阅读说明：本技术 赤眼鳟ips-1基因多克隆抗体的制备方法 (Preparation method of squaliobarbus curriculus IPS-1 gene polyclonal antibody ) 是由 肖调义 赵鑫 李耀国 于 2019-11-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了赤眼鳟IPS-1基因多克隆抗体的制备方法,步骤如下：(1)赤眼鳟IPS-1基因的克隆；(2)赤眼鳟IPS-1基因重组表达载体的构建；(3)赤眼鳟IPS-1蛋白表达及破菌流程；(4)重组蛋白的纯化及浓度测定；(5)多克隆抗体的制备。本发明成功制备了赤眼鳟IPS-1基因多克隆抗体,进一步探究赤眼鳟干扰素启动刺激因子1应对GCRV等病原物的免疫作用,为鱼类抗病育种提供抗性分子资源。(The invention discloses a preparation method of a squaliobarbus curriculus IPS-1 gene polyclonal antibody, which comprises the following steps: (1) cloning Oncorhynchus mykiss IPS-1 gene; (2) constructing a recombinant expression vector of the Oncorhynchus mykiss IPS-1 gene; (3) carrying out IPS-1 protein expression and bacterium breaking process on the squaliobarbus curriculus; (4) purifying and measuring the concentration of the recombinant protein; (5) and (4) preparing a polyclonal antibody. The invention successfully prepares the polyclonal antibody of the squaliobarbus curriculus IPS-1 gene, further explores the immune function of squaliobarbus curriculus interferon promoter-stimulating factor 1 on pathogens such as GCRV and the like, and provides resistance molecular resources for fish breeding for disease resistance.)

赤眼鳟IPS-1基因多克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明属于多克隆抗体的制备领域，具体涉及一种赤眼鳟IPS-1基因多克隆抗体的制备方法。

背景技术

草鱼常因感染具双链RNA基因组的草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)而致死。赤眼鳟与草鱼同属雅罗鱼亚科，其对GCRV具有强抗性，可作为抗性资源供体与草鱼杂交获得强抗性子代，是研究抗性分子机制的优良材料。

赤眼鳟干扰素启动刺激因子1(Interferon-β promoter stimulator 1,IPS1)作为维甲酸诱导基因(retinoic acid-inducible gene I,RIG-I)样受体(RIG-I likereceptors,RLRs))家族的接头分子参与抗GCRV的免疫反应。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种制备赤眼鳟干扰素刺激因子1多克隆抗体的方法，旨在进一步探究赤眼鳟干扰素启动刺激因子1应对GCRV等病原物的免疫作用，为鱼类抗病育种提供抗性分子资源。

本发明的技术方案为：赤眼鳟IPS-1基因多克隆抗体的制备方法，步骤如下：

(1)赤眼鳟IPS-1基因的克隆

提取赤眼鳟脾脏组织总RNA，反转录合成5’和3’cDNA第一链，设计两对特异性引物：IPS-1-5’(W)和IPS-1-3’(W)，IPS1-1-5’(N)和IPS1-1-3’(N)，核苷酸序列分别如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；使用IPS-1-5’(W)和IPS-1-3’(W)进行第一轮5’RACE-PCR和3’RACE-PCR扩增，获得产物作为第二轮PCR的模板；利用第二对特异性引物IPS1-1-5’(N)和IPS1-1-3’(N)进行第二轮5’RACE-PCR和3’RACE-PCR扩增，对PCR产物进行纯化、连接T载体，转化并测序；拼接获得赤眼鳟IPS-1基因全长cDNA序列；

(2)赤眼鳟IPS-1基因重组表达载体的构建

设计第三对特异性引物IPS-1-OF和IPS-1-OR，核苷酸序列分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；分别在上、下游引物添加了BamH I和Xho I酶切位点；以步骤(1)得到的赤眼鳟脾脏组织cDNA为模板，IPS-1-OF和IPS-1-OR为引物，进行PCR扩增；将PCR产物和pET-28a(+)表达载体进行双酶切，回收纯化，T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，获得重组表达载体pET-28a-SUMO-IPS-1；

(3)赤眼鳟IPS-1蛋白表达及破菌流程

将步骤(2)得到的重组表达载体pET-28a-SUMO-IPS-1转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养液中培养至OD值为0.6时，加入IPTG进行诱导；离心收集菌体；破菌后SDS-PAGE电泳确定蛋白表达位置及纯度；

(4)重组蛋白的纯化及浓度测定

利用纯化试剂盒对重组蛋白上样、洗脱、样品处理及再生等处理方法进行纯化；采用Lowry法侧蛋白浓度；设置不同浓度的标准蛋白质溶液，绘制标准曲线，根据样品的光吸收值与标准曲线计算样品蛋白浓度；

(5)多克隆抗体的制备

将步骤(4)纯化的赤眼鳟pET-28a-SUMO-IPS-1重组蛋白作为抗原，对新西兰大白兔进行免疫，然后进行全血分离，收集兔抗血清，纯化得到赤眼鳟IPS1多克隆抗体。

进一步地，步骤(1)中，第一轮5’RACE-PCR和3’RACE-PCR扩增反应程序为94℃5min；5个循环的94℃30s，72℃3min；5个循环的94℃30s，70℃30s，72℃3min；30个循环的94℃30s，68℃30s，72℃3min。

进一步地，步骤(1)中，第二轮5’RACE-PCR和3’RACE-PCR扩增反应条件为94℃5min；30个循环的94℃30s，68℃30s，72℃3min,然后72℃7min。

进一步地，步骤(3)中，破菌方法为：取50mL的1×PBS悬浮菌液，加入50μL巯基乙醇；利用超声破破碎仪，设置破菌时间3s，间隔3s，共10min超声破菌；离心10min得到1号上清液和沉淀，将1号上清液装于50mL离心管中，暂放4℃保存；沉淀先用去离子水洗涤两遍，然后称取6g尿素用1×PBS溶解定容到44mL中，倒入沉淀，吹悬沉淀；继续按破菌3s，间隔3s的设置，破菌5min；破菌后，12000r/min离心10min得到2号上清液和包涵体，吸出2号上清液暂放4℃保存待用；向包涵体中加入6mL ddH₂O悬浮后平均装到4个离心管中，12000r/min离心2min；弃上清，选取其中一管加入1.5mL 8M的尿素，溶解，12000r/min离心1min，将上清转移到新的离心管中。

进一步地，步骤(5)中，对新西兰大白兔进行免疫的方法为：将纯化的赤眼鳟pET-28a-SUMO-IPS-1重组蛋白作为抗原，对新西兰大白兔进行8次免疫，按体积比1：1的比例加入弗氏完全佐剂，采用背部皮下多点注射；加强免疫选用弗氏不完全佐剂；末次免疫10天。

用于赤眼鳟IPS-1基因全长cDNA序列克隆的引物对，引物对有两组，分别为IPS-1-5’(W)和IPS-1-3’(W)，IPS1-1-5’(N)和IPS1-1-3’(N)，IPS-1-5’(W)和IPS-1-3’(W)核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；IPS1-1-5’(N)和IPS1-1-3’(N)核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

用于赤眼鳟IPS-1基因克隆的引物对，引物对为IPS-1-OF和IPS-1-OR，核苷酸序列分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

上述引物对在赤眼鳟IPS-1基因克隆上的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明成功制备了赤眼鳟IPS-1基因多克隆抗体，进一步探究赤眼鳟干扰素启动刺激因子1应对GCRV等病原物的免疫作用，为鱼类抗病育种提供抗性分子资源。

附图说明

图1.破菌纯化后鉴定结果。1：1号上清；2：2号上清；3：2倍稀释的包涵体；4：5倍稀释的包涵体；5：10倍稀释的包涵体；6：pET-28a-SUMO空载诱导表达；7：0.4mg/mL BSA；8：Marker。

图2.Western blot在组织中检测赤眼鳟IPS1多克隆抗体。C IPS-1：健康赤眼鳟样品；12h IPS-1：GCRV刺激12h的赤眼鳟样品。

图3.Western blot在细胞中检测赤眼鳟IPS1多克隆抗体。pEGFP-C1-IPS-1：转染pEGFP-C1-IPS-1的细胞样品。

具体实施方式

除特别说明外，本发明所使用的试剂、设备均为市售，方法为本领域技术人员公知的常规方法。本发明中使用的引物如表1所示。

表1引物序列如下表1所示：

引物名称	引物序列(5'-3')
		IPS-1-5’(W)	CTCCAAATCTTCAGAGACCACGGAGCAAGG(SEQ ID No.1)
IPS-1-3’(W)	GGTTACGCACCCTCCCTCTTCCATCGAGCA(SEQ ID No.2)
		IPS1-1-5’(N)	GGCTCCTGAACTGTCCTTTCCTCTCTCACT(SEQ ID No.3)
IPS1-1-3’(N)	ATGCTCCACACAATGCTGCTTCCTCGAAT(SEQ ID No.4)
		IPS-1-OF	TCGAGCTCAAGCTTCGAATTCATGTCATTGACACGTGAACAATTTT(SEQ ID No.5)
IPS-1-OR	TTATCTAGATCCGGTGGATCCATGCTTGAGCTTCCAAGCCA(SEQ ID No.6)

1、赤眼鳟IPS-1基因的克隆

提取赤眼鳟脾脏组织总RNA，用SMARTer RACE cDNA amplification kit试剂盒合成5’和3’cDNA第一链，于-80℃保存；根据GenBank数据库中已报道的IPS-1基因序列，设计两对特异性引物：IPS-1-5’(W)，IPS-1-3’(W)，IPS1-1-5’(N)和IPS1-1-3’(N)，引物序列见表1。IPS-1-5’(W)和IPS-1-3’(W)进行第一轮5’RACE-PCR和3’RACE-PCR扩增，反应程序为94℃5min；5个循环的94℃30s，72℃3min；5个循环的94℃30s，70℃30s，72℃3min；30个循环的94℃30s，68℃30s，72℃3min。获得产物稀释50倍，作为第二轮PCR的模板；利用第二对特异性引物IPS1-1-5’(N)和IPS1-1-3’(N)进行第二轮5’RACE-PCR和3’RACE-PCR扩增，反应条件为94℃5min；30个循环的94℃30s，68℃30s，72℃3min,然后72℃7min。对PCR产物进行纯化、连接T载体，转化并测序。拼接获得赤眼鳟IPS-1基因全长cDNA序列。

2、赤眼鳟IPS-1基因重组表达载体的构建

根据赤眼鳟IPS-1基因全长cDNA序列，设计第三对特异性引物IPS-1-OF和IPS-1-OR，分别在上、下游引物添加了BamH I和Xho I酶切位点；以赤眼鳟脾脏组织cDNA为模板，IPS-1-OF和IPS-1-OR为引物，进行PCR扩增；将PCR产物和pET-28a(+)表达载体进行双酶切，回收纯化，T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，获得重组表达载体pET-28a-SUMO-IPS-1。

3、赤眼鳟IPS-1蛋白表达及破菌流程

将得到的重组表达载体pET-28a-SUMO-IPS-1转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养液中培养至OD值为0.6时，加入IPTG进行诱导；离心收集菌体；

破菌过程：取50mL的1×PBS悬浮菌液，加入50μL巯基乙醇。利用超声破破碎仪，设置破菌时间3s，间隔3s，共10min超声破菌。离心10min得到1号上清液和沉淀，将1号上清液装于50mL离心管中，暂放4℃保存；沉淀先用去离子水洗涤两遍，然后称取6g尿素用1×PBS溶解定容到44mL中，倒入沉淀，吹悬沉淀。继续按破菌3s，间隔3s的设置，破菌5min；破菌后，12000r/min离心10min得到2号上清液和包涵体，吸出2号上清液暂放4℃保存待用。向包涵体中加入6mL ddH₂O悬浮后平均装到4个2mL离心管中，12000r/min离心2min。弃上清，选取其中一管加入1.5mL 8M的尿素，溶解，12000r/min离心1min，将上清转移到新的2mL离心管中。SDS-PAGE电泳确定蛋白表达位置及纯度(图1)。

4、重组蛋白的纯化及浓度测定

利用纯化试剂盒对重组蛋白上样、洗脱、样品处理及再生等处理方法进行纯化；采用Lowry法侧蛋白浓度。设置不同浓度的标准蛋白质溶液，绘制标准曲线，根据样品的光吸收值与标准曲线计算样品蛋白浓度。

5、多克隆抗体的制备

将纯化的赤眼鳟pET-28a-SUMO-IPS-1重组蛋白作为抗原，对新西兰大白兔进行8次免疫，按体积比1：1的比例加入弗氏完全佐剂，采用背部皮下多点注射；加强免疫选用弗氏不完全佐剂；末次免疫10天后，进行全血分离，收集兔抗血清，纯化得到赤眼鳟IPS1多克隆抗体。

6、Western blot检测

分别提取健康和GCRV刺激12h后的赤眼鳟的肝、脾脏及头肾组织总蛋白，利用Lowry法侧蛋白浓度。将蛋白样品与5×loading buffer以4:1的比例进行混合，沸水浴5分钟使其变性。取20μL变性后的样品在8％的分离胶上进行SDS-PAGE电泳；待溴酚蓝跑至分离胶底部停止电泳进行转膜；转膜后对膜进行封闭。然后，室温孵育赤眼鳟IPS-1多克隆抗体2h；接着，室温孵育兔二抗1h；最后利用ECL发光试剂检测(图2)。同时，构建赤眼鳟IPS1过表达载体pEGFP-C1-ScIPS-1，利用Lipofectamine 2000在草鱼卵巢细胞中进行转染。转染24h后，提取细胞总蛋白，利用赤眼鳟IPS-1多克隆抗体进行检测，检测方法如上(图3)。

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> 赤眼鳟IPS-1基因多克隆抗体的制备方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctccaaatct tcagagacca cggagcaagg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttacgcac cctccctctt ccatcgagca 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggctcctgaa ctgtcctttc ctctctcact 30

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgctccaca caatgctgct tcctcgaat 29

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcgagctcaa gcttcgaatt catgtcattg acacgtgaac aatttt 46

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttatctagat ccggtggatc catgcttgag cttccaagcc a 41