阅读说明：本技术 基于激发态分子内质子转移型的化合物及其制备方法和应用 (Compound based on excited state intramolecular proton transfer type and preparation method and application thereof ) 是由 唐本忠 倪侦翔 李美雪 林荣业 于 2018-07-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种基于激发态分子内质子转移型化合物及其制备方法和应用。本发明合成的一系列基于激发态分子内质子转移型荧光化合物易于合成,并且显示出良好的聚集诱导发光特性,作为生物荧光探针不仅能对脂滴、内质网、溶酶体细胞器进行特异性标记,在光照条件下还能产生消灭癌细胞的活性氧簇,对于推进生物荧光检测技术和光动力疗法的诊疗一体化,具有相当重要的意义与价值。(The invention relates to an excited state intramolecular proton transfer type compound and a preparation method and application thereof. A series of fluorescent compounds synthesized by the invention based on excited state intramolecular proton transfer are easy to synthesize, show good aggregation-induced emission characteristics, can be used as a biological fluorescent probe for specifically marking lipid drops, endoplasmic reticulum and lysosome organelles, can generate active oxygen clusters for killing cancer cells under the illumination condition, and have important significance and value for promoting the diagnosis and treatment integration of a biological fluorescent detection technology and a photodynamic therapy.)

基于激发态分子内质子转移型的化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及检测分析技术领域，具体涉及一种基于激发态分子内质子转移的化合物及其制备方法和应用。

背景技术

激发态分子内质子转移(Excited-state intramolecular proton transfer，ESIPT)是指当探针分子受光激发后，发生在激发态分子内部邻近的质子给体与质子受体之间的质子转移过程。此时，激发态的烯醇式结构通过ESIPT过程迅速转变为激发态的酮式异构体，导致一个大斯托克斯位移的发射。衰减到基态后，酮式异构体通过反向的质子转移过程，恢复为先前的烯醇结构。ESIPT型染料在短波长区的发射为正常激发态所产生的荧光，在长波长区的发射为ESIPT过程所产生的互变异构体荧光，透过这一机制很适合用于设计聚集诱导发光(Aggregation-induced emission，AIE)型荧光材料。AIE发光材料(AIE分子、AIE荧光团、AIEgen)在溶液中几乎不发光，在固态或聚集态下发光增强，其结构的设计策略，主要理论依据为分子内运动受限(RIM)机理模型，即分子内运动导致激发态分子的能量以非辐射形式衰减，产生弱的荧光发射。当这些分子聚集时，彼此的牵制作用限制了分子内部的运动，降低能量的耗散，增加光输出的能量比例，从而表现出荧光增强的现象。经过近二十年的发展，具有AIE特性的材料几乎在众多发光材料领域得到应用，包含刺激响应及可逆型传感的智能材料、可调谐折射率的液晶或偏振光材料、高效率的有机发光二极管器件和照明材料、光波导材料、生物传感探针、以及在生物体系中的细胞器、病毒、细菌或血管成像等荧光探针。

细胞器组成了细胞的基本结构，使细胞能正常的工作和运转，主要有细胞核、线粒体、内质网、脂滴、高尔基体、核糖体等，近年来的研究报导，人体疾病与细胞器的异常息息相关。例如(一)脂滴(Lipid droplet)是一种动态储存脂肪的细胞器，主要功能是动态调节细胞的能量平衡，与合成脂类分子的内质网、能量动力车间线粒体等细胞器有着密切的联系，提供细胞和生物有机体能量，为细胞内重要的能量贮存器。多种代谢性疾病，如肥胖、脂肪肝、心血管疾病及糖尿病、中性脂贮存性疾病和C型尼曼氏疾病，往往都伴随着脂质贮存的异常。(二)溶酶体(Lysosomes)由高尔基体断裂产生，主要是消化作用，内部含有多种水解酶能分解衰老或损伤的细胞器，吞噬并杀死入侵的病毒或细菌。细胞内的消化器官、细胞自溶、防御，以及对某些物质的利用均与溶酶体的消化作用有关。近年来，溶酶体与肿瘤的关系日益引起人们的关注，包含(1)致癌物质引起细胞***调节的机能及染色体畸变；(2)某些影响溶酶体膜通透性的物质(如巴豆油)有着促进致癌作用及细胞异常***的引发因子；(3)溶酶体代谢过程中的某些产物是肿瘤细胞增殖的物质基础；(4)致癌物质进入细胞与染色体整合之前，总是先贮存在溶酶体等问题，尚待进一步探索。(三)内质网(Endoplasmic reticulum)由生物膜构成的相互通连的片层隙状或小管状系统，主要作为细胞内物质运输的通路，以及提供细胞内的酶反应所需的反应面积。粗面内质网主要功能是合成分泌蛋白质；滑面内质网主要参与类固醇、脂类的合成与运输，糖代谢及激素的灭活等。近年来，关于重要细胞器的生物学研究日益受到人们的重视，主要研究重点在于寻找和确定各种细胞器(如脂滴、溶酶体、内质网)能特异性标记，或者能对特定物种、器官和组织的细胞器进行标记的工作。因此，针对现有技术中关于生物荧光标记探针，如商业化的二吡咯探针，存在高制备成本、低稳定性、低灵敏性等诸多问题。本发明将提出一种简易、高收率且能大批量生产的高性能的生物荧光探针，透过ESIPT效应所展现的AIE特性，能有效应用于生物荧光检测技术及光动力疗法的诊疗一体化研究和未来市场。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于激发态分子内质子转移型化合物及其制备方法和应用，解决现有技术中的商业化标记探针高制备成本、高自身吸收、低稳定性、低灵敏性等问题。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：一种基于激发态分子内质子转移型的化合物，所述化合物的结构式为式I所示的结构式：

其中，Ar₁选自下述任一结构式的基团：

Ar₂为H或者选自下述任一结构式的基团：

Ar₃选自下述任一结构式的基团：

其中，R₁和R₂分别各自独立地选自H、CF₃、氰基、硝基、卤素、羟基、胺基、任选被取代的烷基、烷胺盐基、烷氧基、烷硫基、烯基、炔基、环烷基、环烷基氧基、环烷基硫基、酰基、芳基、杂环基、杂芳基、杂环烷基、单烷基胺基或二烷基胺基；阴离子X选自卤素根离子、羟根离子、三氟甲磺酸根离子、硝酸根离子、六氟磷酸根离子。

在本发明的化合物中，所述Ar₁、Ar₂和Ar₃分别各自独立地选自下述任一结构式的基团：

在本发明的化合物中，所述Ar₁、Ar₂和Ar₃分别各自独立地选自：

在本发明的化合物中，所述化合物选自式I’至III’所示的结构式中的一种：

在本发明的化合物中，所述化合物选自下述结构式中的一种：

本发明还提供了上述的化合物的制备方法，包括：将式II所示的酮或醛基结构式化合物和式III所示的间羟基醛腙芳香化合物置于有机溶剂中(此称为母液)，室温搅拌得到式I所示的结构式的反应产物；其中，式II和式III如下：

具体工艺如下：

进一步地，在本发明的制备方法中，将得到的式I所示的结构式的反应产物母液冰浴后，过滤得到固体粗产物和滤液A，再利用冷的有机溶剂稍微洗涤后，过滤得到固体成品和滤液B。其中，有机溶剂可以是乙醇、甲醇、丙酮等等，优选为乙醇。

更进一步地，将滤液A和滤液B经由减压浓缩所得到的粗产品，再加入冷的有机溶剂洗涤后，过滤得到另一批纯的ESIPT型固体化合物，进而提高产品的产率。其中，有机溶剂可以是乙醇、甲醇、丙酮等等，优选为乙醇。

本发明还提供了上述的化合物在制备用于特异性标记细胞器的生物荧光探针中的应用。

在该应用中，所述细胞器包括脂滴、溶酶体和内质网。

本发明还提供了上述的化合物在制备用于标示肿瘤细胞、正常细胞、淡水藻和咸水类海藻的细胞器的生物荧光探针、辨识细菌的荧光探针、发光二极管、光电放大器、光信息存储器、液晶显示器、光波导材料、生物传感器或逻辑门、无损读出的生物探针中的应用。

本发明还提供了上述的化合物在制备用于光动力疗法抗癌制品中的应用或在制备用于生物荧光检测技术和光动力疗法的诊疗一体化的制品中的应用，这里的制品可以是药物、药物组合物、试剂盒等等。

本发明还提供一种体外检测细胞特异性标记方法，如HeLa细胞等等肿瘤细胞的脂滴、溶酶体、内质网，包括如下步骤：

A、使用上述化合物处理细胞；

B、通过荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜检测细胞成像。

术语和定义

术语“卤素”代表氟、氯、溴和碘，特别是氟或氯，优选为氟。

术语“烷基”代表一类仅含有碳、氢两种原子的直链或支链烷基团，例如C1-10烷基是指具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的直链或支链烷基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、2-乙基丁基、2-乙基己基、2-丁基辛基。优选烷基含有1、2、3或4个碳原子(C1-4烷基)，例如甲基、乙基、正丙基或正丁基。

术语“烯基”一般意指直链或支链、含有2-20个碳原子且含有1个或多个双键，例如乙烯基、丙烯基、(E)-2-甲基乙烯基或(Z)-2-甲基乙烯基。

术语“炔基”一般意指直链或支链、含有2-12个碳原子且含有2个或多个双键，例如乙炔基、丙炔基、2-丁炔基或2-戊炔基。

术语“烷氧基”一般意指通过氧原子键合的直链或支链烷基，其中术语“烷基”具有上述定义，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、戊氧基或其异构体。优选烷氧基含有1或2个碳原子(C1-2烷氧基)，例如甲氧基或乙氧基。

术语“烷硫基”一般意指通过硫原子键合的直链或支链烷基，其中术语“烷基”具有如上所述定义。

术语“环烷基”一般意指直链或支链、含有3-8个碳原子的饱和单环烃环，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基。优选环烷基含有5、6或7个碳原子(C5-7环烷基)，例如环戊基、环己基或环庚基。

术语“环烷基氧基”一般意指通过氧原子键合的直链或支链环烷基，其中术语“环烷基”具有如上所述的定义。

术语“环烷基硫基”一般意指通过硫原子键合的直链或支链环烷基，其中术语“环烷基”具有如上所述的定义。

术语“芳基”一般意指芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环，其包含6-14个碳原子，特别是具有6个碳原子的环(例如苯环基或联苯环基)、具有9个碳原子的环(例如茚基)、具有10个碳原子的环(例如二氢化奈基或萘基)、具有13个碳原子的环(例如芴基)或具有14个碳原子的环(例如葱基)。优选芳基为含有1-4个碳原子“烷氧基”取代的苯环基。

术语“杂环基”一般意指含有饱和或部分饱和的单环或双环烃环，其含有5-8个碳原子且含有1-3个选自氧、硫或氮的含杂原子基团。例如呋喃基、噻吩基、吡咯基、噻唑基、噻二唑基、恶唑基、咪唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基或吡喃基。优选杂环基为噻吩基、吡啶基或其含有1-4个碳原子(C1-4烷基)取代杂环基。

术语“杂芳基”一般意指苯环与杂环稠合在一起的化合物基团，例如喹啉基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并恶唑基、吲哚基或嘌呤基。

术语“杂环烷基”一般意指含有3-7个碳原子和1-3个氧、硫或氮杂原子所构成的杂环基团，例如哌啶基、羟基哌啶基、菲诺哌啶基、哌嗪基、N-甲基哌嗪基、四氢化吡咯基、四氢化呋喃基、四氢化噻吩基、***林基或噻嗪基。优选杂环烷基为哌啶基、N-甲基哌嗪基或***林基。

术语“单烷基胺基”一般意指胺基(NH₂)的1个氢被“烷基”所取代，其中术语“烷基”具有如上所述的定义。例如甲基胺基、乙基胺基、丙基胺基、丁基胺基或其异构体。

术语“二烷基胺基”一般意指胺基(NH₂)的2个氢被“烷基”所取代，其中术语“烷基”具有如上所述的定义。例如二甲基胺基、二乙基胺基、二丙基胺基、二丁基胺基或其异构体。优选二烷基胺基为二甲基胺基或二乙基胺基。

术语“杂原子”一般意指含有1个或多个氧、硫或氮原子。

术语“任选取代的”一般意指结构中的氢被所述取代基取代。除非另有说明，任选取代的基团可以在该基团每一个可取代的位置上具有取代基，或者在结构中的多于一个位置可以被取代。

本文使用的数值范围“C1-10”以及其所包含的亚范围一般意指具有限定数量的1-10个原子，亦即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个原子；其中包含碳原子数量范围的“C1-10”以及其所包含的亚范围一般意指具有限定数量的1-10个碳原子基团，亦即包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子基团。

合适的取代基一般选自卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、硝基、氰基、羟基、C1-6二烷基胺基、N-甲基哌嗪基或***林基。

实施本发明的基于激发态分子内质子转移(ESIPT)型的化合物及其制备方法和应用，具有以下有益效果：本发明提供的简易、高收率且能大批量生产的一系列基于特性型荧光化合物易于合成，并且显示出良好的AIE特性，作为生物荧光探针与商业化的标记探针相比，对细胞器脂滴、溶酶体、内质网具有高重叠效率的特异性标记，并且在光照环境下，能产生消灭癌细胞的活性氧簇，具有作为光动力疗法的潜值，对于生物荧光检测技术在诊疗一体化的领域具有相当重要的意义与价值。

附图说明

图1是简易且大批量制作功能型AIE靶向探针的示意图；

图2是AP-DEA在THF溶液中的归一化紫外-可见光吸收光谱和光致发光(PL)光谱(浓度：10μM，激发波长：390nm)；

图3是AP-ML在THF溶液中的归一化紫外-可见光吸收光谱和光致发光(PL)光谱(浓度：10μM，激发波长：360nm)；

图4是AP-PZ在THF溶液中的归一化紫外-可见光吸收光谱和光致发光(PL)光谱(浓度：10μM，激发波长：360nm)；

图5是AP-DEA在激发态进行分子内质子转移的示意图；

图6是AP-DEA在吸收、烯醇式发射和酮式发射的相对能阶图和分子轨道图；

图7是AP-DEA在不同含乙醇率(f_E，vol％，体积％)的THF/乙醇混合物中的PL谱图(浓度：10μM，激发波长：380nm)；

图8是AP-DEA的酮式发射相对于烯醇式发射的PL峰强度(I/I₀)与THF/乙醇混合物的含乙醇率(f_E，体积％)之间关系图(浓度：10μM，激发波长：380nm)；

图9是AP-ML在不同含乙醇率(f_E，vol％，体积％)的THF/乙醇混合物中的PL谱图(浓度：10μM，激发波长：380nm)；

图10是AP-ML的酮式发射相对于烯醇式发射的PL峰强度(I/I₀)与THF/乙醇混合物的含乙醇率(f_E，体积％)之间关系图(浓度：10μM，激发波长：380nm)；

图11是AP-PZ在不同含乙醇率(f_E，vol％，体积％)的THF/乙醇混合物中的PL谱图(浓度：10μM，激发波长：380nm)；

图12是AP-PZ的酮式发射相对于烯醇式发射的PL峰强度(I/I₀)与THF/乙醇混合物的含乙醇率(f_E，体积％)之间关系图(浓度：10μM，激发波长：380nm)；

图13是AP-DEA、AP-ML和AP-PZ在THF溶液下的荧光衰减曲线图(IRF为仪器响应函数)；

图14是AP-DEA、AP-ML和AP-PZ在固态粉末状态下的荧光衰减曲线图(IRF为仪器响应函数)；

图15是AP-DEA晶体分析中的单分子的晶体结构；

图16是AP-DEA晶体分析中的晶包结构图；

图17是AP-DEA晶体分析中的分子间的排列图；

图18是AP-DEA晶体分析中的分子间的作用力图(键长单位：)；

图19是AP-ML晶体分析中的单分子的晶体结构；

图20是AP-ML晶体分析中的晶包结构图；

图21是AP-ML晶体分析中的分子间的排列图；

图22是AP-ML晶体分析中的分子间的作用力图(键长单位：)；

图23是AP-PZ晶体分析中的单分子的晶体结构；

图24是AP-PZ晶体分析中的晶包结构图；

图25是AP-PZ晶体分析中的分子间的排列图；

图26是AP-PZ晶体分析中的分子间的作用力图(键长单位：

)；

图27是AP-DEA、AP-ML和AP-PZ的光动力疗法的数据分析图；DCFH为活性氧簇的指示剂；激发波长：480nm；发射波长：525nm；

图28是共聚焦激光扫描显微镜检测HeLa细胞于AP-DEA和商业化的二吡咯探针共染和的明场和暗场图；激发波长：405nm(AP-DEA)和488nm(二吡咯)；发射滤光片：490-600nm(AP-DEA)和570-700nm(二吡咯)；图像使用的比例尺为20μm；

图29是共聚焦激光扫描显微镜检测HeLa细胞于AP-ML和商业化的ER-Tracker Red探针共染和的明场和暗场图；激发波长：405nm(AP-ML)和560nm(ER-Tracker Red)；发射滤光片：490-600nm(AP-ML)和570-700nm(ER-Tracker Red)；图像使用的比例尺为20μm；

图30是共聚焦激光扫描显微镜检测HeLa细胞于AP-PZ和商业化的LysoTrackerDeep Red探针共染和的明场和暗场图；激发波长：405nm(AP-PZ)和560nm(LysoTrackerDeep Red)；发射滤光片：490-600nm(AP-PZ)和570-700nm(LysoTracker Deep Red)；图像使用的比例尺为20μm；

图31是使用不同浓度(0-10μM)AP-DEA探针于照光和避光下培育HeLa细胞的细胞活力的方块图；

图32是使用不同浓度(0-10μM)AP-ML探针于照光和避光下培育HeLa细胞的细胞活力的方块图；

图33是使用不同浓度(0-10μM)AP-PZ探针于照光和避光下培育HeLa细胞的细胞活力的方块图；

图34是AP-DEA和商业化的二吡咯探针标记的HeLa细胞随辐射时间增加的PL变化图；激发波长：405nm(AP-DEA)和488nm(二吡咯)；发射滤光片：490-600nm(AP-DEA)和570-700nm(二吡咯)；辐射时间：22.4秒/扫描；激光功率：0.3μW。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的基于激发态分子内质子转移型化合物及其制备方法和应用作进一步说明：

本发明采用间羟基醛腙芳香结构作为激发态分子内质子转移(ESIPT)型化合物的基底，如图1所示，开发易于合成且具有聚集诱导发光特性的ESIPT型化合物体系，作为生物荧光探针成功对细胞器脂滴、溶酶体、内质网进行特异性的标记技术，在生物荧光检测技术领域提供了一类光稳性佳、特异性标记佳且生物兼容性佳的荧光探针，在生物荧光检测技术等领域具有重要的意义与价值。

下面通过具体实施例进行详细说明。

实施例1：产品的制备

(1)合成AP-DEA

于100mL单口圆底瓶中，加入4-二甲胺基苯甲醛(4-diethylaminobenzaldehyde，DEA-P-CHO；1.77g，10mmol)、2-肼甲基-苯酚(2-hydrazonomethyl-phenol，H-AP；1.36g，10mmol)和乙醇(EtOH；20mL)溶剂，室温搅拌24小时。反应混合物冰浴至零度后，过滤并以冷的乙醇溶剂冲洗3次，得到亮黃色的AP-DEA固态产物，经由真空干燥后，无需进一步纯化得到亮黃色的AP-DEA产品(2.84g)，收率为96％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃),δ(ppm):11.85(s,1H),8.71(s,1H),8.49(s,1H),7.69(d,2H,J＝8.4Hz),7.34-7.30(m,2H),7.01(d,1H,J＝8.4Hz),6.92(t,1H,J＝7.4Hz),6.69(d,2H,J＝8.0Hz),3.45-3.39(m,4H),1.22-1.19(m,6H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃),δ(ppm):162.68,162.45,162.34,162.05,159.59,150.31,132.23,132.04,131.83,131.62,130.91,130.58,120.17,119.35,119.19,118.23,116.92,116.67,111.22,111.07,44.52,12.69,12.45.HRMS(MALDI-TOF):calcd for C₁₈H₂₁N₃O[M]⁺:295.1685,found:295.1675.

(2)合成AP-ML

于100mL单口圆底瓶中，加入4-吗啉苯甲醛(4-morpholinobenzaldehyde，ML-P-CHO；1.91g，10mmol)、2-肼甲基-苯酚(2-hydrazonomethyl-phenol，H-AP；1.36g，10mmol)和乙醇(EtOH；20mL)溶剂，室温搅拌24小时。反应混合物冰浴至零度后，过滤并以冷的乙醇溶剂冲洗3次，得到亮黃色的AP-ML固态产物，经由真空干燥后，无需进一步纯化得到亮黃色的AP-ML产品(2.88g)，收率为93％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃),δ(ppm):11.85(s,1H),8.74(s,1H),8.53(s,1H),7.76(d,2H,J＝8.8Hz),7.36-7.32(m,2H),7.02(d,1H,J＝8.0Hz),6.95-6.92(m,3H),3.88-3.85(m,4H),3.30-3.28(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃),δ(ppm):163.62,163.32,162.15,161.91,159.69,153.38,132.69,132.28,131.88,130.46,130.16,124.21,119.47,119.30,117.95,117.02,116.77,115.16,114.50,114.34,66.82,66.60,66.37,47.98,47.88.HRMS(MALDI-TOF):calcd for C₁₈H₁₉N₃O₂[M]⁺:309.1477,found:309.1476.

(3)合成AP-PZ

于100mL单口圆底瓶中，加入4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲醛(4-(4-methylpiperazin-1-yl)benzaldehyde，PZ-P-CHO；2.04g，10mmol)、2-肼甲基-苯酚(2-hydrazonomethyl-phenol，H-AP；1.36g，10mmol)和乙醇(EtOH；20mL)溶剂，室温搅拌24小时。反应混合物冰浴至零度后，过滤并以冷的乙醇溶剂冲洗3次，得到亮黃色的AP-PZ固态产物，经由真空干燥后，无需进一步纯化得到亮黃色的AP-PZ产品(3.07g)，收率为95％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃),δ(ppm):11.89(s,1H),8.72(s,1H),8.52(s,1H),7.73(d,2H,J＝8.8Hz),7.35-7.31(m,2H),7.02(d,1H,J＝8.0Hz),6.94-6.92(m,3H),3.38-3.35(m,4H),2.59-2.56(m,4H),2.36(s,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃),δ(ppm):163.41,163.11,162.29,162.04,159.68,153.29,132.21,130.40,130.09,123.72,119.42,118.01,116.99,116.74,115.34,114.66,114.50,54.77,47.56,46.24,45.94.HRMS(MALDI-TOF):calcd forC₁₉H₂₂N₄O[M]⁺:322.1794,found:322.1795.

(4)其他实施例产品，例如AP-TMAS、AP-PYS或AP-TPPS，合成步骤和条件同上述(1)～(3)。

实施例2：产品的光学和聚集诱导发光特性研究

以三个ESIPT型荧光产品(AP-DEA、AP-ML和AP-PZ)作为实施例进行说明，研究其光学性质和聚集诱导发光特性。其它产品同理，不再进行详细赘述。

(1)光学特性的研究

AP-DEA、AP-ML和AP-PZ在四氢呋喃(THF)溶液中的紫外-可见(UV-vis)吸收光谱和光致发光(PL)光谱分别如图2-4所示。三个产品在THF溶液的最大吸收波长介于372-391nm，烯醇式和酮式的发射波长分别位于433-457和535-541nm，酮式的斯托克斯(Stokes)位移高达155nm(AP-DEA)、169nm(AP-ML)和165nm(AP-PZ)。根据激发态分子内质子转移的特性，如图5和6所示，此类型分子具有两个典型的荧光放射，其中，针对酮式构型的荧光放射所造成大的斯托克斯位移，作为生物荧光检测技术所需的探针，能展現低背景干扰、低自吸收和高检测灵敏度等成像优点。此外，三个产品的吸收波段接近共聚焦激光扫描显微镜检测通常使用的405nm激发光源，相当有利于作为生物荧光技术所需的荧光探针。

(2)聚集诱导发光特性的研究

利用不同体积比的乙醇和四氢呋喃(THF)溶液环境对三个产品进行聚集诱导发光(AIE)特性的研究，如图7-12所示，三个分子在纯THF溶液中发光较弱，随着乙醇的体积比率(f_E)增加，分子因聚集导致酮式的荧光强度大大增强，相较之下，烯醇式的荧光强度大大减弱，主要由于分子间的聚集导致分子内质子转移效应增强的原故。观察酮式发射相对于烯醇式发射的荧光强度(K/E)在高的乙醇(体积比率99vol％)环境下，相较于纯THF溶液的荧光强度，AP-DEA、AP-ML和AP-PZ三个产品分别增强了11.0、5.9和5.6倍。研究结果表示，三个产品皆展现了良好的AIE特性，对应用于生物荧光成像而言，能展现良好的荧光成像效果。

(3)荧光寿命测量的研究

荧光材料的荧光寿命与自身的结构、所处微环境的极性、粘度等条件有关，因此通过荧光寿命测定可以直接了解材料在溶液下的单分子状态，以及不良溶剂或固态粉末下的分子聚集状态所发生的变化。如图13和14所示，针对酮式的荧光发射，AP-DEA、AP-ML和AP-PZ三个分子在THF溶液环境分别得到0.41、0.54和0.58纳秒的荧光寿命，在固态粉末环境分别得到1.31、0.94和1.02纳秒的荧光寿命。研究结果表示，三个产品在聚集状态皆有较长的荧光寿命，作为生物荧光探针靶向或堆积在重要细胞器时，分子将因聚集而表达出高的荧光寿命和讯号，相较于溶液下单分子状态的荧光强度，具有较高的检测讯号，这也是典型的AIE特性探针所具备的重要特色，相当具有应用于生物荧光探针的潜值。

(4)固态发光的研究

将三个产品通过THF和正己烷进行晶体培养，晶体结构如图15-26和表1所示，从晶体数据中观察到，(a)三个产品的分子构型极为平面，而且结构上的分子内氢键距离(N…H)分别1.911、1.890和1.917

相较于一般正常氢键

短，加上构成分子内氢键的N-H-O三原子的角度介在141.66–146.82°之间，相当有利于激发态分子进行ESIPT效应；(b)晶体单元分别以正交晶系(orthorhombic)和三斜晶系(triclinic)构成；(c)分子主要受分子间π…H和O…H的氢键作用力，限制了分子的运动，减弱激发态分子的无辐射能量损失，使得分子以辐射方式释放能量(即荧光或磷光发射)，展现出较佳的固态或聚集态发光特性；(d)分子间以交叉的方式排列，无明显的分子间π-π堆积，以至于激发态分子不易因聚集而导致荧光猝灭(ACQ)。此数据说明了，三个ESIPT型产品虽然构型极为平面，但在固体或聚集型态展现独特发光特性的原因所在，此研究更证实此类产品适用于生物成像。

表1：AP-DEA、AP-ML和AP-PZ的晶体数据汇总。

(5)光动力疗法的研究

为了研究三个产品生成活性氧簇的能力，以DCFH作为检测活性氧的指示剂，当DCFH遇到活性氧簇时，将产生绿色荧光的DCF化合物，藉由DCF增强的荧光强度速率，评估三个产品作为光动力疗法的价值。如图27所示，当单独检测三个产品和DCFH化合物时，在白色的LED灯光照20分钟后，相对的荧光强度无明显的增强现象。相较之下，将DCFH分别加入三个产品后，明显观察到，大幅增强的DCF荧光讯号，证明了三个产品在照光的环境下，能产生一系列的活性氧簇。其中，AP-DEA探针的生成一系列的活性氧簇的速率相对较佳。

实施例3：产品在脂滴特异性标记的应用

(1)细胞培养

人类***细胞(HeLa)由美国Type Culture Collection提供。HeLa细胞在含有10％热灭活的胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Thermo Scientific)的改性型培养基(MEM)培养基中培养，并且在37℃含有5％CO₂的湿化孵化器中保持。在实验前，细胞预先培养至达到融合。HeLa细胞在增补10％FBS、青霉素和链霉素的MEM培养基中的盖玻片上生长。

(2)荧光探针染色和细胞成像

使用磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗细胞一次，细胞在1-10μM的ESIPT型荧光探针的MEM培养基中再培养30分钟，接着，将荧光标记的细胞安装在标准的安装介质上，通过共聚焦激光扫描显微镜进行细胞成像。三个产品所选择的激发波长皆为405nm，发射长波通滤波器波长为490–600nm；商业化探针的激发波长条件为488nm(BODIPY493/503Green)和560nm(ER-Tracker Red和LysoTracker Deep Red)，发射长波通滤波器波长为570–700nm。如图28–30所示，三个ESIPT型产品(AP-DEA、AP-ML和AP-PZ)不仅能作为生物探针分别对脂滴、内质网、溶酶体细胞器进行特异性标记，而且相较于商业化的脂滴、内质网、溶酶体标记探针(BODIPY493/503Green、ER-Tracker Red和LysoTracker Deep Red)，皆呈现良好的重叠覆盖率。

(3)细胞毒性研究

使用噻唑蓝(MTT)试验三个ESIPT型探针对HeLa细胞的细胞毒性。将HeLa细胞接种在96孔板、强度为5000细胞/mL和0-10μM的ESIPT型荧光探针中，于37℃培育24小时后，将10微升的MTT溶液(5mg/mL于PBS溶液)加入每一个孔中，再培育4小时。接着，利用白光LED灯进行30分钟的照射实验，同时也制作一组避光实验的MTT样品作为参比。最后，加入100微升的二甲基亚砜(DMSO)溶液溶解紫色晶体,振荡15分钟后，使用Perkin-Elmer Victor酶标仪监测MTT在595nm处的吸亮度。通过经由ESIPT型探针培养的细胞与仅使用培养基培养的细胞的吸亮度来表达细胞活力。每个实验至少进行3次。如图31-33所示，在避光的环境下，HeLa细胞在高浓度(10μM)的AP-DEA、AP-ML和AP-PZ产品溶液中，依然有80％以上的生物兼容性。相较之下，光照环境下，因探针在癌细胞内产生一系列的活性氧簇，抑制了癌细胞的生长，甚至有可能消灭了部分的癌细胞，因此在高浓度探针的条件下，得到较低的生物活性，这也证明了，三个产品具有作为光动力疗法的价值，结合生物荧光探针技术，能实现诊疗一体化的应用工作。

(4)光稳定性研究

荧光标记的细胞使用共聚焦激光扫描显微镜成像，所选定的条件同上述(2)荧光探针染色和细胞成像。如图34所示，以AP-DEA此产品为例，相对于商业化二吡咯探针(BODIPY493/503Green)，本发明的AP-DEA产品皆展现高的光稳定性，原因来自于本发明的ESIPT型荧光探针在聚集态能呈现良好的AIE特性所致。此外，本发明在材料制备上具有简易的优点，更能突显本发明的ESIPT型荧光探针具有相当大的竞争力。

本发明仅以HeLa细胞为实施例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进或变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围内。内容包含对其他肿瘤细胞(如MCF-7细胞或MDA-MB-231细胞)或正常细胞(如COS-7细胞或MDCK-II细胞)的脂滴、内质网、溶酶体进行标记成像、对淡水或咸水类海藻的脂滴进行标记成像，或是采用ESIPT型化合物包覆成纳米探针在生物学上的应用。此外，考虑到该类化合物良好的固态发光性质，可作为发光层，有望用于有机发光二极管装置。

本发明所包含的信息，在未脱离下述权利要求的精神和保护范围下，本发明各种偏离精确的描述，对于与本发明相关的本领域技术人员来说是显而易见的。本发明并不认为限制在所定义的程序、性质或组成的范围内，因为优选的实施例和其他描述只用于说明目前提供发明的特定方面。对于在化学、生物化学或相关领域的技术人员来说，实现本发明于各种修改的描述模式，都应属于本发明所附权利要求的保护范围内。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进或变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围之内。