阅读说明：本技术 一种赛北紫堇四氢异喹啉类生物碱及应用 (Corydalis saxicola tetrahydroisoquinoline alkaloid and application thereof ) 是由 张亚梅 张普照 周鹏 钟国跃 于 2019-11-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种应用于高尿酸血症的赛北紫堇四氢异喹啉类生物碱,为从赛北紫堇原药材中提取的四氢异喹啉类生物碱类化合物。本发明所述赛北紫堇生物碱部位具有抗缺氧、抗炎镇痛、抗心肌缺血、抗癌等活性,本研究证明,其另具有降尿酸作用,可用于高尿酸血症治疗药物,拓宽了原药材赛北紫堇的应用范围,为推动民族地区药材资源的合理利用提供了依据。(The invention relates to corydalis saxicola tetrahydroisoquinoline alkaloids applied to hyperuricemia, which are tetrahydroisoquinoline alkaloid compounds extracted from corydalis saxicola original medicinal materials. The corydalis impatiens alkaloid part has the activities of resisting anoxia, resisting inflammation, easing pain, resisting myocardial ischemia, resisting cancer and the like, and the research proves that the corydalis impatiens alkaloid part also has the function of reducing uric acid, can be used as a medicine for treating hyperuricemia, widens the application range of the original medicine corydalis impatiens, and provides a basis for promoting the reasonable utilization of medicinal material resources in national regions.)

一种赛北紫堇四氢异喹啉类生物碱及应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及药物新应用，具体涉及赛北紫堇中四氢异喹啉生物碱类化合物在制备治疗高尿酸血症中的新应用。

背景技术

高尿酸血症(Hyperuricemia,HUA)是一种因尿酸合成增加和(或)尿酸***减少所引起的代谢性疾病。研究表明，90％的高尿酸血症是由肾脏***受损引起的。慢性肾脏疾病在发展进程中往往伴有高尿酸血症，后者会进一步损害肾脏，引起极性尿酸性肾病、慢性尿酸性肾病和尿酸性肾结石等病症。减少尿酸生成与促进尿酸***均可降低体内尿酸浓度，从而减轻高尿酸血症对肾脏的损害。

血清中的尿素氮由肾小球过滤排出，当肾功代谢失常后，血清中尿素氮的含量会增高，临床上将尿素氮作为判断肾小球滤过功能的指标，因此，降低尿素氮被认为是具有改善肾功能的作用。此外，黄嘌呤氧化酶(XOD)是调控尿酸生成的关键靶酶，连续氧化黄嘌呤、次黄嘌呤生成尿酸和负氧离子，抑制黄嘌呤氧化酶的活性可以有效控制血液中尿酸水平。另有体内尿酸经肾脏转运时所依赖的肾小管上皮细胞(HK-2)，是调控尿酸***的关键靶细胞。研究已发现有5种尿酸盐转运蛋白参与人近曲小管对尿酸盐的转运：即负责尿酸重吸收的尿酸盐阴离子转运体1(URAT1)、负责尿酸分泌的尿酸盐转运体(UAT)和有机阴离子转运体(OAT1和OAT3)，以及负责将尿酸分泌到细胞外，参与肾脏近曲小管对尿酸盐的重吸收的转运蛋白——葡萄糖转运蛋白9(GLUT9)；降低URAT1、GLUT9的蛋白表达可抑制尿酸的重吸收，升高OAT1的蛋白表达可促进尿酸分泌，进而促进尿酸***。

与藏族聚居区域青藏高原的生态环境、生产生活方式、饮食结构等密切相关，痛风也是高原高寒地带的常见多发病。因此，藏医药对该类疾病的认识、临床防治和高原特色药物使用方面积累了丰富的经验，具有明显的临床治疗优势，因而成为了该病种当前研究的热点和趋势之一。

罂粟科紫堇属植物赛北紫堇Corydalis impatiens(pall.)Fisch.为藏医常用药物，藏语名称为“帕下嘎”或“帕夏嘎”、“巴夏嘎”，具有消肿、活血散瘀、祛风利气等功效。在《蓝琉璃》、《度母本草》、《甘露本草明镜》及《晶珠本草》等藏医药古籍文献中均有记载，《四川省中药材标准》记述其可用于治疗伤风发热、风湿、活血化瘀、肝炎、水肿、胃炎、高血压、胆囊炎等病症的治疗，但未见赛北紫堇及其化学成分用于痛风和高尿酸血症的研究报道。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种应用于高尿酸血症的四氢异喹啉类生物碱，为从赛北紫堇原药材中提取的四氢异喹啉类生物碱类化合物。

所述四氢异喹啉类生物碱类化合物的结构式如结构通式(I)所示：

所述四氢异喹啉类生物碱类化合物的结构式如结构通式(Ⅱ)所示：

所述四氢异喹啉类生物碱类化合物的结构式为：

所述四氢异喹啉类生物碱类化合物的结构式为：

所述四氢异喹啉类生物碱类化合物的结构式为：

所述四氢异喹啉类生物碱类化合物的结构式为：

所述四氢异喹啉类生物碱类化合物的结构式为：

一种应用于高尿酸血症的赛北紫堇中四氢异喹啉类生物碱的制备方法，包括以下步骤：

1)将赛北紫堇干药材，粉碎，加入乙醇回流提取，得到提取液；

2)将提取液浓缩至干，加入1％的HCL溶液溶解，过滤，用1mol·L^-1NaOH溶液调节pH10，得到碱性溶液；

3)碱性溶液用氯仿萃取，得总生物碱浸膏；

4)将总生物碱浸膏以硅胶柱层析；分段洗脱，分段接收，分别得到流分；

5)将流分通过TLC检测选取生物碱含量高段进行制备色谱分离，得到化合物1-5。

步骤4)所述的硅胶柱层析的洗脱顺序为：正己烷-乙酸乙酯50：1，正己烷-乙酸乙酯20：1，正己烷-乙酸乙酯10：1，正己烷-乙酸乙酯1：1，正己烷-乙酸乙酯1：5，正己烷-乙酸乙酯1：10。

步骤5)所述的制备液相的色谱条件：色谱柱Phenomenex Luna-C18 column，250mm×21.2mm，10μm；流速为15ml/min；采用梯度洗脱，条件为1h内10％甲醇线性增加到60％。

6)上述赛北紫堇中分离得到化合物1-5运用MS、¹HNMR、¹³CNMR等波谱学数据和文献数据综合解析，鉴定其结构分别为：化合物1(bicuculline)、化合物2(黄紫堇明碱)、化合物3(去甲黄紫堇明碱)、化合物4(欧朝紫堇碱)、化合物5(淡黄紫堇碱)。

7)并采用氧嗪酸钾致小鼠急性高尿酸血症模型，通过检测模型小鼠血清尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肝脏黄嘌呤氧化酶(XOD)活力；RT-PCR测定肾脏转运体mURAT1、mOAT1、mGLUT9 mRNA表达。来探讨化合物1-5降尿酸的活性和可能的作用机制。结果表明，化合物1-5均可通过降低肝脏组织中XOD酶活性和血液中尿素氮(BUN)水平起到显著降尿酸和肾脏保护作用，且化合物1(bicuculline)还可下调肾脏mURAT1 mRNA表达，同时上调mOAT1mRNA表达从而产生促尿酸***作用。

本发明的有益技术效果：本发明所述赛北紫堇生物碱部位具有抗缺氧、抗炎镇痛、抗心肌缺血、抗癌等活性，本研究证明，其另具有降尿酸作用，可用于高尿酸血症治疗药物，拓宽了原药材赛北紫堇的应用范围，为推动民族地区药材资源的合理利用提供了依据；本发明所用药材为藏区常用药材，其化合物未见有关其毒性报道，且化合物结构确定，作用机制明确；本发明采用腹腔注射氧嗪酸钾盐致急性高尿酸血症模型，可同时产生肾脏损害和高尿酸血症现象，模型成熟，结果可靠。

附图说明

图1bicuculline对急性高尿酸血症小鼠肾脏mURAT1、mGLUT9、mOAT1 mRNA表达的影响(x±s，,n＝10)

注：与空白组比较，##P＜0.01；与模型组比较，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05。KB为空白组，MX为高尿酸血症小鼠模型组，BPLC为别嘌呤醇组，SL为bicuculline低剂量组，SH为bicuculline高剂量组。

具体实施方式

实施例一、赛北紫堇中四氢异喹啉类生物碱的制备

1.1化合物提取分离

赛北紫堇干药材(5Kg)，粉碎，加入十倍量的80％乙醇，回流提取三次，每次1.5小时，将提取液合并，过滤，得总提物提取液，浓缩至干，加入1％的HCL溶液溶解，过滤，用1mol·L^-1NaOH溶液调节PH值为10，碱液用5倍体积氯仿萃取5次，萃取时振荡摇匀静置半小时，取下层回收溶剂得总生物碱浸膏129g。以硅胶柱层析分段，正己烷-乙酸乙酯(50：1，20：1，10：1：1：1，1：5，1：10)为洗脱剂分段洗脱，甲醇冲柱，回收溶剂得G1-G7共7个流分，通过TLC检测选取生物碱含量高的G3段进行制备色谱分离，色谱柱Phenomenex Luna-C18column(250mm×21.2mm，10μm)；流速为15ml/min；采用梯度洗脱，条件为1h内10％甲醇线性增加到60％；共得到5个单体成分，每个成分的保留时间分别为15min，23min，30min，32min，36min。

1.2化合物结构鉴定

运用MS、¹H NMR、¹³C NMR、HSQC、¹H-¹H COSY、HMBC、NOESY和HR-ESI-MS等波谱学数据综合解析分离得到的5个化合物，鉴定结果如下：

化合物1：bicuculline

1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:4.10(1H,d,J＝2.4,H-1),3.06(2H,m,H-3),2.26(2H,m,H-4),6.65(1H,s,H-5),6.93(1H,s,H-8),5.82(1H,d,J＝2.4,H-11),6.57(1H,d,J＝8.4,H-16),6.95(1H,d,J＝8.4,H-17),6.12(2H,d,J＝9.6Hz,-OCH2O-),5.92(2H,d,J＝9.6Hz,-OCH2O-),2.57(3H,s,N-CH3)；13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:63.8(C-1),51.0(C-3),26.8(C-4),107.9(C-5),145.9(C-6),145.1(C-7),108.1(C-8),131.0(C-9),127.0(C-10),85.6(C-11),168.0(C-12),110.2(C-13),145.1(C-14),147.9(C-15),112.5(C-16),114.9(C-17),141.2(C-18),100.2(-OCH2O-),102.1(-OCH2O-),45.0(N-CH3)。

化合物2：黄紫堇明碱

1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:6.30(1H,s,H-1),6.57(1H,s,H-4),2.90(2H,m,H-7),3.00(2H,m,H-8),3.52(2H,s,H-10),6.95(1H,d,J＝8.4Hz,H-14),7.20(1H,d,J＝8.4Hz,H-15),6.12(1H,d,J＝9.6Hz,-OCH2O-),5.96(1H,d,J＝9.6Hz,-OCH2O-),5.23(2H,s,＝CH2),3.89(3H,s,OCH3),3.82(3H,s,OCH3),2.19(3H,s,-NCH3)；13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:111.1(C-1),154.2(C-2),148.2(C-3),109.2(C-4),124.8(C-5),137.0(C-6),29.1(C-7),48.5(C-8),37.1(C-10),124.0(C-11),148.4(C-12),150.2(C-13),106.9(C-14),113.9(C-15),137.2(C-16),143.6(C-17),82.1(C-18),55.5(2-OCH3),55.6(3-OCH3),39.0(-NCH3),100.9(-OCH2-),107.2(＝CH2)。

化合物3：去甲黄紫堇明碱

1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:6.44(1H,s,H-1),6.92(1H,s,H-4),3.00(2H,m,H-7),3.19(2H,m,H-8),3.51(2H,s,H-10),7.12(1H,d,J＝8.4Hz,H-14),6.86(1H,d,J＝8.4Hz,H-15),6.12(2H,d,J＝6.9Hz,-OCH2-),5.65(2H,s,＝CH2),3.89(3H,s,OCH3),3.82(3H,s,OCH3)；13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:108.2(C-1),157.5(C-2),149.1(C-3),111.2(C-4),128.0(C-5),138.2(C-6),30.3(C-7),45.3(C-8),41.4(C-10),124.9(C-11),149.2(C-12),148.1(C-13),111.4(C-14),114.6(C-15),130.3(C-16),142.1(C-17),79.8(C-18),104.5(＝CH2),100.9(-OCH2O),55.6(OCH3),55.7(OCH3)。

化合物4：欧朝紫堇碱

1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:6.54(1H,s,H-1),6.82(1H,s,H-4),2.82(2H,m,H-7),3.14(2H,m,H-8),3.52(2H,s,H-10),7.00(1H,d,J＝8.4Hz,H-14),7.35(1H,d,J＝8.4Hz,H-15),5.92(2H,s,-OCH2O-),5.41(2H,s,＝CH2),3.89(3H,s,2-OCH3),2.12(3H,s,-NCH3)；13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:109.3(C-1),149.5(C-2),145.3(C-3),116.2(C-4),126.1(C-5),135.4(C-6),29.8(C-7),49.5(C-8),37.8(C-10),125.6(C-11),157.6(C-12),148.2(C-13),110.9(C-14),116.0(C-15),129.8(C-16),142.9(C-17),73.8(C-18),105.5(＝CH2),102.0(-OCH2O-),55.6(-OCH3),38.7(-NCH3)。

化合物5：淡黄紫堇碱

1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:6.59(1H,s,H-1),6.86(1H,s,H-4),3.01(2H,m,H-7),3.65(2H,m,H-8),5.58(1H,s,H-10),6.92(1H,d,J＝8.4Hz,H-14),7.24(1H,d,J＝8.4Hz,H-15),5.59(1H,s,H-16),2.88(3H,s,-NCH3),5.92(2H,s,9,10-OCH2O-),6.01(2H,s,-OCH2O-)；13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:109.1(C-1),149.0(C-2),142.1(C-3),109.0(C-4),125.6(C-5),140.1(C-6),24.6(C-7),59.1(C-8),79.2(C-10),128.4(C-11),114.4(C-12),109.6(C-13),145.1(C-14),146.2(C-15),129.6(C-16),77.2(C-17),81.6(C-18),35.9(-NCH3),101.2(-OCH2O-),103.5(-OCH2O-)。实施例二赛北紫堇提取物的活性考察

2.1实验方法

2.1.1动物分组、造模及给药

适应性喂养5天后，将130只昆明小鼠按体质量均衡随机分为13组：分别为空白组(生理盐水15mL·kg^-1)，高尿酸血症模型组(氧嗪酸钾盐200mg.kg^-1)，阳性药别嘌呤醇组(10mg·kg^-1别嘌呤醇+氧嗪酸钾盐200mg.kg^-1)，化合物1高/低剂量组(50mg·kg^-1化合物1+氧嗪酸钾盐200mg.kg^-1、20mg·kg^-1化合物1+氧嗪酸钾盐200mg.kg^-1)，化合物2高/低剂量组(50mg·kg^-1化合物2+氧嗪酸钾盐200mg.kg^-1、20mg·kg^-1化合物2+氧嗪酸钾盐200mg.kg^-1)，化合物3高/低剂量组(50mg·kg^-1化合物3+氧嗪酸钾盐200mg.kg^-1、20mg·kg^-1化合物3+氧嗪酸钾盐200mg.kg^-1)，化合物4高/低剂量组(50mg·kg^-1化合物4+氧嗪酸钾盐200mg.kg^-1、20mg·kg^-1化合物4+氧嗪酸钾盐200mg.kg^-1)，化合物5高/低剂量组(50mg·kg^-1化合物5+氧嗪酸钾盐200mg.kg^-1、20mg·kg^-1化合物5+氧嗪酸钾盐200mg.kg^-1)，每天上午固定10：00灌胃给予模型组及给药组氧嗪酸钾盐，1h后灌胃给予药物，连续7天。正常对照组和模型组给予相应体积的双蒸水，每只小鼠灌胃量均为15mL·kg^-1。末次给药1h后，小鼠眼眶后静脉丛采血，全血3000r·min^-1离心10min，取上层血清放于4℃冰箱待用。并在冰台上快速分离小鼠肝脏和同侧肾脏，迅速投入液氨中，转移至-80℃超低温冰箱保存。

2.1.2血清尿酸(UA)、尿素氮(BUN)检测

根据试剂盒说明书检测各指标。

2.1.3肝脏黄嘌呤氧化酶抑制剂(XOD)检测

取冷冻的肝脏组织称重后按重量加入9倍预冷(0℃)的0.9％生理盐水，匀浆成10％的肝组织匀浆，随后在4℃下3500r·min^-1离心10min，取上清液，按照试剂盒说明书测定10％肝组织匀浆中XOD活性。另取部分10％肝组织匀浆上清液，加0.9％冰生理盐水稀释成1％肝组织匀浆液。按照试剂盒说明书测定肝脏组织蛋白质含量。

2.1.4RT-PCR测定肾脏尿酸转运体GLUT9，OAT1，URAT1 mRNA相对表达量

参考文献设计PCR扩增引物序列。取出冻存的肾脏，于冰上取肾脏皮质100mg，依照试剂盒所示方法，用Trizol法提取总RNA，总RNA 1μL用99μLDPEC水稀释，在260nm和280nm下测定吸光度(A)值,以D260/D280计算其浓度以确定纯度；同时取2μL总RNA按照Promaga反转录试剂盒说明书进行操作合成cDNA。采用GLUT9、OAT1、URAT1的基因特异性引物对cDNA模板进行RT-PCR扩增，扩增条件为热启动95℃3min、变性温度90℃30s、退火温度58℃35s、延伸72℃50s，共计进行35个循环，72℃延伸10min。PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳，成像仪成像显出条带，计算光密度。以GAPDH作为参照计算得到待测基因的相对表达值。

表1 PCR引物序列/Fig.1PCRprimer sequence

2.1.5统计学方法

用SPSS19.0软件统计分析所有数据，结果以均数±标准差(±s)表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验。以P<0.05为有统计学意义。

2.2实验结果

2.2.1化合物1-5对高尿酸血症小鼠血清中尿酸(UA)和尿素氮(BUN)水平的影响。

如表2所示，模型组较空白组的小鼠血清尿酸(UA)和尿素氮(BUN)水平显著升高(P＜0.01)，即为模型复制成功。给药1周后，阳性药别嘌呤醇组、化合物1、2高剂量组较模型组小鼠的血清尿酸水平均极显著下降(P＜0.001)，化合物1、2低剂量组和化合物3、4、5高剂量组较模型组小鼠的血清尿酸水平均显著下降(P＜0.01),化合物3、4、5低剂量组有下降趋势(P＜0.05)；阳性药别嘌呤醇组、化合物1、2高/低剂量组、化合物3、4、5高剂量组较模型组小鼠的血清尿素氮(BUN)水平均显著下降(P＜0.01),化合物3、4、5低剂量组有下降趋势(P＜0.05)；所有化合物降尿酸和降尿素氮水平均呈现剂量依赖性。

表2化合物1-5对血清UA、BUN含量的影响((_x±_s，,_n＝10)

注：与空白组比较，^##P＜0.01；与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

2.2.2化合物1-5对高尿酸血症小鼠对高尿酸血症小鼠肝脏中黄嘌呤氧化酶抑制剂(XOD)活性的影响。

如表3所示，持续1周给药后，阳性药别嘌呤醇组较模型组小鼠肝脏XOD活力级显著下降(P＜0.001)；化合物1高/低剂量组、化合物2高剂量组较模型组小鼠肝脏XOD活力都显著下降(P＜0.01)，化合物2低剂量组、化合物3-5高剂量组小鼠肝脏XOD亦有下降(P＜0.05)，化合物3-5低剂量组较模型组XOD活力下降不明显(P＞0.05)。

表3化合物1-5对高尿酸血症小鼠肝脏XOD活力的影响((_x±_s，_n＝10)

注：与空白组比较，^##P＜0.01；与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

2.2.3化合物1对高尿酸血症小鼠肾脏尿酸转运体GLUT9,URAT1和OAT1mRNA表达的影响

如图1所示，模型组小鼠肾脏转运体GLUT9和URAT1的mRNA表达较空白组显著升高(P＜0.01)，OAT1mRNA表达较空白组显著下降(P＜0.01)。与模型组比较，别嘌呤醇组与化合物1低剂量组均能极显著下调高尿酸血症小鼠肾脏URAT1的mRNA表达(P＜0.001)，别嘌呤醇组与化合物1高/低剂量组均能极显著上调高尿酸血症小鼠OAT1的mRNA表达(P＜0.001)；但化合物1高/低剂量组对高尿酸血症小鼠肾脏mGLUT9 mRNA表达下调不明显(P＞0.05)，化合物1高剂量组对高尿酸血症小鼠URAT1 mRNA表达下调不明显(P＜0.001)，无剂量依赖性。