非洲猪瘟预防和/或治疗性中和抗体、其制备方法与应用
阅读说明：本技术 非洲猪瘟预防和/或治疗性中和抗体、其制备方法与应用 (African swine fever preventing and/or treating neutralizing antibody, preparation method and application thereof ) 是由 曹文龙 孔迪 孙祥明 滕小锘 张大鹤 易小萍 于 2019-11-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种非洲猪瘟预防和/或治疗性中和抗体,其为嵌合单克隆抗体,包含重链和轻链,其中的轻链可变区具有SEQ ID No：6所示序列,重链可变区具有SEQ ID No：2所示序列,轻链恒定区、重链恒定区均来源于猪源抗体。本发明还提供了编码嵌合单克隆抗体的基因、包含所述编码基因的表达载体或转化体等。所述表达载体可以是将所述编码基因插入pAAV-CAG载体而得。本发明还提供了一种利用所述表达载体制备AAV的方法。本发明提供的所述抗体序列或转化体等可以用于制备非洲猪瘟病毒的检测试剂、用于在受试动物中诱导针对非洲猪瘟病毒抗原的免疫反应的药剂或者用于预防动物受非洲猪瘟病毒感染的药剂,提供迅速而持续长久的抗体保护,例如非洲猪瘟病毒疫苗。(The invention provides an African swine fever preventing and/or treating neutralizing antibody, which is a chimeric monoclonal antibody and comprises a heavy chain and a light chain, wherein the variable region of the light chain has the amino acid sequence shown in SEQ ID No:6 and the heavy chain variable region has a sequence shown in SEQ ID No:2, the light chain constant region and the heavy chain constant region are both derived from porcine antibodies. The invention also provides a gene encoding the chimeric monoclonal antibody, an expression vector or a transformant containing the encoding gene, and the like. The expression vector can be obtained by inserting the coding gene into pAAV-CAG vector. The invention also provides a method for preparing AAV by using the expression vector. The antibody sequence or the transformant and the like provided by the invention can be used for preparing a detection reagent of the African swine fever virus, a medicament for inducing an immune response to an African swine fever virus antigen in a tested animal or a medicament for preventing the animal from being infected by the African swine fever virus, and provides rapid and long-lasting antibody protection, such as an African swine fever virus vaccine.)
技术领域
本发明涉及一种中和抗体，具体涉及一种非洲猪瘟预防和/或治疗性中和抗体、其制备方法与应用，属于动物免疫药物技术领域。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病，临床表现为高热、皮肤充血、水肿及脏器广泛性出血以及呼吸系统和神经系统功能的改变等。该病发病过程短，潜伏期5-15天，有很高的发病率和死亡率，死亡率甚至可高达100％。在被该病原感染的国家或地区，可造成巨大的经济损失，严重威胁食品安全并且影响养猪产业。世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类疫病，我国规定为动物一类疾病。
ASFV为二十面体对称结构，直径175-215nm。病毒核酸为双链DNA，长度为170kb～190kb，含有151个开放性阅读框，可以编码150～200种蛋白质，其中构成病毒粒子的主要结构蛋白有P72、P54、P220、P62、CD2V等。P54蛋白作为非洲猪瘟病毒的主要结构蛋白，是血清抗体的主要结合位点，有良好的免疫原性，可以作为非洲猪瘟早期检测的标志物。
非洲猪瘟病毒在组织和环境中的抵抗能力强，现在没有有效治疗措施，全球最有效的方法就是杀死疫区及附近地区的所有猪只，这给养猪企业和猪农带来灾难性的后果。
而且，目前也还没有针对非洲猪瘟特别有效的疫苗。传统方法制备的疫苗，比如纯化以及灭活的病毒，甲醛灭活的感染了病毒的猪肺泡巨噬细胞，感染了猪的外周血白细胞上清都不能诱导保护性免疫。亦即，总的来说，细胞免疫和体液免疫对于防治非洲猪瘟的感染和病毒的清除都有限。
早期的研究结果倾向于认为非洲猪瘟病毒不能诱导产生中和抗体(HessWR.1981.African swine fever:a reassessment.Advances in veterinary science andcomparative medicine 25:39-69)，因为使用噬斑减少的方法检测中和抗体比较困难，更具体地将，是因为一些分离的ASFV，特别是传代代次比较低的ASFV，形成肉眼可看的噬斑非常困难。但是，随着研究方法的提升，通过在病毒中引入标记基因，使得病毒的检测非常方便，后续越来越多的研究表面一些分离的ASFV能够被病毒感染而恢复中的猪的血清或者单克隆抗体中和(Borca MV,Irusta P,Carrillo C,Afonso CL,Burrage T,RockDL.1994.African swine fever virus structural protein p72 contains aconformational neutralizing epitope.Virology 201:413-418；Gomez-Puertas P,Rodriguez F,Oviedo JM,Ramiro-Ibanez F,Ruiz-Gonzalvo F,Alonso C,EscribanoJM.1996.Neutralizing antibodies to different proteins of African swine fevervirus inhibit both virus attachment and internalization.Journal of virology70:5689-5694；Zsak L,Onisk DV,Afonso CL,Rock DL.1993.Virulent African swinefever virus isolates are neutralized by swine immune serum and by monoclonalantibodies recognizing a 72-kDa viral protein.Virology 196:596-602；RuizGonzalvo F,Carnero ME,Caballero C,Martinez J.1986.Inhibition of African swinefever infection in the presence of immune sera in vivo and in vitro.Am J VetRes 47:1249-1252；Ruiz Gonzalvo F,Caballero C,Martinez J,CarneroME.1986.Neutralization of African swine fever virus by sera from Africanswine fever-resistant pigs.Am J Vet Res 47:1858-1862)。免疫了减毒活疫苗的猪的血清至少有两种机制去中和病毒对Vero或者猪肺泡巨噬细胞的感染。一种机制是阻止病毒对细胞的结合，另一种机制是阻止病毒的内吞作用(Gomez-Puertas P,Rodriguez F,Oviedo JM,Ramiro-Ibanez F,Ruiz-Gonzalvo F,Alonso C,EscribanoJM.1996.Neutralizing antibodies to different proteins of African swine fevervirus inhibit both virus attachment and internalization.Journal of virology70:5689-5694)。
对感染病毒正在恢复健康的猪的血清的研究表明，P72、P30和P54蛋白是ASFV中免疫原型最强的三个外膜蛋白(Afonso CL,Alcaraz C,Brun A,Sussman MD,Onisk DV,Escribano JM,Rock DL.1992.Characterization of p30,a highly antigenic membraneand secreted protein of African swine fever virus.Virology 189:368-373)。抗P72和抗P54蛋白的抗体只能在病毒吸附易感细胞之前中和病毒，而抗P30抗体能够在病毒吸附易感细胞前或者之后中和病毒。所以，可以认为抗P72和抗P54蛋白的抗体抑制病毒复制周期的第一步即病毒吸附过程。而抗P30蛋白的抗体抑制病毒的内吞作用(Gomez-Puertas P,Rodriguez F,Oviedo JM,Ramiro-Ibanez F,Ruiz-Gonzalvo F,Alonso C,EscribanoJM.1996.Neutralizing antibodies to different proteins of African swine fevervirus inhibit both virus attachment and internalization.Journal of virology70:5689-5694)。
通过去污剂处理ASFV病毒释放P30和P54蛋白，这两个蛋白能够吸附到对ASFV敏感的猪肺泡巨噬细胞表面，并且这种吸附能够被相应的抗体抑制。另外使用昆虫细胞表达ASFV血凝素蛋白CD2V，一种和CD2蛋白同源的蛋白，免疫猪能够产生临时的血凝抑制抗体。
猪免疫弱毒株OUR/T88/3后，能够抵御同源强毒株OUR/T88/1的攻毒，但是当耗尽体内的CD8+淋巴细胞时，就不能完全抵御强毒株攻击，说明CD8+淋巴细胞的细胞免疫在免疫保护中起到一个关键的作用，而单独的中和抗体不能充分的抵御病毒的攻击(Gomez-Puertas P,Rodriguez F,Oviedo JM,Ramiro-Ibanez F,Ruiz-Gonzalvo F,Alonso C,Escribano JM.1996.Neutralizing antibodies to different proteins of Africanswine fever virus inhibit both virus attachment and internalization.Journalof virology 70:5689-5694；Ruiz Gonzalvo F,Carnero ME,Caballero C,MartinezJ.1986.Inhibition of African swine fever infection in the presence of immunesera in vivo and in vitro.Am J Vet Res 47:1249-1252；Ruiz Gonzalvo F,CaballeroC,Martinez J,Carnero ME.1986.Neutralization of African swine fever virus bysera from African swine fever-resistant pigs.Am J Vet Res 47:1858-1862；Barderas MG,Rodriguez F,Gomez-Puertas P,Aviles M,Beitia F,Alonso C,EscribanoJM.2001.Antigenic and immunogenic properties of a chimera of twoimmunodominant African swine fever virus proteins.Arch Virol 146:1681-1691；Gomez-Puertas P,Rodriguez F,Oviedo JM,Brun A,Alonso C,Escribano JM.1998.TheAfrican swine fever virus proteins p54 and p30 are involved in two distinctsteps of virus attachment and both contribute to the antibody-mediatedprotective immune response.Virology 243:461-471；Onisk DV,Borca MV,Kutish G,Kramer E,Irusta P,Rock DL.1994.Passively transferred African swine fevervirus antibodies protect swine against lethal infection.Virology 198:350-354.)。
另一方面，将一个至弱的已经适应CV1细胞中培养的弱毒株注射猪，从恢复的猪的血清中分离的抗体免疫另外健康猪，改健康猪能够抵御强毒株的攻击。从恢复的猪血清中分离的抗体能够中和包括E75、E70、Lisbon60等野毒株，使其感染Vero细胞或者巨噬细胞的能力降低86-97％。
一些研究表明，85％接种了抗ASFV抗体的猪能够抵御强毒株E75毒株的攻击，其余的也而只接种阴性血清或者PBS注射的猪100％死亡。接种抗体的猪除了延迟的以及一过性的发热反应，其他的临床表现都和正常的猪一样，而对照组再攻毒后4天就显现出了明显的ASFV临床症状。另外，接种抗体组的猪血液中病毒的含量降低了10000倍以上，这说明抗ASFV抗体单独能够保护ASFV强毒株的攻击。也有数据表明，抗体介导的保护早起能够延迟疾病的发展。另一些研究表明，当乳猪通过初乳的了抗ASFV的抗体后，乳猪也能获得一定的保护。
研究开发一种可有效预防和治疗非洲猪瘟的药物是对全球医药科学界最严重的挑战，也是一项最为紧迫的任务。
目前也有一些关于非洲猪瘟病毒疫苗的研究见诸报道。例如，CN110093324A、CN106459931A提出了敲除不同基因的非洲猪瘟病毒弱毒株作为非洲猪瘟减毒活疫苗，虽然在实验室条件下，疫苗的保护效果很好，但是减毒活疫苗使用有非常大的副反应，并且因为对非洲猪瘟病毒的研究不够透彻，对病毒毒力相关基因以及机制不是很了解，并且这些减毒活疫苗还没有进行严谨而全面的安全评估，所以作为疫苗的生物风险极大。CN109836478A、CN104311660A等提出了一种针对ASFV P11.5以及VP73蛋白的单克隆抗体。该专利提出的单克隆抗体只是作为诊断试剂使用，抗体没有中和能力，不能用于治疗以及预防性疫苗。CN109734810A的专利申请了一种制备抗非洲猪瘟病毒和CD双靶标猪源化抗体的方法。该专利提供了一种双特异性抗体制备方法，并没有提供抗体序列，该方法使用重组CHO细胞表达抗体，然后纯化并注射到猪体内，但因为抗体半衰期非常短，不能持续提供保护，所以间隔较短的时间就需要重复注射。本专利抗体制备方法中的抗体序列和保护机制与其完全不同。本方法是利用注射重组AAV来持续产生中和抗体，用于治疗以及预防ASFV。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种非洲猪瘟预防和/或治疗性中和抗体、其制备方法与应用，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种嵌合单克隆抗体，包含重链和轻链，所述轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，所述重链包含重链可变区和重链恒定区；所述轻链可变区具有SEQID No：6所示序列或其保守型变异序列，所述重链可变区具有SEQ ID No：2所示序列或其保守型变异序列；所述轻链恒定区、重链恒定区均来源于猪源抗体。
在一些实施方案中，所述嵌合单克隆抗体的轻链、重链分别具有SEQ ID No：14、SEQ ID No：16所示氨基酸序列或其保守型变异序列。
本发明实施例还提供了编码所述嵌合单克隆抗体的基因，其中编码轻链的基因具有SEQ ID No：15所示序列或其保守型变异序列，编码重链的基因具有SEQ ID No：13所示序列或其保守型变异序列。
本发明实施例还提供了含有所述编码嵌合单克隆抗体的基因的表达载体或转化体。
在一些实施方案中，所述表达载体是将所述编码嵌合单克隆抗体的基因***pAAV-CAG载体的酶切位点EcoRⅠ和HindⅢ之间而得，所述转化体是将所述表达载体与pHelper载体、pAAV-RC载体共转染宿主细胞而得。
本发明实施例还提供了所述嵌合单克隆抗体、所述编码嵌合单克隆抗体的基因或所述表达载体或转化体在制备非洲猪瘟病毒的检测试剂、用于在受试动物中诱导针对非洲猪瘟病毒抗原的免疫反应的药剂或者用于预防动物受非洲猪瘟病毒感染的药剂中的用途。
本发明实施例还提供了一种病毒颗粒的制备方法，包括：培养宿主细胞，待细胞生长至70％融合，加入转染试剂，加入所述表达载体、pAAV2-RC载体与pHelper载体共转染宿主细胞，37℃培养5小时后换新鲜培养基，之后继续培养并收集细胞，再将收集的细胞反复冻融裂解，其后经后处理而提取获得病毒颗粒。
较之现有技术，本发明实施例提供的前述技术方案具有以下突出的优点和效果：
(1)例如293细胞等真核细胞表达ASFV P54蛋白抗原，蛋白可溶性分泌表达，折叠正确，免疫原性强；
(2)筛选出的单克隆抗体中和效价高，能够有效抵御病毒对细胞的吸附侵染。
(3)通过抽提杂交瘤细胞的总mRNA，RT-PCR扩增的方法获得抗体的基因序列，将该单抗的轻链，重链可变区与猪IgG抗体轻链重链恒定区杂合成一个嵌合抗体，既保留了抗体的高的中和活力，也降低了抗体的免疫原性，提高了抗体的效果。
(4)通过使用AAV作为基因载体将抗体基因转导到猪细胞内，既可以充分发挥AAV载体所具有的安全性高、病毒粒子小、抗原性弱等优点，还能使猪能够迅速而持续长久的分泌该单克隆抗体，给猪提供持续长久的保护。而现有的使用注射单克隆抗体的方法，因为抗体的半衰期很短，为了达到免疫预防的作用，必须间隔较短的时间就需要重复注射一次，成本高，程序复杂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是实施例1中pCI-P54His质粒的示意图；
图2是实施例2中的SDS-PAGE凝胶电泳图；
图3是实施例6中pAAV-CAG-Cap载体的示意图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本说明书使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明实施例的一个方面提供了一种嵌合单克隆抗体，包含重链和轻链，所述轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，所述重链包含重链可变区和重链恒定区；所述轻链可变区具有SEQ ID No：6所示序列或其保守型变异序列，所述重链可变区具有SEQ ID No：2所示序列或其保守型变异序列；所述轻链恒定区、重链恒定区均来源于猪源抗体。
在一些实施方式中，所述轻链恒定区具有SEQ ID No：8所示序列或为其保守型变异序列。
在一些实施方式中，所述重链恒定区具有SEQ ID No：4所示序列或为其保守型变异序列。
在一些实施方式中，所述重链和轻链是通过链间二硫键连接的。
在一些实施方式中，所述嵌合单克隆抗体的氨基酸序列如SEQ ID No：12所示或为其保守型变异序列。
在一些实施方式中，所述轻链可变区与轻链恒定区组成轻链，所述重链可变区与重链恒定区组成重链，所述轻链的编码基因具有SEQ ID No：15所示序列或其保守型变异序列，所述重链的编码基因具有SEQ ID No：13所示序列或其保守型变异序列。
在一些实施方式中，所述轻链可变区的编码基因具有SEQ ID No：5所示序列或为其保守型变异序列。
在一些实施方式中，所述重链可变区的编码基因具有SEQ ID No：1所示序列或为其保守型变异序列。
在一些实施方式中，所述轻链恒定区的编码基因具有SEQ ID No：7所示序列或为其保守型变异序列。
在一些实施方式中，所述重链恒定区的编码基因具有SEQ ID No：3所示序列或为其保守型变异序列。
在一些实施方式中，所述编码嵌合单克隆抗体的基因具有SEQ ID No：11所示序列或其保守型变异序列。
在本说明书中，前述的保守型变异序列是指由原始核苷酸序列和/或原始氨基酸序列中的一个或多个位点处的核苷酸或氨基酸被替换、***或缺失变异形成的核苷酸和/或氨基酸序列。优选的，所述保守型变异序列中至少95％与原始序列相同。
本发明实施例的另一个方面提供了含有所述编码嵌合单克隆抗体的基因的表达载体或转化体。
在一些实施方式中，所述表达载体(可以定义为AAV表达载体)是将所述编码嵌合单克隆抗体的基因***pAAV-CAG载体的EcoRⅠ和HindⅢ之间而得。
在本说明书中，所述pAAV-CAG载体的制备方法为本领域常规制备方法，或者通过市售可得。其中所述pAAV-CAG载体的多克隆位点的酶切位点为本领域常规的酶切位点，只要能将所述编码嵌合单克隆抗体的基因克隆到pAAV-CAG载体即可，所述酶切位点优选地为限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位点。
在一些实施方式中，所述编码嵌合单克隆抗体的基因的序列较佳地是SEQ ID No:11的同系物，该同系物可以使启动子变体。在所述的核酸序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核酸的替换、***或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平。SEQID No:11的同系物还包括一类具有在标准条件下能够与SEQ ID No:11所示序列的多聚核酸进行杂交的碱基序列的多聚核酸，所述标准条件下进行的杂交可根据《分子克隆》(Cold Spring Harbor Laboratory Press)记载的分子生物学中的通用方案(Current Protocols in Molecular Biology)所述的方式进行。SEQ ID No:11的同系物较佳地为在所述SEQ ID No:11序列之前添加信号肽分子，所述信号肽分子的作用在于控制该SEQ ID No:11序列在细胞中的转移和定位等功能，其中所述信号肽分子为本领域常规的信号肽分子，信号肽分子的序列可以通过人工合成多肽序列或者分子克隆技术获得，可根据《分子克隆》(Cold Spring Harbor Laboratory Press)记载的分子生物学中的通用方案所述的方式进行。
在一些实施方式中，所述表达载体中是在CAG启动子后面***编码重链的基因和编码轻链的基因，且编码重链的基因和编码轻链的基因之间通过连接肽连接。优选的，所述连接肽包括FMDV(Foot and Mouth Disease Virus)2A肽，但不限于此。
在本说明书中，所述转化体为将本发明的表达载体转化至相应的宿主细胞中制得。所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足AAV载体可稳定地自行复制即可，其中所述宿主细胞较佳地为真核细胞，更佳地为HEK293细胞。所述HEK293细胞株的制备方法为本领域常规制备方法，或者通过市售可得。
在一些实施方式中，所述转化体是将所述表达载体(前述的AAV表达载体)与pHelper载体、pAAV-RC载体共转染宿主细胞而得。
本发明实施例的另一个方面提供了一种病毒颗粒的制备方法，其包括：培养宿主细胞，待细胞生长至70％融合，加入转染试剂，加入所述表达载体、pAAV2-RC载体与pHelper载体共转染宿主细胞，37℃培养5小时后换新鲜培养基，之后继续培养并收集细胞，再将收集的细胞反复冻融裂解，其后经后处理而提取获得病毒颗粒。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，较佳地为真核细胞，更佳地为HEK293细胞。
在一些实施方式中，所述转染试剂为本领域常规的转染试剂，只要能满足将外源质粒转染到宿主细胞中即可，较佳地为聚乙烯亚胺试剂(PEI试剂)。所述聚乙烯亚胺试剂的制备方法为本领域常规制备方法，或者市售可得。
在一些实施方式中，所述AAV载体、pAAV2-RC载体、pHelper载体的加入量较佳地为等物质量比例加入。
在一些实施方式中，所述三种质粒的加入量较佳地为6-16μg。
当所述三种质粒的加入量不在上述范围值之内时，会产生AAV病毒包装效率低下，甚至无法包装出AAV病毒的现象发生。
在本说明书中，所述pAAV2-RC载体、pHelper载体为本领域常规的pAAV2-RC载体、pHelper载体，所述载体的制备方法为本领域常规制备方法，或者通过市售可得。
在一些实施方式中，所述病毒颗粒的制备方法还可包括浓缩步骤，所述浓缩的方法为本领域常规的浓缩方法，例如可以用浓缩柱浓缩处理收集的包含病毒的洗脱液。其中所述浓缩柱为本领域常规的浓缩柱，只要能够浓缩所得病毒颗粒即可。所述浓缩柱的制备方法为本领域常规的制备方法，或者通过市售可得。
本发明实施例的另一个方面提供了一种AAV病毒颗粒，其包含所述的表达载体。所述AAV病毒颗粒可以由前述的方法制备。
本发明实施例的另一个方面提供了所述嵌合单克隆抗体、所述编码嵌合单克隆抗体的基因、所述表达载体或转化体或者所述AAV病毒颗粒在制备非洲猪瘟病毒的检测试剂、用于在受试动物中诱导针对非洲猪瘟病毒抗原的免疫反应的药剂或者用于预防动物受非洲猪瘟病毒感染的药剂中的用途。
例如，本发明的一些实施例提供了所述表达载体或所述AAV病毒颗粒在制备非洲猪瘟病毒疫苗中的用途。
本发明实施例的另一个方面提供了免疫组合物，其包括如上所述表达载体为活性成分和至少一种药用载体。本发明所述药用载体为本领域常规药用载体，较佳地为填充剂、稀释剂或赋形剂等，且不限于此。进一步的，所述免疫组合物可以被制备为多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液、混悬液、乳剂、混悬剂、注射液、或粉针剂；较佳地，所述的剂型为注射剂，如静脉注射剂、腹腔注射剂等。
在本发明的一些更为具体的实施例中，使用293细胞表达的ASFV P54蛋白作为抗原免疫小鼠，制备杂交瘤细胞，筛选出能够分泌高中和滴度的单克隆抗体的细胞株，然后抽提杂交瘤细胞总RNA，逆转录扩增出单克隆抗体的基因序列，将单抗的重链和轻链可变区序列与已经公布的猪源抗体的重链和轻链的恒定区序列做成一个猪源化的嵌合抗体。然后将该嵌合抗体基因进行密码子优化然后克隆到AAV载体中，其可以用于治疗或者预防非洲猪瘟病毒，例如用于制备非洲猪瘟病毒疫苗。
应当理解，除非特别说明，本说明书述及的一些术语的释义均是本领域技术人员已知的。例如：
抗体，其由两个相同的轻链(light chain，L)和两个相同的重链(heavy chain,H)组成。每条重链的一端为可变区(variable region,V)，其后是多个恒定区(constantregion，C)。每条轻链的一端为可变区(variable region,V)，其后是多个恒定区(constantregion，C)。
抗体可变区，其所指的是抗体之间某些部分再序列上有很大的不同，并且这些部分再每个特定抗体对其特定靶的结合和特异性中有作用。可变性并不是均匀的分布在抗体可变区中。它集中在轻链和重链可变区被称作互补决定区(complementary determiningregion，CDR)，也称作高变区(hypervariable region，HVR)的三个节段中。可变区中更高度共有的部分称为框架(frame region,FR)。天然重链和轻链的可变区各包含四个FR区，它们大多数采取β折叠构型，由三个CDR连接，改三个CDR连接形成环连接且再某些情况下形成β折叠的一部分。每条链中的多个CRD通过FR区连接再相邻近的位置，并且和另一条链的CDR一起形成抗体的靶结合部位。
腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)，其属于微小病毒科依赖病毒属，是一类DNA复制缺陷型病毒，AAV病毒的复制与增殖需要依赖其他辅助病毒如腺病毒的参与。AAV病毒的基因组为单链DNA，长度约4.7Kb，其中由三个重要的元件组成，即：一对末端反向重复序列(Inverted terminal repeats，ITRs)、一个Rep区和一个Cap区。ITRs可以形成T型二级结构，是AAV病毒复制、包装、整合与拯救等活动需要的唯一顺式作用元件(Molecularstructure of adeno-associated virus variant DNA.The Journal of biologicalchemistry 1980，255:3194-3203)。现阶段已经开发出不需要辅助病毒来完成重组腺相关病毒包装的系统(Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors arebiologically active and free of detectable helper and wild-type viruses.HumGene Ther.1999,10:1031-1039)。该包装系统包括三种质粒和一种细胞系，三种质粒分别是，携带ITRs元件、真核启动子与外源基因***位点的pAAV-MCS；提供AAV病毒包装所必须的Rep区和Cap区的pAAV-RC；提供来源于辅助病毒中的辅助蛋白E2A、E4和VA RNA的pHelper。将这三种质粒共转染到HEK-293细胞系中，即可包装形成具有感染性的重组腺相关病毒颗粒。重组的腺相关病毒可以在细胞内部稳定表达外源基因，并且AAV相对于其他的病毒引起机体的免疫反应相对温和。AAV作为一个病毒载体，在基因治疗，预防以及治疗性疫苗以及基础研究领域得到了普遍的应用。
本发明前述实施例利用真核表达的ASFV P54蛋白作为免疫原，筛选出有效中和ASFV病毒的单克隆抗体，并获得了该中和抗体的序列，继而通过将该中和抗体的编码基因进行密码子优化后克隆到AAV载体等之中，其可以用于治疗或者预防非洲猪瘟病毒，例如用于制备非洲猪瘟病毒疫苗。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中所用试剂和原料均市售可得，而其中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。又及，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Thirdedition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Thirdedition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODSIN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1表达P54蛋白重组质粒构建
将中国分离的一株ASFV(Gene Bank登录号：MK128995)的P54蛋白氨基酸序列进行密码子优化(SEQ ID No：11)，并在南京金斯瑞公司合成并克隆到pCI表达载体，在蛋白的C端加上His标签，***pCI载体的限制性内切酶MluI和XhoI的酶切位点之间，获得pCI-P54His质粒，参阅图1所示。其中，所述pCI表达载体亦可以用本领域常规的可在宿主内复制和表达的各种载体替代。所述宿主可为原核细胞，如细菌细胞；真核细胞，如昆虫、酵母、哺乳动物细胞等；更具体地可以为将前述重组质粒转化大肠杆菌得到的基因工程菌。
实施例2免疫抗原(ASFV P54蛋白)的制备
利用大肠杆菌扩增pCI-P54His质粒，并抽提质粒。将PEI与pCI-P54His质粒转染HEK293细胞，3天后，3000r/min离心15min取上清获得P54His蛋白(SEQ ID No：12)。将收获的细胞培养物进行SDS-PAGE检测，同时使用空的HEK293细胞作为阴性对照。具体操作如下：取40μl收获的细胞培养物，加入10μl的5×loading buffer，沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝胶(12％浓度凝胶)电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。如图2所示，在分子量约20kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。
实施例3非洲猪瘟病毒P54单克隆抗体以及杂交瘤细胞株的制备
利用所制备的P54His蛋白免疫小鼠，采用聚乙二醇法将脾脏B细胞与SP20细胞按细胞数量10：1进行融合，融合后的细胞用含20％胎牛血清的HAT选择培养液轻轻混悬，分散融合细胞到96孔细胞培养板中，细胞培养板放入培养箱中培养，获得抗P54的阳性克隆。待融合细胞长出单克隆后及时采集细胞上清液，采用间接ELISA方法筛选阳性克隆，将阳性克隆转移至24孔细胞培养板中扩大培养，利用有限稀释法进行亚克隆，直至筛选出能够分泌非洲猪瘟病毒的中和抗体克隆杂交瘤细胞株9D8。
实施例4抗体可变区基因序列的扩增
抽提杂交瘤细胞株9D8总RNA，逆转录制备cDNA，然后用特异性引物分别扩增轻链可变区序列(相应的F、R引物序列如SEQ ID No：19、SEQ ID No：20所示)以及重链可变区序列(相应的F、R引物序列如SEQ ID No：21、SEQ ID No：22所示)并测序。
其中：M＝A或C,W＝A或T,S＝C或G,R＝A或G
实施例5抗体序列的获得
将轻链可变区(相应基因、多肽序列分别为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6)以及重链可变区序列(相应基因、多肽序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2)与已经公布的猪IgG抗体的恒定区序列拼接，从而获得嵌合的猪源化的ASFV中和抗体序列。
实施例6表达嵌合ASFV中和抗体AAV表达载体构建。
将上述的嵌合中和抗体氨基酸序列进行密码子优化，然后克隆到载体pAAV-CAG载体上，载体使用CAG启动子，启动子后面***重链基因序列(SEQ ID NO:13)和轻链基因序列(SEQ ID NO:15)，两个基因序列之间用FMDV 2A肽序列(相应基因、多肽序列分别为SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10)连接。所获pAAV-CAG-Cap载体的结构示意图见图3，其中克隆的基因的序列及其编码的蛋白的序列分别如SEQ ID No：17、SEQ ID No：18所示。
实施例7重组AAV制备
将T 25方瓶中的HEK293细胞1∶3传代，细胞汇合度至70％左右时进行转染。将细胞培养基更换为DMEM，并使用三质粒转染的方法制备表达Cap的AAV进行转染，三个质粒共转染12.5μg，并且按pHelper、pAAV-RC和pAAV-CAG-Cap的摩尔比为1：1：1混合DNA样品，将混合的DNA样品转移到500μL的DMEM中，短暂旋涡震荡后，室温放置两分钟，向样品中加入31.25μL的聚乙烯亚胺(PEI)，短暂旋涡震荡后，室温孵育10分钟后，将转染复合物加入HEK293细胞中，5小时后换完全培养基。
病毒收集质粒转染HEK293细胞48～72小时后收集细胞，弃原培养基，加适量DMEM，用细胞刮将细胞刮下后转移到15mL离心管中，5000rmp离心20min，-20℃冷冻，室温融化，彻底冻融3次，冰浴下破碎细胞4次，10000rmp离心20min后收集上清。
实施例8病毒滴度测定
1.纯化AAV病毒颗粒AAV滴度的测定根据Titration Kit(for RealTime PCR)Ver.2(TaKaRa，Cat.#6233)，加入0.5M的EDTA(加入体积为培养基的1/80)，1750g，4℃离心10分钟完全移除上清。旋涡震荡样品并加入250μL AAVTitration Kit提取液A，旋涡震荡15s重悬细胞，室温放置5分钟后，再旋涡震荡15秒，2000g–14000g、4℃离心10分钟。收集上清到新的离心管中，加入25μL的AAV
2.提取AAV病毒基因组用15μL的dH2O溶解2μL AAV病毒样品，并加入2μL l0 xDNase I Buffer和1μL DNase I，37℃孵育15分钟后95℃孵育10分钟，加入20μL的裂解缓冲液，70℃孵育10分钟，用EASY稀释溶液将样品稀释50倍。
3.PCR检测梯度稀释标准品，从2x 107copies/μl稀释到2x 102copies/μl，准备50X引物混合物，5μL AAV Forward Titer引物、5μL AAV Reverse Titer引物并加入15μLdH2O。取12.5μL的TB GreenPremix Ex Taq II(2X conc.)、0.5μL引物混合物、7μL的dH2O和5μL模板进行RT-PCR反应，95℃预变性2分钟；94℃变性5秒，60℃反应30秒，35个循环。根据标准样品的绘制的标准曲线，计算样品的滴度。
实施例9动物免疫以及中和抗体测定
取20头健康未感染ASFV病毒乳猪，其中10头每头接种1013gc(genome copies)的重组AAV2，另外10头接种1013gc空的AAV2，接种后4，6，8，10，12，14week分别采血，检测血清中ASFV中和抗体滴度，结果见下表。
时间(周)
阴性对照中和抗体滴度
中和抗体滴度
4
阴性
1:2<sup>4.1</sup>
6
阴性
1:2<sup>5.3</sup>
8
阴性
1:2<sup>6.7</sup>
10
阴性
1:2<sup>8.4</sup>
12
阴性
1:2<sup>8.7</sup>
14
阴性
1:2<sup>9.1</sup>
应当理解，以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
序列表
<110> 苏州世诺生物技术有限公司、苏州米迪生物技术有限公司
<120> 非洲猪瘟预防和/或治疗性中和抗体、其制备方法与应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 411
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
atgggatgga cctggatctt tattttaatc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactctgac 60
gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg ataaagcctg gcgcttcagt gaagatatcc 120
tgcaaggctt ctggtttctc attcaccggc cacggagtaa gctggatagt gcagaggaat 180
ggaaagagcc ttgagtggat tggaaatatt gatcctggaa gcggtgtaac taacttcaac 240
caaaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagtac attgtacatg 300
cacctcacga gcctgcaatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag aagacggcca 360
tgggactacg tatttgacta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc t 411
<210> 2
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
Met Gly Trp Thr Trp Ile Phe Ile Leu Ile Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe
35 40 45
Thr Gly His Gly Val Ser Trp Ile Val Gln Arg Asn Gly Lys Ser Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asp Pro Gly Ser Gly Val Thr Asn Phe Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Leu Tyr Met His Leu Thr Ser Leu Gln Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Arg Pro Trp Asp Tyr Val Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
130 135
<210> 3
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
tcagccccca agacggcccc atcggtctac cctctggccc cctgcggcag ggacacgtct 60
ggccctaacg tggccttggg ctgcctggcc tcaagctact tccccgagcc agtgaccatg 120
acctggaact cgggcgccct gaccagtggc gtgcatacct tcccatccgt cctgcagccg 180
tcagggctct actccctcag cagcatggtg accgtgccgg ccagcagcct gtccagcaag 240
agctacacct gcaatgtcaa ccacccggcc accaccacca aggtggacaa gcgtgttgga 300
acaaagacca aaccaccatg tcccatatgc ccaggctgtg aagtggccgg gccctcggtc 360
ttcatcttcc ctccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccagacccc cgaggtcacg 420
tgcgtggtgg tggacgtcag caaggagcac gccgaggtcc agttctcctg gtacgtggac 480
ggcgtagagg tgcacacggc cgagacgaga ccaaaggagg agcagttcaa cagcacctac 540
cgtgtggtca gcgtcctgcc catccagcac caggactggc tgaaggggaa ggagttcaag 600
tgcaaggtca acaacgtaga cctcccagcc cccatcacga ggaccatctc caaggctata 660
gggcagagcc gggagccgca ggtgtacacc ctgcccccac ccgccgagga gctgtccagg 720
agcaaagtca ccgtaacctg cctggtcatt ggcttctacc cacctgacat ccatgttgag 780
tggaagagca acggacagcc ggagccagag ggcaattacc gcaccacccc gccccagcag 840
gacgtggacg ggaccttctt cctgtacagc aagctcgcgg tggacaaggc aagatgggac 900
catggagaaa catttgagtg tgcggtgatg cacgaggctc tgcacaacca ctacacccag 960
aagtccatct ccaagactca gggtaaatga 990
<210> 4
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
Ser Ala Pro Lys Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Cys Gly
1 5 10 15
Arg Asp Thr Ser Gly Pro Asn Val Ala Leu Gly Cys Leu Ala Ser Ser
20 25 30
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Met Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
35 40 45
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Pro Ser Gly Leu Tyr
50 55 60
Ser Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ala Ser Ser Leu Ser Ser Lys
65 70 75 80
Ser Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Pro Ala Thr Thr Thr Lys Val Asp
85 90 95
Lys Arg Val Gly Thr Lys Thr Lys Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro Gly
100 105 110
Cys Glu Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Gln Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Lys Glu His Ala Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Thr Ala Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp Leu
195 200 205
Pro Ala Pro Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys Ala Ile Gly Gln Ser Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser Arg
225 230 235 240
Ser Lys Val Thr Val Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp
245 250 255
Ile His Val Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn
260 265 270
Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Ala Arg Trp Asp His Gly Glu Thr
290 295 300
Phe Glu Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Ile Ser Lys Thr Gln Gly Lys
325
<210> 5
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
atggcctgga tttcacttat actctctctc ctggctctca gctcaggggc catttcccag 60
gctgttgtga ctcaggaatc tgcactcacc acatcacctg gtggaacagt catactcact 120
tgtcgctcaa gtactggggc tgttacaact agtaactatg ccaactggat acaagaaaaa 180
ccagatcatt tattcatagg actaataggt ggtaccagca accgaggacc aggtgttcct 240
gccagattct caggctccct gattggagac aaggctgccc tcaccatcat aggggcacag 300
actgaggatg aggcaatata tttctgtgct ctatggttca gaacacactt tgtattcggc 360
agtggaacca aggtcactgt cctaggt 387
<210> 6
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 6
Met Ala Trp Ile Ser Leu Ile Leu Ser Leu Leu Ala Leu Ser Ser Gly
1 5 10 15
Ala Ile Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser
20 25 30
Pro Gly Gly Thr Val Ile Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val
35 40 45
Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Ile Gln Glu Lys Pro Asp His Leu
50 55 60
Phe Ile Gly Leu Ile Gly Gly Thr Ser Asn Arg Gly Pro Gly Val Pro
65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile
85 90 95
Ile Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp
100 105 110
Phe Arg Thr His Phe Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
115 120 125
Gly
<210> 7
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 7
cagcccaagg ccgctcccac ggtcaacctc ttcccgccct cctctgagga gctcggcacc 60
aacaaggcca ccctggtgtg tctaataagt gacttctacc cgggcgccgt gacggtgacc 120
tggaaggcag gcggcaccac cgtcacccag ggcgtggaga ccaccaagcc ctcgaaacag 180
agcaacaaca agtacgcggc cagcagctac ctggccctgt ccgccagtga ctggaaatct 240
tccagcggct tcacctgcca ggtcacccac gaggggacca ttgtggagaa gacagtgacg 300
ccctccgagt gcgcctag 318
<210> 8
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 8
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Thr Val Asn Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gly Thr Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Thr Trp Lys Ala Gly Gly Thr Thr Val
35 40 45
Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ala Leu Ser Ala Ser Asp Trp Lys Ser
65 70 75 80
Ser Ser Gly Phe Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly Thr Ile Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Thr Pro Ser Glu Cys Ala
100 105
<210> 9
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 9
tccttgaact ttgatctgct caagttggca ggggacgtgg agtccaaccc tggg 54
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 10
Ser Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
1 5 10 15
Pro Gly
<210> 11
<211> 489
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 11
gccgccacca tggaaacaga tacactcctc ctctgggtgc tgctcctctg ggtgccagga 60
tctacaggat cctcccggaa gaagaaggcc gccgccatcg aggaggagga catccagttc 120
atcaacccct accaagatca gcagtgggtg gaggtgaccc ctcagcccgg aacctccaag 180
cccgctggcg ctaccacagc ctccgtgggc aaacccgtga ctggtcgtcc cgctaccaat 240
cgtcccgcta ccaacaagcc cgtgaccgac aaccccgtga ccgataggct ggtgatggcc 300
accggaggac ccgctgctgc tcccgctgcc gctagcgctc ccgctcatcc cgctgagccc 360
tacaccaccg tgactaccca gaacaccgct tcccagacca tgtccgccat cgagaatctg 420
cggcagcgga acacctacac ccacaaggat ttagaaaact ctttacatca ccatcaccat 480
cactgatga 489
<210> 12
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 12
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ser Ser Arg Lys Lys Lys Ala Ala Ala Ile Glu Glu
20 25 30
Glu Asp Ile Gln Phe Ile Asn Pro Tyr Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu
35 40 45
Val Thr Pro Gln Pro Gly Thr Ser Lys Pro Ala Gly Ala Thr Thr Ala
50 55 60
Ser Val Gly Lys Pro Val Thr Gly Arg Pro Ala Thr Asn Arg Pro Ala
65 70 75 80
Thr Asn Lys Pro Val Thr Asp Asn Pro Val Thr Asp Arg Leu Val Met
85 90 95
Ala Thr Gly Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala
100 105 110
His Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser
115 120 125
Gln Thr Met Ser Ala Ile Glu Asn Leu Arg Gln Arg Asn Thr Tyr Thr
130 135 140
His Lys Asp Leu Glu Asn Ser Leu His His His His His His
145 150 155
<210> 13
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 13
atgggatgga cctggatctt tattttaatc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactctgac 60
gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg ataaagcctg gcgcttcagt gaagatatcc 120
tgcaaggctt ctggtttctc attcaccggc cacggagtaa gctggatagt gcagaggaat 180
ggaaagagcc ttgagtggat tggaaatatt gatcctggaa gcggtgtaac taacttcaac 240
caaaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagtac attgtacatg 300
cacctcacga gcctgcaatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag aagacggcca 360
tgggactacg tatttgacta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc ttcagccccc 420
aagacggccc catcggtcta ccctctggcc ccctgcggca gggacacgtc tggccctaac 480
gtggccttgg gctgcctggc ctcaagctac ttccccgagc cagtgaccat gacctggaac 540
tcgggcgccc tgaccagtgg cgtgcatacc ttcccatccg tcctgcagcc gtcagggctc 600
tactccctca gcagcatggt gaccgtgccg gccagcagcc tgtccagcaa gagctacacc 660
tgcaatgtca accacccggc caccaccacc aaggtggaca agcgtgttgg aacaaagacc 720
aaaccaccat gtcccatatg cccaggctgt gaagtggccg ggccctcggt cttcatcttc 780
cctccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccagaccc ccgaggtcac gtgcgtggtg 840
gtggacgtca gcaaggagca cgccgaggtc cagttctcct ggtacgtgga cggcgtagag 900
gtgcacacgg ccgagacgag accaaaggag gagcagttca acagcaccta ccgtgtggtc 960
agcgtcctgc ccatccagca ccaggactgg ctgaagggga aggagttcaa gtgcaaggtc 1020
aacaacgtag acctcccagc ccccatcacg aggaccatct ccaaggctat agggcagagc 1080
cgggagccgc aggtgtacac cctgccccca cccgccgagg agctgtccag gagcaaagtc 1140
accgtaacct gcctggtcat tggcttctac ccacctgaca tccatgttga gtggaagagc 1200
aacggacagc cggagccaga gggcaattac cgcaccaccc cgccccagca ggacgtggac 1260
gggaccttct tcctgtacag caagctcgcg gtggacaagg caagatggga ccatggagaa 1320
acatttgagt gtgcggtgat gcacgaggct ctgcacaacc actacaccca gaagtccatc 1380
tccaagactc agggtaaatg a 1401
<210> 14
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 14
Met Gly Trp Thr Trp Ile Phe Ile Leu Ile Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe
35 40 45
Thr Gly His Gly Val Ser Trp Ile Val Gln Arg Asn Gly Lys Ser Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asp Pro Gly Ser Gly Val Thr Asn Phe Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Leu Tyr Met His Leu Thr Ser Leu Gln Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Arg Pro Trp Asp Tyr Val Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Pro Lys Thr Ala Pro
130 135 140
Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Cys Gly Arg Asp Thr Ser Gly Pro Asn
145 150 155 160
Val Ala Leu Gly Cys Leu Ala Ser Ser Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Met Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ser Val Leu Gln Pro Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Met Val Thr
195 200 205
Val Pro Ala Ser Ser Leu Ser Ser Lys Ser Tyr Thr Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Pro Ala Thr Thr Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Gly Thr Lys Thr
225 230 235 240
Lys Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro Gly Cys Glu Val Ala Gly Pro Ser
245 250 255
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Gln
260 265 270
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Lys Glu His Ala
275 280 285
Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Thr Ala
290 295 300
Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
305 310 315 320
Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe
325 330 335
Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp Leu Pro Ala Pro Ile Thr Arg Thr
340 345 350
Ile Ser Lys Ala Ile Gly Gln Ser Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
355 360 365
Pro Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Thr Val Thr Cys
370 375 380
Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile His Val Glu Trp Lys Ser
385 390 395 400
Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln
405 410 415
Gln Asp Val Asp Gly Thr Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ala Val Asp
420 425 430
Lys Ala Arg Trp Asp His Gly Glu Thr Phe Glu Cys Ala Val Met His
435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr Gln
450 455 460
Gly Lys
465
<210> 15
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 15
atggcctgga tttcacttat actctctctc ctggctctca gctcaggggc catttcccag 60
gctgttgtga ctcaggaatc tgcactcacc acatcacctg gtggaacagt catactcact 120
tgtcgctcaa gtactggggc tgttacaact agtaactatg ccaactggat acaagaaaaa 180
ccagatcatt tattcatagg actaataggt ggtaccagca accgaggacc aggtgttcct 240
gccagattct caggctccct gattggagac aaggctgccc tcaccatcat aggggcacag 300
actgaggatg aggcaatata tttctgtgct ctatggttca gaacacactt tgtattcggc 360
agtggaacca aggtcactgt cctaggtcag cccaaggccg ctcccacggt caacctcttc 420
ccgccctcct ctgaggagct cggcaccaac aaggccaccc tggtgtgtct aataagtgac 480
ttctacccgg gcgccgtgac ggtgacctgg aaggcaggcg gcaccaccgt cacccagggc 540
gtggagacca ccaagccctc gaaacagagc aacaacaagt acgcggccag cagctacctg 600
gccctgtccg ccagtgactg gaaatcttcc agcggcttca cctgccaggt cacccacgag 660
gggaccattg tggagaagac agtgacgccc tccgagtgcg cctag 705
<210> 16
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 16
Met Ala Trp Ile Ser Leu Ile Leu Ser Leu Leu Ala Leu Ser Ser Gly
1 5 10 15
Ala Ile Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser
20 25 30
Pro Gly Gly Thr Val Ile Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val
35 40 45
Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Ile Gln Glu Lys Pro Asp His Leu
50 55 60
Phe Ile Gly Leu Ile Gly Gly Thr Ser Asn Arg Gly Pro Gly Val Pro
65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile
85 90 95
Ile Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp
100 105 110
Phe Arg Thr His Phe Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
115 120 125
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Thr Val Asn Leu Phe Pro Pro Ser Ser
130 135 140
Glu Glu Leu Gly Thr Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Thr Trp Lys Ala Gly Gly Thr Thr
165 170 175
Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
180 185 190
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ala Leu Ser Ala Ser Asp Trp Lys
195 200 205
Ser Ser Ser Gly Phe Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly Thr Ile Val
210 215 220
Glu Lys Thr Val Thr Pro Ser Glu Cys Ala
225 230
<210> 17
<211> 2169
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 17
gccgccacca tggcctggat cagcctgatc ctgagcctgc tggccctgag cagcggcgcc 60
atcagccagg ccgtggtgac ccaggagagc gccctgacca ccagccccgg cggcaccgtg 120
atcctgacct gccgcagcag caccggcgcc gtgaccacca gcaactacgc caactggatc 180
caggagaagc ccgaccacct gttcatcggc ctgatcggcg gcaccagcaa ccgcggcccc 240
ggcgtgcccg cccgcttcag cggcagcctg atcggcgaca aggccgccct gaccatcatc 300
ggcgcccaga ccgaggacga ggccatctac ttctgcgccc tgtggttccg cacccacttc 360
gtgttcggca gcggcaccaa ggtgaccgtg ctgggccagc ccaaggccgc ccccaccgtg 420
aacctgttcc cccccagcag cgaggagctg ggcaccaaca aggccaccct ggtgtgcctg 480
atcagcgact tctaccccgg cgccgtgacc gtgacctgga aggccggcgg caccaccgtg 540
acccagggcg tggagaccac caagcccagc aagcagagca acaacaagta cgccgccagc 600
agctacctgg ccctgagcgc cagcgactgg aagagcagca gcggcttcac ctgccaggtg 660
acccacgagg gcaccatcgt ggagaagacc gtgaccccca gcgagtgcgc cagcctgaac 720
ttcgacctgc tgaagctggc cggcgacgtg gagagcaacc ccggcatggg ctggacctgg 780
atcttcatcc tgatcctgag cgtgaccacc ggcgtgcaca gcgacgtgca gctgcagcag 840
agcggccccg agctgatcaa gcccggcgcc agcgtgaaga tcagctgcaa ggccagcggc 900
ttcagcttca ccggccacgg cgtgagctgg atcgtgcagc gcaacggcaa gagcctggag 960
tggatcggca acatcgaccc cggcagcggc gtgaccaact tcaaccagaa gttcaagggc 1020
aaggccaccc tgaccgtgga caagagcagc agcaccctgt acatgcacct gaccagcctg 1080
cagagcgagg acagcgccgt gtactactgc gcccgccgcc gcccctggga ctacgtgttc 1140
gactactggg gccagggcac cctggtgacc gtgagcagcg cccccaagac cgcccccagc 1200
gtgtaccccc tggccccctg cggccgcgac accagcggcc ccaacgtggc cctgggctgc 1260
ctggccagca gctacttccc cgagcccgtg accatgacct ggaacagcgg cgccctgacc 1320
agcggcgtgc acaccttccc cagcgtgctg cagcccagcg gcctgtacag cctgagcagc 1380
atggtgaccg tgcccgccag cagcctgagc agcaagagct acacctgcaa cgtgaaccac 1440
cccgccacca ccaccaaggt ggacaagcgc gtgggcacca agaccaagcc cccctgcccc 1500
atctgccccg gctgcgaggt ggccggcccc agcgtgttca tcttcccccc caagcccaag 1560
gacaccctga tgatcagcca gacccccgag gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagcaag 1620
gagcacgccg aggtgcagtt cagctggtac gtggacggcg tggaggtgca caccgccgag 1680
acccgcccca aggaggagca gttcaacagc acctaccgcg tggtgagcgt gctgcccatc 1740
cagcaccagg actggctgaa gggcaaggag ttcaagtgca aggtgaacaa cgtggacctg 1800
cccgccccca tcacccgcac catcagcaag gccatcggcc agagccgcga gccccaggtg 1860
tacaccctgc ccccccccgc cgaggagctg agccgcagca aggtgaccgt gacctgcctg 1920
gtgatcggct tctacccccc cgacatccac gtggagtgga agagcaacgg ccagcccgag 1980
cccgagggca actaccgcac cacccccccc cagcaggacg tggacggcac cttcttcctg 2040
tacagcaagc tggccgtgga caaggcccgc tgggaccacg gcgagacctt cgagtgcgcc 2100
gtgatgcacg aggccctgca caaccactac acccagaaga gcatcagcaa gacccagggc 2160
aagtgatga 2169
<210> 18
<211> 718
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 18
Met Ala Trp Ile Ser Leu Ile Leu Ser Leu Leu Ala Leu Ser Ser Gly
1 5 10 15
Ala Ile Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser
20 25 30
Pro Gly Gly Thr Val Ile Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val
35 40 45
Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Ile Gln Glu Lys Pro Asp His Leu
50 55 60
Phe Ile Gly Leu Ile Gly Gly Thr Ser Asn Arg Gly Pro Gly Val Pro
65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile
85 90 95
Ile Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp
100 105 110
Phe Arg Thr His Phe Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
115 120 125
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Thr Val Asn Leu Phe Pro Pro Ser Ser
130 135 140
Glu Glu Leu Gly Thr Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Thr Trp Lys Ala Gly Gly Thr Thr
165 170 175
Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
180 185 190
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ala Leu Ser Ala Ser Asp Trp Lys
195 200 205
Ser Ser Ser Gly Phe Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly Thr Ile Val
210 215 220
Glu Lys Thr Val Thr Pro Ser Glu Cys Ala Ser Leu Asn Phe Asp Leu
225 230 235 240
Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Met Gly Trp Thr
245 250 255
Trp Ile Phe Ile Leu Ile Leu Ser Val Thr Thr Gly Val His Ser Asp
260 265 270
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Ser
275 280 285
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305 310 315 320
Asn Ile Asp Pro Gly Ser Gly Val Thr Asn Phe Asn Gln Lys Phe Lys
325 330 335
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Met
340 345 350
His Leu Thr Ser Leu Gln Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
355 360 365
Arg Arg Arg Pro Trp Asp Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
370 375 380
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Pro Lys Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro
385 390 395 400
Leu Ala Pro Cys Gly Arg Asp Thr Ser Gly Pro Asn Val Ala Leu Gly
405 410 415
Cys Leu Ala Ser Ser Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Met Thr Trp Asn
420 425 430
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435 440 445
Pro Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ala Ser
450 455 460
Ser Leu Ser Ser Lys Ser Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Pro Ala Thr
465 470 475 480
Thr Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Gly Thr Lys Thr Lys Pro Pro Cys
485 490 495
Pro Ile Cys Pro Gly Cys Glu Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe
500 505 510
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Gln Thr Pro Glu Val
515 520 525
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Lys Glu His Ala Glu Val Gln Phe
530 535 540
Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Thr Ala Glu Thr Arg Pro
545 550 555 560
Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro
565 570 575
Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Thr Val Thr Cys Leu Val Ile Gly
625 630 635 640
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705 710 715
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 19
cttgggctga cctaggacag t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 20
caggctgttg tgactcagga a 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 21
gacagtggat aracmgatgg 20
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 22
gaggtsmarc tgcagsagtc wgg 23
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