阅读说明：本技术 一种索玛鲁肽的分离纯化方法 (Method for separating and purifying somaglutide ) 是由 沈杰 王良友 郑春旭 陈维维 张璐 于 2019-11-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种高效快速的分离纯化索玛鲁肽的方法,其步骤包括：将索玛鲁肽粗品溶液过滤,滤液分别经过聚合物填料柱和反相硅胶填料柱进行纯化,并结合不同体系的纯化条件进行分离纯化,收集目的产物,最终得到总纯在99.5％以上,最大单杂小于0.1％的产品,此方法简单、收率高,纯度高,非常适合于批量生产。(The invention relates to a method for efficiently and quickly separating and purifying Somalutide, which comprises the following steps: filtering the crude soxhlet peptide solution, purifying the filtrate by a polymer packed column and a reverse phase silica gel packed column respectively, separating and purifying by combining purification conditions of different systems, collecting a target product, and finally obtaining a product with the total purity of more than 99.5 percent and the maximum single impurity of less than 0.1 percent.)

一种索玛鲁肽的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及多肽纯化技术领域，尤其涉及一种索玛鲁肽的分离纯化方法。

背景技术

口服索玛鲁肽是目前GLP-1药物中降糖及减肥效果最好的一个药。目前NovoNordisk公司在2019年9月20号已经获得美国FDA批准，给多肽类带来重大影响，胰岛素注射剂也在积极开发口服制剂。在未来糖尿病领域，多肽口服制剂是市场的必然趋势。索玛鲁肽是NovoNordisk公司研发的每周一次皮下注射的长效GLP-1类似物，从结构上看，索玛鲁肽是GLP-1(7-37)链上8位的Aib取代了Ala，34位的Arg取代了Lys，26位的Lys接上十八烷酸脂肪链。与利拉鲁肽相比，索玛鲁肽的脂肪链更长，疏水性增加，但索玛鲁肽经过短链的PEG修饰，亲水性大大增强。

目前出现了较多关于多肽纯化的公开技术，如CN201811601939.8公开了一种曲普瑞林的纯化方法，CN201510004136.4公开了曲普瑞林的纯化制备方法，CN201811407810.3、CN201811603717.X分别公开了一种利拉鲁肽的分离提纯方法。但是由于不同多肽的序列差异，上述方法均不适用于索玛鲁肽的分离纯化。目前也有不少针对纯化索玛鲁肽的方法以及相关的专利，但步骤繁琐并且收率很低。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种索玛鲁肽的分离纯化方法，本发明现有技术分离得到索玛鲁肽纯度低、收率低及浓缩等技术问题，产品纯度高、收率好且易于产业化。

本发明的一种索玛鲁肽的分离纯化方法，包括以下步骤：

(1)将pH＝8.0-9.0(优选为pH9.0)的索玛鲁肽粗品溶液过滤后，将得到的滤液经过聚合物填料柱进行HPLC梯度分离纯化；

其中，所述索玛鲁肽粗品溶液包括索玛鲁肽粗品和含5v％乙腈的稀氨水；所述HPLC梯度分离纯化过程中，洗脱剂A相为20-30mmol/L(优选为20mmol/L)碳酸盐水溶液，用氨水将其pH调为8.0-9.0(优选为pH9.0)；B相为乙腈；梯度纯化条件为25-40％A相，梯度洗脱时间为40-50min(优选为40min)，在220nm波长下收集主峰纯度在95％以上的一次纯化产品；

(2)将所述一次纯化产品经过反相硅胶填料柱进行进一步HPLC梯度分离纯化，其中，洗脱剂A相为0.1v％TFA水溶液，B相为乙腈，梯度纯化条件为30-45％A相，梯度洗脱时间为40-50min(优选为40min)，在220nm波长下收集主峰纯度在99％以上，最大单杂小于0.2％的二次纯化产品；

(3)将所述二次纯化产品经过反相硅胶填料柱进行脱盐，其中，洗脱剂A相为水，B相为乙腈，采用梯度洗脱法，梯度洗脱条件为30-60％A相，梯度洗脱时间为40-50min(优选为40min)，在220nm波长下收集主峰纯度在99.5％以上，最大单杂小于0.1％的脱盐产品；

(4)采用薄膜蒸发器对所述脱盐产品进行旋转蒸发浓缩以除去产品中的乙腈和大量水，薄膜蒸发器的真空度不高于-0.09MPa(优选为-0.097MPa)，蒸发温度为40-50摄氏度(优选为40摄氏度)，转速为1400-1800r/min(优选为1400-1500r/min)，然后冷冻干燥后，得到纯化后的索玛鲁肽。

进一步地，在步骤(1)中，采用有机滤膜进行过滤，其孔径为0.22μm。

进一步地，在步骤(1)中，索玛鲁肽粗品溶液中，索玛鲁肽粗品的溶解浓度为20-40mmol/L，优选为20-25mmol/L。本发明索玛鲁肽粗品的溶解体系为5v％乙腈的稀氨水，其pH的控制使得索玛鲁肽完全溶解，而加入5v％的乙腈可有效的保护聚合物填料。

进一步地，在步骤(1)中，所述聚合物填料柱中的填料为聚甲基丙烯酸酯聚合物。采用聚甲基丙烯酸酯聚合物填料，更能耐碱冲洗填料，填料分离度好、填料寿命更长。

进一步地，在步骤(1)中，所述碳酸盐水溶液为碳酸铵水溶液。

进一步地，在步骤(1)中，所述碳酸盐水溶液中还包括磷酸。

进一步地，在步骤(2)中，所述反相硅胶填料柱的填料为八烷基硅烷键合硅胶填料。

进一步地，在步骤(3)中，所述反相硅胶填料柱的填料为八烷基硅烷键合硅胶填料。

进一步地，在步骤(4)中，蒸发浓缩的浓缩率为40kg/h。采用薄膜蒸发器进行旋转蒸发浓缩，薄膜蒸发器是通过旋转刮膜器强制成膜，并高速流动，热传递效率高，停留时间短，在真空条件下进行膜蒸发的一种新型高效蒸发器，可快速蒸发出产品中的溶剂，并使其体积缩小且达到浓缩效果。

进一步地，在步骤(4)中，冷冻干燥的解吸附温度为30-35摄氏度。

进一步地，在步骤(4)中，纯化后的索玛鲁肽的珠峰纯度在99.5％以上，最大单杂小于0.1％。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明提供了一种采用不同固定相基质、不同分离条件、脱盐方法以及通过薄膜蒸发器浓缩的索玛鲁肽的分离纯化方法。

本发明利用碳酸盐进行一次纯化，利用碳酸根离子对索玛鲁肽进行分离，使得出峰时间晚于主峰的杂质的去除效果更好，收率更高。

本发明利用TFA进行二次纯化，利用三氟乙酸根对索玛鲁肽进行分离，使得出峰时间早于主峰的杂质的去除效果好，收率更高。

本发明使用水和乙腈做为流动相，将其在制备分离中进一步去除杂质并将索玛鲁肽脱盐。

本发明使用薄膜蒸发器进行浓缩，样品无损耗、浓缩效率更快，是旋转蒸发浓度效率的10倍以上。

采用本发明的方法，最终索玛鲁肽的纯化总收率高达65-70％，纯度在99.5％以上，最大单杂不超过0.1％。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是步骤1中，索玛鲁肽粗品的高效液相色谱分析图谱；

图2是步骤2中，分离纯化后96.80％纯度索玛鲁肽的高效液相色谱分析图谱；

图3是步骤3中，分离纯化后99.82％纯度索玛鲁肽的高效液相色谱分析图谱；

图4是步骤4中，分离纯化后99.89％纯度索玛鲁肽成品的高效液相色谱分析图谱。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

本实施提供了一种索玛鲁肽的分离纯化方法，步骤如下：

1、样品溶解：将10克粗品(目的肽为索玛鲁肽)，用pH为9且含5v％乙腈的稀氨水溶解超声，用0.22μm的有机滤膜过滤得到粗品溶液。

2、一次纯化条件：将粗品溶液经过聚甲基丙烯酸酯聚合物填料进行分离纯化，A相为：20mmol/L碳酸钠溶液(用磷酸调pH至9)，B相为：乙腈，梯度洗脱条件为25-40％A相，梯度洗脱时间为40min，检测波长为220nm，A、B相流速为80mL/min，室温，进样为4克目的产物的粗品溶液。

纯化过程：将色谱柱用95％的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为4g目的物。按照上述一次纯化条件线性梯度洗脱40min，收集目的峰，得到纯度大于95％以上组分，作为第二步纯化之前的样品，一次纯化的收率约为88％左右。

3、二次纯化条件：将一次纯化得到的样品经过八烷基硅烷键合硅胶填料，进行进一步分离纯化，A相为：0.1v％TFA，水溶液B相为：乙腈，梯度洗脱条件为30-45％A相，梯度洗脱时间为40min，检测波长为220nm，A、B相流速为80mL/min，室温，进样为3.52克目的产物的样品。

纯化过程：将色谱柱用95％的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为3.52g目的物。按照上述二次纯化条件线性梯度洗脱40min，收集目的峰，得纯度大于99％以上，最大单杂小于0.2％组分，作为第三次纯化之前的样品，以上步骤收率约为80％。

4、三次纯化条件：将二次纯化得到的样品经过八烷基硅烷键合硅胶填料，进行进一步分离纯化并将其脱盐，A相为：水B相为：乙腈，梯度洗脱条件为30-60％A相，梯度洗脱时间为30min，检测波长为220nm，A、B相流速为80mL/min，室温，进样为2.816克目的产物的样品。

纯化过程：将色谱柱用95％的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为2.816克目的物。按照上述条件线性梯度洗脱40min，收集目的峰，得纯度大于99.5％以上，最大单杂小于0.1％组分，作为薄膜蒸发之前的样品，以上步骤收率约为95％，三次纯化后产物总收率约为66.88％。

4、薄膜蒸发：将三次纯化之后的样品经过薄膜蒸发器进行浓缩回收得到高浓度样品。薄膜蒸发器的真空度为薄膜蒸发器的真空度为-0.097MPa，蒸发温度为40摄氏度，转速为1400r/min。

5、冷冻、干燥：将样品放进冻干盘，进行冷冻干燥，冷冻干燥解吸附温度为35摄氏度，真空压力为0.1pa，即可得到99.5％，最大单杂小于0.1％的索玛鲁肽2.67克，纯化总收率为66.75％。

图1-4中各组分的含量统计结果依次如表1-4所示，表格中的数字编号对应图中峰的编号。从表中可看出，粗品中索玛鲁肽的含量为85.76％，而纯化后的产品中，索玛鲁肽的含量为99.89％，纯度明显提高。

表1 图1中各组分含量统计

表2 图2中各组分含量统计

表3 图3中各组分含量统计

表4 图4中各组分含量统计

因此，本发明提供了一种适于纯化索玛鲁肽的方法，高效快速简单的分离纯化，最终得到纯度在99.5％以上，最大单杂小于0.1％的样品，其收率高达66.75％，生产工艺简单、稳定，可用于批量生产、降低成本。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。