阅读说明：本技术 一种果胶酶人工序列及其表达方法和应用 (Pectinase artificial sequence and expression method and application thereof ) 是由 李洪波 董海丽 邓伟思 严盼 张赛名 于 2019-11-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种果胶酶人工序列及其表达方法和应用,该基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片：1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；或3)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。按照本发明所述的基因序列进一步构建重组载体并转化酵母,可实现该重组果胶酶在甲醇诱导下的分泌表达,通过DEAE阴离子交换纯化,可得到纯度高于95％活性重组果胶蛋白,该活性酶蛋白具有很强的澄清果汁的活性。(The invention relates to a pectinase artificial sequence, an expression method and application thereof, wherein the gene at least contains a DNA sheet of one of the following nucleotide sequences: 1) the nucleotide sequence of SEQ ID NO.1 in the sequence table; 2) a nucleotide sequence which has more than 90 percent of homology with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO.1 and codes the protein with the same biological function; or 3) a nucleotide sequence which is hybridized with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO.1 and encodes the protein with the same biological function. According to the gene sequence of the invention, a recombinant vector is further constructed and yeast is transformed, so that the secretory expression of the recombinant pectinase under the induction of methanol can be realized, and the active recombinant pectic protein with the purity higher than 95 percent can be obtained through DEAE anion exchange purification, and the active pectic protein has strong activity of clarifying juice.)

一种果胶酶人工序列及其表达方法和应用

技术领域

本发明属于生物分子克隆技术领域，涉及一种高活力果胶酶基因的人工序列及其重组蛋白的制备方法与应用。

背景技术

我国是世界上水果生产的大国，近十年来，我国水果总产量保持在四千五百万吨以上。水果资源丰富，为我国果汁工业的发展,提供了良好的基础。目前，果汁市场竞争激烈，品牌众多，许多加工企业都陷入困境，如何发展果汁工业，已成为一个值得重视的课题。果汁生产中的一大瓶劲是产生的果汁较为混浊，从而影响了果汁的品质与口感。利用果胶酶澄清果蔬汁由来已久，早在20世纪30年代已有所应用。通常果蔬汁产品都有浑浊、沉淀的现象，不仅会影响产品外观，而且还直接影响到果蔬汁的质量和稳定性。因此，在加工过程中都要进行澄清处理。在果胶酶作用下果蔬汁中的果胶部分水解后，通过离心、过滤，可将絮凝物除去，从而达到澄清的目的。因此，开发具有高活性的果汁澄清用的果胶酶迫在眉睫。

发明人的前期研究中发现了一种高活力的源自于茯苓的新型高活性果胶酶，但该酶在茯苓中的表达量很低，因此利用外源基因表达系统高效表达该新型重组酶蛋白是开发该果胶酶的必由之路。

利用外源基因表达系统来生产重组果胶酶是大量获得果胶酶的主要技术手段之一。目前，人们已经开发了很多表达系统如：杆状病毒表达系统、原核表达系统、酵母表达系统、丝状真菌表达系统、昆虫细胞表达系统、植物表达系统、哺乳动物表达系统等。大肠杆菌的遗传背景清楚，又由于其具有周期短、高效率、易操作、使用安全等特点，成为外源基因的首选表达系统。不少研究者将外源基因构建大肠杆菌表达载体，经转化E.coli在BL21(DE3)进行表达，但得到的都是无活性的包涵体，通过体外合适的条件下溶解、变性、复性、纯化，从每升培养基可得到仅能得到几十至上百微克的的可溶性蛋白质。在大肠杆菌中表达，可能因为LPS的存在而产生毒副作用，因此往往需要对表达纯化产物的毒性进行分析测定。最后，要得到高纯度的蛋白往往需要经过多步纯化操作处理，纯化的步骤越多，蛋白质的得率就会越低，且更可能导致目标产物的失活，因此该表达系统并不适合于大量生产重组重组果胶酶。昆虫细胞表达系统、植物表达系统、哺乳动物表达系统等外源基因表达系统对技术、设备和技术水平的要求太高，因此生产的产品往往价格都很高，同样不适合果胶酶的大量且低成本地生产。甲醇酵母表达系统是应用最广泛的酵母表达系统，以Pichia pastoris(毕赤巴斯德酵母)为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还具最显著的优点：通过筛选高水平分泌表达的转化子和优化表达条件，可以廉价且大规模地生产和制备重组蛋白。

本发明经反复优化基因和改变表达载体与菌株，获得了一种人工合成的源自于茯苓的果胶酶基因，该优化的基因可以在毕赤酵母中实现诱导型的高水平表达，利用离子交换能有效纯化该重组酶蛋白，该新型重组果胶酶蛋白能澄清果汁，在果汁的生产加工中具有重要的应用开发价值。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种人工合成的新型茯苓果胶酶基因及其重组蛋白的制备方法与应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种果胶酶人工序列，所述序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的相似度≥90％

进一步的改进，所述序列包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

进一步的改进，序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

进一步的改进，所述应用为构建重组载体、表达盒或重组菌。

进一步的改进，所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸编码的蛋白质用于果汁澄清。

一种果胶酶人工序列的表达方法，包括如下步骤：

步骤一、将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列重组构建到pPICZα载体中，经转化到毕赤酵母宿主菌细胞中并用1000μg/mL Zeocin的YPD平板筛选得到高Zeocin抗性的转化子；

步骤二、所得的转化子用BMGY培养基培养至OD₆₀₀为10～12，离心收集细胞沉淀，用BMMY培养基重悬细胞，加入甲醇并使其质量分数为1～2％，诱导1～3d，筛选高水平分泌表达果胶酶的转化子；

步骤三、高水平分泌表达果胶酶的转化子用BMGY大量生长培养，之后用BMMY培养基重悬细胞并在28℃继续诱导培养，补加甲醇使其质量分数保持在1～2％。

进一步的改进，还包括步骤四，蛋白纯化：

用DEAE离子交换柱对步骤三中BMMY培养基的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，再将经过透析去除离子并调节pH的上清液过柱，用含30mM NaCl的pH 8.0缓冲液漂洗柱子，然后用含100mM NaCl的pH 6.0缓冲液溶液将目标蛋白洗脱下来即可。

含有上述基因的重组载体、表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体具体为将上述基因***表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。所述重组载体具体优选为将上述基因***表达载体pPICZαA的Xho I和Xba I酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。

扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

上述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No.3，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No.4，利用SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4的引物扩增的目标基因同样可以进行相关的酶切和连接操作。

本发明还提供一种制备果胶酶蛋白的方法，包括以下步骤：

S1：将权利要求1所述的基因和表达载体pPICZαA分别用Xho I和Xba I双酶切并纯化回收，然后利用连接酶在16℃连接，得重组载体pPICZαA-果胶酶；

S2：将所述重组载体pPICZαA-果胶酶用Sac I单酶切线性化，并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过Zeocin筛选得到阳性克隆；

S3：将所述阳性克隆转接至含有1000μg/mL Zeocin的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，用含有10ml BMGY培养液的50毫升离心管培养高抗性的转化子，28℃、250rpm培养至OD₆₀₀＝10左右，离心收集菌体并加入1.5ml的BMMY培养基，28℃、250rpm培养2天，每隔12小时向离心管中加入10μl的甲醇，诱导结束后，离心取上清，将上清液40μl加入到10μl的5倍上样缓冲液中，经变性后，利用12％SDS-PAGE进行电泳分析，经染色和脱色后，根据目标蛋白的表达情况，确定最高水平表达重组果胶酶的转化子。

S4：将高水平分泌表达果胶酶的转化子用BMGY大量生长培养，之后用BMMY培养基重悬细胞并在28℃继续诱导培养，用于大量分泌果胶酶重组蛋白，并补加甲醇使其质量分数保持在1～2％。

进一步，将所述高表达果胶酶的转化子用1L的BMGY培养基扩大培养至OD600为10～15，离心所得菌体用100ml的BMMY培养基重悬后，诱导培养用于大量分泌果胶酶重组蛋白，诱导培养的条件是：28℃、250rpm、每隔24小时向离心管中加入1ml的甲醇，共诱导3-4天。

BMGY扩大生长培养后，一般以生长培养基1/10-1/5体积的诱导培养基BMMY来诱导培养。

优选地，在步骤S4之后，还包括纯化蛋白的如下步骤：

S5：将所述S4发酵后的培养液离心，取上清液利用Tris碱调节pH至8，以大于或等于15000g的转速离心30分钟，将获得的上清液加入到经10mM的pH 8Tris-HCl缓冲液中透析过夜，透析后15000g的转速离心30分钟，上样到经10mM的pH 8Tris-HCl缓冲液平衡后的DEAE离子交换柱中，用10倍层析柱体积的pH 8的含10mM Tris-HCl、30mM NaCl的液漂洗所述层析柱；

S6：用含100mM NaCL的pH6.0的缓冲液洗脱所述层析柱，将得到的洗脱液利用分子量为10kDa的透析袋于pH6.0的PBS缓冲液中透析，然后超滤浓缩。

优选地，在步骤S5之后，还包括保存蛋白的如下步骤：

S7：将所述超滤浓缩得到的产品在-80℃下速冻，然后冷冻干燥。

根据上述任一种制备蛋白的方法制备得到的蛋白也属于本发明的保护范围。

通过步骤S3筛选得到的稳定且能高水平分泌表达果胶酶的酵母转化子也属于本发明保护的范围。

上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系也是本发明保护的范围。

上述制备方法得到的蛋白在食品、保健领域中的应用，例如蛋白用于果汁的澄清。

本发明提供的技术方案具有以下优点：一是提供一种能高效表达高活力的果胶酶的人工基因序列，；二是利用酵母载体pPICZαA-果胶酶上的分泌信号α-因子信号肽引导目的蛋白的基因分泌表达，目的蛋白会大量分泌到培养液中，且能形成准确的空间结构，从而保持果胶酶的天然活性；三是通过筛选得到了稳定且能高水平分泌表达得果胶酶的酵母转化子；四是摸索出用真核宿主毕赤酵母来表达果胶酶的方法和快速高效纯化果胶酶的方法，可以降低成本且实现大量生产；根据本技术方案所述的表达方法分泌表达和纯化得到的具有生物活性的重组果胶酶能够有效防止宿主菌对表达产物的降解，减轻宿主细胞代谢的负荷和表达产物对宿主的毒性作用；六是表达的重组蛋白可以利用DEAE阴离子层析快速纯化，纯化的蛋白具有很强澄清果汁的活性。

本发明通过优化基因首次利用毕赤外源基因表达系统制备了一种来源于茯苓的新型高活力的重组果胶酶。该重组果胶酶的成功制备为下一步的产业化开和用于果汁澄清等研究领域具有重要的应用开发前景。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例中的表达载体pPICZαA-果胶酶构建示意图。

图2为本发明实施例中高Zeocin抗性果胶酶的酵母转化子培养液上清的SDS-PAGE检测结果图。

图3为本发明实施例中在扩大培养条件下，不同时间点目标蛋白表达情况的SDS-PAGE检测结果图。

图4为本发明实施例DEAE离子交换纯化的洗脱曲线图。

图5为本发明实施例中纯化得到的果胶酶蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图6为对比例酵母转化子上清液中的目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明选用毕赤酵母菌株和整合性表达质粒pPICZαA均购自美国Invritrogen公司。

本发明中的引物具体序列如序列表中的SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，利用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的引物扩增的目标基因同样可以进行相关的酶切和连接操作。

所用培养基配方如下：

1)酵母生长培养基(BMGY)

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到800mL。121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入100mL 1M磷酸钾溶液，100mI YNB，2mL 500×生物素，20mL 50％灭菌甘油；

2)酵母诱导培养基(BMMY)

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到800mL。121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入100mL 1M磷酸钾溶液，100mL YNB，2mL500×生物素，10mL甲醇；

3)YPD培养基

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到900mL，121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却至70℃左右再加入100mL 20％灭菌葡萄糖溶液。在其中加入1.6-1.8％的琼脂可制得YPD固体培养基。

实施例1

本实施例提供了一种优化的人工合成的果胶酶基因，具体序列如序列表中的SEQID No.1所示，该基因所对应的蛋白质序列如序列表中的SEQ ID No.2所示。优化后的DNA序列经NCBI比对，没有明显相似性。

将本发明根据果胶酶基因自身序列特点和酵母密码子偏好性合成的DNA序列、优化前的果胶酶的天然DNA和按大肠杆菌密码子偏爱性优化后合成的人工DNA序列分别连接至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA上，得到重组载体，然后利用Invitrogen公司操作手册提供的氯化锂转化法分别将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌X-33中，转化后分别用含有100μg/mL Zeocin抗生素的YPD平板进行筛选，利用PCR对转化子进行验证，将PCR验证后的毕赤酵母转化子划线分别接种至终浓度为1000μg/mL Zeocin抗生素的YPD平板，分别筛选得高抗性的毕赤酵母转化子。将筛选得到高Zeocin抗性的转化子，用含有10ml BMGY培养液的50毫升离心管于28℃、250rpm条件下培养至OD₆₀₀＝10左右，离心收集菌体并加入1.5ml的BMMY培养基，28℃、250rpm培养2天，每隔12小时向离心管中加入10μl的甲醇，诱导结束后，离心取上清，离心取上清，将上清液40μl加入到10μl的5倍上样缓冲液中，经变性后，利用12％SDS-PAGE进行电泳分析，经染色和脱色后，根据目标蛋白的表达情况，确定最高水平表达重组果胶酶的转化子。分析结果显示用优化前的果胶酶天然DNA和按大肠杆菌密码子偏爱性优化后合成的人工DNA序列构建得到的毕赤酵母转化子几乎不能检测到重组酶蛋白的表达而以基因自身序列特点和酵母密码子偏好性合成的DNA序列即SEQ ID No.1构建载体所筛选的转化子都具有很高的重组酶表达能力。

实施例2

本实施例提供一种制备高活力果胶酶蛋白的方法，具体包括如下步骤：

S1：构建表达载体及转化：将实施例1的根据基因自身序列特点和酵母密码子偏好性合成的DNA序列即SEQ ID No.1中的DNA连接至毕赤酵母组成型分泌型表达载体pPICZαA，得到重组载体pPICZαA-果胶酶，载体构建如图1所示，图1为本发明实施例中的真核表达载体pPICZαA-果胶酶构建示意图。主要的载体构建步骤优选如下：

(1)用Xho I和Xba I双酶切含合成的果胶酶基因的质粒，获得目的片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(2)用Xho I和Xba I双酶切pPICZαA，获得载体片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(3)将步骤(1)和(2)得到的目的片断和载体片断用DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行。

(4)将步骤(3)回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司)进行连接反应，目的基因准确***到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内，反应体系如下：

S2：重组质粒的转化：将所述重组载体pPICZαA-果胶酶用Sac I单酶切线性化，按照Invitrogen公司操作手册提供的氯化锂转化法，将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌中，本实施例选用的是X-33。转化后用含有100μg/mL Zeocin抗生素的YPD平板进行筛选得到阳性克隆，并利用PCR对转化子进行验证。

S3：高水平分泌表达酵母转化子的筛选和蛋白的表达：将PCR验证后的毕赤酵母转化子划线接种至含有1000μg/mL Zeocin的YPD平板，将筛选得到高Zeocin抗性的转化子，再用含有10ml BMGY培养液的50毫升离心管于28℃、250rpm条件下培养至OD₆₀₀＝10左右，离心收集菌体并加入1.5ml的BMMY培养基，28℃、250rpm培养2天，每隔12小时向离心管中加入10μl的甲醇，诱导结束后，离心取上清，将上清液40μl加入到10μl的5倍上样缓冲液中，经变性后，利用12％SDS-PAGE进行电泳分析，经染色和脱色后，根据目标蛋白的表达情况，确定最高水平表达重组果胶酶的转化子，转化子的筛选结果如图2所示。

S4：将所述高表达果胶酶的转化子用1L的BMGY培养基扩大培养至OD₆₀₀为10～15，离心所得菌体用100ml的BMMY培养基重悬后，诱导培养用于大量分泌果胶酶重组蛋白，诱导培养的条件是：28℃、250rpm、每隔24小时向离心管中加入1ml的甲醇，共诱导4天。每天取样一次，离心取上清，将上清液40μl加入到10μl的5倍上样缓冲液中，经变性后，利用12％SDS-PAGE进行电泳分析，经染色和脱色后，根据目标蛋白的表达情况确定最适诱导时间为甲醇诱导3-4天，该结果如图3所示。

BMGY扩大生长培养后，一般以生长培养基1/10-1/5体积的诱导培养基BMMY来诱导培养。

需要说明的是，将高Zeocin抗性的转化子用BMMY培养基小量表达，经SDS-PAGE分析，从高抗性(抗性水平为1000μg/mL Zeocin)转化子中筛选得到了3株稳定且高水平分泌表达果胶酶的酵母转化子，而从抗性水平低于300μg/mL Zeocin YPD平板的转化子分泌表达目标蛋白的能力明显低于高抗性的转化子且酶活检测具有同样的结果，部分高Zeocin抗性转化子分泌目标蛋白的SDS-PAGE结果如图2所示。

同样需要说明的是，用SDS-PAGE检测不同时间目标蛋白表达情况分析，电泳结果如图3所示，图3为本发明实施例中在甲醇诱导下不同时间点目标蛋白表达情况的SDS-PAGE检测结果图。经培养1～4天，通过继续补加甲醇，培养得到的目的蛋白总量更高，具体上清液蛋白的总量结果如下表1所示。

表1总蛋白含量

诱导时间	1天	2天	3天	4天
					总蛋白浓度(mg/L)	96	344	877	883

取培养1～4天的发酵液上清，经SDS-PAGE，在45kDa左右有明显目的蛋白表达，且通过继续补加甲醇，培养得到的目的蛋白总量更高，使用Bio-rad凝胶成像系统对SDS-PAG胶的灰度扫描结果显示，目标蛋白的比例与培养时间成反比，目的蛋白占上清液总蛋白的比例结果如下表2所示。

表2不同诱导时间得到的目的蛋白占上清液蛋白的百分比含量结果

诱导时间	1天	2天	3天	4天
					百分比含量(％)	18	42	64	65

经计算，虽然目标蛋白比例在下降，但由于总蛋白增加得更快，因此目标蛋白总量仍在明显增加，目的蛋白含量结果如下表3所示。

表3目标蛋白总量

优选地，在步骤S4之后，还包括纯化蛋白的如下步骤：

S5：将所述S4发酵后的培养液离心，取上清液利用Tris碱调节pH至8，以大于或等于15000g的转速离心30分钟，将获得的上清液加入到经10mM的pH 8Tris-HCl缓冲液中透析过夜，透析后15000g的转速离心30分钟，上样到经10mM的pH 8Tris-HCl缓冲液平衡后的DEAE离子交换柱中，用10倍层析柱体积的pH 8的含10mM Tris-HCl、30mM NaCl的液漂洗所述层析柱；

S6：用含100mM NaCL的pH6.0的缓冲液洗脱所述层析柱，将得到的洗脱液利用分子量为10kDa的透析袋于pH6.0的PBS缓冲液中透析，然后超滤浓缩。

优选地，在步骤S6之后，还包括保存蛋白的如下步骤：

S7：将所述超滤浓缩得到的产品在-80℃下速冻，然后冷冻干燥，即得到冻干粉蛋白。冻干粉溶解于生理盐水中，4℃、15000g的转速离心20分钟，取上清液进行SDS-PAGE分析，结果如图5所示，检测到了目标蛋白且目标蛋白具有很高纯度，说明该蛋白处理的方法不会使蛋白大量变性蛋白仍呈可溶解状态。表4为发酵上清液及各纯化阶段蛋白纯化比较，其中总体积为100ml发酵上清液经过每一个步骤处理后的大致体积。

表4发酵上清液蛋白纯化比较

对比例

茯苓的形成是由茯苓菌丝体在适宜的条件下寄生于已死松木上，不断分解松木中的营养，并将菌化后的多余物质积聚迅速膨大，形成的营养贮藏器官和休眠器官即为菌核，俗称松茯苓。发明人利用转录组技术对茯苓的果胶酶基因的表达谱进行分析发现了几个高丰度的纤维素分解的酶基因。利用转录组得到的数据，设计引物，经RT-PCR扩增目标基因并连接至克隆载体，扩增的目标基因天然序列如序列表中SEQ ID NO.5所示；同样，也合成了仅按大肠杆菌密码子偏爱性优化后合成的人工DNA序列分别连接至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA上，合成的人工序列如序列表中SEQ ID NO.6所示。将上述果胶酶基因序列用XhoI和Xba I双酶切，并连接到同样经Xho I和Xba I双酶切的pPICZαA表达载体。重组载体pPICZαA-果胶酶用Sac I单酶切线性化，并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过Zeocin筛选得到阳性克隆。将PCR验证后的毕赤酵母转化子划线接种至含有1000μg/mLZeocin的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，用含有10ml BMGY培养液的50毫升离心管于28℃、250rpm条件下培养至OD₆₀₀＝10左右，离心收集菌体并加入1.5ml的BMMY培养基，28℃、250rpm培养2天，每隔12小时向离心管中加入10μl的甲醇，诱导结束后，离心取上清，心取上清，将上清液40μl加入到10μl的5倍上样缓冲液中，经变性后，利用12％SDS-PAGE进行电泳分析，经染色和脱色后，SDS-PAGE的检测结果如图6所示，未在目标位置检测到目标蛋白条带。结果说明，只有本发明提供的根据果胶酶基因自身序列特点和酵母密码子偏好性合成的DNA序列表SEQ ID NO.1所示的序列转化到毕赤酵母中才能实现目标蛋白的高水平分泌表达。

实施例3

本实施例对纯化的重组果胶酶对苹果汁、葡萄汁和橙汁的澄清情况进行检测。该酶能提高果汁的澄清度，具体步骤和结果如下：

(1)将0、1、2、4、8毫克的重组果胶酶分别加到10ml的新榨苹果汁中(经2000g离心10分钟所得的果汁上清)，并于室温下静置60分钟。取果汁，用分光光度检测它们在OD₆₀₀处的吸光值。测得的结果如表5所示，可以看出，添加了果胶酶的实验组获得的果汁吸光值要低于未加添重组果胶酶的果汁，当添加8毫克的重组果胶酶至10ml苹果汁中，其吸光值要显著低于未加重组果胶酶的实验组。

表5重组果胶酶对苹果汁产量的影响

酶的加入量(mg)	0	1	2	4	8
						OD<sub>600</sub>	1.01	0.99	0.95	0.91	0.86

(2)将0、1、2、4、8毫克的重组果胶酶分别加到10ml的新榨葡萄汁中(经2000g离心10分钟所得的果汁上清)，并于室温下静置60分钟。取果汁，用分光光度检测它们在OD₆₀₀处的吸光值。测得的结果如表6所示，可以看出，添加了果胶酶的实验组获得的果汁吸光值要低于未加添重组果胶酶的果汁，当添加8毫克的重组果胶酶至10ml葡萄汁中，其吸光值要显著低于未加重组果胶酶的实验组。

表6重组果胶酶对葡萄汁产量的影响

酶的加入量(mg)	0	1	2	4	8
						OD<sub>600</sub>	0.75	0.72	0.67	0.63	0.59

(3)将0、1、2、4、8毫克的重组果胶酶分别加到10ml的新榨橙汁中(经2000g离心10分钟所得的果汁上清)，并于室温下静置60分钟。取果汁，用分光光度检测它们在OD₆₀₀处的吸光值。测得的结果如表7所示，可以看出，添加了果胶酶的实验组获得的果汁吸光值要低于未加添重组果胶酶的果汁，当添加8毫克的重组果胶酶至10ml橙汁中，其吸光值要显著低于未加重组果胶酶的实验组。

表7重组果胶酶对橙汁产量的影响

酶的加入量(mg)	0	1	2	4	8
						OD<sub>600</sub>	1.31	1.28	1.25	1.16	1.12

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

序列表

<110> 怀化学院

<120> 一种果胶酶人工序列(Artificial sequence)及其表达方法和应用

<130> 2

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1263

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

caattgtccg gttccgttgg tccaacttcc tcgttgtcct ccaagcaggg tactatctgc 60

aacgtcttga actacggtgg ttccgttggt tcctcagaca ttggtccagc tatcggtaag 120

gctttctccg actgcgttac taaggctaca aacggtgcca ccttgtacgt tccaccaggt 180

aactacaaca tgcagacttg gcagactctg aaccacggta ctaagtgggc ttttcagttg 240

gacggtgtta tcactagaac ttcgactacc ggtggtaaca tgatcgttat ccagaacgct 300

aacgacttcg agttcttctc gtcaactggt aagggtgcca ttcaaggtaa cggttaccag 360

tgaagaaacg ccggtccaag attgatcaga gttgttactt cgaccaactg gtccctgcac 420

gacatcatta tggttgactc cccagagttc cacctggtta ttcaagacgg ttcaaacggt 480

gaggtctaca acaccgttat cagaggtggt aaccttggtg gttccgacgg tattgatgtt 540

tggggaacta actactggat tcacgacatc gaggttacca acagagatga gtgtgttacc 600

gttaagtcac cagctaacca cattcaggtt gagcagatct ggtgcaatca atccggtgga 660

tccgctatcg gttcattggg tgctaacact accattcaga acgtcctgta cagaaacgtc 720

tacaccaacg gtggaaacca gatcttcatg atcaagtcaa acggcggttc gggtactgtg 780

cagaacgtta acttggagaa cttcattgcc agaaacaccg cctacggttt ggacattgac 840

caatactggt cgtcccaatc aactgctcca ggtaatggtg ttcagttgaa ggacatcact 900

ttctcaaact gggacggttt cattactgac ggtgctagaa gggctccaat ccaggttttg 960

tgtgctgatg gtgctccatg taccgacatc aacatcaaca acgtcaactt gtgggctgct 1020

aacaaccagg ctaccaacaa gtgcagatcg gcttacggta ctggtgcctg tttgaagtct 1080

ggttctggtg gatcatactc gcaggtcact aagactattt caaagccacc agctttcact 1140

actccagcta ctatgtccgg tgacttgtct gacggtttcc caactaactc gccaattcca 1200

attcctacta tcccaccatc attcttccct ggtactcaac cattgaaggc tttggctggt 1260

aag 1263

<210> 2

<211> 427

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

Gln Leu Ser Gly Ser Val Gly Pro Thr Ser Ser Leu Ser Ser Lys Gln

1 5 10 15

Gly Thr Ile Cys Asn Val Leu Asn Tyr Gly Gly Ser Val Gly Ser Ser

20 25 30

Asp Ile Gly Pro Ala Ile Gly Lys Ala Phe Ser Asp Cys Val Thr Lys

35 40 45

Ala Thr Asn Gly Ala Thr Leu Tyr Val Pro Pro Gly Asn Tyr Asn Met

50 55 60

Gln Thr Trp Gln Thr Leu Asn His Gly Thr Lys Trp Ala Phe Gln Leu

65 70 75 80

Asp Gly Val Ile Thr Arg Thr Ser Thr Thr Gly Gly Asn Met Ile Val

85 90 95

Ile Gln Asn Ala Asn Asp Phe Glu Phe Phe Ser Ser Thr Gly Lys Gly

100 105 110

Ala Ile Gln Gly Asn Gly Tyr Gln Cys Arg Asn Ala Gly Pro Arg Leu

115 120 125

Ile Arg Val Val Thr Ser Thr Asn Trp Ser Leu His Asp Ile Ile Met

130 135 140

Val Asp Ser Pro Glu Phe His Leu Val Ile Gln Asp Gly Ser Asn Gly

145 150 155 160

Glu Val Tyr Asn Thr Val Ile Arg Gly Gly Asn Leu Gly Gly Ser Asp

165 170 175

Gly Ile Asp Val Trp Gly Thr Asn Tyr Trp Ile His Asp Ile Glu Val

180 185 190

Thr Asn Arg Asp Glu Cys Val Thr Val Lys Ser Pro Ala Asn His Ile

195 200 205

Gln Val Glu Gln Ile Trp Cys Asn Gln Ser Gly Gly Ser Ala Ile Gly

210 215 220

Ser Leu Gly Ala Asn Thr Thr Ile Gln Asn Val Leu Tyr Arg Asn Val

225 230 235 240

Tyr Thr Asn Gly Gly Asn Gln Ile Phe Met Ile Lys Ser Asn Gly Gly

245 250 255

Ser Gly Thr Val Gln Asn Val Asn Leu Glu Asn Phe Ile Ala Arg Asn

260 265 270

Thr Ala Tyr Gly Leu Asp Ile Asp Gln Tyr Trp Ser Ser Gln Ser Thr

275 280 285

Ala Pro Gly Asn Gly Val Gln Leu Lys Asp Ile Thr Phe Ser Asn Trp

290 295 300

Asp Gly Phe Ile Thr Asp Gly Ala Arg Arg Ala Pro Ile Gln Val Leu

305 310 315 320

Cys Ala Asp Gly Ala Pro Cys Thr Asp Ile Asn Ile Asn Asn Val Asn

325 330 335

Leu Trp Ala Ala Asn Asn Gln Ala Thr Asn Lys Cys Arg Ser Ala Tyr

340 345 350

Gly Thr Gly Ala Cys Leu Lys Ser Gly Ser Gly Gly Ser Tyr Ser Gln

355 360 365

Val Thr Lys Thr Ile Ser Lys Pro Pro Ala Phe Thr Thr Pro Ala Thr

370 375 380

Met Ser Gly Asp Leu Ser Asp Gly Phe Pro Thr Asn Ser Pro Ile Pro

385 390 395 400

Ile Pro Thr Ile Pro Pro Ser Phe Phe Pro Gly Thr Gln Pro Leu Lys

405 410 415

Ala Leu Ala Gly Lys His His His His His His

420 425

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ctcgagaaaa gacaattgtc tggttccgtt ggtc 34

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

tctagattac ttaccagcca aagccttc 28

<210> 5

<211> 1263

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

cagctgtctg ggtctgtggg gcccacatcc tcgctgtcgt cgaagcaggg caccatctgt 60

aacgttctca actatggtgg ctctgtcggt tctagtgaca tcggcccagc cattggtaaa 120

gcgttcagcg actgtgtcac caaggccacc aacggtgcta cgctctacgt gccccctggt 180

aactacaaca tgcagacttg gcagacactg aaccacggta ccaagtgggc gttccagttg 240

gacggtgtca tcacccgtac cagcaccact ggaggtaaca tgatcgtcat ccagaacgct 300

aacgacttcg agttcttctc gagcacgggc aagggtgcca tccagggtaa cggctaccag 360

tgccgcaatg ctggacctcg tctcatccgt gtggtcacgt cgactaactg gtctttgcac 420

gacatcatca tggttgactc tcccgagttc caccttgtca tccaggacgg ctcgaacggt 480

gaagtgtaca acacggtcat tcgcggagga aacctcggcg gttctgacgg tatcgacgtc 540

tggggcacaa actactggat ccacgacatc gaagtcacca accgcgacga gtgcgtcact 600

gtcaagtccc ccgcgaacca cattcaagtc gagcaaatct ggtgcaacca atccggtggc 660

tccgccattg gctcgcttgg tgccaacact accatccaga acgtgctcta ccgcaatgtg 720

tacacgaacg ggggcaacca gatctttatg atcaagtcta atggtggaag tggaacggtg 780

cagaacgtga acttggagaa cttcattgcg aggaatacgg cgtatgggtt ggatattgat 840

cagtattgga gtagccagag tactgcgccg ggcaatggtg tgcagctcaa ggacatcacc 900

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<210> 6

<211> 1263

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

cagctgagcg gtagcgttgg tccgaccagc agcctgagca gcaaacaggg caccatttgt 60

aatgttctga attatggtgg tagcgtgggt agcagcgata ttggtccggc aattggtaaa 120

gcatttagcg attgtgttac caaagcaacc aatggtgcaa ccctgtatgt tccgcctggt 180

aactataata tgcagacctg gcagaccctg aatcatggca ccaaatgggc atttcagctg 240

gatggtgtta ttacccgtac cagcaccaca ggtggtaata tgattgttat tcagaacgcc 300

aacgacttcg aatttttcag cagcaccggt aaaggtgcaa ttcaaggtaa tggttatcag 360

tgtcgtaatg caggtccgcg tctgattcgt gttgttacct caaccaattg gagcctgcat 420

gacattatta tggttgacag tccggaattt catctggtta ttcaggatgg tagcaatggc 480

gaagtgtata acaccgttat tcgtggtggc aatttaggtg gtagtgatgg tattgatgtt 540

tggggcacca attattggat tcacgatatt gaagtgacca atcgtgatga atgcgttacc 600

gttaaaagtc cggcaaatca tattcaggtt gagcagattt ggtgtaatca gagcggtggt 660

tcagccattg gtagcctggg tgcaaatacc accattcaga atgttctgta tcgcaacgtt 720

tataccaacg gtggcaatca gatcttcatg attaaaagca atggtggcag cggcaccgtg 780

cagaatgtta atctggaaaa ctttattgca cgcaataccg catatggcct ggatattgat 840

cagtattgga gcagccagag caccgcacct ggtaatggtg tgcagctgaa agatattacc 900

tttagcaatt gggatggctt tattaccgat ggtgcccgtc gtgcaccgat tcaggttctg 960

tgtgcagatg gtgcaccgtg taccgatatt aacattaata acgttaatct gtgggcagcc 1020

aataatcagg caaccaataa atgtcgtagc gcctatggta caggtgcatg tctgaaaagc 1080

ggcagcggtg gtagctatag ccaggttacc aaaaccatta gcaaaccgcc tgcatttacc 1140

acaccggcaa ccatgagcgg tgatctgagt gatggttttc cgaccaatag tccgattccg 1200

attcctacca ttccgcctag cttttttccg ggtacacagc cgctgaaagc actggcaggt 1260

aaa 1263