一种具有抗癌生物活性的碳点及制备方法
阅读说明：本技术 一种具有抗癌生物活性的碳点及制备方法 (Carbon dots with anticancer bioactivity and preparation method thereof ) 是由 张涛 王雅泓 曹永平 郭一民 左磊 李卓扬 于 2020-06-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种碳点及其制备方法与应用。该碳点是按照包括下述步骤的方法制备得到的：采用脉冲电解法或激光辐照法制备成碳点；所述碳点,其粒度小于1000nm；其组成成分中碳原子的个数大于50％。该碳点具有诱导肿瘤细胞凋亡的效果。对正常的人外周淋巴细胞也没有任何毒副作用。体内外的研究证明,该材料能够显著抑制肿瘤细胞的生长,诱导癌症细胞死亡；在裸鼠移植瘤的模型中,明显抑制肿瘤的生长,并对小鼠的重要器官没有明显影响。(The invention discloses a carbon dot and a preparation method and application thereof. The carbon dots are prepared according to a method comprising the following steps: preparing carbon dots by adopting a pulse electrolysis method or a laser irradiation method; the carbon dots have a particle size of less than 1000 nm; the number of carbon atoms in the composition is more than 50%. The carbon dots have the effect of inducing apoptosis of tumor cells. Has no toxic and side effect on normal human peripheral lymphocytes. In vivo and in vitro researches prove that the material can obviously inhibit the growth of tumor cells and induce cancer cell death; in a model of nude mice transplanted tumor, the growth of tumor is obviously inhibited, and the important organs of the mice are not obviously influenced.)
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种具有抗癌活性碳点及其制备方法与应用。
背景技术
多年来癌症的诊断和治疗一直是各国重点开展的研究领域，虽然在抗癌的药物和方法两方面都不断取得进展和突破，到目前为止，癌症仍然是威胁人类生命和健康的重大疾患之一。目前癌症的治疗手段主要有手术切除、放射治疗、化学治疗以及免疫治疗等，不能达到人们期望的效果。手术切除不仅造成对身体的程度不同的损伤，而且对已处于癌细胞扩散状态的患者往往不具备手术治疗的条件。放射治疗、化学治疗以及免疫治疗等在治疗过程中不仅治愈效果有限，而且普遍存在毒副作用。因此，面对癌症发病率的不断提升，需要开发低毒副作用或无毒副作用的抗癌药物。
研究文献报道小于一定尺寸的碳点可以到达细胞膜和细胞质，不同粒径的碳点能够到达细胞内的部位，可用不同粒径的碳点标记细胞的不同部位。利用碳点与癌细胞融合成像后研究的实验结果表明：在与细胞孵育后碳点能成功进入细胞。对碳点表面进行特定修饰后，碳点能更好地与癌细胞结合。目前的研究仅局限在利用碳点具有的这些特性对癌细胞的标记和成像试剂。由于碳点癌细胞器官和部位的普遍作用特性，其对细胞的生理过程也将产生影响。但碳点对癌细胞生物活性产生影响的研究未见报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种具有抗癌生理活性的碳点。
所述碳点是通过激光辐照或电解法将石墨制备成碳点。
所述激光辐照法具体可为脉冲激光辐照；所述电解法具体可为脉冲电解法。
所述石墨可为天然石墨或人造石墨，所述石墨的形状不限，可为片状、块状或粉状。
本发明所制备的碳点的粒径为小于1000纳米的以碳元素为主的颗粒。
本发明所制备的碳点，其组成成分中碳原子百分比大于50％。所述碳点内部和表面可含有水、其他元素或官能团(如含氧官能团-OH、C-O-C等)。
根据本发明的一个实施方式，采用如下方法制备碳点胶体溶液，具体包括下述步骤：
将所述石墨结构碳制成电极浸入水或含有电解质的水溶液中，采用平均电压1-10V和平均电流1-30A的20KHz-40KHz脉冲电流或电化学循环伏安扫描，利用蒸馏水或饮用水中的离子氢离子、氢氧根离子或其它带有正电或负电的离子从石墨结构原料电极材料的缺陷处剥落碳点，得到碳点溶胶。
根据本发明的一个实施方式，采用如下方法制备碳点胶体溶液，具体包括下述步骤：
用激光辐照水或乙醇等有机溶剂的石墨粉悬浊液，石墨粉作为激光辐照靶材，激光辐照在溶剂中靶材与溶液界面处，脉冲激光对靶材消融,制成碳点溶胶。
所述石墨粉悬浊液中石墨粉的浓度为10-1000mg/l。
所述激光波长为532nm，10ns的激光；所述辐照的时间为0.5-10小时，也可连续照射。所述辐照的时间根据辐照的石墨的量进行调节。如果辐照的量大，可以适当延长辐照时间。
本发明的再一个目的是提供上述碳点以及碳点胶体溶液的应用。
本发明所提供的应用是碳点和/或碳点胶体溶液在制备预防和/或治疗癌症药物中的应用，或在制备抑制癌细胞增殖药物中的应用。
所述的癌症包括本领域中已知的各种癌症(实体癌或非实体癌)，包括但不限于：肝癌、骨肉瘤、淋巴癌、骨髓瘤、宫颈癌、结肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、白血病。
所述的癌细胞包括肝癌细胞、骨肉瘤细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞、宫颈癌细胞、结肠癌细胞、非小细胞肺癌细胞、乳腺癌细胞、食管癌细胞、白血病细胞。
所述肝癌细胞具体可为人肝癌HepG2细胞；所述骨肉瘤细胞具体可为骨肉瘤143B细胞。
以碳点和/或碳点胶体溶液为活性成分制备的预防和/或治疗癌症的药物也属于本发明的保护范围。
所述预防和/或治疗癌症的药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
上述药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明的优点：碳点以简单的材料来源，低廉的制作成本，快速合成，具有水溶性好和生物毒性低，良好的生物相容性，环境友好等优点，并且由于其颗粒尺度小，其在细胞中迁移快，也能可以通过肾脏排出体外，整个实验过程中没有表现出毒性反应。由于本发明具有以上所述的许多优点，在抗癌领域中有广阔的应用前景。
本发明的体内外实验研究证明，碳点能够显著抑制肿瘤细胞的生长，诱导癌症细胞死亡，在裸鼠移植瘤的模型中，明显抑制肿瘤的生长，但对小鼠的重要器官没有明显影响，相反能够提供重要的保护作用。对正常的人外周淋巴细胞也没有任何毒副作用；通过自愿的形式，给予大量各类末期肿瘤病人口服，取得了很好的临床效果。
研究表明其对癌细胞的抑制机理为：通体外细胞实验可以得出碳点对不同恶性程度的肿瘤细胞表现出了时间-剂量依赖性的细胞毒性，说明碳点可通过某种途径引起肿瘤细胞的死亡，综合现有对碳点的研究，碳点可通过经典的线粒体凋亡通路诱发肿瘤细胞的凋亡(图4)。
附图说明
图1为采用石墨脉冲电解法制备的碳点透射电镜照片
图2为石墨脉冲电解法制备的碳点红外吸收光谱(傅里叶红外光谱)。
图3为脉冲电解法制备的碳点Emission Wavelength发射光谱。
图4为脉冲电解法制备的碳点Excitation Wavelength激发光谱。
图5为采用石墨脉冲激光辐照法制备的碳点透射电镜照片
图6为石墨脉冲激光辐照制备的碳点红外吸收光谱(傅里叶红外光谱)。
图7为脉冲激光辐照法制备的碳点Emission Wavelength发射光谱。
图8为脉冲激光辐照法制备的碳点Excitation Wavelength激发光谱。
图9碳量子点溶胶的浓度和处理时间对人体肝癌细胞(HepG2)的体外细胞毒性的影响。
图10为脉冲电解法制备的碳点线粒体凋亡通路。
图11为CCK-8法测定脉冲电解法制备的碳点对HepG2细胞的细胞毒性。
图12为CCK-8法测定脉冲电解法制备的碳点对143B细胞的细胞毒性。
图13为胃灌脉冲电解法制备的碳点后对小鼠各组织病理(HE染色)的照片。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、采用石墨脉冲电解法制备碳点及含有人参碳点胶体溶液
利用石墨制成电极浸入水中，采用平均电压5V，电流变化范围为3-10A的20KHz脉冲电流，利用水离子的振动作用从石墨结构原料靶材的缺陷处剥落碳点，制成粒径尺度小于1000nm的碳点溶胶；
图1为采用石墨脉冲电解法制备的碳点透射电镜照片，碳点呈球形，直径在小于10nm，且多表现为单分散状。根据测定，多数碳点的直径范围在5-10nm。图2为电化学法制备碳点傅里叶红外光谱。组成化学键或官能团的原子处于不断振动的状态，其振动频率与红外光的振动频率相当。所以，用红外光照射有机物分子时，分子中的化学键或官能团可发生振动吸收，不同的化学键或官能团吸收频率不同，在红外光谱上将处于不同位置，从而可获得分子中含有何种化学键或官能团的信息。图2所示3436cm-1处为羟基(-OH)的伸缩振动峰，2956cm-1与1453cm-1处是C-H的振动峰，1629cm-1处的吸收峰表明存在酰胺基1045cm-1处的吸收信号表明存在C-O-C官能团，538cm-1处表示C-C＝O的弯曲振动。1714cm-1处为C＝O的伸缩振动峰，1253cm-1处的吸收峰表明存在C-O官能团，866cm-1处表示存在C-C的伸缩振动。由此可以看出碳点表面存在很多含氧官能团(如-OH、C-O-C等)，这些含氧官能团使碳点具有良好的亲水性和在水中的稳定性。
图3为激发光波长不变情况下碳点的Emission Wavelength发射光谱,又称荧光光谱。测定样品发射出不同波长的荧光，波长为横坐标，以其强度F为纵坐标作图。325nm激发波长下碳点的荧光光谱。可以看出此激发波长下的荧光最大发射波长约为460nm。
图4为保持荧光发射波长不变碳点Excitation Wavelength激发光谱。测定不同波长的激发光激发下得到的荧光强度F。然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，就可得到该荧光物质的激发光谱。激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大激发波长，是激发荧光最灵敏的波长。图3为400nm发射波长下纳米颗粒的激发光谱，可以看出最大激发波长约为390nm。可以看出纳米颗粒具有光致发光性。
一般能发生荧光的物质，其分子都含有共轭双键(π键)的结构体系，因为共轭体系含有容易被激发的非定域π电子。共轭体系越大，电子的离域性越大，越容易被激发，荧光强度也较强。从图3图4可以看出，颗粒具有光致发光性，结合图2的结论，荧光物质的分子在特定条件下吸收激发光能量后，分子呈激发态而极不稳定，当其迅速回到基态时，能以电磁辐射形式释放出所有的光能。荧光物质分子中含有共轭双键这样的强吸收基团，且共轭体系越大，π电子的离域性越强，越易被激发而产生荧光。荧光物质的取代基对荧光强度有很大的影响。给电子取代基(如-OH)使共轭体系增大，导致荧光增强。而吸收电子取代基如(-COOH)则使荧光减弱。从图1中可以看出，颗粒表面含有-OH和-COOH，这些基团互相作用可能使得颗粒的荧光强度不高。
实施例2、采用脉冲激光辐照法制备碳点及含有碳点胶体溶液
采用脉冲激光辐照法制备碳点与脉冲电解法制备的碳点相似。
具体制备方法如下：用激光辐照30L石墨粉乙醇悬浊液(浓度为500mg/L)，石墨粉作为激光辐照靶材，激光辐照在溶剂中靶材与溶液界面处，脉冲激光对靶材消融,制成碳点溶胶。
所述激光波长为532nm，10ns的激光；所述辐照的时间为1小时。
图5为采用脉冲激光辐照法制备的碳点透射电镜照片，碳点呈球形，直径在10nm以内，且多表现为单分散状。根据测定，多数碳点的直径范围在5-10nm。图6为脉冲激光辐照法制备碳点傅里叶红外光谱。图6所示3439cm-1处为羟基(-OH)的伸缩振动峰，2923cm-1、1443cm-1、860cm-1与625cm-1处是C-H的振动峰，1629cm-1处的吸收峰表明存在酰胺基。1725cm-1处为C＝O的伸缩振动峰，1235cm-1处的吸收峰表明存在C-O官能团。所得到的碳点表面存在很多含氧官能团(如-OH、C＝O等)，这些含氧官能团使碳点具有良好的亲水性和在水中的稳定性。
图7为激发光波长不变情况下碳点的Emission Wavelength发射光谱,又称荧光光谱。测定样品发射出不同波长的荧光，波长为横坐标，以其强度F为纵坐标作图。325nm激发波长下碳点的荧光光谱。可以看出此激发波长下的荧光最大发射波长约为440nm。
图8为保持荧光发射波长不变碳点Excitation Wavelength激发光谱。400nm发射波长下纳米颗粒的激发光谱，可以看出最大激发波长约为470nm。可以看出纳米颗粒具有光致发光性。从图7图8可以看出，颗粒具有光致发光性，结合图6的结论，颗粒表面含有-OH和-COOH。
实施例3、脉冲电解法(实施例1)制备的碳点的体外药效验证
采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)和流式细胞仪CCK-8评价了碳点对人体肝癌细胞(HepG2)的毒性如图9所示。在处理72h后，C2组和C3组展现出高于其它组的细胞毒性，而低浓度组(C1组)在测试期内展现的毒性不显著。结果表明一定条件下碳点溶胶对肿瘤细胞具有显著的毒性(C2和C3处理72h)。光学显微镜观测结果进一步验证了溶胶浓度对细胞毒性的影响(图9(b)-(d))。图9(a)碳点溶胶的浓度(C1＝69μgmL-1、C2＝138μgmL-1、C3＝276μgmL-1)和处理时间(24、48、72h)对人体肝癌细胞(HepG2)的体外细胞毒性的影响。误差线表示标准偏差(n＝3)。*P<0.05，与对照组相比。与不同浓度的碳点溶胶孵化72小时后，HepG2的代表性光学显微照片。(b)对照组，(c)C2和(d)C3。数据表明，HepG2细胞活性受到了抑制，并且溶胶浓度和时间会对这种抑制效果产生影响，验证了脉冲电解法(实施例1)制备的碳点的体外药效。
实施例4、脉冲电解法(实施例1)制备的碳点体内药效验证
将143B人骨肉瘤细胞制成1×107/L的细胞悬液，用1mL注射器吸取0.2mL注射在已消毒的裸鼠后后侧背部皮下，进针已穿透裸鼠整个皮层而又不进入肌层和腹腔为宜，待细胞悬液打进后用无菌镊子轻夹1min，防止细胞悬液漏出。每只裸鼠进行右后肢背侧皮下单点注射，待四周后裸鼠注射处肿瘤明显成型(100mm3)。
将30只BALB/c荷瘤裸鼠随机分成2组，每组各15只，实验组:高浓度276微克/毫升碳点(CNC)；对照组:0.9％生理盐水。各组均胃灌药物0.5ml，按以上分组及药物连续胃灌30天，每天1次，定期观察肿瘤的生长情况。
通过给正常小鼠灌胃碳点的体内动物实验表明：碳点通过线粒体凋亡通路导致肿瘤凋亡(如图10所示)。碳点对小鼠的体重、血常规、生化指标及重要器官脏器病理均无明显影响(图13)；通过给骨肉瘤裸鼠胃灌碳点，可见肿瘤体积有明显的缩减(见表1)。我们推测碳点抗不仅有直接抗肿瘤性，还可能通过免疫调控来抗肿瘤。
表1胃灌碳点对裸鼠肿瘤体积变化的影响
(*与对照组比较P＜0.05)
选取恶性程度较低的人肝癌HepG2细胞系来验证碳点对骨肉瘤细胞的作用。选用CCK-8法来测定碳点对HepG2细胞的细胞毒性。由图11可见随着碳点浓度的增加及时间的推移，三种浓度碳点均在72h时表现出对143B细胞明显的增殖抑制性，且高浓度效果最好。可见碳点对肿瘤细胞的毒性为时间-剂量依赖性。
选取恶性程度较高的骨肉瘤143B细胞系来验证碳点对骨肉瘤细胞的作用。选用CCK-8法来测定碳点对143B细胞的细胞毒性。由图12可见随着碳点浓度的增加及时间的推移，高浓度碳点在48h及72h时表现出对143B细胞明显的增殖抑制性。也可见碳点对肿瘤细胞的毒性为时间-剂量依赖性。
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