阅读说明：本技术 DNA编码化合物库构建中On-DNA氨基磷酸酯化合物的合成方法 (Method for synthesizing On-DNA phosphoramidate compound in construction of DNA coding compound library ) 是由 刘炜 邓伟 孙赛赛 喻春燕 龚平秀 陈琳琳 范梅 吴阿亮 李科 蒯乐天 杨洪芳 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种DNA编码化合物库中On-DNA氨基磷酸酯化合物的制备方法,将On-DNA叠氮化合物与亚磷酸三酯混合在一定温度下反应一段时间后得到DNA氨基磷酸酯化合物。本发明反应条件温和、成本低、操作方便、收率高,适合于多孔板进行的DNA编码化合物库的合成,可以让DNA编码胺基化合物库通过该方法盖帽得到DNA编码氨基磷酸酯类化合物库,提供了一种增加DNA编码氨基化合物库的多样性的方法。(The invention discloses a preparation method of an On-DNA phosphoramidate compound in a DNA coding compound library, which comprises the steps of mixing an On-DNA azide compound and phosphotriester, reacting for a period of time at a certain temperature to obtain the DNA phosphoramidate compound. The method has the advantages of mild reaction conditions, low cost, convenient operation and high yield, is suitable for synthesizing the DNA coding compound library by using a porous plate, can obtain the DNA coding phosphoramidate compound library by using the DNA coding amino compound library through the method, and provides a method for increasing the diversity of the DNA coding amino compound library.)

DNA编码化合物库构建中On-DNA氨基磷酸酯化合物的合成 方法

技术领域

本发明属于DNA编码化合物库技术领域，具体涉及一种DNA编码化合物库中由On-DNA叠氮化合物制得On-DNA氨基磷酸酯化合物的方法。

背景技术

美国Scripps研究院的Sydney Brenner和Richard Lerner教授于1992年提出了DNA编码化合物库(DNA Encoded Library，简称DEL)的概念(参考文献：Proc.Natl.Acad.Sci.,1992,89,5381)，该方法通过将一个有机小分子试剂与一段独特序列的DNA在分子水平进行连接，利用组合化学的“组合-拆分”策略通过两个至多个循环快速地构建数量巨大的化合物库，该化合物库中每一个化合物都由不同有机小分子试剂残基组成，并由相应的唯一碱基序列的DNA标识，将少量的DNA编码化合物库与靶标进行亲和筛选，与靶标没有吸附的库分子先被洗掉，留下与靶标有吸附的库分子再洗脱下来，这时得到的库分子浓度很低，常规手段难以分析和识别，通过DNA独有的聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction，简称PCR)可以把得到的与靶标有吸附的库分子中的DNA部分进行复制扩增直至得到的DNA量可以被DNA测序仪识别，测序后的数据再通过构建DNA编码化合物库时创建的小分子试剂与DNA碱基序列之间的关系表来解码，进而找到具有潜在活性分子相对应的具体化合物对应的小分子试剂，再通过传统的有机合成方法把这些小分子试剂组合在一起得到筛选的目标分子，检测并确认其对靶标的生物活性。

DNA编码化合物库的构建方法主要有三种，第一种是以美国Ensemble公司为主利用DNA模板技术得到的DNA导向分子库(DNA-Templated Chemical Library Synthesis，简称DTCL)，第二种是以美国GSK公司，X-Chem公司和国内的成都先导为主利用DNA标记技术得到的DNA记录分子库(DNA-Recorded Chemical Library，简称DRCL)，第三种是以瑞士Philogen公司为主基于片段的药物设计(Fragment-based drug discovery，简称FBDD)技术得到的编码自组装分子库(Encoded Self-Assembling Chemical Libraries，简称ESAC)，目前工业上被大量运用的构建DNA编码化合物库的方法主要是第二种，该方法操作简单，成本更低，能更快速地利用组合化学方法得到含有海量的化合物的DNA编码化合物库。

除了DNA起始片段(详见本公司发明专利：CN108070009A,CN109868268A)外，需要有大量的DNA标签和可以按照一定顺序进行反应的有机小分子试剂。DNA标签的编码可以通过一定的计算机程序来获得(详见本公司发明专利：CN107958139A)，再通过DNA合成仪得到具体的DNA碱基序列的引物。有机小分子试剂的获得，可以使用一定的计算机程序来对获得的试剂清单进行筛选得到(详见本公司发明专利：CN108959855A)。

DEL库领域目前最主要的工作之一是DNA上化学反应的开发，简称on-DNA化学反应。因为DNA必须在一定的水相中、pH、温度、金属离子浓度和无机盐浓度下才能保持稳定，因此，对DNA损伤小、有较好的回收率和底物适应性广的on-DNA化学反应，才是大规模应用于DNA编码化合物库的合成所需要的。目前公开报道的on-DNA化学反应种类近60种，每种的反应条件少则一种，多则十几种，可以说，在其他情况一样的情况下，on-DNA化学反应的种类越多，条件越丰富，在DNA编码化合物库的设计时的选择性才越多，最终DNA编码化合物库的合成成功率才越高，得到的DNA编码化合物库的多样性才越丰富。

表1可用于DRCL构建的On-DNA化学反应种类和具体条件

在on-DNA化学反应中，缓冲液的选择十分重要，我们确定了几种常用的缓冲液的配制和质检方法(详见本公司发明专利：CN109456368A)，并提供了在该缓冲液条件下的几种具体的On-DNA化学反应(详见本公司发明专利：CN109680342A)。目前DNA编码化合物库构建中最常使用的成键化学反应有：形成酰胺键反应、其他胺的盖帽反应(还原氨化、取代、(硫)脲的形成、氨基甲酸酯的形成、磺酰化等)、Suzuki偶联反应、Sonogashira偶联反应、Heck偶联反应、Buchwald偶联反应、Ullmann偶联反应等(参考文献：Angew.Chem.Int.Ed.,2019,58,10.1002/anie.201902489)。

受上述on-DNA化学反应的限制，目前并不能通过DNA编码化合物库的合成直接得到很多种类的DNA编码化合物分子。为了将目前在药物化学领域研究较为热门的小分子氨基磷酸酯类化合物的合成引入我们的DNA编码化合物库的合成，我们研究并开发了本发明的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种DNA编码化合物库构建中由On-DNA叠氮化合物一步反应获得On-DNA氨基磷酸酯化合物的合成方法，具有反应条件温和、选择性高、产率高、后处理简单的优点，适合DNA编码化合物库的生产，能显著提高化合物库分子的多样性。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种DNA编码化合物库构建中On-DNA氨基磷酸酯化合物的合成方法，其特征在于，将摩尔浓度为0.1～2.0mM的On-DNA叠氮化合物DNA-N₃与10～500摩尔当量的亚磷酸三酯溶液混合，在20～100℃下反应1～24小时直至反应结束，反应结构式如下：

其中，所述On-DNA叠氮化合物的结构式为：DNA-N₃，所述On-DNA氨基磷酸酯化合物的结构式为：DNA-NH-P＝O(OR)₂；

其中，R为卤素、胺基、C₁-C₈烷基、C₃-C₈环烷基、C₁-C₈烯烃基、C₁-C₈炔烃基、C₁-C₈烷氧基、C₃-C₈烷硅基、苯基中的任意一种至多种的随机组合；

其中，结构式中的DNA是由经人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链；

其中，所述溶剂是含乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、叔丁醇、异丙醇、四氢呋喃、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一种或几种的含水的混合溶剂；优选地，所述on-DNA叠氮化合物溶于水。

本发明提供一种在DNA编码化合物库中直接合成得到DNA编码的氨基磷酸酯的方法，对于扩大本公司的DNA编码化合物库的多样性，让DNA编码化合物库的库分子合成方法的多样性能覆盖目前的小分子药物研究领域的主要热点领域，以便得到的DNA编码化合物库的库分子更能满足市场的需要。

本发明反应条件温和、选择性高、产率高、后处理简单，适合大批量多孔板的DNA编码化合物库的生产，能显著提高目前DNA编码化合物库分子的多样性。

附图说明

图1为本发明方法的原料制备方法，DNA-NH₂化合物1与含有芳硝基羧酸二元化合物使用EDCI为缩合剂、s-NHS为缩合活化剂，生成on-DNA芳硝基化合物2，进一步与B₂(OH)₄发生还原反应原位生成相应的on-DNA芳胺化合物3，3再与亚硝酸钠、对甲基苯磺酸和叠氮三甲基硅烷混合，原位反应得到相应的on-DNA芳基叠氮类化合物4的化学反应式。

图2A为本发明方法的3步制备得到的原料on-DNA芳基叠氮类化合物4的转化率统计图。

图2B为图2A中的部分代表结构式的转化率图。

图3为本发明用on-DNA芳基叠氮类化合物4与亚磷酸三甲酯混合，原位反应得到相应的on-DNA芳基氨基磷酸酯化合物的化学反应式。

图4为本发明用on-DNA芳基叠氮类化合物4与亚磷酸三甲酯混合，原位反应得到相应的on-DNA芳基氨基磷酸酯化合物的代表结构式的转化率图(转化率以LCMS-LTQ上的TIC峰面积为准)。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1，on-DNA芳基叠氮类化合物4的合成

1)on-DNA芳硝基化合物2的合成

DNA-NH₂化合物1(例如专利CN108070009A的提及的起始头片段)溶于250mM,pH＝9.5的硼酸缓冲液，配制成1mM浓度溶液，分装到96孔板中，与96个含有芳硝基羧酸二元化合物使用EDCI作为缩合剂、s-NHS缩合活化剂反应得到相应的on-DNA芳硝基化合物2(参考文献：Nat.Chem.,2015,7,3,241)，该反应完成后只做乙醇沉淀处理，浓缩干燥后直接用于下一步的还原反应。

2)on-DNA芳胺化合物3的合成

上述on-DNA芳硝基化合物2溶于250mM,pH＝9.5的硼酸缓冲液，配制成1mM浓度溶液，分装到96孔板中，使用B₂(OH)₄还原剂反应得到原位生成芳基胺化合物3(参考文献：CN109680342A)，该反应完成后只做乙醇沉淀处理，浓缩干燥后直接用作on-DNA芳基叠氮化合物合成的原料。

3)on-DNA芳基叠氮化合物4的合成

向上述原位生成的96个DNA-Ar-NH₂化合物3的每个孔(10μL,10nmol,1mM水溶液)依次加入亚硝酸钠溶液(10μL,1000nmol,100mM超纯水,100摩尔当量)和对甲苯磺酸溶液(10μL,125nmol,12.5mM超纯水，12.5摩尔当量)，离心，让溶液沉底，涡旋混匀，再次离心后，放置于20℃下震荡5分钟，离心，加入叠氮三甲基硅烷(10μL,2000nmol,200mM DMA溶液,200摩尔当量)，96孔板在震荡仪器中20℃下反应16小时，该反应完成后乙醇沉淀处理，浓缩干燥后得到on-DNA芳基叠氮化合物4(参考文献：CN110105408A)。

加入乙醇沉淀：

向96孔板的反应孔加入总反应液体积10％的5M氯化钠溶液，封膜，振荡混匀后，加入总体积3倍的在-20℃储存的冷无水乙醇，于-80℃冰箱冷冻2小时，之后拿出在4℃以4000G的离心力离心30分钟，吸除上清液，沉淀用去离子水溶解后于-40℃真空冻干，得到产物，通过酶标仪检测OD确认回收率，同时检测LC-MS确认每个小分子的转化率(见图2A)。

在原位转化率>50％的on-DNA芳胺化合物3得到on-DNA芳基叠氮化合物4的转化率>50％个数是26个，占比28％。为了更好地验证on-DNA氨基磷酸酯的合成方法，我们只选择其中20个转化率较好(见图2B)，DNA回收率较高的on-DNA芳基叠氮化合物4用于下一步反应。

实施例2，on-DNA氨基磷酸酯5的合成

向上述20个原位生成的on-DNA芳基叠氮化合物4(10μL,10nmol,1mM水溶液)加入亚磷酸三甲酯溶液(10μL,2000nmol,200mM DMA溶液,200当量)，离心，让溶液沉底，涡旋混匀，再次离心后，封膜，96孔板在PCR仪器中40℃下反应16小时(盖温：40℃)。

乙醇沉淀：向96孔板的反应孔加入总反应液体积10％的5M氯化钠溶液，封膜，振荡混匀后，加入总体积3倍的在-20℃储存的冷无水乙醇，于-80℃冰箱冷冻2小时，之后拿出在4℃以4000G的离心力离心30分钟，吸除上清液，沉淀用去离子水溶解后于-40℃真空冻干，得到产物，通过酶标仪检测OD确认回收率，同时检测LC-MS确认每个小分子的转化率，代表结构式的转化率见图4。

综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。