中的一种或多种向受试者给予FLT3特异性CAR-T细胞：抗PD-1抗体(例如，纳武单抗、派立珠单抗或PF-06801591)、抗PD-L1抗体(例如，艾维路单抗、阿特珠单抗或度伐单抗(durvalumab))、抗OX40抗体(例如，PF-04518600)、抗4-1BB抗体(例如，PF-05082566)、抗MCSF抗体(例如，PD-0360324)、抗GITR抗体和/或抗TIGIT抗体。结合抗PD-L1抗体艾维路单抗向受试者给予包含SEQ ID NO:236所示的氨基酸序列的FLT3特异性CAR。在另外的实施例中，本发明T细胞可与化疗、放射、免疫抑制剂(如环孢素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯)和FK506、抗体或其它免疫消融剂(如CAMPATH)、抗CD3抗体或其它抗体疗法、細胞毒素、氟达拉滨、环孢素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和/或辐射组合使用。这些药物抑制钙依赖磷酸酶钙调神经磷酸酶(环孢灵和FK506)或抑制p70S6激酶，其对于生长因子诱导的信号传导(雷帕霉素)至关重要(Henderson,Naya等人1991；Liu,Albers等人1992；Bierer,Hollander等人1993)。在另外的实施例中，本发明T细胞可与受体酪氨酸激酶抑制剂(如米哚妥林(Midostaurin)和舒尼替尼(Sunitinib))、mTOR抑制剂(如雷帕霉素和依维莫司(Everolimus))、表观遗传调节剂(如伏立诺他(Vormostat))、蛋白酶体抑制剂(如硼替佐米(Bortezomib))、免疫调节剂(如来那度胺)、刺猬抑制剂(如伊莫德吉(Erismodegib))和PF-04449913或异柠檬酸脱氢酶(IDH)抑制剂(如AG-120和AG-221)组合使用。在另一实施例中，结合(例如，之前、同时或之后)以下向受试者给予本发明的细胞组合物：骨髓移植、使用如化疗剂(如氟达拉滨、外部射束放射疗法(XRT)、环磷酰胺)或抗体(如OKT3或CAMPATH)的T细胞消融疗法，在一些实施例中，在B细胞消融疗法(如与CD20反应的药剂，例如美罗华(Rituxan))之后给予本发明的细胞组合物。例如，在一些实施例中，受试者可经历伴随大剂量化疗的标准治疗，继之以周边血液干细胞移植。在某些实施例中，在移植之后，受试者接受本发明的扩增免疫细胞的输注。在一些实施例中，在手术之前或之后给予扩增细胞。

在一些实施例中，提供一种从给予有所述细胞的个体耗竭表达FLT3特异性CAR的工程化免疫细胞的方法。耗竭可通过抑制或消除进行。

在一个方面，耗竭包含对单克隆抗体具有特异性的表位的表达FLT3特异性CAR的工程化免疫细胞的方法包含使所述工程化免疫细胞与对表位具有特异性的单克隆抗体接触。

在一些实施例中，从给予有包含对单克隆抗体具有特异性的表位的表达FLT3特异性CAR的工程化免疫细胞的受试者耗竭的方法包含向所述受试者给予对表位具有特异性的单克隆抗体。在这些实施例中，向受试者给予对CAR的胞外域中所存在的表位具有特异性的单克隆抗体会从受试者消除或抑制表达CAR的工程化免疫细胞的活性。在一个方面，表达CAR的工程化免疫细胞的耗竭允许恢复表达FLT3的细胞的内源性群。

在一个方面，本发明涉及一种用于促进给予有在细胞表面表达FLT3特异性CAR的工程化免疫细胞的受试者的表达FLT3的内源性细胞恢复的方法，所述FLT3特异性CAR包含对单克隆抗体具有特异性的表位，所述方法包含向受试者给予对表位具有特异性的单克隆抗体。在一些实施例中，表达FLT3的内源性细胞为表达FLT3的内源性骨髓细胞。在一个方面，术语“恢复”是指增加表达FLT3的内源性细胞的数目。表达FLT3的内源性细胞的数目可由于表达FLT3的内源性细胞的增殖的增加和/或由于表达FLT3 CAR的工程化免疫细胞减少消除表达FLT3的内源性细胞而增加。在一些实施例中，向受试者给予单克隆抗体会耗竭受试者中表达FLT3 CAR的工程化免疫细胞并增加表达FLT3的内源性细胞，例如表达FLT3的内源性骨髓祖细胞的数目。在一个实施例中，与给予单克隆抗体之前的表达FLT3的内源性细胞的数目相比，向受试者给予单克隆抗体使表达FLT3的内源性细胞的数目增加至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。

在一个方面，提供一种治疗受试者的FLT3介导性病症的方法，所述方法包含：(a)向受试者给予在细胞表面处表达包含对一种或多种单克隆抗体具有特异性的一种或多种表位的FLT3特异性CAR的工程化免疫细胞；和(b)之后通过向受试者给予对表位具有特异性的一种或多种单克隆抗体而从受试者耗竭工程化免疫细胞。

在一些实施例中，用于耗竭表达CAR的工程化免疫细胞的方法中所用的mAb选自阿仑单抗、替伊莫单抗、莫罗单抗-CD3、托西莫单抗、阿昔单抗、巴利昔单抗、本妥昔单抗、西妥昔单抗、英利昔单抗、利妥昔单抗、贝伐单抗、培塞利珠单抗、达利珠单抗、艾库组单抗、依法利珠单抗、吉妥珠单抗、那他珠单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、兰比珠单抗、托西利单抗、曲妥珠单抗、维多珠单抗、阿达木单抗、贝利单抗、卡那单抗、地诺单抗、戈利木单抗、伊匹单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、QBEND-10、优特克单抗和其组合。

在一些实施例中，对单克隆抗体具有特异性的所述表位(mAb特异性表位)为CD20表位或模拟表位，例如，SEQ ID NO.229，并且对表位具有特异性的mAb为利妥昔单抗。

在一些实施例中，向受试者给予单克隆抗体的步骤包含用向受试者输注单克隆抗体。在一些实施例中，向受试者给予的表位特异性mAb的量足以在受试者中消除至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％表达CAR的免疫细胞。

在一些实施例中，向受试者给予单克隆抗体的步骤包含每周一次或若干次向受试者输注375mg/m²利妥昔单抗。

在一些实施例中，当表达包含mAb特异性表位的CAR的免疫细胞(表达CAR的免疫细胞)在使用表位特异性mAb的CDC测定中耗竭时，表达CAR的活免疫细胞的量下降例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

在一些实施例中，细胞毒性药物偶联于用于耗竭表达CAR的免疫细胞的表位特异性mAb。通过使单克隆抗体的靶向能力结合细胞毒性药物的细胞杀伤能力，当相较于使用单独的药物时，抗体-药物结合物(ADC)提供健康和病变组织之间的敏感辨别。若干ADC已得到市场批准；其制造技术(尤其利用接头)大量展现在以下现有技术中(Payne,G.(2003)《癌细胞(Cancer Cell)》3:207-212；Trail等人(2003)《癌症免疫与免疫疗法(CancerImmunol.Immunother.》)52:328-337；Syrigos和Epenetos(1999)《抗癌研究(AnticancerResearch)》19:605-614；Niculescu-Duvaz和Springer(1997)《先进药物递送评论(Adv.Drug Del.Rev.)》26:151-172；美国专利第4,975,278号)。

在一些实施例中，预先结合能够促进补体依赖细胞毒性(CDC)的分子输注表位特异性mAb。因此，补体系统辅助或补充抗体从生物体清除病原体的能力。当受到若干中之一刺激时，由于应答的大规模扩增和杀伤细胞的攻膜复合物的活化而触发活化级联。可使用不同分子结合mAb，如聚糖[Courtois,A,Gac-Breton,S.,Berthou,C,Guezennec,J.,Bordron,A.和Boisset,C.(2012),治疗抗体片段的补体依赖细胞毒活性通过免疫原性聚糖偶联得到(Complement dependent cytotoxicity activity of therapeutic antibodyfragments is acquired by immunogenic glycan coupling),《生物技术电子杂志(Electronic Journal of Biotechnology》)ISSN:0717-3458；http://www.ejbiotechnology.info DOI:10.2225/voll5-第5期)。

试剂盒

本发明还提供供用于本发明方法中的试剂盒。本发明试剂盒包括一个或多个容器，其包含如本文所述的编码FLT3特异性CAR的聚核苷酸、包含编码FLT3特异性CAR的聚核苷酸的工程化免疫细胞或FLT特异性抗体；以及根据本文所述的本发明方法中的任一种的使用说明书。通常，这些说明书包含针对上述治疗性治疗给予工程化免疫细胞的描述。

与如本文所述的工程化免疫细胞或抗体的使用有关的说明书大体上包含关于预期治疗的剂量、投药时程和给药途径的信息。容器可为单位剂量、散装(例如多剂量包装)或亚单位剂量。虽然本发明试剂盒中供应的说明书通常为在标签或药品说明书(例如试剂盒中包括的纸片)上的书面说明书，但机器可读说明书(例如磁盘或光盘存储盘上载有的说明书)也是可接受的。

本发明的试剂盒呈适合包装形式。合适包装包括(但不限于)小瓶、瓶子、罐、柔性包装(例如密封聚酯薄膜或塑料袋)等。还涵盖用于与特定装置(例如吸入器、经鼻投药装置(例如雾化器)或输注装置(例如小型泵))组合的包装。试剂盒可具有无菌进入孔(例如容器可为静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。容器也可具有无菌进入孔(例如容器可为静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为FLT3特异性CAR或FLT3特异性抗体。容器可进一步包含第二医药活性剂。

试剂盒可任选地提供另外组分(如缓冲剂)和说明性信息。通常，试剂盒包含容器和在容器上或与容器相结合的标记或药品说明书。

以下实例仅出于说明性目的提供，并且不打算以任何方式限制本发明的范围。实际上，所属领域的技术人员将根据前文描述显而易知除本文所展示和所描述的修改之外的本发明各种修改，并且所述修改处于所附权利要求书的范围内。

本发明的代表性物质在2017年6月1日保藏在弗吉尼亚州马纳萨斯10801大学大道(10801 University Boulevard)20110-2209的美国典型培养物保藏中心。具有ATCC登录号PTA-124228的载体P3E10-VL为编码P3E10轻链可变区的聚核苷酸，并且具有ATCC登录号PTA-124227的载体P3E10-VH为编码P3E10重链可变区的聚核苷酸。在《出于专利申请程序的微生物保藏取得国际承认的布达佩斯条约和其法规(Budapest Treaty on theInternational Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose ofPatent Procedure and Regulations thereunder)》的规定下进行保藏。这确保保藏的活培养物从保藏日开始维持30年。保藏将由ATCC根据布达佩斯条约的条款进行提供，并且受辉瑞公司(Pfizer,Inc.)和ATCC之间的合约约束，所述合约确保在颁布相关美国专利后或在任何美国或外国专利申请向公众公开后(无论哪个在先)，保藏的培养物的后代可供公众永久并不受限制地使用，并确保后代可供根据35U.S.C.章节122和依据其的专员规定(包括37C.F.R.章节1.14，特别参考886 OG 638)包括享有所有权的由美国专利和商标专员所确定的人使用。

本申请的受让人已同意，如果当在合适的条件下培育时，保藏中的物质的培养物死亡或损失或破坏，那么所述物质将迅速地根据通知用相同的另一物置换。保藏物质的可用性不应被解释为违反任何政府的职权部门根据其专利法授予的权利来实施本发明的许可。

实例

实例1：测定37℃下人类FLT3/FLT3抗体相互作用的动力学和亲和力

这一实例测定37℃下多种抗FLT3抗体的动力学和亲和力。所有实验均在BiacoreT200表面等离子体共振生物传感器(新泽西州皮斯卡特维通用生命科学(GELifesciences,Piscataway NJ))上进行。

传感器芯片制备在25℃下用10mM HEPES、150mM NaCl、0.05％(v/v)Tween-20，pH7.4的运作缓冲液进行。通过以10μL/min的流动速率，用400mM EDC和100mM NHS的1:1(v/v)混合物激活Biacore CM4传感器芯片的所有流动池持续7分钟来得到抗人类Fc传感器芯片。将抗人类Fc试剂(山羊抗人类IgG Fc、南方生物科技(SouthernBiotech)目录号#2081-01)在10mM乙酸钠(pH 4.5)中稀释到30μg/mL，并以20μL/min注射于所有流动池持续7分钟。以10μL/min用100mM乙二胺的150mM硼酸盐缓冲液(pH 8.5)封闭所有流动池持续7分钟。

在37℃下用10mM HEPES、150mM NaCl、0.05％(v/v)Tween-20，pH 7.4、1mg/mL BSA的运作缓冲液进行实验。以10μL/min的流动速率从未经稀释的上清液捕获FLT3抗体于流动池(流动池2、3和4)下游持续1分钟。将不同抗体捕获于每个流动池上。流动池1用作参考表面。捕获FLT3抗体之后，以30μL/min在所有流动池上注射分析物(缓冲液，hFLT3)持续两分钟。分析物注射之后，监测解离10分钟继之以用三种75mM磷酸的1分钟注射液重新产生所有流动池。对于每个所捕获的FLT3抗体，进行以下分析物注射：缓冲液、11nM hFLT3、33nMhFLT3、100nM hFLT3和300nM hFLT3。处于双参考目的针对每个所捕获的FLT3抗体收集缓冲液循环(双参考如Myszka,D.G.《改良生物传感器分析(Improving biosensor analysis.)》《分子识别杂志(J.Mol.Recognit.)》12,279-284(1999)中所述)。使双参考传感图总体拟合于简单的1:1朗格缪尔加质量输送结合模型(1:1Langmuir with mass transport bindingmodel)。

用于测试抗FLT3抗体的动力学和亲和力参数显示于表7中。表7中所示出的抗体共有与具有相同名称的表8中所示出的CAR相同的VH和VL区。

表7

实例2：FLT3特异性CAR-T细胞的生成

a)质粒

合成下表8中所列的以下经密码子优化的FLT3 CAR序列并使用EcoRI(5')和MluI(3')限制位点亚克隆于如pLVX EF1a-IRES-Puro(克隆科技公司(Clontech))的慢病毒载体中(由此去除IRES-Puro盒)。

表8：示例性FLT3特异性CAR

在一些实验中，编码CAR的序列前面是编码如蓝色荧光蛋白(BFP)的荧光蛋白的序列并通过编码自裂解2A肽的序列与所述序列隔开。使用psPAX2，一种HIV-1gag-pol封装质粒和pMD2.G，一种VSV-G表达质粒产生慢病毒。

b)T细胞活化和慢病毒转导

使用泛T细胞分离试剂盒(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))从人类外周血单核细胞分离未受影响的T细胞，并用抗人类CD2、CD3和CD28抗体活化所述T细胞三天(T细胞活化/扩增试剂盒-美天旎生物技术公司)。通过在6孔板中瞬时转染近汇合HEK-293T/17(美国典型培养物保藏中心(ATCC))细胞来产生慢病毒载体(LV)。简单来说，根据制造商说明书，使用脂染胺2000(英杰)，以4:3:1比率分别转染pLVX、psPAX2和pMD2.G质粒。第二天，将培养基置换成T细胞培养基(5％人类AB血清于X-vivo-15培养基(龙沙))，并在转染之后48小时，收集Lv上清液并经由0.45μm针筒过滤器(密理博(Millipore))加以过滤。以0.25×10⁶个细胞/毫升将活化T细胞接种于含有40ng/ml IL-2的T细胞培养基中，并通过添加相同体积的新制LV上清液来转导。将包含以下CAR构建体的LV用于这些实验中：P1A5、P1B4、P3A1、P3E10、P4C7、P4H11、P7H3、P9B5、P12B6和P14G2。在37℃和5％CO₂下培养细胞三天并将所述细胞用于流式细胞术分析或在含有20ng/ml IL-2的新制T细胞培养基中扩增。

c)通过流式细胞术测量转导效率

为了测定不同FLT3 CAR慢病毒构建体的转导效率，在转导之后72小时在T细胞上进行流式细胞术分析。简单来说，使用前向散射和侧向散射参数对单一细胞进行门控。在其它情况下，通过用抗CD20抗体利妥昔单抗，继之以经FITC结合的抗人类IgG染色侦测表达CAR的细胞，所述利妥昔单抗结合CAR分子中的CD20表位。图1显示活化T细胞在不同效率(30％至70％)下经不同FLT3 CAR构建体得到有效地转导。

d)FLT3FLT3 CAR-T细胞在培养期间分化但维持高百分比的记忆T细胞亚群

培养期间CAR-T细胞上的活化标记物CD25和4-1BB(CD137)的表达与T细胞耗竭和向效应记忆表型的分化的增加相关(Long等人，2015)。在这一实验中，在刺激后十天将用P1A5、P1B4、P3A1、P3E10、P4C7、P4H11、P7H3、P9B5、P12B6和P14G2CAR转导的T细胞用CD25和CD137抗体染色并通过流式细胞术分析。通过对CD25和4-1BB呈阳性的CAR-T细胞的百分比测定T细胞活化的程度。包括未经转导(NT)的T细胞群以供比较(图2)。一些FLT3FLT3 CAR(P1A5、P12B6和P14G2)的表达与“活化”状态相关(图2)，而包括P9B5、P3E10、P4C7和P3A1的其它FLT3FLT3 CAR的表达产生与未经转导的细胞相当的活化标记物的量(图2)。较高的活化标记物表达量转译为CAR-T细胞的分化增加，其可到刺激后第15天通过测量其细胞表面上的CD62L和CD45RO的表达来评定。在这一实验中，使用特异性抗体用所述标记物对CAR-T细胞进行染色，并且所述细胞分类成伴随增加的分化程度的四种不同类别或亚群：1)CD62L^高D45RO^低干细胞记忆(Tscm)细胞；2)CD62L^高CD45RO^高中心记忆(Tcm)细胞；CD62L^低D45RO^高效应记忆(Tem)细胞；和CD62L^低CD45RO^低效应(Teff)细胞。图3显示P9B5 CAR-T细胞(低分化)和P14G2 CAR-T细胞(高分化)的代表性FACS图和在刺激后第15天的所有不同FLT3FLT3 CAR-T细胞的T细胞亚群组合物。到培养结束时，展现“活化”表型的CAR-T细胞还显示更多分化表型(即较高百分比的Tem细胞和较低百分比的Tscm细胞)(图3)。确切地说，P9B5、P3A1、P7H3和P3E10FLT3 CAR的表达与高百分比的干细胞记忆和中心记忆细胞相关，其与ALL和CLL受试者中增加之存留性和抗肿瘤功效相关(Xu等人,《血液》2014；123(24):3750-3759)。

e)体外增殖和长期杀伤活性测定

CAR-T细胞增殖和裂解表达同源抗原的靶细胞的能力为评定其体外活性的有效方式。为了通过荧光监测靶细胞存活力，稳定地转导表达FLT3的Molm13细胞以表达荧光素酶基因。随后将这些Luc+靶细胞与FLT3 CAR-T细胞一起培育，并通过荧光和活细胞计数来分别测量CAR-T细胞的杀伤活性以及增殖。对于经设计以强调效应细胞(CAR-T细胞)的更严格的测定，将新靶细胞定期添加到初始培养物中，并在培养结束时通过荧光测定CAR-T细胞的长期杀伤活性(图4)。与干细胞记忆和中央记忆T细胞的较高增殖能力一致，P9B5、P3A1、P7H3和P3E10 CAR-T细胞群显示较高靶向物依赖性扩增和长期的体外细胞毒活性，而具有较高分化程度的CAR-T细胞，如P12B6和P14G2，在靶细胞存在下扩增不佳并具有降低的杀伤活性。

f)原位小鼠测定中的FLT3特异性CAR-T细胞的活性

这一实例说明使用Eol1原位模型用FLT3 CAR-T细胞处理AML。在原位模型中用表达荧光素酶和GFP的Eol1细胞进行FLT3 CAR-T细胞的体内功效研究。经由尾静脉将三十万Eol1 Luc2AGFP细胞静脉内注射于6-8周龄雌性CB17/SCID动物中。腹膜内注射D-荧光素(伊利诺伊州莫顿格罗夫(Morton Grove,IL)Regis Technologies公司)(以15mg/mL，每只动物200μL)，继之以用异氟醚麻醉，和随后进行的全身生物发光成像(BLI)实现监测肿瘤负荷。通过使用IVIS Spectrum CT(马萨诸塞州珀金埃尔默(Perkin Elmer,MA))成像捕获由肿瘤细胞表达的荧光素酶与荧光素之间的相互作用所发射的生物发光信号，并使用LivingImage 4.4(加利福尼亚州阿拉米达卡立泊生命科学公司(Caliper Life Sciences,Alameda,CA))将所述信号量化为总通量(光子数/秒)。

当对于所有动物，总通量达到30E6的平均值(肿瘤植入后第10天)时，将动物随机分为三组。向各组给予以下细胞中的一种：1)未经转导的T细胞用作对照，2)表达P3E10的FLT3 CAR-T细胞(“P3E10 V1”)或3)表达P3A1的FLT3 CAR-T细胞(“P3A1 v1”)。所有1-3细胞均具有TCRα。如以上实例中所述制备FLT3 CAR-T细胞。FLT3 CAR构建体P3E10和P3A1显示于上表8中。经由尾静脉快速注射给予单一剂量的250或500万对照(NT)或FLT3 CAR-T(P3E10或P3A1)细胞。当其总体重减轻超过15％(Eol1原位模型的一个指标)时，处死动物。

研究结果汇总在图5中。相较于阴性对照，单一剂量的500万P3E10或P3A1 FLT3CAR-T细胞或250万P3E10 FLT3 CAR-T细胞从肿瘤植入后第13-43天产生较低总通量。因此，相较于阴性对照，用FLT3 CAR-T细胞处理抑制了肿瘤进展。

这些结果证明FLT3 CAR-T细胞有效地抑制肿瘤进展。

实例3：表达CD20表位的FLT3特异性CAR T细胞的耗竭

a)在利妥昔单抗存在下，表达CD20表位的FLT3特异性CAR T细胞对补体依赖细胞毒性(CDC)敏感

使用CDC测定体外评估在抗CD20抗体存在下，FLT3特异性CAR T细胞对补体的敏感性。对于这一实验，在存在或不存在利妥昔单抗(100μg/mL)下，将用慢病毒构建体转导以表达在胞外域中含有CD20表位的FLT3 CAR的T细胞与25％补体(AbD serotec)混合并在37℃和5％CO₂下培育4小时。使用生物素化FLT3蛋白，通过流式细胞术分析测定FLT3 CAR-T细胞的耗竭。图6显示在抗体和补体存在下，表达FLT3 CAR和CD20表位的细胞高效耗竭，而未表达CD20表位的对照FLT3特异性CAR T细胞受到的影响最小。

这些结果证明，在利妥昔单抗和补体存在下，表达CD20表位的FLT3特异性CAR-T细胞可体外耗竭。

b)给予利妥昔单抗后FLT3 CAR T细胞的耗竭使得NSG小鼠中表达FLT3的骨髓祖细胞得到恢复

在小鼠中测试抗CD20抗体利妥昔单抗介导表达CD20表位的FLT3特异性CAR T细胞的耗竭并促进骨髓恢复的能力。在这一实验中，用表达可结合于骨髓祖细胞表面上的小鼠FLT3蛋白并包含被利妥昔单抗识别的CD20表位的FLT3 CAR的T细胞(α-小鼠FLT3 CAR T)或表达对照CAR的T细胞处理小鼠，其中可以忽略与小鼠FLT3蛋白的结合。骨髓细胞的流式细胞术分析用于证明对表达FLT3的造血祖细胞的CAR T细胞细胞毒活性，与接受对照CAR T细胞的小鼠或未经处理小鼠相比，看出祖细胞有所减少。(图7，图区B)。确认CAR T细胞杀伤活性之后，向小鼠给予利妥昔单抗持续连续四天，并在第13天通过流式细胞术对循环残余CART细胞进行计数。图7，图区C显示，与未接受利妥昔单抗的对照组相比，这些小鼠的血液中的FLT3 CAR T细胞耗竭。最后，骨髓细胞的流式细胞术分析证明，仅接受利妥昔单抗的小鼠(第20天)显示骨髓恢复(图7，图区D)。

这一实验证明，表达CD20表位的FLT3 CAR T细胞的利妥昔单抗依赖性耗竭减轻了对如骨髓的表达FLT3的组织的损伤，使得骨髓从残余祖细胞得到快速恢复。

尽管已描述关于多种应用、方法、试剂盒和组合物的所公开的传授内容，但应了解，可在不脱离本文中的传授内容和以下所要求的发明的情况下做出多种变化和修改。提供上述实例以较好地阐明所公开的传授内容并且不打算限制本文中呈现的传授内容的范围。虽然已在这些示例性实施例方面描述本传授内容，但熟练技术人员将容易理解在不过度实验情况下这些示例性实施例的大量变化和修改是可能的。所有这类变化和修改都在现有传授内容的范围内。

本文中列举所有参考(包括专利、专利申请、论文、文本等等以及其中列举的参考文献(在一定程度上其并没有引入))以全文引用的方式由此并入本文中。在所并入的文献和类似材料中的一个或多个(包括(但不限于)定义术语、术语用法、所述技术等)与本申请不同或抵触的情况下，以本申请为准。

前述描述和实例详述了本发明的某些特定实施例并描述了发明人设想的最佳模式。然而，应理解，无论前述内容在文本中的详细程度如何，本发明可以以多种方式实践，并且本发明应根据所附权利要求书和其任何等同物来解释。