阅读说明：本技术 一种h1n1流感病毒抗体及其在h1n1病毒超微量检测方面的应用 (H1N1 influenza virus antibody and application thereof in H1N1 virus ultramicro-detection ) 是由 董金华 董航 单喜军 李海梅 陈丽梅 于 2019-11-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种H1N1流感病毒抗体及其在H1N1病毒超微量检测方面的应用,该H1N1流感病毒抗体包括重链可变区、第一重链超可变区、第二重链超可变区、第三重链超可变区、轻链可变区、第一轻链超可变区、第二轻链超可变区和第三轻链超可变区；本发明的H1N1流感病毒抗体能够与H1N1流感病毒特异性结合,用于H1N1流感的超微量检测,实现H1N1流感的尽早预防和治疗,具有非常重要的经济和社会意义。(The invention discloses an H1N1 influenza virus antibody and application thereof in H1N1 virus ultramicro detection, wherein the H1N1 influenza virus antibody comprises a heavy chain variable region, a first heavy chain hypervariable region, a second heavy chain hypervariable region, a third heavy chain hypervariable region, a light chain variable region, a first light chain hypervariable region, a second light chain hypervariable region and a third light chain hypervariable region; the H1N1 influenza virus antibody can be specifically combined with H1N1 influenza virus, is used for ultramicro detection of H1N1 influenza, realizes early prevention and treatment of H1N1 influenza, and has very important economic and social meanings.)

一种H1N1流感病毒抗体及其在H1N1病毒超微量检测方面的 应用

技术领域

本发明涉及生物技术流感病毒抗体技术领域，具体说是一种H1N1流感病毒抗体及其在H1N1病毒超微量检测方面的应用。

背景技术

流感病毒(Influenzavirus)是一种传染病病原，会引起流行性感冒，高病原性流感病毒可引起人畜的死亡。该病毒属正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，流感病毒属。流感病毒按照核蛋白和基质蛋白抗原性可分为A、B、C三型。病毒颗粒的表面有血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)两种重要蛋白，根据这两种蛋白的不同，流感病毒又可分为多个亚型，以A型蛋白为例，目前已发现的HA有18个亚型(H1-H18))，NA有11个亚型(NA1-11)。A型流感病毒的表面蛋白容易发生抗原突变，难以控制，历史上多次大流感，均是由A型流感病毒引起的，这些大流感造成大约30万至5千万人的死亡，对人们的生命安全和经济财产造成了巨大威胁。

目前治疗H1N1流感的方法主要有药物治疗和抗体治疗，其中药物治疗主要采用离子通道抑制剂和神经氨酸酶抑制剂两类。离子通道抑制剂包括金刚烷胺和金刚乙胺及其衍生物，长时间使用会产生胃肠道和中枢神经系统的副作用，并且导致毒力和传播性能均不减弱的耐药毒株的产生；而神经氨酸酶抑制剂主要包括扎那米韦和奥司他韦，该类药物对H1N1流感早期病人具有良好的治疗效果，但是治疗后的病人容易对神经氨酸酶抑制剂产生耐药性。相比之下，抗体治疗H1N1流感具有极大的优势，因为活性抗体可以阻断病毒与靶细胞结合，诱导免疫细胞杀死被病毒感染的细胞，从而起到快速治疗H1N1流感的目的。

因此，开发针对H1N1流感病毒的抗体，满足人们对H1N1病毒超微量检测、实现H1N1病毒性流感早期防治的问题亟待解决。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种H1N1流感病毒抗体及其在H1N1病毒超微量检测方面的应用。

本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：

一种H1N1流感病毒抗体，包括序列独特、新颖的重链可变区、第一重链超可变区、第二重链超可变区、第三重链超可变区、轻链可变区、第一轻链超可变区、第二轻链超可变区和第三轻链超可变区；

其中重链可变区具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

第一重链超可变区具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；

第二重链超可变区具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；

第三重链超可变区具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；

轻链可变区具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；

第一轻链超可变区具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列；

第二轻链超可变区具有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；

第三轻链超可变区具有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。

本发明还包括一种编码如上所述的H1N1流感病毒抗体的DNA片段，重链可变区具有SEQ ID NO.1所示的基因序列，轻链可变区具有SEQ ID NO.6所示的基因序列。

本发明还包括一种表达载体，所述表达载体包含至少一个拷贝的如上所述的DNA片段。

本发明还包括一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如上所述的表达载体。

本发明还包括H1N1流感病毒抗体在H1N1病毒超微量检测方面的应用。

本发明相比现有技术具有以下优点：

本发明的H1N1流感病毒抗体能够与H1N1流感病毒特异性结合，用于H1N1流感病毒的超微量检测、为H1N1流感的早期防治提供新的方法，具有非常重要的经济和社会意义。

附图说明

图1为小鼠免疫前后血清中H1N1流感病毒抗体的含量比较示意图；

图2为扩增小鼠抗体可变区基因PCR产物的琼脂糖电泳图；

图3为抗体库中抗体与H1N1病毒及链霉亲和素的结合性能结果示意图；

图4为抗H1N1病毒单克隆抗体的筛选结果示意图；

图5为纯化后的抗体片段执行聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果示意图；

图6为抗H1N1病毒单克隆抗体F1与H1N1病毒的结合性能检测结果示意图；

图7为基于F1抗体的酶联免疫吸附试验检测H1N1流感病毒的原理示意图；

图8为基于F1抗体的酶联免疫吸附试验检测H1N1流感病毒的标准曲线；

附图标记

M：DNA marker；V_L：抗体轻链可变区基因；V_H：抗体重链可变区基因。

具体实施方式

本发明的目的是提供一种H1N1流感病毒抗体及其在H1N1病毒超微量检测方面的应用，通过以下技术方案实现：

一种H1N1流感病毒抗体，包括重链可变区、第一重链超可变区、第二重链超可变区、第三重链超可变区、轻链可变区、第一轻链超可变区、第二轻链超可变区和第三轻链超可变区；

其中重链可变区具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

第一重链超可变区具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；

第二重链超可变区具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；

第三重链超可变区具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；

轻链可变区具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；

第一轻链超可变区具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列；

第二轻链超可变区具有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；

第三轻链超可变区具有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。

本发明还包括一种编码如上所述H1N1流感病毒抗体的DNA片段，重链可变区具有SEQ ID NO.1所示的基因序列，轻链可变区具有SEQ ID NO.6所示的基因序列。

本发明还包括一种表达载体，所述表达载体包含至少一个拷贝的如上所述的DNA片段。

本发明还包括一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述表达载体。

本发明还包括H1N1流感病毒抗体在H1N1病毒超微量检测方面的应用。

以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。

实施例

利用灭活的H1N1病毒颗粒免疫小鼠，待小鼠血液中出现流感病毒抗体后，摘取小鼠脾脏，提取总核糖核酸(RNA)并合成与RNA链呈互补碱基序列的DNA(cDNA),利用抗体特异性引物，执行聚合酶链式反应(PCR)扩增抗体基因。对抗体基因进行处理后，将其克隆到噬菌体展示载体pDong1，利用构建的载体进一步转化大肠杆菌TG-1，制作了噬菌体展示抗体库。针对H1N1病毒进行淘筛，获得一株抗体F1，该抗体可与H1N1病毒结合，但不与牛血清蛋白结合，具有H1N1病毒特异性。具体过程如下：

一、小鼠的免疫及免疫后小鼠血清中抗H1N1抗体的确认

首先利用灭活的H1N1A/Beijing/262/95病毒对小鼠进行免疫。使用小鼠为3周龄雌性BALB/C小鼠，免疫采用皮下注射的方法，剂量为每次10μg病毒，隔周进行，共免疫3次。最后一次免疫一周后，将小鼠断尾取血，执行酶联免疫吸附试验，确认小鼠血液中含有H1N1流感病毒抗体。

酶联免疫吸附试验的操作如下：在96孔酶标板孔内加入100μL含有H1N1A/Beijing/262/95病毒(0.5μg/mL)的PBS溶液，4℃过夜，次日弃抗原溶液，加入200μL2％脱脂奶粉溶液，在25℃下孵育2小时，对酶标板进行封闭；

用含有0.1％吐温20的PBS溶液洗涤酶标板3次，加入稀释了1000、2000、4000、8000、16000、32000及64000倍的免疫前及免疫后的小鼠血清，25℃孵育1小时，用PBST溶液洗涤酶标板，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗小鼠IgG抗体，孵育1小时后，用PBST洗板，加入HRP底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMBZ；用pH6.0的乙酸钠溶液配制，含1/10000稀释的30％H₂O₂)，显色后用酶标仪测450nm处的吸光度，绘制曲线，比较免疫前后小鼠血清中抗体的含量。

酶联免疫吸附试验的结果如图1所示，免疫后1000倍稀释的小鼠血清在450nm处的吸光度为2.4，随着稀释倍数的增加，吸光度逐渐降低，64000倍稀释时的吸光度接近免疫前血清所产生吸光度。免疫前的小鼠血清稀释前后变化不大，一直维持在较低的水平。该实验结果表明，免疫后的小鼠血清中存在抗H1N1病毒的抗体。

二、小鼠抗体可变区基因的扩增及噬菌体展示抗体的构建

实验过程：确认小鼠血清中含有抗H1N1流感病毒抗体后处死小鼠，摘取小鼠脾脏，使用TRIzol试剂提取总RNA，以总RNA为模板合成cDNA，并进一步利用抗体基因特异性引物执行聚合酶链式反应，扩增抗体可变区基因。

使用限制酶SalI/NotI处理小鼠轻链可变区基因，将其克隆到噬菌体展示载体pDong1。克隆成功后将含有轻链可变区基因的质粒扩增，并进一步将用SfiI/XhoI处理过的抗体重链可变区基因克隆到已含有轻链的pDong1，转化大肠杆菌TG-1。

37℃培养转化大肠杆菌至OD₆₀₀为0.5，加入辅助噬菌体M13，37℃感染1小时后，3000g离心30分钟，弃上清，使用含有100μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素及0.1％葡萄糖的2YT培养基(1.6％Tryptone，1％Yeast Extract，0.5％NaCl)悬浮菌体，30℃，250rpm的速度摇菌16小时，次日5000g，30分钟离心培养液，分离回收上清，在上清液中加入1/5容积的PEG/NaCl溶液，混合均匀后在冰上放置30分钟，5000g，30分钟离心，弃上清，加入2mL的灭菌PBS溶液将沉淀溶解，作为噬菌体展示抗体库溶液。

扩增小鼠抗体可变区基因PCR产物的琼脂糖电泳图如图2所示，小鼠抗体可变区基因成功扩增，其中重链可变区基因的长度约为400bp，轻链可变区基因的长度约为370bp，将以上基因片段克隆至噬菌体展示载体pDong1，利用大肠杆菌TG-1制作噬菌体，最后获得一个含有约10⁷种抗体的噬菌体展示抗体库。

三、抗体库的筛选

在96孔微孔板的10个孔内各加入100μL的含有1μg/ml H1N1病毒的PBS溶液，4℃过夜孵育，次日弃抗原溶液，每孔加入200μL含有2％脱脂奶粉的PBS溶液，25℃孵育2小时进行封闭，用PBST洗涤3次后，每孔加入200μL的噬菌体溶液(R0；每孔含有10⁹cfu的噬菌体)，室温下孵育2小时，用PBST洗涤后，每孔加入100μL的胰蛋白酶将结合到H1N1病毒的噬菌体洗脱；

培养TG-1大肠杆菌至OD₆₀₀为0.4，取4mL菌液，将500μL溶出的噬菌体溶液加入到菌液中，37℃感染30分钟，5000g离心20分钟，弃上清，用含有100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL卡那霉素及0.1％葡萄糖的2YT培养基悬浮菌体，30℃，250rpm摇菌16小时；次日5000g，30分钟离心培养液，分离回收上清，在上清溶液中加入1/5容积的PEG/NaCl溶液，混合均匀后在冰上放置30分钟，5000g，30分钟离心，弃上清，加入200μL的灭菌PBS溶液，作为第一次富集后的噬菌体溶液(R1)；

重复以上步骤两次，分别获得噬菌体溶液R2和R3；执行酶联免疫吸附试验，验证淘筛过程中获得的噬菌体展示抗体库跟H1N1病毒的结合特异性及结合性能。

酶联免疫吸附试验的操作如下：在96孔酶标板内加入100μL含有H1N1A/Beijing/262/95病毒(0.5μg/mL)或链酶亲和素(Streptavidin)的PBS溶液，4℃过夜，次日弃抗原溶液，加入200μL含有2％脱脂奶粉的溶液，在25℃下孵育2小时，对酶标板进行封闭。用含有0.1％吐温20的PBS溶液洗涤酶标板3次，加入稀释后的R0、R1、R2及R3噬菌体溶液(10⁹cfu/well)，25℃孵育1小时，用PBST溶液洗涤酶标板，加入HRP标记的小鼠抗M13抗体，孵育1小时后，用PBST洗板，加入HRP底物TMBZ(用pH6.0的乙酸钠溶液配制，含1/10000稀释的30％H₂O₂)，显色后用酶标仪测在450nm处的吸光度，绘制柱状图，比较各步获得噬菌体抗体跟H1N1病毒及链酶亲和素的结合性能。

酶联免疫吸附试验的结果如图3所示，比较噬菌体淘筛过程中获得的噬菌体库R0、R1、R2及R3跟H1N1病毒的结合能力时发现，第二轮淘筛时所得噬菌体溶液与H1N1病毒结合能力开始增加，第三轮淘筛所获的噬菌体溶液R3跟H1N1病毒的结合能力与R0、R1、R2比较显著增加，而对链酶亲和素的结合性能非常微弱且没有变化，说明构建的噬菌体展示抗体库中抗H1N1病毒的抗体得以富集。

四、单克隆抗体筛选

培养TG-1大肠杆菌至OD₆₀₀为0.4，取100μL淘筛R2噬菌体抗体库溶出的噬菌体溶液，用于感染200μL的大肠杆菌菌液，37℃孵育30分钟后，将菌液涂布到含有100μg/mL氨卞青霉素，50μg/mL卡那霉素及1％葡萄糖的2YT培养基平板上，37℃过夜培养；次日挑48个菌落接种到96孔的培养板上，37℃培养至OD₆₀₀为0.4,每个孔内加入M13噬菌体，感染后5000g离心20分钟，去除上清，每孔加入200μL含有100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL卡那霉素及0.1％葡萄糖的2YT培养基,悬浮菌体，30℃，250rpm的速度培养16小时；次日5000g，30分钟离心培养液，分离回收上清，执行酶联免疫吸附试验，验证各单克隆抗体跟H1N1病毒的结合特异性及结合性能。

酶联免疫吸附试验的操作如下：在96孔酶标板内加入100μL含有H1N1A/Beijing/262/95病毒(0.5μg/mL)的PBS溶液，4℃过夜，次日弃抗原溶液，加入200μL含有2％脱脂奶粉的溶液，在25℃下孵育2小时，对酶标板进行封闭。用含有0.1％吐温20的PBS溶液洗涤酶标板3次，加入噬菌体溶液，25℃孵育1小时，用PBST溶液洗涤酶标板，加入HRP标记的小鼠抗M13抗体，孵育1小时后，用PBST洗板，加入HRP底物TMBZ(用pH6.0的乙酸钠溶液配制，含1/10000稀释的30％H₂O₂)，显色后用酶标仪测450nm的吸光度，绘制柱状图，比较利用各克隆制作的噬菌体抗体跟H1N1病毒及牛血清蛋白的结合性能。

结果如图4所示，在48个克隆中有30个克隆制作的噬菌体抗体跟H1N1病毒结合能力强于跟牛血清蛋白的结合能力，显示了抗体的抗原特异性。挑选跟病毒结合能力强的克隆F1,培养后抽提质粒，分析该克隆序列，其重链可变区基因及氨基酸序列如SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示，抗体轻链可变区的基因及氨基酸序列如SEQ ID NO.6及SEQ ID NO.7所示。

重链可变区中的超可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5所示；轻链可变区中的超可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10所示。

第一重链超可变区具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列|：GYTFTNYW；

第二重链超可变区具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列：TAPGSGST；

第三重链超可变区具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列：ALSTGTGALDY；

第一轻链超可变区具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列：QSLVHSNGNTY；

第二轻链超可变区具有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列：KVS；

第三轻链超可变区具有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列：SQSTHVPWT。

通过与抗体基因库中登录抗体序列进行比对，没有发现与本抗体基因相同的序列，因此F1抗体为一新型抗体。

五、单克隆抗体F1的表达与纯化

培养步骤四所得F1大肠杆菌菌落，提取pDong1载体，转化非抑制型大肠杆菌HB2151，挑取单菌落，接种到4mL的LB液体培养基中，37℃过夜培养，将过夜培养菌液接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的500mL LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀为0.4，加入IPTG使其终浓度为1mM，将温度调至30℃，连续培养16小时；离心收集培养液上清液，加入硫酸铵调节溶液中其浓度为75％，4℃放置2小时后，6000rpm离心20分钟，弃上清，用10mL的TALON缓冲液溶解沉淀，使用TALON树脂纯化F1抗体的Fab片段。执行聚丙烯酰胺凝胶电泳,用考马斯亮蓝染色，确认纯化后的抗体片段。

对染色后的凝胶脱色后，观察到如图5所示的两条蛋白质条带。其中上面的条带分子量为27kDa,为抗体重链可变区与第一恒定区蛋白，下面略小的条带为抗体轻链。该结果显示，F1Fab片段得以用大肠杆菌表达，使用TALON树脂得以纯化。

六、单克隆抗体F1的H1N1病毒结合性

执行酶联免疫吸附试验，确认所纯化Fab抗体片段具有H1N1病毒结合活性。在96孔酶标板内加入100μL含有H1N1A/Beijing/262/95病毒(0.5μg/mL)或BSA(1μg/mL)的PBS溶液，4℃过夜，次日弃蛋白溶液，加入200μL 2％脱脂奶粉溶液，在25℃下孵育2小时，对酶标板进行封闭；用含有0.1％吐温20的PBS溶液洗涤酶标板3次后，每孔加入100μL稀释的Fab抗体片段溶液，25℃孵育1小时，用PBST溶液洗涤酶标板，加入HRP标记的小鼠抗组氨酸标签抗体，孵育1小时后，用PBST洗板，加入HRP底物TMBZ(用pH6.0的乙酸钠溶液配制，含1/10000稀释的30％H₂O₂)，显色后用酶标仪在450nm处测其吸光度，绘制柱状图，比较纯化的Fab片段与H1N1病毒及牛血清蛋白的结合性能。

酶联免疫吸附试验的结果如图6所示，纯化后的F1Fab片段与H1N1病毒结合，其吸光度为0.25，而包被BSA孔的吸光度为0.01，因此可以断定抗体F1Fab能够与H1N1病毒特异性结合。

七、基于F1抗体的H1N1流感病毒检测

基于噬菌体展示F1抗体，利用图7所示方法对H1N1流感病毒进行检测。在96孔微孔板的孔内包被抗H1N1抗体，封闭微孔板后，添加灭活的H1N1病毒，洗板后加入噬菌体展示F1抗体，之后加入标记辣根过氧化物酶的抗噬菌体抗体，洗板后加入底物显色。当样品中没有病毒时，反应体系不显色；有病毒时体系显色且样品中的H1N1病毒越多，则通过病毒捕获到酶标板的F1噬菌体就越多，相应的捕获的抗噬菌体抗体也就越多，加入酶的底物显色后颜色越深。通过绘制病毒浓度与吸光度的标准曲线，可以测定溶液中病毒的含量。

具体操作如下。在96孔酶标板的孔内加入抗H1N1抗体(M149，宝日生物技术有限公司)，4℃过夜，次日弃孔内液体，加入200μL 2％脱脂奶粉溶液，室温放置两个小时，对酶标板进行封闭。洗板后在微孔内加入100μL含有不同浓度(0、0.1、1、10、100、1000、10000ng/mL)灭活禽流感H1N1病毒溶液或牛血清蛋白(BSA)溶液，25℃孵育1小时，去除孔内溶液，用含有0.1％吐温的PBS溶液(PBST溶液)洗涤酶标板，加入噬菌体展示的F1抗体溶液，25℃孵育1小时，洗板后加入标记有辣根过氧化酶(HRP)的抗噬菌体抗体溶液(1μg/mL)，25℃孵育1小时，去除孔内溶液后用PBST洗板3次，最后加入HRP底物3,3,5,5-四甲基联苯胺盐酸盐(TMBZ)溶液显色，测定孔内溶液在450nm处的吸收度，制作标准曲线。

其结果如图8所示。横轴代表H1N1病毒或BSA溶液的浓度，病毒溶液浓度从0到10000ng/mL，纵轴是每个浓度对应酶标孔内溶液的吸光度。随着溶液中病毒浓度的逐渐增加，溶液的吸光度也在逐渐增加，呈直线对应关系，而作为阴性对照添加BSA的孔内，其吸光度没有因为BSA浓度的增加而变化，说明F1抗体具有H1N1病毒特异性，可根据此曲线来测定样品中H1N1病毒的含量，即本研究所开发的F1抗体可用于检测H1N1流感病毒在样品中的含量，并且在H1N1病毒的超微量时即可检测出其含量，最低检测限为1ng/mL。

序列表

<110> 潍坊医学院

山东宽和正生物医药有限公司

<120> 一种H1N1流感病毒抗体及其在H1N1病毒超微量检测方面的应用

<141> 2019-11-14

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 351

<212> DNA

<213> 小白鼠(Mus musculus)

<400> 1

caggtgcagc tgaaggagtc tggagatgat ctggtaaagc ctggggcctc agtgaagctg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc aactactgga ttaactggat aaaacagagg 120

cctggacagg gccttgagtg gataggacgt actgctcctg gaagtggtag tacttactac 180

aatgaattgt tcaagggcaa ggcaacactg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240

attcagctca gcagcctgtc atctgaggac tctgctgtct atttctgtgc cctctcaact 300

gggacggggg ctttggacta ttggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc g 351

<210> 2

<211> 117

<212> PRT

<213> 小白鼠(Mus musculus)

<400> 2

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Asp Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Thr Ala Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Leu Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Ile Gln Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Leu Ser Thr Gly Thr Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser

115

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 小白鼠(Mus musculus)

<400> 3

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 小白鼠(Mus musculus)

<400> 4

Thr Ala Pro Gly Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 小白鼠(Mus musculus)

<400> 5

Ala Leu Ser Thr Gly Thr Gly Ala Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 342

<212> DNA

<213> 小白鼠(Mus musculus)

<400> 6

gatattgtga tgacacagtc tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120

tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg 300

tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgtg cg 342

<210> 7

<211> 114

<212> PRT

<213> 小白鼠(Mus musculus)

<400> 7

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Ala

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 小白鼠(Mus musculus)

<400> 8

Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 9

<211> 3

<212> PRT

<213> 小白鼠(Mus musculus)

<400> 9

Lys Val Ser

1

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 小白鼠(Mus musculus)

<400> 10

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr

1 5