阅读说明：本技术 一种deoB基因改造的重组菌株及其构建方法与应用 (Recombinant strain modified by deoB gene and construction method and application thereof ) 是由 贾慧萍 孟刚 魏爱英 赵春光 周晓群 马风勇 郭小炜 田斌 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种deoB基因改造的重组菌株及其构建方法与应用,是对大肠杆菌中的deoB基因进行点突变形成,突变后的deoB基因序列如SEQ ID NO:2所示。该重组菌株与未突变的野生型菌株相比,有利于生产高浓度的L-苏氨酸,且菌株稳定性好,作为L-苏氨酸生产菌株能够进一步降低生产成本。(The invention discloses a recombinant strain modified by deoB gene, a construction method and application thereof, which is formed by point mutation of deoB gene in escherichia coli, wherein the sequence of the mutated deoB gene is shown as SEQ ID NO. 2. Compared with a wild strain without mutation, the recombinant strain is favorable for producing high-concentration L-threonine, has good strain stability, and can further reduce the production cost when being used as an L-threonine producing strain.)

一种deoB基因改造的重组菌株及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种deoB基因改造的重组菌株及其构建方法与应用。

背景技术

L-苏氨酸是八大必需氨基酸之一，且是人和动物自身不能合成的氨基酸。L-苏氨酸可以强化谷物吸收，调节体内代谢平衡，促进机体生长发育，被广泛应用于饲料、医药及食品工业中。

目前，L-苏氨酸生产主要有化学合成法、蛋白水解法和微生物发酵法，其中微生物发酵法生产成本低、生产强度高、对环境污染小，因而成为目前工业生产L-苏氨酸应用最广泛的方法。多种细菌可用于L-苏氨酸的微生物发酵生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型。然而，传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。因此，运用代谢工程手段构建重组大肠杆菌是生产L-苏氨酸的有效途径。

目前，利用表达质粒介导的氨基酸合成途径和竞争途径中关键性酶基因的过表达或弱化是对大肠杆菌进行基因改造的主要手段。但是仍然存在对开发以高产率更经济地生产L-苏氨酸的方法的需要。

发明内容

本发明第一方面，提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示的野生型deoB基因编码序列第1049位碱基发生突变而形成的序列。

根据本发明，所述突变是指所述位点的碱基/核苷酸发生变化，所述突变方法可以选自诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。

根据本发明，所述突变为SEQ ID NO:1中第1049位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)；具体地，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第二方面，提供如上所述的多核苷酸序列编码的重组蛋白。

根据本发明的重组蛋白，其包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

本发明的第三方面，提供包括上述多核苷酸序列的重组载体。

根据本发明的重组载体，是将上述多核苷酸序列导入质粒构建而成；作为一个实施方案，所述质粒为pKOV质粒。具体地，可以将所述多核苷酸序列和所述质粒通过内切酶进行酶切，形成互补的粘性末端，将二者连接构建成重组载体。

本发明的第四方面，提供一种重组菌株，其含有编码序列发生点突变的deoB基因编码核苷酸序列。

根据本发明的重组菌株，其含有如第一方面所述的多核苷酸序列。

作为本发明的一个实施方案，其含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

作为本发明的一个实施方案，其含有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

根据本发明的重组菌株，是将上述如本发明第三方面所述的重组载体导入宿主菌株中重组形成；所述宿主菌株没有特别的限定，可以选自本领域已知的保留deoB基因的产L-苏氨酸菌株，例如选自大肠杆菌。作为本发明的一个实施方案，所述宿主菌株为E.coliK12(W3110) 菌株、E.coli CGMCC 7.232菌株。

根据本发明的重组菌株，是以pKOV质粒为载体。

根据本发明的重组菌株，其可以进一步包括其他改造。

本发明的第五方面，还提供一种重组菌株的构建方法，包括如下步骤：

改造如SEQ ID NO:1所示的野生型deoB基因开放阅读框区域的核苷酸序列，使其第1049 位碱基发生突变，得到包含突变deoB编码基因的产L-苏氨酸重组菌株。

根据本发明的构建方法，所述改造包括诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。

根据本发明的构建方法，所述突变是指SEQ ID NO:1中第1049位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)；具体地，所述突变后的多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

示例性的，所述构建方法包括如下步骤：

(1)改造如SEQ ID NO:1所示的野生型deoB基因开放阅读框区域的核苷酸序列，使其第1049位碱基发生突变，得到突变的deoB基因开放阅读框区域多核苷酸序列；

(2)将所述突变的多核酸序列与质粒连接，构建重组载体；

(3)将所述重组载体导入宿主菌株，得到所述包含点突变的产L-苏氨酸重组菌株。

根据本发明的构建方法，所述步骤(1)包括：点突变的deoB基因编码区构建，即根据 deoB基因编码序列，合成两对扩增deoB基因编码区片段的引物，通过PCR定点突变法在野生型deoB基因编码区(SEQ ID NO:1)中引入点突变，得到点突变的deoB基因编码区核苷酸序列(SEQ ID NO:2)，记为deoB^(G1049A)。

在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)中，所述引物为：

P1:5'CGGGATCCATGGACGGCAACGCTGAAG 3'(划线部分为限制性内切酶酶切位点BamH I)(SEQ ID NO:5)

P2:5'GATCGTAACCGTGGTCAG 3'(SEQ ID NO:6)

P3:5'CTGACCACGGTTACGATC 3'(SEQ ID NO:7)

P4:5'AAGGAAAAAAGCGGCCGCGCTCGTGAGTGCGGATGT 3'(划线部分为限制性内切酶酶切位点Not I)(SEQ ID NO:8)；

在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)包括：以E.coli K12为模板，分别以引物P1/P2 及P3/P4，进行PCR扩增，获得两条含有deoB基因编码区分离的大小为836bp和890bp DNA 片段(deoB Up和deoB Down)。将上述两条DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以上述两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过重叠PCR扩增(Overlap PCR)，获得deoB^(G1049A)-Up-Down。

在本发明的一个实施方案中，所述deoB^(G1049A)-Up-Down核苷酸序列大小为1726bp。

在本发明的一个实施方案中，所述PCR扩增按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火 30s，以及72℃延伸30s(30个循环)。

在本发明的一个实施方案中，所述重叠PCR扩增按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸60s(30个循环)。

根据本发明的构建方法，所述步骤(2)包括重组载体的构建，将上述deoB^(G1049A)-Up-Down 片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化，然后将其和pKOⅤ质粒分别用BamH I/Not I双酶切，将酶切后的deoB^(G1049A)-Up-Down片段和pKOⅤ质粒经琼脂糖凝胶电泳分离纯化并连接，获得重组载体pKOⅤ-deoB^(G1049A)。

根据本发明的构建方法，所述步骤(3)包括重组菌株的构建：将重组载体 pKOⅤ-deoB^(G1049A)转化宿主菌株，得到重组菌株。

在本发明的一个实施方案中，所述步骤(3)的转化为电转化法；示例性地，所述步骤(3) 中，是将重组载体导入至所述宿主菌株。

根据本发明的构建方法，还进一步包括筛选重组菌株的步骤；示例性地，采用氯霉素培养基进行筛选。

本发明的第六方面，还提供如上所述的构建方法所获得的重组菌株。而且，本发明第五方面所述的构建方法可用于构建如第四方面所述的重组菌株。

本发明的第七方面，提供如第四方面或第六方面所述的重组菌株在L-苏氨酸制备或者提高L-苏氨酸发酵量中的应用。

根据本发明所述的重组菌株在L-苏氨酸制备中的应用，包括采用所述重组菌株进行发酵，制备得到L-苏氨酸。

有益效果

本发明通过对野生型谷氨酸棒状杆菌中deoB基因编码序列引入点突变，获得重组型菌株，所获得的菌株与未突变的野生型菌株相比，有利于生产高浓度的L-苏氨酸，且菌株稳定性好，作为L-苏氨酸生产菌株能够进一步降低生产成本。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。但本领域技术人员了解，本发明的保护范围不仅限于以下实施例。根据本发明公开的内容，本领域技术人员将认识到在不脱离本发明技术方案所给出的技术特征和范围的情况下，对以上所述实施例做出许多变化和修改都属于本发明的保护范围。

实施例1构建deoB基因编码区定点突变(G1049A)的质粒pKOⅤ-deoB^(G1049A)(对应编码蛋白的氨基酸序列SEQID NO:3中第350位半胱氨酸被酪氨酸取代(C350Y))

磷酸戊糖变位酶由deoB基因编码，在E.coli K12菌株及其衍生菌株(如MG1655等)中，野生型的deoB基因ORF序列如Genbank登录号为CP032667.1中序列3902352-3903575所示。依据该序列设计并合成两对扩增deoB的引物，构建载体用于将出发菌株中deoB基因编码区序列(SEQ ID NO:1)第1049位碱基G变为A。引物设计如下(由上海invitrogen公司合成)：

P1:5'CGGGATCCATGGACGGCAACGCTGAAG 3'(划线部分为限制性内切酶酶切位点BamH I)(SEQ ID NO:5)

P2:5'GATCGTAACCGTGGTCAG 3'(SEQ ID NO:6)

P3:5'CTGACCACGGTTACGATC 3'(SEQ ID NO:7)

P4:5'AAGGAAAAAAGCGGCCGCGCTCGTGAGTGCGGATGT 3'(划线部分为限制性内切酶酶切位点Not I)(SEQ ID NO:8)

构建方法为：以野生型菌株E.coli K12基因组为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4进行PCR扩增，获得含有点突变的、长度分别为836bp和890bp的两条DNA片段 (deoB^(G1049A)-Up和deoB^(G1049A)-Down片段)。PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture (各2.5mM)4μL，MgCl₂(25mM)4μL，引物(10pm)各2μL，Template 1μL，Ex Taq(5U/μl) 0.25μL，总体积50μL，所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，(94℃变性30s、 52℃退火30s、以及72℃延伸90s，30个循环)，72℃过度延伸10min。将上述两条DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以纯化后的两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过Overlap PCR扩增出长度约为1726bp的片段(deoB^(G1049A)-Up-Down片段)。Overlap PCR 体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，MgCl₂(25mM)4μL，引物(10pm) 各2μL，Template 1μL，Ex Taq(5U/μl)0.25μL，总体积50μL，所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，(94℃变性30s、52℃退火30s、以及72℃延伸90s，30个循环)，72℃过度延伸10min。将上述deoB^(G1049A)-Up-Down片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化，然后将其和 pKOⅤ质粒(购自Addgene公司)分别用BamH I/Not I双酶切，将酶切后的deoB^(G1049A)-Up-Down 片段和pKOⅤ质粒经琼脂糖凝胶电泳分离纯化并连接，获得载体pKOⅤ-deoB^(G1049A)。将载体pKOⅤ-deoB^(G1049A)送测序公司进行测序鉴定，结果如SEQ ID NO:11所示。将含有正确的点突变(deoB^(G1049A))的载体pKOⅤ-deoB^(G1049A)保存备用。

实施例2包含点突变基因deoB^(G1049A)的工程菌株的构建

野生型大肠杆菌菌株E.coli K12(W3110)和高产L-苏氨酸的菌株E.coli CGMCC7.232(保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心)的染色体上均保留了野生型的deoB基因。将构建好的质粒pKOⅤ-deoB^(G1049A)分别转入E.coli K12(W3110)和E.coli CGMCC7.232，通过等位基因置换，将这两个菌株染色体中的deoB基因序列相对于SEQ ID NO:1的第1049位碱基G变为A。

具体过程为：将质粒pKOⅤ-deoB^(G1049A)通过电击转化转入宿主菌感受态细胞后加入 0.5mL的SOC液体培养基；在30℃、100rpm的摇床中复苏2h；取100μL培养液涂布于氯霉素含量为34mg/mL的LB固体培养基，30℃培养18h；挑选长出的单克隆菌落，接种于10mL LB液体培养基中，37℃、200rpm培养8h；取100μL培养液涂布于氯霉素含量为34mg/mL 的LB固体培养基，42℃培养12h；挑选1-5个单菌落接种于1mL LB液体培养基中，37℃、 200rpm培养4h；取100μL培养液涂布于含有10％蔗糖的LB固体培养基，30℃培养24h；挑选单克隆，并一一对应划线于LB固体培养基和氯霉素含量为34mg/mL的LB固体培养基；挑选在LB固体培养基上生长，同时在氯霉素含量为34mg/mL的LB固体培养基不能生长的对应菌株进行PCR扩增鉴定。PCR扩增采用如下引物(上海invitrogen公司合成)：

P5：5'TGACGCCACCATCAAAGAGA 3'(SEQ ID NO:9)

P6：5'GTCAACGCTCCGCCCAAAT 3'(SEQ ID NO:10)

上述PCR扩增产物进行SSCP(单链构象多态性，Single-Strand ConformationPolymorphism) 电泳，以质粒pKOⅤ-deoB(G1049A)扩增片段为阳性对照，野生型大肠杆菌扩增片段为阴性对照，水作为空白对照。在SSCP电泳中，长度相同而序列排列不同的单链寡核苷酸链在冰浴中形成的空间结构不同，电泳时迁移率也会有所差异。所以，片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致，且与阳性对照片段位置一致的菌株即为等位替换成功的菌株。以等位替换成功的菌株为模板，用引物P5和P6再次通过PCR扩增目的片段，并将目的片段连接到pMD19-T 载体，测序。通过测序结果序列比对，测序结果如SEQ ID NO:12所示，deoB基因编码区序列第1049位碱基G变为A的重组子即为改造成功的菌株。将来自E.coliK12(W3110)的重组子命名为YPThr09，将来自E.coli CGMCC 7.232的重组子命名为YPThr10。

实施例3苏氨酸发酵实验

将E.coli K12(W3110)菌株、E.coli CGMCC 7.232菌株以及突变菌株YPThr09、YPThr10 分别接种在25mL表1所述的液体培养基中，于37℃、200rpm培养12h。然后，分别取1mL 各菌株的培养物接种在25mL表1所述的液体培养基中，于37℃、200rpm发酵培养36h。通过HPLC测定L-苏氨酸的含量，每株菌做三个平行，计算平均值，检测结果见表2。

表1培养基配方

成分	配方g/L
		葡萄糖	40
硫酸铵	12
		磷酸二氢钾	0.8
七水硫酸镁	0.8
		七水硫酸亚铁	0.01
一水硫酸锰	0.01
		酵母提取物	1.5
碳酸钙	0.5
		L-甲硫氨酸	0.5
氢氧化钾调节pH值	pH 7.0

表2苏氨酸发酵实验结果

由表2结果所示，无论对于高产还是低产L-苏氨酸的原始菌株，deoB基因的氨基酸序列第 350位半胱氨酸被酪氨酸取代后，都有助于L-苏氨酸产量的提高。

序列表

<110> 内蒙古伊品生物科技有限公司

<120> 一种deoB基因改造的重组菌株及其构建方法与应用

<130> CPCN19410622

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1224

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 1

atgaaacgtg catttattat ggtgctggac tcattcggca tcggcgctac agaagatgca 60

gaacgctttg gtgacgtcgg ggctgacacc ctgggtcata tcgcagaagc ttgtgccaaa 120

ggcgaagctg ataacggtcg taaaggcccg ctcaatctgc caaatctgac ccgtctgggg 180

ctggcgaaag cacacgaagg ttctaccggt ttcattccgg cgggaatgga cggcaacgct 240

gaagttatcg gcgcgtacgc atgggcgcac gaaatgtcat ccggtaaaga taccccgtct 300

ggtcactggg aaattgccgg tgtcccggtt ctgtttgagt ggggatattt ctccgatcac 360

gaaaacagct tcccgcaaga gctgctggat aaactggtcg aacgcgctaa tctgccgggt 420

tacctcggta actgccactc ttccggtacg gtcattctgg atcaactggg cgaagagcac 480

atgaaaaccg gcaagccgat tttctatacc tccgctgact ccgtgttcca gattgcctgc 540

catgaagaaa ctttcggtct ggataaactc tacgaactgt gcgaaatcgc ccgtgaagag 600

ctgaccaacg gcggctacaa tatcggtcgt gttatcgctc gtccgtttat cggcgacaaa 660

gccggtaact tccagcgtac cggtaaccgt cacgacctgg ctgttgagcc gccagcaccg 720

accgtgctgc agaaactggt tgatgaaaaa cacggccagg tggtttctgt cggtaaaatt 780

gcggacatct acgccaactg cggtatcacc aaaaaagtga aagcgactgg cctggacgcg 840

ctgtttgacg ccaccatcaa agagatgaaa gaagcgggtg ataacaccat cgtcttcacc 900

aacttcgttg acttcgactc ttcctggggc caccgtcgcg acgtcgccgg ttatgccgcg 960

ggtctggaac tgttcgaccg ccgtctgccg gagctgatgt ctctgctgcg cgatgacgac 1020

atcctgatcc tcaccgctga ccacggttgc gatccgacct ggaccggtac tgaccacacg 1080

cgtgaacaca ttccggtact ggtatatggc ccgaaagtaa aaccgggctc actgggtcat 1140

cgtgaaacct tcgcggatat cggccagact ctggcaaaat attttggtac ttctgatatg 1200

gaatatggca aagccatgtt ctga 1224

<210> 2

<211> 1224

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaacgtg catttattat ggtgctggac tcattcggca tcggcgctac agaagatgca 60

gaacgctttg gtgacgtcgg ggctgacacc ctgggtcata tcgcagaagc ttgtgccaaa 120

ggcgaagctg ataacggtcg taaaggcccg ctcaatctgc caaatctgac ccgtctgggg 180

ctggcgaaag cacacgaagg ttctaccggt ttcattccgg cgggaatgga cggcaacgct 240

gaagttatcg gcgcgtacgc atgggcgcac gaaatgtcat ccggtaaaga taccccgtct 300

ggtcactggg aaattgccgg tgtcccggtt ctgtttgagt ggggatattt ctccgatcac 360

gaaaacagct tcccgcaaga gctgctggat aaactggtcg aacgcgctaa tctgccgggt 420

tacctcggta actgccactc ttccggtacg gtcattctgg atcaactggg cgaagagcac 480

atgaaaaccg gcaagccgat tttctatacc tccgctgact ccgtgttcca gattgcctgc 540

catgaagaaa ctttcggtct ggataaactc tacgaactgt gcgaaatcgc ccgtgaagag 600

ctgaccaacg gcggctacaa tatcggtcgt gttatcgctc gtccgtttat cggcgacaaa 660

gccggtaact tccagcgtac cggtaaccgt cacgacctgg ctgttgagcc gccagcaccg 720

accgtgctgc agaaactggt tgatgaaaaa cacggccagg tggtttctgt cggtaaaatt 780

gcggacatct acgccaactg cggtatcacc aaaaaagtga aagcgactgg cctggacgcg 840

ctgtttgacg ccaccatcaa agagatgaaa gaagcgggtg ataacaccat cgtcttcacc 900

aacttcgttg acttcgactc ttcctggggc caccgtcgcg acgtcgccgg ttatgccgcg 960

ggtctggaac tgttcgaccg ccgtctgccg gagctgatgt ctctgctgcg cgatgacgac 1020

atcctgatcc tcaccgctga ccacggttac gatccgacct ggaccggtac tgaccacacg 1080

cgtgaacaca ttccggtact ggtatatggc ccgaaagtaa aaccgggctc actgggtcat 1140

cgtgaaacct tcgcggatat cggccagact ctggcaaaat attttggtac ttctgatatg 1200

gaatatggca aagccatgtt ctga 1224

<210> 3

<211> 407

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 3

Met Lys Arg Ala Phe Ile Met Val Leu Asp Ser Phe Gly Ile Gly Ala

1 5 10 15

Thr Glu Asp Ala Glu Arg Phe Gly Asp Val Gly Ala Asp Thr Leu Gly

20 25 30

His Ile Ala Glu Ala Cys Ala Lys Gly Glu Ala Asp Asn Gly Arg Lys

35 40 45

Gly Pro Leu Asn Leu Pro Asn Leu Thr Arg Leu Gly Leu Ala Lys Ala

50 55 60

His Glu Gly Ser Thr Gly Phe Ile Pro Ala Gly Met Asp Gly Asn Ala

65 70 75 80

Glu Val Ile Gly Ala Tyr Ala Trp Ala His Glu Met Ser Ser Gly Lys

85 90 95

Asp Thr Pro Ser Gly His Trp Glu Ile Ala Gly Val Pro Val Leu Phe

100 105 110

Glu Trp Gly Tyr Phe Ser Asp His Glu Asn Ser Phe Pro Gln Glu Leu

115 120 125

Leu Asp Lys Leu Val Glu Arg Ala Asn Leu Pro Gly Tyr Leu Gly Asn

130 135 140

Cys His Ser Ser Gly Thr Val Ile Leu Asp Gln Leu Gly Glu Glu His

145 150 155 160

Met Lys Thr Gly Lys Pro Ile Phe Tyr Thr Ser Ala Asp Ser Val Phe

165 170 175

Gln Ile Ala Cys His Glu Glu Thr Phe Gly Leu Asp Lys Leu Tyr Glu

180 185 190

Leu Cys Glu Ile Ala Arg Glu Glu Leu Thr Asn Gly Gly Tyr Asn Ile

195 200 205

Gly Arg Val Ile Ala Arg Pro Phe Ile Gly Asp Lys Ala Gly Asn Phe

210 215 220

Gln Arg Thr Gly Asn Arg His Asp Leu Ala Val Glu Pro Pro Ala Pro

225 230 235 240

Thr Val Leu Gln Lys Leu Val Asp Glu Lys His Gly Gln Val Val Ser

245 250 255

Val Gly Lys Ile Ala Asp Ile Tyr Ala Asn Cys Gly Ile Thr Lys Lys

260 265 270

Val Lys Ala Thr Gly Leu Asp Ala Leu Phe Asp Ala Thr Ile Lys Glu

275 280 285

Met Lys Glu Ala Gly Asp Asn Thr Ile Val Phe Thr Asn Phe Val Asp

290 295 300

Phe Asp Ser Ser Trp Gly His Arg Arg Asp Val Ala Gly Tyr Ala Ala

305 310 315 320

Gly Leu Glu Leu Phe Asp Arg Arg Leu Pro Glu Leu Met Ser Leu Leu

325 330 335

Arg Asp Asp Asp Ile Leu Ile Leu Thr Ala Asp His Gly Cys Asp Pro

340 345 350

Thr Trp Thr Gly Thr Asp His Thr Arg Glu His Ile Pro Val Leu Val

355 360 365

Tyr Gly Pro Lys Val Lys Pro Gly Ser Leu Gly His Arg Glu Thr Phe

370 375 380

Ala Asp Ile Gly Gln Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gly Thr Ser Asp Met

385 390 395 400

Glu Tyr Gly Lys Ala Met Phe

405

<210> 4

<211> 407

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Lys Arg Ala Phe Ile Met Val Leu Asp Ser Phe Gly Ile Gly Ala

1 5 10 15

Thr Glu Asp Ala Glu Arg Phe Gly Asp Val Gly Ala Asp Thr Leu Gly

20 25 30

His Ile Ala Glu Ala Cys Ala Lys Gly Glu Ala Asp Asn Gly Arg Lys

35 40 45

Gly Pro Leu Asn Leu Pro Asn Leu Thr Arg Leu Gly Leu Ala Lys Ala

50 55 60

His Glu Gly Ser Thr Gly Phe Ile Pro Ala Gly Met Asp Gly Asn Ala

65 70 75 80

Glu Val Ile Gly Ala Tyr Ala Trp Ala His Glu Met Ser Ser Gly Lys

85 90 95

Asp Thr Pro Ser Gly His Trp Glu Ile Ala Gly Val Pro Val Leu Phe

100 105 110

Glu Trp Gly Tyr Phe Ser Asp His Glu Asn Ser Phe Pro Gln Glu Leu

115 120 125

Leu Asp Lys Leu Val Glu Arg Ala Asn Leu Pro Gly Tyr Leu Gly Asn

130 135 140

Cys His Ser Ser Gly Thr Val Ile Leu Asp Gln Leu Gly Glu Glu His

145 150 155 160

Met Lys Thr Gly Lys Pro Ile Phe Tyr Thr Ser Ala Asp Ser Val Phe

165 170 175

Gln Ile Ala Cys His Glu Glu Thr Phe Gly Leu Asp Lys Leu Tyr Glu

180 185 190

Leu Cys Glu Ile Ala Arg Glu Glu Leu Thr Asn Gly Gly Tyr Asn Ile

195 200 205

Gly Arg Val Ile Ala Arg Pro Phe Ile Gly Asp Lys Ala Gly Asn Phe

210 215 220

Gln Arg Thr Gly Asn Arg His Asp Leu Ala Val Glu Pro Pro Ala Pro

225 230 235 240

Thr Val Leu Gln Lys Leu Val Asp Glu Lys His Gly Gln Val Val Ser

245 250 255

Val Gly Lys Ile Ala Asp Ile Tyr Ala Asn Cys Gly Ile Thr Lys Lys

260 265 270

Val Lys Ala Thr Gly Leu Asp Ala Leu Phe Asp Ala Thr Ile Lys Glu

275 280 285

Met Lys Glu Ala Gly Asp Asn Thr Ile Val Phe Thr Asn Phe Val Asp

290 295 300

Phe Asp Ser Ser Trp Gly His Arg Arg Asp Val Ala Gly Tyr Ala Ala

305 310 315 320

Gly Leu Glu Leu Phe Asp Arg Arg Leu Pro Glu Leu Met Ser Leu Leu

325 330 335

Arg Asp Asp Asp Ile Leu Ile Leu Thr Ala Asp His Gly Tyr Asp Pro

340 345 350

Thr Trp Thr Gly Thr Asp His Thr Arg Glu His Ile Pro Val Leu Val

355 360 365

Tyr Gly Pro Lys Val Lys Pro Gly Ser Leu Gly His Arg Glu Thr Phe

370 375 380

Ala Asp Ile Gly Gln Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gly Thr Ser Asp Met

385 390 395 400

Glu Tyr Gly Lys Ala Met Phe

405

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgggatccat ggacggcaac gctgaag 27

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatcgtaacc gtggtcag 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgaccacgg ttacgatc 18

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaggaaaaaa gcggccgcgc tcgtgagtgc ggatgt 36

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgacgccacc atcaaagaga 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtcaacgctc cgcccaaat 19

<210> 11

<211> 1684

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gacggcaacg ctgaagttat cggcgcgtac gcatgggcgc acgaaatgtc atccggtaaa 60

gataccccgt ctggtcactg ggaaattgcc ggtgtcccgg ttctgtttga gtggggatat 120

ttctccgatc acgaaaacag cttcccgcaa gagctgctgg ataaactggt cgaacgcgct 180

aatctgccgg gttacctcgg taactgccac tcttccggta cggtcattct ggatcaactg 240

ggcgaagagc acatgaaaac cggcaagccg attttctata cctccgctga ctccgtgttc 300

cagattgcct gccatgaaga aactttcggt ctggataaac tctacgaact gtgcgaaatc 360

gcccgtgaag agctgaccaa cggcggctac aatatcggtc gtgttatcgc tcgtccgttt 420

atcggcgaca aagccggtaa cttccagcgt accggtaacc gtcacgacct ggctgttgag 480

ccgccagcac cgaccgtgct gcagaaactg gttgatgaaa aacacggcca ggtggtttct 540

gtcggtaaaa ttgcggacat ctacgccaac tgcggtatca ccaaaaaagt gaaagcgact 600

ggcctggacg cgctgtttga cgccaccatc aaagagatga aagaagcggg tgataacacc 660

atcgtcttca ccaacttcgt tgacttcgac tcttcctggg gccaccgtcg cgacgtcgcc 720

ggttatgccg cgggtctgga actgttcgac cgccgtctgc cggagctgat gtctctgctg 780

cgcgatgacg acatcctgat cctcaccgct gaccacggtt acgatccgac ctggaccggt 840

actgaccaca cgcgtgaaca cattccggta ctggtatatg gcccgaaagt aaaaccgggc 900

tcactgggtc atcgtgaaac cttcgcggat atcggccaga ctctggcaaa atattttggt 960

acttctgata tggaatatgg caaagccatg ttctgatgga tttgggcgga gcgttgactc 1020

cgcctttgtt atgtcacaaa aaggataaaa caatggctac cccacacatt aatgcagaaa 1080

tgggcgattt cgctgacgta gttttgatgc caggcgaccc gctgcgtgcg aagtatattg 1140

ctgaaacttt ccttgaagat gcccgtgaag tgaacaacgt tcgcggtatg ctgggcttca 1200

ccggtactta caaaggccgc aaaatttccg taatgggtca cggtatgggt atcccgtcct 1260

gctccatcta caccaaagaa ctgatcaccg atttcggcgt gaagaaaatt atccgcgtgg 1320

gttcctgtgg cgcagttctg ccgcacgtaa aactgcgcga cgtcgttatc ggtatgggtg 1380

cctgcaccga ttccaaagtt aaccgcatcc gttttaaaga ccatgacttt gccgctatcg 1440

ctgacttcga catggtgcgt aacgcagtag atgcagctaa agcactgggt attgatgctc 1500

gcgtgggtaa cctgttctcc gctgacctgt tctactctcc ggacggcgaa atgttcgacg 1560

tgatggaaaa atacggcatt ctcggcgtgg aaatggaagc ggctggtatc tacggcgtcg 1620

ctgcagaatt tggcgcgaaa gccctgacca tctgcaccgt atctgaccac atccgcactc 1680

acga 1684

<210> 12

<211> 401

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgacgccacc atcaaagaga tgaaagaagc gggtgataac accatcgtct tcaccaactt 60

cgttgacttc gactcttcct ggggccaccg tcgcgacgtc gccggttatg ccgcgggtct 120

ggaactgttc gaccgccgtc tgccggagct gatgtctctg ctgcgcgatg acgacatcct 180

gatcctcacc gctgaccacg gttacgatcc gacctggacc ggtactgacc acacgcgtga 240

acacattccg gtactggtat atggcccgaa agtaaaaccg ggctcactgg gtcatcgtga 300

aaccttcgcg gatatcggcc agactctggc aaaatatttt ggtacttctg atatggaata 360

tggcaaagcc atgttctgat ggatttgggc ggagcgttga c 401